Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme protease từ vi sinh vậ

LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ thời cổ xưa, vi sinh vật đã được con người sử dụng để chế biến và sản xuất thực phẩm, nó là một bộ phận trong khẩu phần ăn của con người và các loài vật nuôi. Ngày nay việc sản xuất protein từ nguồn vi sinh vật không chỉ nhằm mục đích sử dụng để làm thức ăn, mà sản xuất protein từ vi sinh vật được trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Protease là enzyme hiện nay được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như: Chế biến thực phẩm ( đông tụ sữa dùng làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã được cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất và có nhiều ưu điểm nhất như: có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…, có hoạt tính mạnh chỉ cần một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh chóng, trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme lớn….Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Đây cũng chính là lý do em chon đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme protease từ vi sinh vật”  Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan về enzyme Định nghĩa enzyme[1] co thanh nga Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là chất xúc tác sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng như: cường lực xúc tác lớn, sự chuyển hóa cơ chất mạnh…. Thành phần cấu tạo của enzyme[2]co thanh nga Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp. Trên cơ sở đó, người ta phân enzyme thành hai nhóm: Enzyme một thành phần (enzyme một cấu tử) và enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử). Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenzyme, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme. Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt vào phần protein hoặc chỉ có thể liên kết lỏng lẻo và có thể tách khỏi phần protein khi cho thẩm tích qua màng. Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme. Trong đó coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính. Còn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme. Phân loại enzyme Dựa trên những phản ứng xúc tác, Ủy ban danh pháp của Liên minh quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử (IUBMB) đề nghị việc phân loại sau đây. 1. Oxidoreductases xúc tác cho một loạt các phản ứng oxy hóa giảm. Các tên thường gặp bao gồm dehydrogenase, oxidase, reductase và catalase. 2. Transferases xúc tác chuyển giao của các nhóm (acetyl, methyl, phosphate, vv). Các tên thường gặp bao gồm acetyltransferase, protein kinase methylase, và polymerase. Ba lớp con đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong quy định của quá trình tế bào. Phản ứng hóa học của họ được thể hiện trong HYPERLINK "" \l "acetylation" hình 2-E-1 . Polymerase là điều cần thiết cho sự tổng hợp DNA và RNA. 3. Hydrolases xúc tác phản ứng thủy phân một phân tử được chia thành hai hoặc nhiều phân tử nhỏ hơn bằng cách cho thêm nước. Ví dụ phổ biến được đưa ra dưới đây. Protease chia tách các phân tử protein. Ví dụ:  HYPERLINK "" HIV protease và  HYPERLINK "" caspase . HIV protease là điều cần thiết cho nhân bản HIV không. Caspase đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis. Nucleases chia tách các axit nucleic (DNA và RNA) . Căn cứ vào loại chất nền, họ được chia thành RNase và DNase. RNase xúc tác thủy phân của RNA và DNase hành vi trên DNA. Họ cũng có thể được chia thành exonuclease và endonuclease.Exonuclease dần dần tách ra khỏi nucleotide duy nhất từ ​​một đầu của DNA hoặc RNA. Endonuclease chia tách DNA hoặc RNA tại các trang web nội bộ. Phosphatase xúc tác dephosphorylation (loại bỏ các nhóm phosphate) . Ví dụ: HYPERLINK "" calcineurin . Các ức chế miễn dịch thuốc FK506 và Cyclosporin A là những chất ức chế calcineurin. 4. Lyases xúc tác sự phân tách của CC, CO, CS và CN trái phiếu bằng các phương tiện khác hơn so với thủy phân hoặc quá trình oxy hóa. Tên gọi thông thường bao gồm decarboxylase, aldolase. 5. Isomerase xúc tác tái sắp xếp nguyên tử trong một phân tử . Ví dụ như  HYPERLINK "" \l "rotamase" rotamase, isomerase disulfide protein (PDI), epimerase và racemase. 6. Ligases xúc tác cho phản ứng mà tham gia hai phân tử. Các ví dụ bao gồm các enzym tổng hợp peptide, aminoacyl-tRNA synthetase, DNA ligase và RNA ligase. Trung tâm hoạt động của enzyme[2]co thanh nga Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ. Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hình thành sẵn với một cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào. Do đó có thể ví sự tương ứng đó như ”ổ khóa với chìa khóa”. Còn theo Koshland thì đặc điểm của vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và linh hoạt , các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động, khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất. Cũng vì vậy, người ta gọi mô hình này là mô hình “tiếp xúc cảm ứng” hoặc “khớp cảm ứng”. Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng ezyme và sản phẩm phản ứng. Tính đặc hiệu của enzyme[2] co thnah nga Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phẩn ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme. Tính đặc hiệu là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme. Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất. Đặc hiệu kiểu phản ứng Phần nhiều mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định. Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng ấy phải do một enzyme đặc hiệu xúc tác. Ví dụ: Amino acid có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin. Vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase. Đặc hiệu kiểu cơ chất Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định. Mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme khác nhau không giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức như sau: Đặc hiệu tuyệt đối Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất nhất định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi. Ví dụ: Urease có thể phân giải ure, ngoài ra nó còn có thể hydroxyure nhưng tốc độ thấp hơn 120 lần. Đặc hiệu nhóm tuyệt đối Các enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở phần liên kết chịu tác dụng. Ví dụ:Maltase thuộc nhóm α-glucosidase chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glucoside được tạo thành từ nhóm OH glucoside của α-glucose với nhóm OH của một monose khác. Đặc hiệu nhóm tương đối Mức độ đặc hiệu của các enzyme thuộc nhóm này hơn nhóm trên. Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó. Ví dụ: Lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este. Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất. Ví dụ: Phản ứng khử nước của malic acid để tạo thành fumaric acid dưới tác dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với L-malic acid mà không tác dụng lên D-malic acid. 1.2. Tổng quan về enzyme protease 1.2.1.Giới thiệu chung về protease 1.2.1.1. Định nghĩa về enzyme protease Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton. Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme protease 1.2.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [7] Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. + Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. E + S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2 Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 1.2.2. Phân loại protease  HYPERLINK ""  Sơ đồ phân loại enzyme protease: Aspartic proteinase Peptidase ( protease) Exopeptidase Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine proteinase Cystein proteinase Metallo proteinase Endopeptidase  Hình 1.3. Sơ đồ phân loại protease Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Như: papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. + Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn. - Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa. - Protease kiềm có pH 9-11. * Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác: - Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly - Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên men trên môi trường rắn. Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay khi quá trình lên men đang diễn ra. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme protease  HYPERLINK ""  1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [3]. Và gần đây nhất là những sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như: + Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút. [14]. + Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [15]. + Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [16],[4]. + “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C. + Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993-1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. [8] 1.2.3.2. Tình hình sản xuất enzyme Protease trên thế giới Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [11]. Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin… [11]. Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải Protein của Xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chees pha enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [11]. Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sửa (Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al., 2004); trong công nghiệp thuộc da, Protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng (Rao et al., 1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [13]. Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5%- 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4],[1]. 1.2.3. Nguồn thu nhận enzyme protease TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMKHOA KỸ THUẬT HÓA HỌcBÀI BÁO CÁO MÔN HÓA SINH THỰC PHẨMNGUỒN THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về kinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu suất cao. Hiện nay chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease : - Động vật : Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày, niêm mạc ruột non, tuyến tụy…). Vd: Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao. Chymosin “rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi Tuy nhiên, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme không lớn lắm - Thực vật : Từ các thực vật bậc cao người ta cũng thu được một số chế phẩm enzyme quan trọng Vd : Papain thu từ mủ đu đủ xanh, Bromelin từ than cây dứa… Lượng enzyme thu được từ các nguyên liệu thực vật không lớn lắm so với lượng nhiên liệu tiêu hao - Vi sinh vật :Hai nguồn nguyên liệu trên không thể dùng dùng nguyên liệu trong sản xuất công nghiệp qui mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì vậy, dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế trên. + Nguồn nguyên liệu vô hạn + Hệ enzyme phong phú + Hoạt tính mạnh + Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống + Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh + Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ riền. 1.2.4. Ứng dụng của enzyme protease  HYPERLINK ""  Protease không những được ứng dụng nhiều trong y dược, hóa học, trong nông nghiệp, mà trong công nghiệp Protease chiếm vai trò quan trọng, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn. Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lãnh vực đã dùng Protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học… Sau đây là những ứng dụng mà Protease mang lại trong công nghiệp thực phẩm: 1.2.4.1. Trong công nghiệp chế biến thịt - Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. Có thể ngâm thịt vào dinh dưỡng Protease ở pH và nhiệt độ xác định-phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (E, muối, bột ngọt), tiêm dung dịch enzyme vào thịt (tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ). 