Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nƣớc ta có nhiều nhà máy đƣờng tạo ra một sản lƣợng lớn về đƣờng kết tinh. Bên cạnh đó một lƣợng không nhỏ mật rỉ đƣờng mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi trƣờng. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ L-lysine, acid citric, acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid lactic đƣợc quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực nhƣ bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trƣờng (acid polylactic thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, PP, đĩa CD, bịch nilon), mỹ phẩm.v.v. Tổng thị trƣờng thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500.000 tấn vào năm 2010. Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dƣợc IIdong (Hàn Quốc) xuất khẩu một số lƣợng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dƣợc ở Việt Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40]. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. Dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Nguyễn Đức Lƣợng trƣờng Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hƣng Trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường”. 1.2. Mục đích của đề tài Chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic nhiều nhất để sản xuất acid lactic. 1.3. Yêu cầu - Phân lập vi khuẩn lactic - Tuyển chọn các khuẩn lạc có khả năng lên men lactic - Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình lên men - So sánh sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc - Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về acid lactic Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid (CH3CHOHCOOH) là acid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, đƣợc tìm thấy ở ngƣời, động vật, thực vật và vi sinh vật. Đƣợc phát hiện vào năm 1780 do nhà hóa học Thụy Điển Sheele ở trong sữa chua. Acid lactic đƣợc chấp nhận là sản phẩm của một quá trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32]. Trong cấu tạo phân tử của acid lactic có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - acid lactic và L - acid lactic. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau. Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể. Chúng có khả năng tan trong nƣớc, tan trong cồn, tan trong eter, không tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 28 o C [9]. L - acid lactic đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Hầu hết các sinh vật lên men lactic đồng hình đều tạo ra đƣợc các dạng đồng phân quang học [32]. Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nƣớc tan trong cồn. Nhiệt độ nóng chảy 28o C. Nếu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 ngƣời ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lý tƣởng này mà chỉ có đƣợc hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL - acid lactic có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl3 [9]. 2.2. Vi sinh vật trong lên men lactic Vi khuẩn lactic có thể đƣợc phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt trái cây và rau [24]. Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và âm đạo [21]. 3 Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dƣơng, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu khuẩn hay hình que. Chúng sản xuất ra acid lactic nhƣ là sản phẩm lên men chính. Chúng không có enzyme catalase mặc dù catalase giả có thể đƣợc tìm thấy trong những trƣờng hợp rất hiếm vì vậy không phân giải oxi già. Các thành viên của nhóm này thiếu cytochrome. Tất cả các vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kị khí. Tuy nhiên, không giống nhƣ những vi khuẩn kị khí, hầu hết các vi khuẩn acid lactic không nhạy cảm với oxi và cũng có thể phát triển tốt trong điều kiện có mặt oxi cũng nhƣ không có mặt oxi. Vì thế chúng là vi khuẩn kị khí tùy ý (Madigan et al. 2000) [30]. Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể phân chia thành 3 nhóm [23], [19]. - Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhƣng không có phosphoketolase. Chúng lên men đƣợc hexose để tạo acid lactic nhƣng không lên men đƣợc pentose.) - Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase. Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose đƣợc chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic). - Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase nhƣng không có FDP aldolase, quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình). 4 Bảng 2.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986) Đặc đểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men pentose Tạo CO2 từ glucose Tạo CO2 từ gluconate Sự hiện diện FDP aldolase Sự hiện diện phosphoketolase - - - + - + - + a + + b + + + a - + Một vài đại diện L. acidophilus L. delbrueckii L. helveticus L. salivarius L. casei L. curvatus L. plantarum L. sake L. brevis L. buchneri L. fermentum L. reuteri a: Khi lên men b: Cảm ứng khi có pentose Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt các giống vi khuẩn acid lactic là sự lên men glucose dƣới các điều kiện chuẩn nhƣ: nồng độ glucose và các yếu tố tăng trƣởng (các tiền chất acid amin, vitamin và acid nucleic) thì không giới hạn và giới hạn sử dụng oxi. Dƣới những điều kiện này, vi khuẩn acid lactic có thể phân thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình thì chuyển hầu hết lƣợng glucose để tạo thành acid lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2. Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt đƣợc giữa hai nhóm này (Sharpe, 1979). 