Nghiên cứu quá trình phân tích hàm lượng Cabaryl Dimethoate VIT C trong cải bắp

LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ii LÔØI CAÛM ÔN Hôn boán naêm ngoài treân gheá giaûng ñöôøng ñaïi hoïc, vaø ñaëc bieät laø khoaûng thôøi gian laøm luaän vaên toát nghieäp vöøa qua ñaõ giuùp cho em raát nhieàu trong vieäc phaùt trieån khaû naêng hoïc taäp nghieân cöùu cuõng nhö laø reøn luyeän nhaân caùch cuûa mình. Ñeå coù ñöôïc nhöõng ñieàu naøy, em xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh nhaát ñeán taát caû caùc quyù thaày coâ trong tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa, vaø ñaëc bieät laø caùc thaày coâ trong Boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm, nhöõng ngöôøi ñaõ giaûng daïy vaø chæ baûo taän tình cho em trong suoát thôøi gian qua. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc nhaát ñeán thaày Ngoâ Maïnh Thaéng vaø thaày Hoaøng Minh Nam ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo ñeå em coù theå hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Traân troïng caûm ôn Ths.Ñoaøn Taán Vinh, giaùm ñoác coâng ty VIPESCO ñaõ hoã trôï hoaït chaát Dimethoate. Trung taâm noâng döôïc thuoäc coâng ty VIPESCO ñaõ phaân tích ñoái chöùng moät soá maãu Dimethoate töø dòch trích rau. Con xin caûm ôn boá meï ñaõ nuoâi döôõng chaêm lo, ñoäng vieân cho con ñeå con coù theå hoaøn thaønh toát nhieäm vuï cuûa mình. Toâi xin göûi lôøi caûm ôn ñeán taát caû baïn beø toâi, nhöõng ngöôøi luoân gaén boù, giuùp ñôõ toâi raát nhieàu trong hoïc taäp cuõng nhö trong cuoäc soáng. Tp HCM, ngaøy 05 thaùng 01 naêm 2008 Sinh vieân Ñinh Thò Thu Haèng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP iii TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN Luaän vaên ñaõ nghieân cöùu quy trình phaân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C trong caûi baép vôùi thieát bò HPLC. Cuï theå: Ñoái vôùi Carbaryl, Dimethoate: Tieán haønh queùt phoå haáp thu böôùc soùng UV -VIS cuûa Carbaryl, Dimethoate trong dung dòch. Löïa choïn pha ñoäng vôùi tyû leä Axetonitril/nöôùc thích hôïp ñeå phaân tích Carbaryl, Dimethoate. Xaây döïng ñöôøng chuaån xaùc ñònh haøm löôïng Carbaryl, Dimethoate trong dung dòch vôùi böôùc soùng haáp thu cöïc ñaïi vaø tyû leä Axetonitril/nöôùc ñaõ choïn. Khaûo saùt, caûi thieän quy trình trích ly Carbaryl, Dimethoate trong caùc maãu rau caûi baép. ÖÙng duïng quy trình trích ly xöû lyù vaø phaân tích haøm löôïng Carbaryl, Dimethoate ñeå xaùc ñònh dö löôïng trong maãu rau mua ôû chôï vaø hieäu suaát phaân huyû Carbaryl trong caûi baép sau quaù trình chieáu xaï. Ñoái vôùi Vitamin C: Tieán haønh queùt phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong dung dòch. Xaây döïng ñöôøng chuaån xaùc ñònh haøm löôïng Vitamin C trong dung dòch vôùi böôùc soùng haáp thu cöïc ñaïi ñaõ xaùc ñònh. Khaûo saùt ñoä thu hoài cuûa quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP iv MUÏC LUÏC Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU................................................................................................................1 Chöông 2: TOÅNG QUAN......................................................................................................... 3 2.1. Thuoác baûo veä thöïc vaät: [1, 4, 7].................................................................................... 3 2.1.1. Ñònh nghóa: .............................................................................................................. 3 2.1.2. Phaân loaïi:................................................................................................................. 3 2.1.3. Caùch taùc ñoäng cuûa thuoác leân dòch haïi: .................................................................. 3 2.1.5. Dö löôïng thuoác treân caây troàng vaø noâng saûn: [7] .................................................. 4 2.1.6. Tình hình söû duïng thuoác BVTV: [9, 20] ................................................................ 4 2.1.7. Tình hình ngoä ñoäc thuoác BVTV: [20] .................................................................... 5 2.2. Thuoác tröø saâu Carbaryl: ............................................................................................. 5 2.2.1. Đặc tính sinh học. Ứng dụng. [1] ............................................................................ 5 2.2.2. Tính chaát lyù hoùa: [4] ............................................................................................... 5 2.2.3. Ñoäc tính: [4] ............................................................................................................ 6 2.3. Thuoác tröø saâu Dimethoate:........................................................................................... 7 2.3.1. Ñaëc tính sinh hoïc. ÖÙng duïng. [1] ........................................................................... 7 2.3.2. Tính chaát lyù hoùa: ..................................................................................................... 7 2.3.3. Ñoäc tính: [4] ............................................................................................................ 9 2.4. Caûi baép: .......................................................................................................................... 9 2.5. Vitamin C: [15, 18, 17, 19]........................................................................................... 11 2.5.1. Giôùi thieäu chung veà Vitamin C: [15] ................................................................... 11 2.5.2. Tính chaát vaät lyù: [18] ............................................................................................ 11 2.5.3. Tính chaát hoaù hoïc: [18] ........................................................................................ 12 2.5.4. Nguoàn goác: [15] ..................................................................................................... 12 2.5.4. Vai troø cuûa Vitamin C : [17] ................................................................................ 12 2.6. Phöông phaùp phaân tích HPLC: [8]............................................................................. 13 2.6.1. Phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp:......................................................................... 13 2.6.2. Heä thoáng thieát bò saéc kyù loûng cao aùp: .................................................................. 