1.2.4.2. Trong chế biến thuỷ sản - Khi sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme Protease để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Phương pháp sử dụng Protease trong xản xuất nước mắm: Protease Protease Protease Protein polypeptid peptid amino acid + Nước mắm truyền thống là kết quả của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới tác động của hệ Protease nội tại trong điều kiện có muối theo cơ chế: Trong 24 giờ đầu tiên, dưới tác động của các hệ Protease nội tại của cá một phần protein thịt cá bị thủy phân thành peptid, polypeptid hòa tan trong nước bổi. Sau đó protein thịt cá, polypeptid và các peptid được tạo thành này tiếp tục bị thủy phân mạnh mẽ bởi các Protease kim loại tạo thành các aa tự do, các peptid ngắn và đã có sự hình thành hương vị của nước mắm. 1.2.4.3. Trong công nghiệp sữa - Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát [1] Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng. . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. 1.2.4.4. Trong sản xuất Bia - Chế phẩm Protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [6]. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội. Ứng dụng enzyme Protease để làm trong và ổn định chất lượng nước quả và rượu vang - một trong những nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc làm trong nước quả và gây đục nước quả là protein [7]. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên),(2004), Công Nghệ EnZym, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Ngoài ra, Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,… - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm, … 1.3. Tổng quan về vi sinh vật 1.3.1. Giới thiệu chung về vi sinh vật - Trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme có một số kỹ thuật chung và một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm: [7] + Kỹ thuật tạo giống + Lựa chọn phương pháp nuôi cấy + Thiết kế thiết bị nuôi cấy + Kỹ thuật lên men + Tách, tinh chế thu nhận E. - Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học. - Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. 3.1 Vi khuẩn Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh Protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp Protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các Protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.[2] Các Protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các Protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với Protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Chúng còn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và thơm và được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [2]. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000dalton. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12. [2] 3.2 Nấm mốc Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn Protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicilliumchysogenum)…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại P: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các Protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [2]. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp Protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát. 3.3 Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp Protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus…[2]. Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành acid amin. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, CP được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da [2]. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. 1.3.2. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 1.3.2.1. Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thông qua các phương pháp sau: - Phương pháp gây đột biến - Phương pháp biến nạp - Phương pháp tiếp hợp gene - Phương pháp tải nạp 1.3.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. a) Nguồn cacbon [1],[11] Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. - Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae 79có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza. - Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. b) Nguồn nitơ [1] Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22- 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung. Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật. Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực Protease của chủng đột biến A. oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%. Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp proteinza VSV. c) Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng [1] - Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi VSV. + Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt. + Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất 1.3.2.3. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề mặt [3] Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. - Ưu, nhược điểm + Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme. Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20Tấn/ngày. + Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này dần được thay thế bằng nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn. 1.3.3. Thu nhận enzyme (E) 1.3.3.