2.2.1. Vi khuẩn lactic dị hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng, các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng tạo ra lƣợng acid lactic không lớn lắm. Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác nhƣ acid acetic, ethanol, CO2 [3], [9]. Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đƣợc nghiên cứu nhƣ sau: - Lactobacillus pasteurianus Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc rộng 0,5 – 1 μm; dài 7,0 – 35 μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ, không di động. Có khả năng lên men đƣợc, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men 5 tạo một số sản phẩm nhƣ CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic. Nhiệt độ thích hợp 29 - 33 o C, pH thích hợp 8 [9]. - Lactobacillus brevis Thuộc trực khuẩn, gram dƣơng, không có khả năng di động, kích thƣớc rộng 0,7 - 1,0 μm, dài 2,0 - 4,0 μm. Trong thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat canxi nhƣ nguồn cung cấp cacbon. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose. Chúng hiếm khi lên men mannitol, glycerol, dextrin, và tinh bột. Chúng không hóa lỏng gelatin [18]. - Lactobacillus lycopessici Trực khuẩn, gram dƣơng, trong thiên nhiên chúng tồn tại từng đôi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đƣờng, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2 . - Streptococcus cumoris Thuộc loài cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. Thuộc gram dƣơng, nhiệt độ thích hợp phát triển là 30o C, không phát triển ở nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, diacetyl, CO2. Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn . - Streptolacticus lactic Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dƣơng, nhiệt độ phát triển từ 10 – 45o C, có khả năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, saccharose, mannitol, tạo ra acid lactic, acid acetic, diacetyl, CO2. Chúng không có khả năng lên men đƣợc glycerol, sorbitol . - Streptococcus faecalis Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 37o C, nhiệt độ sinh trƣởng 10 - 45o C, có thể phát triển duới hoặc 5o C, hiếm khi phát triển ở 50o C. Có khả năng sống sót ở 62,8o C trong 30 phút. Phát triển ở pH 9,6. Chịu đƣợc nồng độ NaCl 2 %, 4 % và 6,5 %. Có khả năng lên men đƣờng glucose, maltose, lactose và luôn luôn lên men mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol [18]. 6 2.2.2. Vi khuẩn lactic đồng hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng thì vi khuẩn lactic đồng hình thƣờng tạo ra acid lactic là chủ yếu [3], [9]. Một số loài vi khuẩn lactic điển hình đƣợc nghiên cứu kỹ nhƣ sau: - Lactobacillus acidophilus Lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi Moro (1900) đƣợc phân lập từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẩu thuật và bê mới đẻ . Có dạng hình que, chịu nhiệt, quá trình lên men tạo ra 2,2 % acid lactic [4], [17]. Chúng có kích thƣớc rộng 0,6 - 0,9 μm, dài 1,5 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ. Đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn. Trên môi trƣờng gelatin: chúng không phát triển ở 20o C, không có khả năng hóa lỏng. Trên môi trƣờng khoai tây thì không phát triển. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng và không di động. Chúng có khả năng lên men đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, để tạo acid lactic. Chúng không có khả năng lên men glycerol, mannitol, sorbitol. Không thể phát triển đƣợc trong môi trƣờng không có carbohydrate. Nhiệt độ tối ƣu 37o C. Nó phát triển từ 20 - 22o C. Nhiệt độ phát triển tối đa 43 - 48o C [18]. - Lactobacillus bulgaricus Chúng đƣợc tìm ra do Mesnhicov ở sữa chua Bungari [14]. Thuộc loại trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram dƣơng. Chúng không có khả năng di động, có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, lactose, galactose. Có thể hoặc không thể lên men fructose, maltose và sucrose. không lên men đƣợc xylose, mannitol, dextrin. Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate [9]. Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14]. Trên môi trƣờng khoai tây, có khuẩn lạc trắng vàng [18]. pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 5,2 - 5,6 [7]. Nhiệt độ tối ƣu 45 - 50 o C. Tối thiểu 22o C [20]. Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thƣờng đƣợc chọn để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng Ca(OH)2 để trung hòa lƣợng acid lactic tạo thành. Nhiệt độ lên men 43o C, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật gây nhiễm mà không ức chế L. bulgaricus [22]. - Lactobacillus bifidus Trực khuẩn rất nhỏ, kích thƣớc trung bình khoảng 4 μm, không có khả năng di động, thuộc gram dƣơng. Chúng có thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn. Có khả năng 7 lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, saccharose, dextrin, tinh bột và maltose [18]. - Lactobacillus casei Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng trong chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thƣớc 0,7 - 1,1 μm; 2,0 - 4,0 μm, trực khuẩn nhỏ thƣờng gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4]. Chúng thuộc gram dƣơng, không có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose và mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 30o C, thấp nhất 10o C. Tối đa 37 - 40o C và vài chủng có thể 45o C. Quá trình lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18]. - Lactobacillus causaciccus Trực khuẩn ngắn, không có khả năng di động, gram dƣơng. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 48 - 55o C [9]. - Lactobacillus delbrueckii Thƣờng gặp chúng trên hạt đại mạch [14]. Vi khuẩn chịu nhiệt, đƣợc tìm thấy ở các loài hạt ngũ cốc và tinh bột, đây là một giống vi khuẩn có khả năng đồng hóa đƣợc tinh bột. Trực khuẩn dài, kích thƣớc 0,5 - 0,8 μm; 2,0 - 9,0 μm, không di động, gram dƣơng. Quá trình lên men tạo 2,5 % acid lactic. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose, maltose, sucrose, galactose và dextrin. Chúng không có khả năng lên men xylose, lactose, tinh bột, mannitol. Nhiệt độ tối ƣu 45o C [9], [18]. -Lactobacillus leichmannii Trực khuẩn gram dƣơng. Kích thƣớc tế bào 0,6 – 2 μm. Vi khuẩn này có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, không di động, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 36o C. Tối đa 40 - 46 o C. Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate. Có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose. Trong môi trƣờng khoai tây chúng tạo 1,3 % acid lactic [18]. - Lactobacillus helveticcus Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc 0,7 - 0,9 μm; 2,0 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào. Nhiệt độ phát triển 40 - 42o C. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose, galactose, maltose và lactose [9]. 8 - Lactobacillus thermophillus Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,5 - 3,0 μm, không có khả năng di động. Lên men đƣợc glucose, lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol. Không tạo acid từ mannitol. Lên men đƣợc fructose, galactose, maltose và dextrin. Không tạo nitrit từ nitrate. Nhiệt độ tối ƣu 50 - 62,8o C. Nhiệt độ tối thiểu 30o C, nhiệt độ tối đa 65 o C. Điểm nhiệt độ chết khoảng 71o C trong 30 phút [18]. - Lactobacillus plantanrum Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,7 - 1,0 μm; 3,0 - 8,0 μm. Nhiệt độ tối ƣu 30o C. Tối thiểu 10o C, tối đa 40o C. Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75o C trong 15 phút. Có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Chúng có khả năng lên men glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose. Tinh bột thì không lên men. Không tạo đƣợc nitrit từ nitrate [18]. - Lactobacillus sporogenes Thuộc giống Lactobacillus dựa trên các đặc tính bởi Nakayama và Yanoshi (1967). Chúng thuộc Gram dƣơng, có khả năng sinh bào tử, có dạng hình que, kích thƣớc 3 – 5 μm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, là vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất ra axít lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển ở nhiệt độ dao động từ 35 - 50o C, pH tối ƣu dao động từ 5,5 - 6,5, phản ứng với catalase dƣơng tính. Tạo acid từ glucose, galactose, fructose, maltose và sucrose. Không có thủy phân tinh bột hoặc casein, không hóa lỏng gelatin. phản ứng indol âm tính và không tạo khí [31]. 2.3. Cơ chế tạo ra acid lactic [20] Kluyver chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm dựa vào sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa glucose. Quá trình này tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men glucose đƣợc gọi là lên men đồng hình. Số lƣợng acid lactic đồng hình thu đƣợc nhiều hơn lactic dị hình khoảng 2 lần. Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lƣợng mole lactat, CO2 và ethanol bằng nhau. 9 Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20] Lên men đồng hình Lên men dị hình Sinh vật Dạng lactat % G+C Sinh vật Dạng lactat % G+C Lactobacillus Lactobacillus L. acidophilus DL 36,7 L. brevis DL 42,7 - 46,4 L. bulgaricus D(-) 50,3 L. buchneri DL 44,8 L. casei L(+) 46,4 L. cellobiosus DL 53 L. coryniformis DL 45 L. coprophilus DL 41,0 L. curvatus DL 43,9 L. fermentum DL 53,4 L. delbrueckii D(-) 50 L. hilgardii DL 40,3 L. helveticus DL 39,3 L. sanfrancisco DL 38,1 - 39,7 L. jugurti DL 36,5-39,0 L. trichoides DL 42,7 L. jensenii D(-) 36,1 L. fructivorans DL 38 - 41 L. lactis D(-) 50,3 L. pontis DL 53 - 56 L. leichmannii D(-) 50,8 Leuconostoc L. plantarum DL 45 L.cremoris D(-) 39 - 42 L. salivarius L(+) 34,7 L.dextranicum D(-) 38 - 39 Pediococcus L.lactis D(-) 43 - 44 P.acidilactici DL 44,0 L.mesenteroides D(-) 39 - 42 P.cerevisiae DL L.gelidum D(-) 37 P.pentosaceus DL 38 L.carnosum D(-) 39 Streptococcus Carnobaterium S.bovis D(-) 38 – 42 C.divergens 33,0 - 36,4 S.thermophilus D(-) 40 C.mobile 35,5 - 37,2 Lactococcus C.gallinarum 34,3 - 36,4 L.lactis subsp. lactis D(-) 38,4 - 38,6 C.piscicola 33,7 - 36,4 L.lactissubsp.cremoris D(-) 38,0 - 40,0 Weissella L.lactissubsp.hordniae 35,2 W.confusa DL 44,5 - 45,0 L.garvieae 38,3 - 38,7 W.hellenica D(-) 37 - 47 L.plantarum 36,9 - 38,1 W.halotolerans DL 45 L.raffinolactis 40,0 - 43 W.kandler DL 39 Vagococcus W.minor DL 44 V.fluvialis 33,6 W.paramesenteroides D(-) 38 - 39 V.salmoninarum 36,0 - 36,5 W.viridescens DL 43 Oenococcus O.oeni DL 38 - 42 10 2.3.1. Vi khuẩn lactic dị hình [9] Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng thiếu hai loại enzym quan trọng đó là aldolase và hexose isomerase. Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thƣờng đƣợc tiến hành theo con đƣờng hexose monophosphate hay gọi là con đƣờng pentose phosphate (PP ) . Quá trình chuyển hóa đƣờng đƣợc trình bày nhƣ sau: 2.3.2.Vi khuẩn lactic đồng hình Quá trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose isomerase nhƣng thiếu phosphoketolase. Chúng sử dụng con đƣờng Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20]. Quá trình chuyển hóa đƣợc trình bày nhƣ sau: 11 12 2.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển đƣợc chỉ có chứa glucose và NH4 +. Đa số trong chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin) và các acid amin. Vì thế ngƣời ta thƣờng nuôi cấy chúng trên các môi trƣờng phức tạp chứa một số lƣợng tƣơng đối lớn cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí máu. Một số loài vi khuẩn lactic có những nhu cầu về yếu tố tăng trƣởng chính xác hơn động vật hữu nhũ [25]. 