15 2.7. Caùc phöông phaùp phaân tích Vitamin C: [10, 11, 12] ................................................. 18 2.7.1. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp HPLC ................................................. 18 2.7.2. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp chuaån ñoä:............................................ 18 2.7.3. Phöông phaùp so maøu:............................................................................................ 19 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP v 2.7.4. Phöông phaùp söû duïng enzim: ............................................................................... 20 2.8. Phöông phaùp phaân tích thuoác tröø saâu: [7]................................................................. 21 Chöông 3: MOÂ TAÛ THÖÏC NGHIEÄM .................................................................................. 22 3.1. Hoùa chaát vaø thieát bò söû duïng....................................................................................... 22 3.1.1. Hoùa chaát: ............................................................................................................... 22 3.1.2. Thieát bò: ................................................................................................................. 22 3.2. Khaûo saùt phoå haáp thu UV-VIS Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C. ......................... 23 3.3. Thieát laäp caùc thoâng soá cho heä thoáng HPLC............................................................... 23 3.4. Khaûo saùt thaønh phaàn pha ñoäng phaân tích hai chaát Carbaryl vaø Dimethoate......... 24 3.5. Xaây döïng caùc ñöôøng chuaån cuûa caùc chaát phaân tích .................................................. 24 3.6. Xaùc ñònh ñoä thu hoài maãu qua coät cuûa moãi chaát öùng vôùi ñieàu kieän choïn phaân tích. 24 3.7. Khaûo saùt caùc baäc trích ly Carbaryl, Dimethoate vaø xaùc ñònh hieäu suaát thu hoài qua caùc baäc................................................................................................................................. 25 3.7.1. Löïa choïn quy trình trích ly ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate............................ 25 3.7.2. Khaûo saùt hieäu suaát trích ly dòch Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc qua caùc baäc trích ly....................................................................................................................... 27 3.7.3 Khaûo saùt ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate treân maãu caûi baép ..................................................................................................................... 27 3.8. ÖÙng duïng quy trình phaân tích Carbaryl ñeå khaûo saùt söï phaân huûy Carbaryl trong caûi baép sau khi chieáu xaï lieàu thaáp. .................................................................................... 30 3.9. Khaûo saùt hieäu suaát thu hoài cuûa quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép. ........... 30 3.9.1. Quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép......................................................... 30 3.9.2. Khaûo saùt hieäu suaát trích ly ñoái vôùi quy trình trích ly Vitamin C trong caûi baép 30 Chöông 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN ............................................................................. 33 4.1. Kết quả khaûo saùt phoå haáp thu cuûa Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C:................... 33 4.1.1. Phoå haáp thu UV cuûa Carbaryl trong nöôùc. ......................................................... 33 4.1.2. Phoå haáp thu UV cuûa Dimethoate trong nöôùc. .................................................... 33 4.1.3. Phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong ñeäm:........................................................ 34 4.2. Keát quaû khaûo saùt pha ñoäng ñoái vôùi Carbaryl vaø Dimethoate .................................. 34 4.2.1. Keát quaû khaûo saùt pha ñoäng cuûa Carbaryl:.......................................................... 34 4.2.2. Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng thaønh phaàn pha ñoäng phaân tích Dimethoate ..... 35 4.3. Keát quaû xaây döïng ñöôøng chuaån Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C ........................ 36 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP vi 4.3.1. Ñöôøng chuaån cuûa carabryl trong dung dòch nöôùc: ............................................. 36 4.3.2. Ñöôøng chuaån Dimethoate trong dung dòch nöôùc: .............................................. 37 4.3.3. Ñöôøng chuaån dung dòch Vitamin C trong ñeäm:.................................................. 38 4.3. Keát quaû ñoä thu hoài maãu Carbaryl, Dimthoate vaø Vitamin C: ................................. 39 4.3.1. Ñoä thu hoài maãu Dimethoate qua coät: .................................................................. 39 4.3.2. Ñoä thu hoài qua coät cuûa Carbaryl: ........................................................................ 39 4.3.3.Ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C: ....................................................................... 40 4.4. Keát quaû khaûo saùt hieäu suaát trích ly dòch Carbaryl vaø Dimethoate trong nöôùc qua caùc baäc trích ly.................................................................................................................... 41 4.5. Keát quaû khaûo saùt ñoä thu hoài maãu cuûa quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate treân maãu caûi baép: ............................................................................................................... 42 4.5.1. Keát quaû ñoä thu hoài Carbaryl cuûa caûi baép ........................................................... 42 4.5.2. Keát quaû ñoä thu hoài Dimethoate cuûa caûi baép:...................................................... 44 4.6. Keát quaû khaûo saùt söï phaân huûy Carbaryl döôùi taùc duïng cuûa chieáu xaï: .................... 47 4.7. Keát quaû khaûo saùt ñoä thu hoài cuûa quy trình trích Vitamin C töø caûi baép: ................. 48 4.7.1. Ñoä thu hoài Vitamin C khi boå sung theâm chuaån vaøo rau: ................................... 48 4.7.2. Ñoä thu hoài Vitamin C khi boå sung vaøo dòch rau: ................................................ 50 Chöông 5: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ ........................................................................... 