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme [3] Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào. - Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate... và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. + Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. - Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. -Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình công nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp không có mặt các chất gây biến hình enzyme. - Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hóa học. Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế bào (E nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như: + Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi. + Để tế bào tự phân hủy + Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ. + Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp. - Thẩm tích [9] Trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực…người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết E, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất hòa tan trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau. - Làm đặc [9] Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều. Làm đặc dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách thẩm thấu ngược ( tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm). 1.3.3.2. Các dạng chế phẩm enzyme thu được a) Thu chế phẩm kỹ thuật Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm enzyme chưa được tinh chế, nó có thể chứa một hoặc vài enzyme chủ yếu tùy theo yêu cầu sử dụng, ngoài ra trong thành phần còn có thể có các protein không hoạt động, các chất ổn định và các tạp chất khác. Để thu được chế phẩm enzyme kỹ thuật bước đầu người ta cô đặc các dịch enzyme có nồng độ chất khô thấp 4-6 g/l lên tới 15 – 20 g/l ở nhiệt độ 35oC trong thiết bị có chân không cao. Sau đó: + Hoặc là ta sẽ cô đặc tiếp ở nhiệt độ 40- 45oC để đạt nồng độ chất khô 30-35g/l, bổ sung thêm các bảo quản NaCl, Glixerol, Socbitol, Benzoat và thu được chế phẩm ở dạng lỏng, có thể bảo quản ở nhiệt độ thường từ 1-2 năm. + Hoặc là bổ sung thêm các chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30-40 g/l rồi sấy phun với nhiệt độ sấy có nhiệt độ đầu vào 120oC và đầu ra 60oC. Kết quả thu được CP ở dạng bột. + Hoặc người ta có thể kết tủa enzyme bằng các loại muối trung tính như (NH4)2SO4 hoặc cồn, trộn thêm các chất ổn định rồi sấy khô, nghiền mịn. Kết quả ta thu được chế phẩm ở dạng bột. b) Thu chế phẩm enzyme tinh khiết Việc tinh chế enzyme có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và qua nhiều giai đoạn khác nhau. Các protein không hoạt động có thể được loại khỏi dịch enzyme bằng phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH, nhiệt. Các protein đã bị biến tính có thể tách khỏi dung dịch khi ly tâm hoặc loại bỏ kết tủa. Có thể dùng phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion để thu những phần có hoạt lực enzyme cao nhất.  Chương II: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE  HYPERLINK ""  Thu nhận sinh khối (enzyme thô) Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Chế phẩm ezyme thô đem sử dụng Khoáng hỗn hợp Nguyên liệu dinh dưỡng (bột bắp, cao nấm men, pepton) Hấp thanh trùng Làm nguội đến 300C Nước Đỗ lên khay Giống Asp.oryzae Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 0,5-2% Dùng trong chăn nuôi Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy Tinh chế Bã Chế phẩm ezyme Kỹ thuật Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Sấy  Chương III: THUYẾT MINH QUY TRÌNH  HYPERLINK ""  3.1. Đối tượng nghiên cứu Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes. Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. 3.2. Thuyết minh quy trình 3.2.1. Kỹ thuyật nuôi cấy Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: . Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. . Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Enzym protease được tổng hợp mạnh. Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất. . Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C, trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzym protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. 3.2.2. Thu nhận sản phẩm: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau: . Nghiền mịn Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của qúa trình này là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật. . Trích ly: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này. . Kết tủa enzym protease Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W). Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn protease ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương. Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzym ngoài enzyme ta quan tâm.  KẾT LUẬN Từ các kết quả tham khảo những đề tài, tài liệu mang tính thiết thực, qua đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất protease từ vi sinh vật” em rút ra được một số kết luận sau: Biết được quy trình sản xuất enzyme protease từ vi sinh vật, đặc biệt là từ nấm mốc Aps. Oryzae, đặc tính của nấm mốc Aps. Oryzae dùng để sản xuất protease, tình hình sản xuất enzyme protase trong nước và trên thế giới, cấu tạo và phân loại của enzyme protease, úng dung của enzyme protease… TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tham khảo tiếng Việt [9]. Hồ Thị Tuyết Mai(2006), bài giảng Công nghệ E, Trường Cao Đẳng Lương Thực Thực Phẩm. [1]. Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng. [2]. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. [3]. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [6]. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội. [7]. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên),(2004), Công Nghệ EnZym, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. [11]. enzyme Vi Sinh Vật, tập 1, Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu, NXB Jhoa học kỹ thuật Hà Nội 1982.  Tài liệu tham khảo mạng-internet.  HYPERLINK "" ht tp://www.scribd.com/