2.4.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng carbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc nhiều carbohydrate nhƣ glucose, fructose, maltose, saccharose…các nguồn carbon này dùng để cung cấp năng lƣợng và tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là nguồn thức ăn có ý nghĩa hàng đầu đối với sự sống của tế bào vi sinh vật [13]. Nguồn carbon tốt nhất là các loại đƣờng và ở mức độ nhỏ các đƣờng chứa nhóm rƣợu, còn polysaccharide thì thực chất không thể lên men. Tốc độ lên men các loại mono-, di- và oligosaccharide khác nhau đến mức có thể dùng tiêu chuẩn này để có thể phân biệt giữa các loài [2]. 2.4.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Đa số vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp đƣợc các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, chỉ có một số loài có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng. Tuy nhiên, để sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng thì ngoài nitơ dƣới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ: cao thịt, cao nấm men, pepton, casein…[13]. Bảng 2.3 Các acid amin cần thiết cho vi khuẩn lactic [34] L-Alanine Glycine L-Proline D-Alanine L-Histidine L-Serine L-Arginine L-Isoleucine L-Threonine L-Acid aspartic L-Leucine L-Tryptophan L-Cysteine L-Lysine L-Tyrosine L-Acid glutamic L-Phenylalanine L-Valine 13 2.4.1.3. Nhu cầu về vitamin Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển và các vitamin này đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp đƣợc vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ: riboflavin, tiamin, biotin. Bảng 2.4 Các vitamin và các yếu tố có liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn lactic [34] Yếu tố phát triển Các sinh vật đại diện mà đòi các hợp chất cho sự phát triển p-Acid aminobenzoic Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus Biotin Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Acid folic (Acid pteroylglutamic) Lactobacillus casei Streptococcus faecalis Acid folinic (acid leucovorin, 5-Formyl- 5,6,7,8-tetrahydropteroylglutamic) Leuconostoc citrovorum Acid lipoic (Acid thioctic, yếu tố thay thế acetat, protogen) Lactobacillus casei Streptococcus lactis Acid nicotinic Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Acid pantothenic Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Pantetheine hoặc pantethine Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Riboflavin Lactobacillus casei Streptococcus lactis Thiamine Lactobacillus fermenti Streptococcus lactis Pyridoxal Lactobacillus casei Pyridoxamin Streptococcus faecalis Pyridoxamin phosphat Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus lactis Vitamin B12 Lactobacillus lactis Lactobacillus leichmannii 14 2.4.1.4. Nhu cầu về các chất hữu cơ Ngoài các nguồn dinh dƣỡng trên, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của chúng nhƣ purine, pyrimidine. Acid hữu cơ nhƣ acid acetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác. Tween 80 là một dẫn xuất của acid oleic, là một loại acid hữu cơ quan trọng có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của hầu hết các loại vi khuẩn lactic. Ngoài ra các acid béo cũng ảnh hƣởng lên sinh trƣởng của các vi khuẩn lactic nhƣng cơ chế còn chƣa đƣợc biết rõ [2]. 2.4.1.5. Nhu cầu các muối vô cơ Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ. Phosphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu. Các muối amôn không thể đƣợc dùng làm nguồn nitơ duy nhất song hình nhƣ chúng gây một ảnh hƣởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Fe2+, Mg2+ có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic [13]. Sự vắng mặt glucose thì Mg2+ không ảnh hƣởng đến sự ổn định của Lactobacillus delbrueckii nhƣng khi có glucose thì nó làm ổn định quá trình thủy phân (Rees và Pirt, 1979). Cơ chế của sự ổn định này chƣa đƣợc xác định, nhƣng tất cả các các trình tự thủy phân của kinase xem Mg2+ nhƣ là đồng nhân tố. Sự đòi hỏi Mg2+ bởi Lactobacillus delbrueckii không thể thay thế bằng Mn2+ [23]. 2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic thì thƣờng sử dụng môi trƣờng: MRS (de Man, Rogosa and Sharpe), môi trƣờng cà chua, môi trƣờng cao nấm men, môi trƣờng rau cải, môi trƣờng cà chua - Tween 80, môi trƣờng nấm men - glucose, môi trƣờng nhũ thanh, môi trƣờng sữa. Tùy theo từng loại và thành phần môi trƣờng mà áp dụng phƣơng pháp xử lý cho thích hợp. Thiết bị lên men dùng để lên men trong phòng thí nghiệm là bình erlen hoặc fermentor cỡ nhỏ có gắn các thiết bị kiểm soát các thông số có liên quan. Dù ta sử dụng môi trƣờng, thiết bị lên men nào cũng phải đảm bảo điều kiện vô trùng, công đoạn này quyết định hiệu quả của quá trình lên men. 2.4.2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dƣỡng. Nguồn năng lƣợng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lƣợng do trao đổi chất với môi trƣờng bên ngoài. Để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trƣờng dinh dƣỡng làm nguồn carbon 15 (chủ yếu là đƣờng lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các nguyên tố vi lƣợng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dƣỡng trên với liều lƣợng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men. 2.4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hƣởng tới sinh trƣởng. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng manh. 2.4.