52 5.1 Keát luaän: ....................................................................................................................... 52 5.2. Kieán nghò:..................................................................................................................... 52 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO .................................................................................................... 53 PHUÏ LUÏC ............................................................................................................................... 55 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP vii DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Baûng 2.1: Moät soá tính chaát vaät lyù cuûa Carbaryl......................................................................... 6 Baûng 2.2: Ñoä tan cuûa Dimethoate trong moät soá dung moâi ôû 250C. ........................................... 8 Baûng 2.3: Ñoä tan trong nöôùc cuûa Dimethoate ôû 200C ............................................................... 9 Baûng 2.4: Thaønh phaàn caùc chaát dinh döôõng coù trong 100 g caûi baép: [20] .............................. 10 Baûng 2.5: Giôùi haïn dö löôïng thuoác tröø saâu trong caûi baép........................................................ 11 Baûng 2.6: Thaønh phaàn Vitamin C trong moät soá nguyeân lieäu thöïc phaåm................................. 12 Baûng 4.1: Dieän tích peak vaø thôøi gian löu cuûa Carbaryl ôû caùc pha ñoäng ................................ 35 Baûng 4.2: Dieän tích vaø thôøi gian löu cuûa Dimethoate ôû caùc pha ñoäng .................................... 35 Baûng 4.3: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Dimethoate: ....................................................................... 39 Baûng 4.4: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Carbaryl ............................................................................. 40 Baûng 4.5: Ñoä thu hoài qua coät cuûa Vitamin C........................................................................... 40 Baûng 4.6: Keát quaû khaûo saùt caùc baäc trích ly Dimethoate ........................................................ 41 Baûng 4.7: Keát quaû khaûo saùt caùc baäc trích ly Carbaryl ............................................................. 41 Baûng 4.8: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Carbaryl ................................................. 42 Baûng 4.9: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài Carbaryl theâm vaøo dòch ................................ 44 Baûng 4.10: Keát quaû ño maãu xaùc ñònh ñoä thu hoài cuûa Dimethoate........................................... 45 Baûng 4.11: Keát quaû ño maãu Dimethoate boå sung vaøo dòch sau loïc......................................... 45 Baûng 4.12: Keát quaû ño maãu boå sung Vitamin C...................................................................... 49 Baûng 4.13: Keát quaû ño maãu boå sung Vitamin C vaøo dòch ....................................................... 50 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP viii DANH MUÏC HÌNH VEÕ Hình 2.1: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Carbaryl ................................................................................ 5 Hình 2.2: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Dimethoate ........................................................................... 7 Hình 2.3: Caûi baép..................................................................................................................... 10 Hình 2.4: (a)-Acid Ascorbi, (b)-Acid Dehydroascorbic………………………………………....11 Hình 2.5: Coät saéc kyù ................................................................................................................ 16 Hình 2.6: Heä thoáng maùy saéc kyù loûng cao aùp ........................................................................... 17 Hình 2.7: OÁng daãn FIA söû duïng ñeå ñònh löôïng acid ascorbic baèng phöông phaùp quang phoå. 20 Hình 3.1: Sô ñoà quy trình trích ly Carbaryl vaø Dimethoate………………………………………………………………….26 Hình 3.2: Sô ñoà trích ly 3 baäc…………………………………………………………………………………………………………………………..28 Hình 3.3: Quy trình trích ly Vitamin C .................................................................................... 31 Hình 4.1: Phoå haáp thu UV cuûa dung dòch Carbaryl trong nöôùc ............................................... 33 Hình 4.2: Phoå haáp thu UV cuûa dung dòch chuaån Dimethoate trong Axetonitril: nöôùc............. 33 Hình 4.3: Phoå haáp thu UV cuûa Vitamin C trong dung dòch ñeäm………………………………………………………..34 Hình 4.4: Saéc kyù ñoà ño chuaån Carbaryl ôû noàng ñoä 10 ppm (a) vaø 5 ppm (b) .......................... 36 Hình 4.5: Ñöôøng chuaån phaân tích Carbaryl trong nöôùc ........................................................... 36 Hình 4.6: Saéc kyù ñoà ño chuaån Dimethoate ôû noàng ñoä 5 ppm (a) vaø 1 ppm (b) ....................... 37 Hình 4.7: Ñöôøng chuaån phaân tích Dimethoate trong dung dòch Axetonitril: nöôùc .................. 37 Hình 4.8: Saéc kyù ñoà ño chuaån Vitamin C 1ppm vaø 2 ppm....................................................... 38 Hình 4.9: Ñöôøng chuaån Vitamin C trong dung dòch ñeäm ........................................................ 38 Hình 4.10: Quy trình trích ly caûi baép……………………………………………………………………………………………………………..43 Hình 4.11: Hieäu suaát phaân huûy treân caûi baép ôû caùc lieàu chieáu khaùc nhau................................ 48 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 1 Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU Rau xanh laø nhu caàu khoâng theå thieáu trong cô caáu böõa aên haøng ngaøy cuûa con ngöôøi treân khaép haønh tinh. Ñaëc bieät khi löông thöïc vaø caùc thöùc aên giaøu ñaïm ñaõ ñöôïc ñaûm baûo thì yeâu caàu veà soá löôïng vaø chaát löôïng rau laïi caøng gia taêng. Rau khoâng chæ cung caáp moät löôïng chaát xô, caùc sinh toá A, B, C… maø coøn cung caáp caùc nguyeân toá vi löôïng vaø ña löôïng raát caàn thieát trong caáu taïo teá baøo. Coù nhieàu chuûng loaïi rau nhö rau aên laù (caûi baép, caûi xanh…), rau aên quaû (döa leo), rau aên cuû… [9]. Hieän nay, do muoán thu lôïi nhuaän cao neân ngöôøi noâng daân söû duïng raát nhieàu caùc loaïi thuoác tröø saâu, thuoác tröø beänh… goïi chung laø thuoác baûo veä thöïc vaät (BVTV) leân caùc loaïi rau ñeå taêng naêng suaát caây troàng. Caùc loaïi thuoác tröø saâu ñöôïc söû duïng roäng raõi trong noâng nghieäp nhaèm baûo veä muøa maøng khoûi söï phaù hoaïi cuûa coân truøng, trò caùc beänh treân thöïc vaät do coân truøng hoaëc caùc vaät kí sinh beân ngoaøi gaây ra. Tuy nhieân, vieäc söû duïng quaù lieàu vaø phun gaàn ngaøy thu hoaïch khieán cho löôïng thuoác toàn dö cao treân saûn phaåm sau khi thu hoaïch. Theo thoáng keâ, haøng naêm ôû mieàn Ñoâng – Nam nöôùc ta, toång löôïng thuoác baûo veä thöïc vaät söû duïng leân ñeán con soá 1000 taán, trong ñoù thuoác baûo veä thöïc vaät duøng treân rau raát lôùn chieám töø 50 – 80% toång löôïng thuoác duøng cho caùc loaïi caây troàng. Ñieàu ñoù gaây ra nhöõng moái nguy cho söùc khoûe con ngöôøi. Moät soá nôi ngöôøi söû duïng rau bò ngoä ñoäc xaûy ra ngaøy caøng nhieàu vaø phoå bieán. Vì vaäy ñeå ñaûm baûo an toaøn cho ngöôøi tieâu duøng rau, caàn thieát phaûi coù bieän phaùp quaûn lyù, kieåm soaùt caùc nguoàn rau cung caáp. Vaán ñeà xaùc ñònh dö löôïng thuoác tröø saâu coøn toàn ñoïng trong rau quaû coù chính xaùc thì môùi coù theå keát luaän ñuùng veà ñoä an toaøn cuûa rau ñem ñi kieåm tra. Nhö vaäy phöông phaùp phaân tích dö löôïng thuoác tröø saâu trong rau cuõng caàn nghieân cöùu ñeå coù theå phaân tích ñöôïc nhanh choùng vaø chính xaùc dö löôïng thuoác coù trong rau. Töø ñoù vaán ñeà kieåm soaùt nguoàn rau saïch cuõng ñôn giaûn vaø deã daøng hôn. Moãi phöông phaùp, qui trình phaân tích dö löôïng thuoác tröø saâu trong rau ñeàu bao goàm 2 phaàn chính: Taùch dö löôïng thuoác tröø saâu caàn phaân tích, vaø xaùc ñònh dö löôïng naøy vôùi thieát bò phaân tích phuø hôïp. Vôùi thieát bò saéc kyù loûng hieän coù ôû boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm, böôùc ñaàu ñaõ coù moät vaøi nghieân cöùu khaû naêng öùng duïng ñeå phaân tích dö löôïng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 2 Carbaryl, Dimethoat [5, 6] trong rau maø khoâng phaûi toán keùm nhieàu veà tieàn thueâ thieát bò phaân tích. Tuy nhieân, keát quaû ñaït ñöôïc coøn haïn cheá do ñoä thu hoài maãu cuûa giai ñoaïn trích ly töø rau vaø giai ñoaïn phaân tích qua coät HPLC coøn thaáp. Muïc tieâu cuûa luaän vaên naøy laø khaûo saùt khaû naêng caûi tieán qui trình trích ly Carbaryl, Dimethoat töø rau caûi baép baèng caùch naâng soá baäc trích ly nhaèm ñaït ñoä thu hoài caùc hoaït chaát ñoù töø rau cao hôn, töø ñoù laøm taêng ñoä chính xaùc, ñoä tin caäy cuûa keát quaû phaân tích dö löôïng hai chaát naøy trong rau. Beân caïnh ñoù caûi baép coù chöùa moät löôïng Vitamin C ñaùng keå neân cuõng caàn coù phöông phaùp ñònh löôïng chính xaùc haøm löôïng Vitamin C trong ñoù. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 3 Chöông 2: TOÅNG QUAN 2.1. Thuoác baûo veä thöïc vaät: [1, 4, 7] 2.1.1. Ñònh nghóa: Thuoác baûo veä thöïc vaät (BVTV) coøn goïi laø thuoác tröø dòch haïi hoaëc saûn phaåm noâng döôïc, bao goàm nhöõng cheá phaåm duøng ñeå phoøng tröø caùc sinh vaät gaây haïi taøi nguyeân thöïc vaät, caùc cheá phaåm coù taùc duïng ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät, caùc cheá phaåm coù taùc duïng xua ñuoåi hoaëc thu huùt caùc sinh vaät gaây haïi hoaëc taøi nguyeân thöïc vaät ñeán ñeå tieâu dieät. 2.1.2. Phaân loaïi: Theo ñoái töôïng phoøng tröø, ngöôøi ta phaân loaïi thuoác BVTV vaøo caùc nhoùm sau: - Thuoác tröø saâu - Thuoác tröø beänh - Thuoác tröø coû - Thuoác tröø chuoät - Thuoác tröø nheän - Thuoác tröø oác seân - Thuoác ñieàu tieát sinh tröôûng caây troàng 2.1.3. Caùch taùc ñoäng cuûa thuoác leân dòch haïi: Caùch taùc ñoäng laø ñöôøng xaâm nhaäp gaây haïi cuûa thuoác vaøo cô theå dòch haïi. Thuoác BVTV coù caùch taùc ñoäng chuû yeáu laø: - Tieáp xuùc: thuoác tröø saâu tieáp xuùc xaâm nhaäp vaøo cô theå saâu qua bieåu bì - Vò ñoäc: Laø taùc ñoäng cuûa thuoác khi xaâm nhaäp vaøo boä phaän tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät (coân truøng, chuoät, chim). Chaát ñoäc aên qua ñöôøng mieäng vaøo trong ruoät, hoøa tan vaøo trong dòch vò ôû daï daøy vaø ruoät giöõa, thaám qua thaønh ruoät vaø di chuyeån ñeán caùc cô quan trong cô theå ñeå gaây haïi. - Xoâng hôi: thuoác coù theå sinh ra khí, khoùi, muø coù taùc duïng dieät coân truøng, naám, vi khuaån, chuoät. Thuoác coù taùc ñoäng xoâng hôi coù theå duøng phun leân caây, xoâng hôi trong nhaø ôû, nhaø kho, kho taøng, nhaø kính, haøng hoùa hoaëc trong ñaát ñeå tieâu dieät caùc vi sinh vaät gaây haïi. Hôi thuoác ñoäc xaâm nhaäp qua loã thôû hoaëc tröïc tieáp tieâu dieät dòch haïi. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 4 - Noäi haáp (löu daãn): laø khaû naêng cuûa thuoác coù theå xaâm nhaäp vaø di chuyeån trong caây ñeå ñeå dieät dòch haïi baèng caùch tieáp xuùc hay vò ñoäc. - Thaám saâu: thuoác coù khaû naêng thaám qua caùc lôùp teá baøo bieåu bì caây ñeå gieát dòch haïi naèm döôùi lôùp bieåu bì, maø khoâng coù khaû naêng di chuyeån trong caây. 2.1.5. Dö löôïng thuoác treân caây troàng vaø noâng saûn: [7] Thuoác baûo veä thöïc vaät toàn taïi treân caây troàng vaø noâng saûn treân moät thôøi gian laø ñieàu caàn thieát ñeå baûo veä caây troàng vaø noâng saûn choáng laïi söï gaây haïi cuûa dòch haïi ôû treân ruoäng, trong quaù trình vaän chuyeån vaø baûo quaûn. Nhöng dö löôïng thuoác coù treân noâng saûn seõ laø nguoàn gaây haïi cho ngöôøi tieâu duøng. Dö löôïng thuoác coù theå goàm nhöõng chaát tan ñöôïc trong lipit, nhöng khoâng tan ñöôïc trong nöôùc, thöôøng toàn taïi ôû lôùp bieåu bì neân coù teân laø dö löôïng bieåu bì. Dö löôïng goàm nhöõng chaát tan trong nöôùc nhöng khoâng tan trong lipit, toàn taïi döôùi lôùp bieåu bì goïi laø dö löôïng noäi bì. Coøn dö löôïng laø nhöõng chaát khoâng tan caû trong lipit vaø nöôùc, naèm ôû phaàn ngoaøi bieåu bì mang teân dö löôïng ngoaïi bì. Dö löôïng thuoác thöôøng coù trong töïc phaåm vaø chuùng chæ gaây haïi khi vöôït ngöôõng cho pheùp. Dö löôïng thuoác BVTV ñöôïc tính baèng mg thuoác coù trong 1 kg noâng saûn. Dö löôïng toái ña cho pheùp (Maximum Residue Limit, vieát taét MRL): laø dö löôïng thuoác BVTV toái ña ñöôïc pheùp toàn taïi trong noâng saûn maø khoâng gaây ñoäc cho ngöôøi vaø vaät nuoâi khi söû duïng noâng saûn ñoù laøm thöùc aên. 2.1.6. Tình hình söû duïng thuoác BVTV: [9, 20] Vì muïc ñích baûo veä caây troàng, thuoác BVTV ñöôïc söû duïng ngaøy caøng roäng raõi vaø nhieàu. Theo moät soá ñieàu tra gaàn ñaây, ôû nöôùc ta noâng daân söû duïng khoaûng 28 loaïi thuoác tröø saâu, 19 loaïi thuoác tröø beänh khaùc nhau. Haàu heát noâng daân xem bieän phaùp hoaù hoïc laø caùch chuû yeáu ñeå phoøng tröø saâu beänh treân rau. Coù tôùi 43,8% noâng daân söû duïng thuoác coù ñoäc tính cao ñaõ caám söû duïng treân rau, 48,42% laïi khoâng ñaûm baûo thôøi gian caùch li an toaøn, coù khi chæ sau moät hoaëc hai ngaøy phun ñaõ mang ra chôï baùn. Keát quaû nghieân cöùu khaûo saùt veà dö löôïng thuoác baûo veä thöïc vaät vaø chaát baûo quaûn trong rau quaû naêm 2002 – 2003 cuûa TS Haø Thò Anh Ñaøo (Vieän Dinh döôõng quoác gia) vaø coäng söï [18] cho thaáy: Vôùi 240 maãu rau thu thaäp taïi caùc khu vöïc buoân baùn rau quaû lôùn ôû Haø Noäi vaø TP. Hoà Chí Minh, tæ leä rau quaû coù dö löôïng hoaù chaát laø 30,4%, vôùi caùc chaát Dimethoat, Diazinon, Cypermethin… Trong ñoù dö löôïng Dimethoat, Carbendazin, Cypermethin vuôït quaù giôùi haïn cho pheùp. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 5 2.1.7. Tình hình ngoä ñoäc thuoác BVTV: [20] Treân theá giôùi, haøng naêm coù treân 40000 ngöôøi cheát vì ngoä ñoäc rau teân toång soá 2 trieäu ngöôøi bò ngoä ñoäc (döïa theo thoáng keâ cuûa toå chöùa Lao ñoäng Quoác teá ILO). Tuy chöa coù thoáng keâ chính thöùc veà soá ngöôøi ngoä ñoäc do thuoác tröø saâu ôû nöôùc ta, nhöng theo nhöõng thoâng baùo töø nhöõng naêm qua veà caùc tröôøng hôïp ngoä ñoäc leû teû hay haøng loaït ôû töøng beänh vieän, töøng ñòa phöông cho thaáy soá ngöôøi ngoä ñoäc laø con soá ñaùng keå. Töø naêm 2000 ñeán thaùng 6 naêm 2003, coù nhieàu thoâng baùo veà ngöôøi bò nhieãm ñoäc do aên phaûi rau quaû coøn dö löôïng thuoác tröø saâu, naëng nhaát vaãn laø caùc tænh ñoàng baèng soâng Cöûu Long. Naêm 2005, coù 13000 ngöôøi nhieãm ñoäc vaø trong ñoù coù ñeán 354 ngöôøi cheát. Nguyeân nhaân ngoä ñoäc chuû yeáu laø aên phaûi thöïc phaåm coù löôïng thuoác tröø saâu chöa phaân huûy heát hoaëc thöïc phaåm coù söû duïng chaát ñoäc ñeå baøo quaûn, laøm haáp daãn veà hình thöùc vaø muøi vò … 2.2. Thuoác tröø saâu Carbaryl: 2.2.1. Đặc tính sinh học. Ứng dụng. [1] Carbaryl laø thuoác tröø saâu tieáp xuùc, vò ñoäc vaø noäi haáp nheï, vôùi phoå taùc ñoäng dieät tröø saâu beänh khaù roäng. Noù laø moät trong nhöõng thuoác tröø saâu hoï Carbamat laâu ñôøi nhaát (baét ñaàu söû duïng töø naêm 1956) nhöng ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát vaø thay theá thuoác tröø saâu clo höõu cô (Hieän nay thuoác tröø saâu nhoùm boâng cuùc söû duïng thay theá daàn nhoùm Carbamate). Thöôøng duøng ñeå tröø caùc loaøi saâu, raày haïi luùa, caây coâng nghieäp, caây aên quaû ..Noù ñöôïc ñaùnh giaù coù ñoä ñoäc trung bình, LD50 (caáp tính ñoái vôùi chuoät ñöïc) 850 mg/kg, LD50 (maõn tính) > 2000 mg/kg. Tuy nhieân, saûn phaåm gia coâng coù theå ñoäc hôn nhieàu, ví duï Tecyl 85 WP coù ñoä ñoäc loaïi I. Ñoäc vôùi ong. Khoâng tích luõy trong môõ. 2.2.2. Tính chaát lyù hoùa: [4] Coâng thöùc phaân töû: C12H11NO2. Coâng thöùc caáu taïo: Hình 2.1: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Carbaryl Khoái löôïng phaân töû: 201,22. Teân hoaù hoïc: 1-naphtol-N-metyl carbamate hoaëc 1-naphtyl-N-metyl carbamine. Teân thöông maïi vaø caùc teân khaùc: Sevin, Atoxan, Caprotin, Gamonil, Panam, Sevidol. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 6 Carbaryl 99% laø tinh theå maøu traéng coù ñieåm noùng chaûy 142oC, aùp löïc hôi 0,002 mmHg (40oC). Khoâng tan trong nöôùc, tan trong phaàn lôùn caùc dung moâi phaân cöïc nhö Axeton, Cyclohexanon. Baûn thaân beàn vôùi aùnh saùng vaø ñoä aåm, nhöng bò thuûy phaân trong moâi tröôøng kieàm maïnh thaønh α - naphtol vaø metylamin. Trong cô theå coân truøng, Carbaryl bò oxy hoùa thaønh 4-hydroxyCarbaryl, sau ñoù bò thaûi ra ngoaøi döôùi daïng lieân keát vôùi axít glucuronic. [4] Baûng 2.1: Moät soá tính chaát vaät lyù cuûa Carbaryl Phaân töû löôïng 201.2 ñvC Nhieät ñoä noùng chaûy 138 0C (ñoä tinh khieát 99.1%) Nhieät ñoä hoaù hôi 1930C Tæ troïng ôû 200C 1.232 Ñoä hoøa tan trong nöôùc 40 mg/l ôû 300C Hoøa tan trong caùc dung moâi höõu cô Acetone (200 - 300 g/kg), Methanol (79.6 g/kg), Dicloromethan (242.6 g/kg), Hexan (0.214g/kg). Ñoä oån ñònh - OÅn ñònh trong moâi tröôøng trung tính vaø acid yeáu nhöng deã daøng bò thuûy phaân trong moâi tröôøng kieàm taïo thaønh 1-naphthol - OÅn ñònh vôùi nhieät ñoä leân ñeán 700C vaø aùnh saùng. Khi bò gia nhieät ñeå phaân huûy noù taïo ra khoùi ñoäc NOx. 2.2.3. Ñoäc tính: [4] Thuoäc nhoùm ñoäc loaïi II, lieàu löôïng Carbaryl tieâu dieät 50% soá sinh vaät tieáp xuùc (LD50): LD50 qua mieäng 246-283 mg/kg, LD50 qua da > 2000 mg/kg; noàng ñoä Carbaryl tieâu dieät 50% soá sinh vaät tieáp xuùc (LC50): LC50 xoâng hôi > 6,08 mg/l. Carbaryl deã daøng ñöôïc haáp thuï qua ñöôøng hoâ haáp vaø ñöôøng mieäng, nhöng ít bò haáp thuï hôn qua tieáp xuùc vôùi da. Khi tieáp xuùc tröïc tieáp coù theå gaây boûng da hoaëc maét. Hít vaøo hay nuoát phaûi Carbaryl vôùi löôïng nhaát ñònh coù theå gaây ngoä ñoäc cho heä thaàn kinh, heä hoâ haáp, gaây ra caùc trieäu chöùng noân möûa, co thaét daï daøy, ñau ñaàu, hoân meâ, roái loaïn thaàn kinh, suy hoâ haáp, … Daáu hieäu nhieãm ñoäc taêng nhanh sau khi haáp thuï vaø cuõng LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 7 nhanh choùng keát thuùc sau khi khoâng coøn tieáp xuùc nöõa. Khi bò haáp thuï vaøo cô theå ngöôøi, noù seõ nhanh choùng ñöôïc baøi tieát ra theo nöôùc tieåu (baøi tieát khoaûng 91,5% trong voøng 24h). Carbaryl raát coù haïi cho con ngöôøi neáu vaøo mieäng (LD50 = 614 mg/kg theå troïng) vaø hít vaøo (LC50 = 2,43 mg/l). Carbaryl coù ñoä ñoäc qua da thaáp (LD50 > 5000 mg/kg theå troïng). 2.3. Thuoác tröø saâu Dimethoate: 2.3.1. Ñaëc tính sinh hoïc. ÖÙng duïng. [1] Dimethoate laø thuoác tröø saâu coù taùc duïng tieáp xuùc vaø löu daãn vôùi phoå taùc ñoäng roäng. Noù coøn coù taùc duïng tröø nheän. Ñoä ñoäc thaáp ñoái vôùi ñoäng vaät maùu noùng, LD50 185- 245 mg/kg, khoâng gaây chaùy laù. Do vaäy coù theå duøng Dimethoate trong nhieàu lónh vöïc: rau quaû, nguõ coác, chaên nuoâi…. Taïi Vieät Nam, Dimethoate vaãn ñöôïc söû duïng nhieàu. Thöôøng ôû daïng hoãn hôïp caùc thuoác BVTV khaùc. Tuy nhieân, thuoác coù muøi hoâi neân aûnh höôûng ñeán moâi tröôøng. 2.3.2. Tính chaát lyù hoùa: Dimethoat laø thuoác BVTV thuoäc nhoùm laân höõu cô, coù teân goïi theo danh phaùp quoác teá laø O,O-dimethyl S–methylcarbamoylmethyl – phosphorodithioate, soá CAS: 60-51-5. Coâng thöùc hoaù hoïc: C5H12NO3PS2, Khoái löôïng phaân töû: 229,2 Coâng thöùc caáu taïo: Hình 2.2: Coâng thöùc caáu taïo cuûa Dimethoate Dimethoate ôû daïng raén, ñieåm noùng chaûy 51-52oC; aùp löïc hôi 1,1 mPa (25oC). Tan trong nöôùc vaø caùc dung moâi höõu cô chuû yeáu, khoù tan trong hydrocacbon. Bò thuûy phaân trong moâi tröôøng kieàm, nhöng töông ñoái beàn trong moâi tröôøng trung tính (2< pH < 7). Bò phaân huûy khi ñun noùng, ñaàu tieân taïo daãn xuaát cuûa O,S-dimetyl. [4] LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 8 Baûng 2.2. Ñoä tan cuûa Dimethoate trong moät soá dung moâi ôû 250C. Dung moâi Ñoä hoaø tan (g/100mL) Aceton 140 Acetonitril 140 Cyclohexane 120 Dodecane 0.043 Etanol 150 Ethyl acetate 120 Hexane 0.03 2-propanol 120 Methanol 160 Dicloromethane 150 1-octanol 52 Toluene 100 Xylene 31 1,2-dicloroethane 120 n-heptane 0.024 Dimethoate phaân huyû nhanh khi gia nhieät ñeán nhieät ñoä >800C. Söï phaân huyû naøy taïo ra caùc khí ñoäc haïi dimethyl sulfic, carbon monoxide, methyl mercaptane, pentoxide phospho. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 9 Baûng 2.3. Ñoä tan trong nöôùc cuûa Dimethoate ôû 200C pH Ñoä tan (g/L) 5 23,3 7 23,8 9 25,0 Dimethoate phaân huyû trong thôøi gian ngaén trong ñaát, nöôùc vaø caây troàng. Thôøi gian toàn taïi trong ñaát cuûa Dimethoate laø 4 – 16 ngaøy, ngaén hôn trong ñaát aåm. Trong nöôùc soâng, sau 18h – 8 tuaàn thì bò giaûm moät nöûa. Trong ñoäng vaät cuõng nhö trong thöïc vaät, cô cheá bieán ñoåi cuûa Dimethoate laø gioáng nhau. Noù bò oxi hoaù thaønh O,O-dimethyl- phosphorothioate vaø hydro hoùa thaønh O,O-dimethyl-phosphorodithioate, - phosphorothioate, -phosphat. Söï oxi hoaù Dimethoate taïo neân hôïp chaát omethoate, moät chaát ñoäc vaø laø chaát öùc cheá enzyme cholinesterase maïnh, noù cuõng phaân huyû trong moâi tröôøng nhanh nhö Dimethoate. [4] 2.3.3. Ñoäc tính: [4] Dimethoate thuoäc nhoùm ñoäc II. Ñoái vôùi nguôøi, LD50 qua mieäng laø 235mg/kg, qua da >400mg/kg. ADI: 0.02mg/kg theå troïng / ngaøy. Noàng ñoä cao nhaát ñöôïc chaáp nhaän cuûa Dimethoate trong nöôùc uoáng laø 0,02mg/L. Caùc nghieân cöùu môùi ñaây taïi Vieän nghieân cöùu haït nhaân Ñaø Laït ñaõ phaùt hieän baèng chöùng bieán loaïn nhieãm saéc theå treân teá baøo limpho ngöôøi ôû moät nhoùm daân cö saûn xuaát noâng nghieäp ôû Laâm Ñoàng gaây ra bôûi thuoác tröø saâu BAI 58. Thaønh phaàn chính cuûa BAI 58 laø Dimethoate 40EC vaø 60% chaát taïo nhuõ. Dimethoate laø ñoái töôïng nghieân cöùu ñoäc chaát moâi tröôøng cuûa theá giôùi töø nhöõng naêm 60. Maëc duø, BAI 58 laø loaïi thuoác tröø saâu laân höõu cô ñang ñöôïc xem xeùt laïi ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi, song ôû Vieät Nam vaãn ñang ñöôïc caáp pheùp söû duïng vaø ñang ñöôïc söû duïng phoå bieán trong noâng nghieäp Vieät Nam, nhaát laø nhöõng vuøng caây coâng nhieäp nhö caø pheâ, daâu taèm… 2.4. Caûi baép: Teân khoa hoïc: Brassica oleracea var. capitata. Hoï: Cruciferae. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 10 Hình 2.3: Caûi baép Ñaëc ñieåm baép caûi traéng Laù ngoaøi coù nhieäm vuï quang hôïp neân coù maøu xanh. Laù trong khoâng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi aùnh saùng, coù maøu traéng ngaø. Chuùng coù nhieäm vuï döï tröõ chaát dinh döôõng vaø laø boä phaän duøng laøm thöïc phaåm. Haøm löôïng Vitamin ôû laù giaø cao hôn. Thu hoaïch vaø baûo quaûn: Caûi baép ñöôïc troàng töø thaùng 9 ñeán thaùng 10, vuï muoän töø thaùng 11 ñeán thaùng 12. Thôøi gian sinh tröôûng töø 80 – 90 ngaøy. Khi baép caûi cuoän chaët thì coù theå thu hoaïch. Ta duøng dao caét vaø ñeå laïi vaøi laù giaø beân ngoaøi. Nhieät ñoä thích hôïp ñeå baûo quaûn caûi baép laø 0 – 10C. Söû duïng caûi baép Caûi baép laø loaïi rau nhieàu chaát dinh döôõng, coù theå cheá bieán ñöôïc nhieàu moùn aên nhö: aên soáng, luoäc, xaøo vôùi thòt, muoái chua… Theo Ñoâng y, caûi baép vò ngoït, tính bình, coù coâng duïng boå coát tuyû, khoeû gaân coát. Noù coù taùc duïng caét côn ñau vaø thuùc cho mau laønh ñoái vôùi chöùng loeùt daï daøy. Baûng 2.4: Thaønh phaàn caùc chaát dinh döôõng coù trong 100 g caûi baép: [20] Nöôùc eùp töø caûi baép laø loaïi "maùy loïc" tuyeät vôøi vaø giuùp giaûm caân vì chöùa ít calo. Chaát sulfur vaø chlorine trong caûi baép giuùp taåy saïch maøng nhaày baùm ôû bao töû vaø ruoät. Ngoaøi ra, nöôùc caûi baép cuõng chöùa ñuû löôïng ioát caàn thieát cho cô theå ngöôøi, ñoàng thôøi raát toát cho vieäc chöõa vieâm daï daøy, ung loeùt daï daøy, vieâm mieäng vaø vieâm lôïi. Moät soá nghieân cöùu cho thaáy chaát isothiocyanates chöùa nhieàu trong caùc loaïi rau nhaø hoï caûi coù taùc duïng tieâu dieät caùc khoái u gaây ung thö phoåi. Protein Lipit Carbs Ca Fe Caroten Vit B1 Vit B2 Vit B3 Vit C 1.1 g 0.2 g 3.4 g 32mg 0.3mg 0.02mg 0.04mg 0.04mg 0.3mg 30mg LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 11 Baûng 2.5: Giôùi haïn dö löôïng thuoác tröø saâu trong caûi baép Thuoác tröø saâu Giôùi haïn dö löôïng MRL(ppm) Carbaryl 5 Dimethoate 2 2.5. Vitamin C: [15, 18, 17, 19] 2.5.1. Giôùi thieäu chung veà Vitamin C: [15] Vitamin C laø teân goïi thoâng duïng cuûa acid ascorbic. Caùc teân goïi hoaù hoïc laø L- Ascorbic acid, L-xyloascorbic acid, 3-oxo-L-gulofuranolactone (daïng enol), L-3- ketothreohexuronic acid lactone. Vôùi coâng thöùc phaân töû C6H8O6. Vitamin C coù khoái löôïng phaân töû 176,1. Hình 2.4 cho thaáy coâng thöùc caáu taïo vaø moâ hình caáu truùc phaân töû Vitamin C. 2.5.2. Tính chaát vaät lyù: [18] Acid ascorbic tinh khieát toàn taïi ôû daïng tinh theå, khoâng maøu hoaëc coù maøu traéng. Acid ascorbic thöôøng khoâng coù muøi, coù vò chua acid, tan voâ haïn trong nöôùc, ít tan trong ethanol, khoâng tan trong ether vaø chloroform. Nhieät ñoä noùng chaûy 190oC. Acid ascorbic bò hoaù ñen khi ñeå tröïc tieáp ngoaøi aùnh saùng maët trôøi, tuy nhieân söï bieán maøu nheï coù theå khoâng laøm maát hoaït tính chöõa beänh cuûa acid ascorbic. Thaäm chí khi khoâng coù maët aùnh saùng thì acid ascorbic vaãn deã daøng bò bieán tính khi tieáp xuùc vôùi ñoä aåm trong khoâng khí vaø söï phaân huyû naøy caøng nhanh khi nhieät ñoä moâi tröôøng caøng cao. (a) (b) Hình 2.4: (a)-Acid Ascorbic; (b)-Acid Dehydroascorbic LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 12 2.5.3. Tính chaát hoaù hoïc: [18] Acid ascorbic coù caùc giaù trò pKa laø 4,2 vaø 11,6. Trong dung moâi nöôùc, dung dòch acid ascorbic 5% coù pH = 2,2 – 2,5. Trong dung dòch, acid ascorbic nhanh choùng bò oxi hoaù khi coù maët khoâng khí vaø pH vuøng kieàm. Acid ascorbic beàn trong moâi tröôøng trung tính, acid, khoâng beàn trong moâi tröôøng coù caùc ion kim loaïi nhö Cu2+, Fe2+, Enzym ascorbatoxydase… 2.5.4. Nguoàn goác: [15] Acid ascorbic coù caû nguoàn goác töï nhieân vaø nhaân taïo. Trong töï nhieân, acid ascorbic ñöôïc tìm thaáy trong caùc loaïi rau quaû töôi. Nguoàn thöùc aên chöùa Vitamin C raát toát laø nhöõng traùi caây thuoäc hoï citrus hay nöôùc eùp töø traùi hoï citrus, quaû moïng, hoà tieâu xanh hay ñoû, caø chua, boâng caûi, rau caûi boù xoâi. Baûng 2.6: Thaønh phaàn Vitamin C trong moät soá nguyeân lieäu thöïc phaåm STT Nguyeân lieäu Vitamin C (mg/100g) 1 Döùa 17 2 Caûi baép 30 3 Me 75 4 Vaûi 167 5 Haït ñieàu 1 6 Döa leo 12 7 Nhaõn 8 8 Chanh 46 9 Caûi xanh 70 10 Ôùt 250 2.5.4. Vai troø cuûa Vitamin C : [17] Vitamin C ñöôïc Albert Szent-Gyorgyi phaân laäp naêm 1928. Gaàn 70 naêm sau, caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ khaùm phaù ra nhieàu lôïi ích cuûa Vitamin C treân söùc khoeû. Ñaây laø loaïi LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 13 Vitamin maø cô theå caàn nhieàu nhaát. Ñoái vôùi ngöôøi bình thöôøng caàn khoaûng 80 ÷100mg Vitamin C trong 24 giôø. Tuyø thuoäc vaøo heä di truyeàn vaø caùc yeáu toá trong loái soáng, moät soá ngöôøi ñoøi hoûi löôïng Vitamin C nhieàu hôn löôïng trung bình cuûa moät ngöôøi bình thöôøng nhaèm ngaên chaën söï giaùn ñoaïn cuûa caùc phaûn öùng sinh hoaù quan troïng. Chaúng haïn nhö ngöôøi lôùn tuoåi, uoáng röôïu, ngöôøi bò beänh tieåu ñöôøng, ngöôøi huùt thuoác laù thöôøng bò thieáu Vitamin C. Khoâng nhö haàu heát caùc loaïi ñoäng vaät khaùc, cô theå ngöôøi khoâng theå töï saûn xuaát Vitamin C. Moät beänh do thieáu huït Vitamin C phoå bieán nhaát laø beänh scorbus (scurvy). 2.6. Phöông phaùp phaân tích HPLC: [8] 2.6.1. Phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp: Saéc kyù loûng cao aùp (High pressure liquid chromatography_HPLC) hay saéc kyù loûng hieäu naêng cao laø moät phöông phaùp phaân tích saéc kyù loûng hieän ñaïi, ñöôïc söû duïng roäng raõi trong kyõ thuaät phaân tích ñeå phaân tích caùc chaát coù haøm löôïng nhoû nhö: Vitamin, acid amin, ñoäc toá cuûa vi sinh vaät, dö löôïng thuoác tröø saâu trong thöïc phaåm...  Nguyeân taéc: Saéc kí loûng laø kyõ thuaät phaân tích saéc kyù duøng ñeå taùch caùc ion hoaëc caùc phaân töû hoøa tan trong dung dòch. Khi dung dòch maãu tieáp xuùc vôùi moät pha raén hay moät pha loûng thöù hai, caùc chaát hoøa tan khaùc nhau trong dung dòch maãu seõ töông taùc vôùi caùc pha ñoù vôùi moät möùc ñoä khaùc nhau döïa treân söï khaùc nhau veà khaû naêng haáp phuï, khaû naêng trao ñoåi ion, khaû naêng phaân boá hay döïa treân söï khaùc nhau veà caáu truùc phaân töû cuûa caùc chaát (saéc kí loïc gel). Söï khaùc nhau naøy seõ taùch caùc caáu töû ra khoûi hoãn hôïp. Caáu töû naøo coù aùi löïc vôùi pha ñoäng maïnh seõ ñi ra tröôùc, caáu töû naøo coù aùi löïc vôùi pha ñoäng yeáu hôn seõ ñi ra sau. Caùc caáu töû ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua thôøi gian löu cuûa caáu töû trong coät saéc kí. Ñeå ñònh danh caùc caáu töû ñoùù, chuùng ta phaûi ñöôïc hoã trôï bôûi moät phöông phaùp khaùc, ví duï nhö söû duïng ñaàu doø hoàng ngoaïi IR, ñaàu doø töû ngoaïi UV…  Ñaëc ñieåm: - Söû duïng coät saéc kyù: kích thöôùc cuûa coät saéc kyù nhaèm muïc ñích phaân tích thöôøng beù (Chieàu daøi: 10-25cm, ñöôøng kính: 2-4mm). - Pha ñoäng laø chaát loûng. - Pha tónh ña daïng tuøy vaøo kieåu coät saéc kyù nhö saéc kyù haáp phuï, phaân boá, loïc gel, trao ñoåi ion. Do ñoù khaû naêng öùng duïng cuûa phöông phaùp naøy raát lôùn vaø ña daïng. - Haït vaät lieäu nhoài coù kích thöôùc raát beù, khoaûng 1 – 4 µm. Do ñoù, toác ñoä chaûy cuûa pha ñoäng seõ raát chaäm. Vì vaäy phaûi söû duïng aùp suaát cao (100 – 400 bar), toác ñoä doøng khi ñoù LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 14 ñaït khoaûng 0,1 ñeán 10 ml/phuùt. Thôøi gian phaân tích maãu thöôøng dao ñoäng trong khoaûng tôùi 30 phuùt.  Phaân loaïi: Coù theå chia phöông phaùp HPLC ra laøm 2 loaïi:  Saéc kyù pha thuaän (Normal-phase HPLC): laø phöông phaùp saéc kyù coù pha ñoäng laø dung moâi khoâng phaân cöïc nhö hexane, coøn pha tónh laø caùc haït chaát mang baèng silicagel treân ñoù coù gaén caùc goác phaân cöïc nhö _CN hoaëc _NH2.  Saéc kyù pha ñaûo (Reversed-phase HPLC): laø phöông phaùp saéc kyù coù pha ñoäng laø dung moâi phaân cöïc nhö nöôùc hoaëc nöôùc cuøng vôùi caùc dung moâi phaân cöïc khaùc nhö methanol hay Axetonitril, coøn pha tónh laø caùc haït chaát mang baèng silicagel treân ñoù coù gaén caùc goác khoâng phaân cöïc nhö octadecyl- hay octylsilane. Thöôøng söû duïng saéc kyù pha ñaûo cho saéc kyù loûng cao aùp:  pha ñoäng phaân cöïc  pha tónh keùm phaân cöïc Nguyeân nhaân laø do pha ñoäng phaân cöïc cho pheùp söû duïng nhieàu loaïi pha ñoäng ña daïng, ngoaøi ra coù theå boå sung theâm caùc thaønh phaàn khaùc nhau vaøo pha ñoäng ñeå taïo ra caùc ñoä phaân cöïc khaùc nhau. Thaønh phaàn chính cuûa pha ñoäng laø nöôùc, laø moät dung moâi reû, ít gaây oâ nhieãm moâi tröôøng vaø khoâng ñoäc haïi.  Phaïm vi öùng duïng cuûa phöông phaùp: Phaân tích caùc thaønh phaàn hoaù hoïc trong thöïc phaåm nhö caùc thaønh phaàn dinh döôõng, phuï gia, ñoäc toá, theo doõi söï bieán ñoåi cuûa thöïc phaåm trong quaù trình baûo quaûn vaø cheá bieán. Cuï theå:  Vitamin  Acid amin  Thuoác, khaùng sinh, döôïc lieäu.  Ñoäc toá (aflatoxin).  Thuoác tröø saâu.  Thuoác tröø coû.  Phuï gia coâng nghieäp vaø thöïc phaåm.  Acid höõu cô LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 15  Caùc loaïi ñöôøng  Chaát kích thích. 2.6.2. Heä thoáng thieát bò saéc kyù loûng cao aùp:  Nguyeân taéc hoaït ñoäng: Pha ñoäng sau khi ñöôïc baøi khí ñöôïc bôm ñöa vaøo heä thoáng saéc kyù. Heä thoáng töï ñoäng bôm maãu vaøo coät (hoaëc chuùng ta töï bôm maãu vaøo). Pha ñoäng khi ñi ngang qua seõ cuoán maãu caàn phaân tích ñi theo. Khi vaøo trong coät saéc kyù, chaát naøo coù aùi löïc maïnh vôùi pha ñoäng seõ theo pha ñoäng ñi ra tröôùc, chaát naøo coù aùi löïc yeáu hôn seõ ñi ra sau. Ñaàu doø phaùt hieän caùc caáu töû ñi ra khoûi coät, chuyeån tín hieäu cho maùy ghi keát quaû.  Caáu taïo:  Bôm :  Laø boä phaän coù tính quan troïng haøng ñaàu trong heä thoáng HPLC. Bôm aùp löïc cao ñöôïc söû duïng ñeå ñaåy dung moâi ñi xuyeân qua pha tónh. Kích thöôùc vaät lieäu chaát nhoài coät caøng nhoû thì aùp suaát phaûi caøng cao.  Yeâu caàu: taïo ñöôïc doøng pha lieân tuïc, oån ñònh vaø khoâng coù xung.  Bôm thöôøng söû duïng laø bôm pittong.  Caùc loaïi bôm hieän ñaïi co nhöõng thoâng soá sau:  Vaän toác doøng: 0,1 – 10 ml/phuùt.  Ñoä oån ñònh cuûa doøng löu löôïng: Dao ñoäng khoâng lôùn hôn 1%.  Aùp löïc lôùn nhaát: leân ñeán 5000psi.  (Heä thoáng HPLC trong phoøng thí nghieäm Hoùa sinh cuûa khoa söû duïng bôm LC- 10AS).  Boä phaän nhaäp maãu: Cho pheùp laáy chính xaùc löôïng maãu ñöa vaøo coät saéc kyù moät moät caùch töï ñoäng vaø ñöôïc chöông trình hoùa:  Theå tích maãu bôm vaøo.  Thôøi gian thay ñoåi maãu.  Thôøi gian röûa boä phaän nhaäp maãu.  Nhieät ñoä bôm maãu. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 16  Aùp suaát bôm maãu (Chuù yù aùp suaát bôm maãu phaûi nhoû hôn 70bar thì maãu môùi taäp trung ñöôïc vaøo coät, khaû naêng phaân tích maãu môùi toát). Ngoaøi ra, ta coù theå bôm maãu thuû coâng baèng caùch duøng xilanh bôm maãu vaøo coät.  Coät saéc kyù : Hình 2.5: Coät saéc kyù Laø boä phaän chính cuûa heä thoáng thieát bò HPLC, ñoù chính laø nôi dieãn ra söï phaân taùch caùc caáu töû trong hoãn hôïp nhôø khaû naêng haáp phuïï hay phaân boá cuûa caùc caáu töû giöõa pha ñoäng vaø pha tónh. Phoå bieán nhaát laø coät ODS (Octadodecyl siloxane). Raát ngaén, khoaûng 10 – 25 cm, ñöôøng kính trong 2 – 4 mm. Vaät lieäu nhoài coät:  Ñoái vôùi saéc kyù haáp phuï: chaát mang raén thöôøng laø silicagel hay oxyt nhoâm.  Ñoái vôùi saéc kyù phaân boá: chaát mang raén laø daãn xuaát cuûa silicagel (caùc haït silicagel ñöôïc gaén vôùi caùc nhoùm chöùc khaùc nhau taïo ra caùc haït coù chöùc naêng phuø hôïp vôùi maãu caàn phaân tích). Ví duï nhö: Siloxanes (C18, C8…). Yeâu caàu ñoái vôùi chaát mang:  Coù tính choïn loïc caàn thieát ñoái vôùi thaønh phaàn maãu nghieân cöùu.  Beàn nhieät.  Beàn cô hoïc.  Beàn vaø trô veà maët hoùa hoïc vôùi caùc caáu töû khaùc trong maãu phaân tích.  Ñaàu doø:  Ngaøy nay caùc ñaàu doø quang hoïc ñöôïc söû duïng phoå bieán trong caùc heä thoáng saéc kyù loûng. Nhöõng ñaàu doø naøy ñöa moät tia saùng xuyeân qua doøng chaûy ra khoûi coät. Söï thay ñoåi veà cöôøng ñoä aùnh saùng do söï haáp thu tia UV, söï phaùt xaï huyønh quang töø caùc thaønh phaàn… seõ ñöôïc ghi nhaän laïi ôû daïng thay ñoåi cuûa ñieän theá ñaàu ra. Nhöõng ñieän theá naøy ñöôïc bieåu dieãn treân moät ñoà thò vaø ñöa vaøo maùy tính ñeå hieån thò thôøi gian löu vaø peak.  Ñaàu doø trong HPLC raát ña daïng:  Ñaàu doø UV.  Ñaàu doø UV – VIS. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 17  Ñaàu doø huyønh quang.  Ñaàu doø daãn nhieät.  Ñaàu doø khuùc xaï keá vi sai (RI).  Heä thoáng HPLC trong phoøng thí nghieäm Hoaù sinh cuûa khoa söû duïng ñaàu doø quang phoå UV-VIS loaïi SPD - 6VA. Caùc ñaëc tröng quan troïng cuûa moät ñaàu doø laø:  Ñoä nhaïy.  Giôùi haïn doø tìm.  Quaùn tính vaø phaïm vi phuï thuoäc tuyeán tính giöõa cöôøng ñoä tín hieäu vôùi noàng ñoä.  Maùy ghi : Coù theå veõ saéc kyù ñoà, ghi laïi thôøi gian löu, tính dieän tích peak, ghi laïi phöông phaùp xaùc ñònh, ñoàng thôøi coù theå söû duïng maùy ghi ñeå ñieàu khieån, chöông trình hoùa quaù trình chaïy saéc kyù.  Heä thoáng HPLC trong phoøng thí nghieäm Hoùa sinh cuûa khoa söû duïng maùy ghi Chromatopac CR 6A.  Sô ñoà heä thoáng: Hình 2.6: Heä thoáng maùy saéc kyù loûng cao aùp Coät saéc kyù Ñaàu doø Maùy ghi Bôm Pha ñoäng Valve phun Maùy troän LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 18 2.7. Caùc phöông phaùp phaân tích Vitamin C: [10, 11, 12] Vitamin C coù theå ñöôïc phaân tích baèng nhieàu phöông phaùp, tuøy thuoäc vaøo ñaëc ñieåm cuûa maãu caàn phaân tích, thôøi gian phaân tích vaø thieát bò coù theå tieáp caän ñöôïc. Caùc phöông phaùp thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích Vitamin C laø: - Phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp (HPLC) - Phöông phaùp chuaån ñoä. - Phöông phaùp so maøu. - Phöông phaùp söû duïng enzim 2.7.1. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp HPLC Phöông phaùp naøy ñöôïc giôùi thieäu trong nhieàu taøi lieäu tham khaûo vaø ñaõ trôû thaønh moät baøi thí nghieäm trong PTN Hoùa sinh, B/m CN thöïc phaåm. Coät saéc kyù söû duïng laø coät pha ñaûo ODS C18. Pha ñoäng söû duïng laø dung dòch ñeäm phosphate pH = 2,8 troän vôùi methanol theo tyû leä theå tích 90/10, löu löôïng pha ñoäng qua coät 1 mL/phuùt. Söû duïng ñaàu doø UV ño ñoä haáp thuï ôû böôùc soùng 245 nm. Pha ñoäng ñöôïc ñaùnh sieâu aâm ñeå ñuoåi khí hoøa tan tröôùc khi söû duïng, vaø ñöôïc loïc lieân tuïc trong quaù trình chaïy saéc kyù baèng maøng loïc 450 nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån vôùi caùc maãu acid ascorbic tinh khieát vôùi naêm noàng ñoä khaùc nhau. Maãu rau quaû ñöôïc nghieàn trong dung dòch ñeäm phosphate pH = 2,8 ñeå trích Vit.C ra, pha loaõng theo tyû leä thích hôïp roài phaân tích nhö vôùi caùc maãu chuaån. Haøm löôïng Vitamin C trong maãu ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch noäi / ngoaïi suy tín hieäu cuûa maãu töø ñöôøng chuaån. [10] 2.7.2. Phaân tích Vitamin C baèng phöông phaùp chuaån ñoä:  Chuaån ñoä vôùi 2,6- dichloroindophenol (DCP) Ñaây laø moät phöông phaùp höõu duïng ñeå ñònh löôïng Vitamin C trong rau quaû. Cô sôû cuûa phöông phaùp naøy laø phaûn öùng oxi hoùa acid ascorbic trong dung dòch bôûi DCP thaønh daïng dehydroascorbic acid. Saûn phaåm cuûa phaûn öùng oxy hoùa khöû naøy ñeàu khoâng maøu. Phöông trình phaûn öùng: (pH=3) C6H8O6 (khoâng maøu) + C12H7O2NCl2(ñoû) C6H6O6 (khoâng maøu) + C12H9O2NCl2 (khoâng maøu) Söï chuaån ñoä naøy ñaëc bieät thuaän lôïi bôûi vì DCP cuõng ñoùng vai troø nhö chaát chæ thò maøu. Khi nhoû dung dòch DCP vaøo moät dung dòch coù chöùa Vitamin C, thì hoãn hôïp phaûn öùng khoâng maøu cho ñeán khi taát caû löôïng Vitamin C coù trong hoãn hôïp chuyeån heát thaønh LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP 19 daïng dehydroascorbic acid. Gioït dung dòch DCP tieáp theo theâm vaøo neáu xuaát hieän maøu ñoû chöùng toû ñoù laø gioït DCP coøn dö vaø phaûn öùng ñaõ keát thuùc. Do ñoù, ñieåm töông ñöông ñöôïc xaùc ñònh (chæ thò) khi dung dòch chuaån ñoä töø khoâng maøu chuyeån sang maøu ñoû cuûa DCP. Yeáu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø dung dòch DCP raát keùm beàn neân chuùng ta chæ pha dung dòch ngay tröôùc khi söû duïng chuùng. Tröôùc khi tieán haønh chuaån ñoä, caàn xöû lyù maãu thöïc phaåm vôùi metaphosphoric acid. Böôùc xöû lyù vôùi acid naøy nhaèm laøm bieán tính vaø keát tuûa protein trong maãu ñeå traùnh aûnh höôûng ñeán keát quaû phaân tích, ñoàng thôøi cuõng nhaèm giuùp oån ñònh acid ascorbic traùnh bò phaân huyû. Acid h