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giới hạn pH nhất định của môi trƣờng nuôi cấy. Với vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trƣờng thƣờng không ảnh hƣởng đến các sản phẩm đặc trƣng của quá trình lên men, còn đối với vi khuẩn lactic dị hình, pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến việc tạo thành các sản phẩm lên men. Khi pH môi trƣờng cao thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic, còn khi pH môi trƣờng thấp thì ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm phụ khác. Acid mới tạo thành phải đƣợc trung hòa liên tục. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ƣu phải nằm giữa 5,5 và 6,0. Lên men bị ức chế mạnh ở pH = 5 và sẽ dừng lại ở các pH dƣới 5 [2]. Khi acid lactic đƣợc hình thành và nồng độ tăng dần trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm và nồng độ acid lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức chế vi khuẩn lactic [15]. 2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu đƣợc acid, tuy nhiên với lƣợng acid tích lũy trong môi trƣờng ngày càng một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thƣờng không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng tạo ra ức chế, ngƣời ta cho vào môi trƣờng các chất đệm thích hợp với một lƣợng đủ để trung hòa lƣợng acid sinh ra thông thƣờng chất đệm này là CaCO3. 2.4.2.5. Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Trong quá trình lên men tạo sinh khối thƣờng dựa trên cơ sở nuôi cấy một chủng thuần khiết, vì vậy việc đảm bảo cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ giữ giống trong ống nghiệm, nhân giống trong bình erlen…đều phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Hệ vi sinh vật tạp mhiễm, thƣờng ảnh hƣởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành các sản phẩm lên men. 16 2.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic và acid lactic Vi khuẩn lactic và acid lactic ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ trong bảo quản và chế biến thực phẩm, y học, môi trƣờng, mỹ phẩm.v.v. Nhƣng nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm… 2.5.1. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm [17] [19] Vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để lên men thu nhận acid lactic. Acid lactic sản xuất công nghiệp đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Do vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản, một lƣợng lớn acid lactic đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Acid lactic đƣợc sử dụng nhƣ là một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt, sirô. Ngoài ra, acid lactic còn đƣợc dùng để acid hóa rƣợu vang và hoa quả nghèo acid, acid hóa dịch đƣờng hóa trong công nghiệp sản xuất rƣợu mạnh và để sản xuất bột chua trong ngành bánh mì. - Ứng dụng để sản xuất dƣa chua Quá trình muối chua rau, quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Trong quá trình phát triển của chúng, trong rau quả, khi lên men sẽ tạo ra acid lactic và acid acetic cùng một số loạt acid hữu cơ khác. Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tƣợng gây thối rau, quả. Mặt khác nhờ có lƣợng acid hữu cơ đƣợc tạo thành sẽ làm tăng hƣơng vị của khối ủ chua rau, quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản [9]. - Ứng dụng để làm chua quả Trƣớc đây, ngƣời ta thƣờng sử dụng acid acetic để ngâm chua quả. Sau này ngƣời ta sử dụng acid lactic để ngâm chua quả. Phƣơng pháp thay thế này tỏ ra hiệu quả vì chúng ít làm thay đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo chất lƣợng quả ngâm chua. - Ứng dụng trong sản xuất tƣơng Sản xuất tƣơng theo phƣơng pháp của miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả nƣớc đậu sau khi rang. Quá trình ngả nƣớc đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hƣơng vị cho sản phẩm. 17 - Ứng dụng trong sản xuất đậu phụ Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu. Phƣơng pháp truyền thống thƣờng làm là dùng nƣớc chua (chứa vi khuẩn lactic) để tạo kết tủa (nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành). - Ứng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic. Nhờ có quá trình chuyển hóa đƣờng thành acid lactic mà casein đƣợc kết tủa và tạo cho sản phẩm hƣơng vị đặc trƣng. Hippocrates, ngƣời đƣợc xem là cha đẻ của ngành y đã cho rằng “Whey”, loại nƣớc xuất hiện khi tách bơ ra khỏi sữa chính là một dạng huyết thanh của sữa. Trong “Whey” chiếm khoảng 4,5% đƣờng sữa. Trong ruột chất đƣờng này biến thành acid lactic, một chất hỗ trợ cho loại vi khuẩn lành mạnh trong ruột phát triển [28]. - Ứng dụng để ủ thức ăn gia súc Về nguyên tắc, ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng giống nhƣ công nghệ sản xuất dƣa chua. Quá trình lên men lactic xảy ra làm gia tăng giá trị dinh dƣỡng và khả năng bảo quản cỏ, lá cây cho gia súc. 2.5.2. Trong y học - Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đƣờng ruột Thực ra việc ứng dụng này đã đƣợc Việt Nam ứng dụng từ lâu. Khi ngƣời ta bị tiêu chảy, thầy thuốc khuyên hàng ngày uống 1 - 2 chén nƣớc dƣa chua. Phƣơng pháp này tỏ ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dƣợc chƣa phát triển. Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đƣa ra thị trƣờng từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên là Biolactyl. Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic. - Ứng dụng acid lactic theo phƣơng pháp chữa vi lƣợng đồng cân (homeopathy) Trong quá trình vận động của cơ thể, mô cơ hoạt động mạnh và trong một thời gian dài sẽ gây hiện tƣợng mệt mỏi. Hiện tƣợng mệt mỏi này xuất hiện do các phản ứng sinh hóa xảy ra trong mô cơ, tạo acid lactic. Các thầy thuốc đã tạo ra một vị thuốc bao gồm acid lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi và có khả năng làm việc và hoạt động liên tục trong thời gian dài. 18 - Ứng dụng acid lactic trong phẫu thuật chỉnh hình Trong phẫu thuật chỉnh hình, ngƣời ta thƣờng sử dụng loại vật liệu có tên là purasorb. Purasorb là một hợp chất cao phân tử đƣợc sản xuất từ acid lactic. Thành phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, polylactides, polyglycolide, lactide/glycolide copolyme. Purasorb đƣợc sử dụng nhƣ những định ghim, gắn phần xƣơng lại với nhau; khi xƣơng định hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy [9]. Một loại thanh dẫn có thể mang 20 lớp thuốc khác nhau vừa đƣợc các chuyên gia Singapore sáng chế. Đây là loại thanh dẫn tự tiêu đầu tiên trên thế giới giúp ngƣời bệnh tim mau chóng bình phục đồng thời giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng và phát bệnh trở lại. Các nhà phát minh thuộc Đại học Công nghệ Nanyang cho rằng, với loại thanh dẫn này, bác sĩ có thể kết hợp nhiều loại thuốc phù hợp với từng loại bệnh trạng của từng ngƣời để tăng hiệu quả điều trị. Khi đƣợc đƣa vào cơ thể, thanh dẫn sẽ nhả thuốc vào từng thời điểm khác nhau kéo dài trong nhiều tháng. Khi hết thuốc nó sẽ tự hủy hoàn toàn. Thanh dẫn đƣợc chế tạo bằng PLA và PLGA, khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành acid lactic và có thể hấp thụ vào máu. Không chỉ đƣợc sử dụng trong động mạch vành tim, loại thanh dẫn tự hủy này có thể đƣợc cấy trong não, phôi, đƣờng niệu hoặc bất kì cơ quan nào bị nghẽn mạch máu. Đƣợc biết, các loại thanh dẫn hiện nay đều làm bằng kim loại và chỉ mang đƣợc một loại thuốc duy nhất, có thể gây tụ huyết khối và làm mạch máu tắc nghẽn trở lại [26]. - Ứng dụng acid lactic trong nha khoa [9], [22] Trong nha khoa có hai chế phẩm đƣợc sử dụng nhiều đó là Puramex và puracal. Puramex bao gồm các thành phần sau: amulinium lactat, Fe-lactat (đƣợc sử dụng để điều trị thiếu máu), Mg-lactat, Mn-lactat, Zn-lactat còn puracal chỉ có lactat canxi. Các chế phẩm này thƣờng làm răng khỏe hơn. - Ứng dụng để sản xuất vật liệu sinh học (Biomaterials) Các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic. Các copolyme này có tính năng rất giống những bộ khung xƣơng động vật. Hƣớng này đang đƣợc nghiên cứu và ngƣời ta hy vọng trong tƣơng lai nó sẽ đƣợc ứng dụng nhiều. - Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi Ngƣời ta thƣờng bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dƣỡng, bánh ngọt, bánh nƣớng để tăng lƣợng canxi cho cơ thể [9]. Thiếu calci lại ảnh hƣởng đến 19 hoạt động của cơ tim, tới sự tạo huyết và đông máu, là nguyên nhân của bệnh còi xƣơng ở trẻ em và giòn xƣơng xốp xƣơng ở ngƣời già [27]. 2.5.3. Trong môi trường Các phòng thí nghiệm đang nghiên cứu loại chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo củ khó phân hủy. Chất dẻo mới này là một loại polyme đƣợc gọi là poly acid lactic (PLA). Đó là sản phẩm tạo ra từ phản ứng trùng hợp acid lactic. Ngƣời ta hy vọng trong tƣơng lai nó sẽ thay thế chất dẻo đƣợc sản xuất từ dầu mỏ vì tính chất dễ phân hủy của nó có ý nghĩa rất lớn trong bảo vệ môi trƣờng [9]. 2.5.4. Trong mỹ phẩm [9][22] Các loại lactat kim loại (chẳng hạng nhƣ lactat natri) đƣợc sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da nhƣ punosal và của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [9]. 2.6. Sản xuất acid lactic 2.6.1. Mật rỉ đường [1], [8], [12] Là phế liệu chứa nhiều đƣờng không kết tinh trong sản xuất đƣờng từ mía hoặc củ cải đƣờng. Thông thƣờng tỉ lệ rỉ đƣờng trong sản xuất đƣờng mía chiếm khoảng 3 – 5 % trọng lƣợng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất đƣờng.v.v. Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: Nƣớc chiếm 15 – 20 %; chất khô chiếm 80 – 85 %. Trong chất khô có 60 % là đƣờng (40 % là đƣờng saccharose và 20 % là fructose và glucose) và 40 % chất khô còn lại là chất không phải là đƣờng (phi đƣờng). Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30 – 32 % hợp chất hữu cơ và 6 – 10 % hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có K2O: 3,5 %; Fe2O3: 0,2 %; MgO: 0,1 %; sulfat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; SiO2: 0,5 %; P2O5: 0,5 %; Clorit: 0,4 %. Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leuxin, isoleuxin [2]. Ngoài ra trong rỉ đƣờng có một số vitamin (tính theo μ/g mật rỉ đƣờng ) nhƣ sau: 20 Bảng 2.5 Thành phần vitamin trong rỉ đƣờng Các vitamin Số lƣợng (μg/g) Thiamin Riboflavin Acid nicotinic Acid folic Pyridoxin Biotin Acid pantotenic 8,3 2,5 21,0 0,038 6,5 12,0 21,4 2.6.2. Qui trình sản xuất acid lactic [14] Acid lactic tinh thể Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch acid lactic Vi khuẩn CaCO3 H2SO4 Kết tinh Cô đặc 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005 3.1.2. Địa điểm Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu - Chế phẩm Biolactyl của Pháp - Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc - Đại mạch của trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH, máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nƣớc và bếp điện. - Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống nghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman. 3.2.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trƣờng MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36] - Môi trƣờng MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) - Môi trƣờng YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] - Môi trƣờng thử khả năng lên men đƣờng [11] - Môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng - Môi trƣờng thử khả năng phân giải gelatin - Môi trƣờng thạch bán lỏng di động - Môi trƣờng thử khả năng sinh indol Thành phần và tỉ lệ môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày ở mục 1 phần phụ lục. 22 3.2.5.Thuốc nhuộm và thuốc thử - Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] - Thuốc nhuộm Gram [11] - Thuốc thử uphenmen [11] - Thuốc thử DNS [10] - Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử đƣợc trình bày ở mục 2 phần phụ lục. 3.3. Phương pháp thí nghiệm 3.3.1. Phân lập và sơ chọn giống 3.3.1.1. Quan sát đại thể - Môi trƣờng MRS agar và YGC agar + Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc. Giống phân lập trên môi trƣờng YGC agar, CaCO3 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh khuẩn lạc. + Thực hiện * Pha loãng mẫu trong nƣớc cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau. * Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trƣờng MRS agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ. * Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trƣờng YGC agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. - Môi trƣờng MRS broth Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trƣởng trong 24 giờ. 3.3.1.2. Quan sát vi thể Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ở mục 3.2 phần phụ lục). 3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31] - Thực hiện + Cấy vi khuẩn đã phân lập đƣợc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C trong 24 giờ. + Li tâm thu dịch trong. 23 + Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi màu. Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng: + Ống 1: 5 ml môi trƣờng MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. + Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. 3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11] - Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên men có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein. - Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục) 3.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 3.3.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng - Ảnh hƣởng pH Điều chỉnh pH môi trƣờng bằng CH3COOH và NaOH sao cho pH ban đầu là : 4, 5, 6, 7 (pH sau khi khử trùng ). Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % cao nấm men). Nuôi cấy ở 37o C. Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng với các độ pH khác nhau. Chọn pH thích hợp cho sự tích lũy acid của các khuẩn lạc. - Ảnh hƣởng nhiệt độ Sau khi chọn đƣợc pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37o C, 45 o C, 50 o C. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dich nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ mật rỉ Chọn đƣợc pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ nhƣ trên và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ giống Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ. Khảo sát tỉ lệ giống: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy tỉ lệ giống nhƣ trên cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng thời gian Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời 24 điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. 3.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa - Thử phản ứng catalase - Kiểm tra khả năng sinh indol - Xem khả năng di động - Khả năng khử nitrate - Khả năng phân giải gelatin - Khả năng đông vón sữa - Khả năng lên men nguồn carbohydrate Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục) 3.3.5. So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D - Môi trƣờng cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. - Môi trƣờng cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. - Môi trƣờng sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. 3.3.6. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 3.3.6.1. Định lượng đường khử [10] + Nguyên tắc: Có một vài tác nhân đƣợc sử dụng để định lƣợng đƣờng nhờ các đặc tính khử của đƣờng. 3,5 - dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino - 5 - nitrosalicylic có màu đỏ cam. + Thực hiện: (xem mục 3.3 phần phụ lục) 3.3.6.2. Định lượng vi sinh vật [16] - Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Cách tiến hành: (xem mục 3.4 phần phụ lục) - Thiết lập mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm của dịch huyền phù tế bào. 25 + Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Nhƣ vậy, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lƣợng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy. + Tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ đƣợc suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo ở bƣớc sóng 610 nm. + Thực hiện * Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu đƣợc dịch huyền phù có các giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. * Đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng ứng với 5 giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. * Dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x). 3.3.6.3. Qui trình sản xuất Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch H2SO4 Vi khuẩn CaCO3 H2SO4 Dung dịch acid lactic Than hoạt tính 26 - Chuẩn bị môi trƣờng lên men Trƣớc tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H2SO4 vào với tỉ lệ 3,5 ml H2SO4 trong 1000 ml mật rỉ. Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu đƣợc phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5 % cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ƣu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic). - Giai đoạn lên men + Chuẩn bị giống để lên men * Giống cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. * Giống cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. * Giống sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. + Cho 10 % giống sản xuất vào môi trƣờng chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ƣu trong thời gian 7 ngày. - Giai đoạn tạo lactat canxi Trong thời gian lên men, lƣợng acid tạo ra liên tục nên ta phải trung hòa bằng CaCO3 để cho pH ổn định cho khuẩn lạc đó. Sau khi kết thúc quá trình lên men, loại bỏ dịch trên, thu đƣợc phần lactat canxi. Đem trung hòa lƣợng lactat canxi bằng H2SO4 , thu đƣợc phần dịch, đem lọc bằng than hoạt tính thu đƣợc dung dịch acid lactic. 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và sơ chọn giống 4.1.1. Quan sát đại thể 4.1.1.1. Môi trường MRS agar và YGC agar Từ các nguồn: Biolactyl, Antibio, Đại mạch, quá trình phân lập và làm thuần đƣợc 3 dạng khuẩn lạc sinh acid. Ký hiệu A, B, D. Khuẩn lạc A phân lập từ Antibio, khuẩn lạc B từ Biolactyl và khuẩn lạc D từ Đại mạch. Các khuẩn lạc trên đƣợc phân biệt dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích thƣớc của khuẩn lạc. - Trên môi trƣờng MRS agar + Khuẩn lạc A: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: màu trắng sữa, bóng ƣớt, bề mặt phẳng, hơi nhô lên, đƣờng kính khuẩn lạc 1,1 mm. Hình 4. 1: Hình dạng khuẩn lạc A + Khuẩn lạc B: Đƣợc ủ 48 giờ ở 50o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, láng bóng, vun tròn và mép khuẩn lạc có bề phẳng và nhẵn bóng, đƣờng kính khuẩn lạc 1,4 mm. Hình 4. 2: Hình dạng khuẩn lạc B 28 + Khuẩn lạc D: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, màu trắng sữa, bóng ƣớt, đƣờng kính khuẩn lạc 0,5 mm. Hình 4. 3: Hình dạng khuẩn lạc D - Trên môi trƣờng YGC agar Khả năng tạo acid làm tan CaCO3 của 3 khuẩn lạc nhƣ sau: Hình 4. 4: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc A Hình 4. 5: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc B Hình 4. 6: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc D 29 Từ hình 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vòng trong suốt rộng nhất, kế đến khuẩn lạc D, cuối cùng khuẩn lạc B. Do khuẩn lạc A, B và D có khả năng chuyển hóa đƣờng thành acid nên phân giải CaCO3 trong môi trƣờng tạo nên vòng trong suốt. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. 4.1.1.2. Môi trường MRS broth Sau khi nuôi vi khuẩn trên môi trƣờng MRS dịch thể chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 7: Khả năng phát triển trong môi trƣờng MRS dịch thể của các khuẩn lạc A, B và D. Từ hình 4.7 chúng tôi thấy: Khuẩn lạc A: Làm đục môi trƣờng, lắng nhiều sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc B: Làm đục môi trƣờng, lắng ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc D: Làm đục môi trƣờng, lắng rất ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Do khuẩn lạc A thích nghi nhanh trên môi trƣờng MRS, phát triển tốt cho nên tạo sinh khối nhiều hơn khuẩn lạc B và D. 4.1.2. Quan sát vi thể Sau khi tiến hành nhuộm Gram của các khuẩn lạc A, B và D chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 8: Nhuộm Gram của khuẩn lạc A, xem ở vật kính x 100 30 + Khuẩn lạc B: Tế bào hình que, tạo chuỗi dài, Gram dƣơng, không sinh bào tử Hình 4. 9: Nhuộm Gram của khuẩn lạc B, xem ở vật kính x 100 + Khuẩn lạc D: Tế bào hình cầu, đơn hoặc đôi, Gram dƣơng, không sinh bào tử. Hình 4. 10: Nhuộm Gram của khuẩn lạc D, xem ở vật kính x 100 4.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic Sau khi tiến hành định tính acid lactic bằng thuốc thử uphenmen chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Hình 4. 11: Khả năng sinh acid lactic, làm đổi màu thuốc thử uphenmen Từ hình 4.11 chúng tôi thấy màu của khuẩn lạc A, B và D giống với màu của acid lactic tinh khiết, khác với màu của môi trƣờng là do cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng tạo acid lactic, khi kết hợp với thuốc thử uphenmen thì chuyển từ màu xanh dƣơng đậm sang vàng. 31 4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 4.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng Sau khi khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống, thời gian. Chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: 4.3.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự tạo acid tổng Bảng 4. 1: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 1,53 5 37 10 10 24 2,88 6 37 10 10 24 10,17 7 37 10 10 24 9,36 Qua bảng 4.1 chúng tôi thấy khuẩn lạc A tạo acid tổng nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn tối ƣu cho khuẩn lạc A. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 45 10 10 24 1,08 5 45 10 10 24 1,98 6 45 10 10 24 7,65 7 45 10 10 24 5,67 Qua bảng 4.2 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc B. Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 2,25 5 37 10 10 24 13,59 6 37 10 10 24 12,51 7 37 10 10 24 9,45 32 Từ bảng 4.3 chúng tôi thấy ở pH = 5 lƣợng acid tổng nhiều nhất nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc D pH = 5. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 Biểu đồ 4.1Ảnh hƣởng pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc: A, B và D 4.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 6 10 10 24 7,29 37 6 10 10 24 14,04 45 6 10 10 24 9,36 50 6 10 10 24 1,37 Qua bảng 4.4 lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc A: 37o C. Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 6 10 10 24 2,07 37 6 10 10 24 4,59 45 6 10 10 24 7,83 50 6 10 10 24 6,3 33 Từ bảng 4.5 chúng tôi thấy ở nhiệt độ 45o C thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn n