Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao

Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao GVHD: PGS. TS Lê Văn Việt Mẫn Trang  PAGE 53 SVTH: Lê Vũ Anh Thư CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU Sữa dừa (nước cốt dừa) là một hệ nhũ tương dầu trong nước, được trích ly từ cơm dừa nạo nhuyễn có hoặc không bổ sung thêm nước. Sữa dừa sản xuất ở quy mô công nghiệp là một dạng sản phẩm rất phổ biến ở các nước châu Á có diện tích trồng dừa lớn như Phillipines, Malaysia, Thailand, Indonesia… Ở Việt Nam, những năm gần đây đã tập trung nghiên cứu, khai thác các sản phẩm làm từ dừa như nước dừa non đóng lon, kẹo dừa, kem dừa, bơ dừa, cơm dừa nạo sấy, sữa dừa…Trên thị trường Việt Nam và thế giới hiện nay, các sản phẩm sữa dừa thương mại đều có hàm lượng béo không vượt quá 35%wt (Ngô Minh Hiếu, 2007). Nước ta có nguồn tài nguyên dừa phong phú, tập trung ở các tỉnh như Bình Định, Bến Tre…với chất lượng dừa rất tốt. Vì vậy, chúng tôi đề xuất nghiên cứu sản xuất sữa dừa có hàm lượng béo cao (50%wt béo) nhằm đa dạng hóa sản phẩm và tiết kiệm chi phí trong quá trình bảo quản và vận chuyển sản phẩm. Năm 2006, Huỳnh Trung Việt đã nghiên cứu ứng dụng quá trình ly tâm nhằm tăng hàm lượng béo trong sữa dừa từ 32% wt béo tăng lên đến 50% wt béo. Năm 2007, Ngô Minh Hiếu đã nghiên cứu chọn nhiệt độ và thời gian tiệt trùng thích hợp để kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm, chọn hàm lượng các chất phụ gia thích hợp để chống lại quá trình chống oxy hóa chất béo và làm tăng độ bền của hệ nhũ tương. Dựa trên các kết quả thu được của các tác giả trên, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao (50% béo), tập trung vào các vấn đề sau: Khảo sát chọn áp suất đồng hóa sữa dừa. Xác định hàm lượng phụ gia để làm tăng độ bền của hệ nhũ tương. Khảo sát chọn hàm lượng chất chống vi sinh vật thích hợp để tăng thêm thời gian bảo quản sản phẩm. Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm của quy trình sản xuất và kiểm tra các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh của sản phẩm. Chúng tôi hy vọng rằng những kết quả thu được sẽ là cơ sở để góp phần triển khai công nghệ sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao vào điều kiện thực tế tại Việt Nam. CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung về dừa: [2], [38] Cây dừa (Cocos nucifera) là một loài cây trong họ cau (Arecaceae). Nó cũng là thành viên duy nhất trong chi Cocos và là một loại cây lớn, thân đơn trục (nhiều khi gọi là nhóm thân cau dừa) có thể cao tới 30 m, với các lá đơn xẻ thùy lông chim 1 lần, cuống và gân chính dài 4–6 m, các thùy với gân cấp 2 có thể dài 60–90 cm. Cây dừa được xem là một loại cây có giá trị kinh tế, mỗi cây trưởng thành có khả năng cho 75 quả mỗi năm. Điều kiện tự nhiên Việt Nam thuận lợi cho việc phát triển cây dừa, nhất là từ vỹ tuyến 20 trở vào. Dừa có thể sinh trưởng trên các loại đất khác nhau, nhưng phát triển tốt trên đất cát có nhiễm mặn nhẹ. Diện tích trồng dừa của Việt Nam hiện nay vào khoảng 220.000 ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh ở miền Trung (Bình Định) và đồng bằng sông Cửu Long (Bến Tre). Đối với quả dừa tươi, thành phần dinh dưỡng quan trọng nhất là nước dừa, còn đối với quả dừa khô, cơm dừa được xem là thành phần giàu giá trị dinh dưỡng và được sử dụng nhiều nhất. Thành phần hóa học của cơm dừa theo USDA được cho ở bảng 1. Hình 1: Quả dừa khô bổ đôi Giới thiệu chung về sữa dừa và công nghệ sản xuất sữa dừa: [31] Sữa dừa Sữa dừa là một dạng chất lỏng màu trắng sữa với thành phần hóa học có chứa nhiều chất như béo, protein, carbohydrate, khoáng…Hàm lượng chất béo trong sữa dừa thường được hiệu chỉnh tùy thuộc vào yêu cầu của từng địa phương và thường nằm trong khoảng 15 – 40% (Pichivittayakarn, 2006). Sữa dừa là một loại sản phẩm được sử dụng phổ biến ở quy mô gia đình và quy mô công nghiệp, đây là một nguyên liệu cần thiết để chế biến các món ăn truyền thống ở các nước Châu Á, đặc biệt là Thái Lan, Malaysia,….(Pichivittayakarn, 2006). Ngoài ra, sữa dừa còn là nguyên liệu sản xuất các sản phẩm như jam dừa, syrup dừa, “phô mai” dừa, đậu hũ dừa (coconut tofu) và một số sản phẩm nước uống như “cocosoy milk”,…Năm 1990, các nhà nghiên cứu ở Philippines đã tạo ra dòng sản phẩm mới bằng cách phối trộn sữa gầy (skim cow’s milk) với sữa dừa. (Seow và Gwee, 1997). Sữa dừa tươi (fresh coconut milk) và sữa dừa sản xuất trong công nghiệp rất dễ bị hư hỏng do vi sinh vật. Ngoài ra, sự tách pha của hệ nhũ trong sữa làm cho sản phẩm bị phân lớp và không đồng nhất. Vì vậy, trong sản xuất sữa dừa thương mại, chúng ta sẽ bổ sung các chất nhũ hoá đồng thời thực hiện quá trình đồng hóa, đóng lon và tiệt trùng nhằm kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Bảng 1: Thành phần hóa học của cơm dừa (USDA, 1995) Thành phầnHàm lượng (tính trên 100g ăn được)Đơn vịNước46.99gNăng lượng354KcalProtein3.33gLipid tổng (fat)33.49gChất khoáng0.97gCarbohydrate15.23gChất xơ9.0g Bảng 2: Thành phần hóa học của sữa dừa theo USDA (1995) Thành phầnHàm lượng (tính trên 100g ăn được)Đơn vịNước53.90gNăng lượng33.0KcalProtein3.63gLipid tổng (fat)34.681gChất khoáng1.15gCarbohydrate6.65gChất xơ2.2g Cơm dừa nạo nhuyễn Quy trình công nghệ sản xuất sữa dừa Trích ly Nước ấm Ép Bã Sữa dừa Sản phẩm Hình 2: Quy trình công nghệ sản xuất sữa dừa có hàm lượng béo cao Lon Phụ gia Nước Bã Tiệt trùng Đóng lon Đồng hoá Phối trộn Gia nhiệt Ly tâm Lọc Thuyết minh một số công đoạn chính trong quy trình công nghệ Trích ly: Cơm dừa sau khi nạo nhuyễn được trích ly trong nước ấm 500C trong 10 phút. Tỷ lệ nước và dung môi là 1:1 Ly tâm: Sau khi ép và lọc, sữa dừa được ly tâm để tăng hàm lượng chất béo. Theo kết quả nghiên cứu của Huỳnh Trung Việt (2006), để thu được sữa dừa hàm lượng béo 50%wt, lực ly tâm cần sử dụng không thấp hơn 880G (N). Phối trộn: Sau khi gia nhiệt, sữa dừa được phối trộn với các phụ gia như các chất nhũ hóa, chất chống oxy hóa, chất chống vi sinh vật và natri metabisulphite nhằm tránh sự tách pha của hệ nhũ, hạn chế quá trình oxy hóa chất béo, kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm hạn chế sự sẫm màu trong quá trình tiệt trùng. Đồng hóa: Quá trình đồng hóa được thực hiện nhằm ổn định hệ nhũ tương, chống lại sự tách pha dưới tác dụng của trọng lực. Sau khi đồng hóa, các hạt cầu béo được xé nhỏ và phân bố đều trong sữa dừa. Thiết bị thường sử dụng hiện nay là thiết bị đồng hóa áp lực cao, hai cấp. Tiệt trùng: Quá trình tiệt trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật và enzyme có trong sản phẩm, kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Theo nghiên cứu của Ngô Minh Hiếu (2007), thông số của quá trình tiệt trùng là 1200C, 30 phút. Quá trình tiệt trùng được thực hiện trong nồi hấp autoclave. Quá trình đồng hóa [6] Giới thiệu chung Đồng hóa là quá trình thường được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Mục đích của quá trình này nhằm ổn định hệ nhũ tương trong thực phẩm, chống lại sự tách pha dưới tác dụng của trọng lực. Đồng hóa được hiểu là quá trình xé nhỏ các hạt phân tán có kích thước lớn tồn tại trong hệ nhũ tương thành những hạt có kích thước đồng đều và nhỏ hơn. Nhũ tương là một hệ phân tán của hai chất lỏng không hòa tan được với nhau nhưng được trộn lẫn. Khi đó, một chất lỏng sẽ tồn tại dưới dạng hạt (được gọi là pha không liên tục, pha phân tán hoặc pha nội) trong lòng của chất lỏng còn lại (được gọi là pha liên tục, pha không phân tán hoặc pha ngoại). Trong công nghiệp thực phẩm, các hệ nhũ tương thường gặp gồm hai chất lỏng đại diện: nước và dầu. Như vậy, ta sẽ có hai dạng nhũ tương cơ bản: Nước trong dầu (water in oil – w/o) trong đó nước ở dạng pha phân tán còn dầu ở dạng pha liên tục. Dầu trong nước (oil in water – o/w) trong đó dầu ở dạng pha phân tán còn nước ở dạng pha liên tục. Hình 3: Hệ nhũ tương nước trong dầu (w/o) và dầu trong nước (o/w) Trong thực phẩm, ta còn có thể gặp một số hệ nhũ tương phức tạp khác như hệ nhũ tương nước trong dầu trong nước (water in oil in water – w/o/w), hay hệ nhũ tương dầu trong nước trong dầu (oil in water in oil – o/w/o)...(Hình 4). Nhìn về mặt nhiệt động lực học thì nhũ tương là một hệ không bền, do đó để tạo độ bền cho nhũ tương, ta có thể cho thêm các phụ gia được gọi là chất nhũ hóa và chất ổn định. Hình 4: Hệ nhũ tương nước trong dầu trong nước (w/o/w) Cơ sở khoa học của quá trình đồng hóa Kỹ thuật đồng hóa hệ nhũ tương bao gồm các phương pháp phá vỡ, làm giảm kích thước những hạt thuộc pha phân tán và phân bố đều chúng trong pha liên tục. Hiện nay có rất nhiều phương pháp đồng hóa được áp dụng trong thực phẩm như: phương pháp khuấy trộn, phương pháp đồng hóa áp lực cao, đồng hóa bằng nghiền keo, bằng siêu âm,…Bảng 3 dưới đây so sánh sơ lược về tính năng cũng như đặc điểm của các phương pháp đồng hóa. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đồng hóa Hiện nay, đồng hóa áp suất cao là phương pháp phổ biến nhất trong công nghệ thực phẩm. Trong phần tiếp theo, chúng tôi sẽ giới thiệu sự ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ quan trọng đến hiệu quả đồng hóa bằng phương pháp sử dụng áp suất cao. Tỷ lệ phần trăm giữa thể tích pha phân tán và tổng thể tích hệ nhũ tương Nếu thể tích của pha phân tán chỉ chiếm một phần nhỏ so với thể tích của toàn hệ nhũ tương thì quá trình đồng hóa sẽ được thực hiện dễ dàng và hệ nhũ tương thu được sẽ có độ bền cao. Ngược lại, hệ nhũ tương với pha phân tán chiếm tỷ lệ cao thường khó đồng hóa bằng các phương pháp thông thường. Bên cạnh đó, các hạt của pha phân tán có xu hướng dễ kết hợp lại với nhau để tạo thành các hạt lớn hơn, từ đó dẫn đến hiện tượng tách pha. Nhiệt độ Nhiệt độ của mẫu càng thấp thì quá trình đồng hóa càng kém hiệu quả do một số chất béo chuyển sang dạng rắn. Ngược lại, nếu nhiệt độ quá cao, chi phí năng lượng cho quá trình sẽ gia tăng và các phản ứng hóa học không cần thiết có thể xảy ra làm ảnh hưởng đến chất lượng của hệ nhũ tương. Do đó, dựa vào thành phần hóa học của hệ nhũ tương mà ta nên chọn nhiệt độ đồng hóa cho thích hợp. Baûng 3: So saùnh caùc phöông phaùp ñoàng hoùa söû duïng ñeå saûn xuaát heä nhuõ töông Phương pháp ñoàng hoùaKieåu hoaït ñoängKieåu doøng chaûy chuû yeáuCöôøng ñoä naêng löôïng E(J.m)  Naêng löôïng (J.m)Kích thöôùc hạt phân tánÑoä nhôùt maãuKhuaáy troän cao toácMeû hoaëc lieân tuïc TI, TV, LVThaáp ñeán cao 1010Thaáp2mThaáp ñeán trung bìnhNghieàn keoLieân tuïc LV (TV) Thaáp ñeán cao 1010 Trung bình1mTrung bình ñeán caoÑoàng hoùa aùp löïc caoLieân tuïc TI, TV (CI) LV Vöøa ñeán cao 1010cao0.1mThaáp ñeán trung bìnhÑaàu doø sieâu aâmMeû hoaëc lieân tuïcCI Vöøa ñeán cao 1010Thaáp0.1mThaáp ñeán trung bìnhTia sieâu aâmLieân tuïc CI Vöøa ñeán cao 1010Cao1mThaáp ñeán trung bìnhVi loûng hoùaLieân tuïc TI, TV Vöøa ñeán cao 102.10cao 18 thì có hoạt tính bề mặt thấp, vì chúng rất kị nước hoặc rất ưa nước. Trong những trường hợp này, người ta sẽ sử dụng kết hợp các chất nhũ hóa để tăng cường khả năng làm ổn định hệ nhũ tương thực phẩm. Chỉ số HLB của một số chất hoạt động bề mặt thường được sử dụng trong thực phẩm được trình bày trong bảng 6. Một trong những hạn chế của khái niệm HLB là không đề cập đến sự ảnh hưởng của nhiệt độ hay những yếu tố khác đến sự thay đổi của tính năng nhũ hóa của các chất hoạt động bề mặt. Nghĩa là một chất hoạt động bề mặt có thể dùng để ổn định hệ nhũ tương này nhưng ở nhiệt độ khác thì nó được dùng để ổn định hệ nhũ tương khác, mặc dù chúng có cùng cấu tạo hóa học. Ngoài ra, chỉ số HLB tối ưu của một chất hoạt động bề mặt dùng để ổn định hệ nhũ tương còn phụ thuộc vào loại dầu được sử dụng. Vì vậy, cần xác định bằng thực nghiệm chỉ số HLB tối ưu cho từng loại dầu khác nhau. Một số chất hoạt động bề mặt thường được sử dụng Monoglyceride Từ năm 1930 đến nay, mono-diglycerides được sử dụng làm chất nhũ hóa. Lần đầu tiên thì mono-diglycerides được sử dụng trong sản xuất magarine. Thuật ngữ monoglycerides thường dùng để chỉ các chất hoạt động bề mặt được sản xuất từ các acid béo và glycerol. Tuy nhiên, trong công nghiệp hoá chất, để thu được các monoglycerides người ta trộn hỗn hợp triglycerides với glycerol, ở nhiệt độ 200 – 2600C với xúc tác là kiềm. Trên thị trường, sản phẩm monoglyceride có độ dài mạch carbon và độ không no khác nhau. Nhìn chung, đây là chất hoạt động bề mặt với chỉ số HLB tương đối thấp (2-5). Cấu trúc phân tử của monoglyceride được trình bày ở hình 8. Bảng 6: Chỉ số HLB của một số chất hoạt động hoá học thường dùng trong thực phẩm Chất hoạt động bề mặtHLBSodium lauryl sulfate40Sodium stearoyl lactylate22Potassium oleate20Sucrose monoester20Sodium oleate18Polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate15.6Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate15.0Sucrose monolaurate15.0Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate14.9Decaglycerol monooleate14Decaglycerol monostearate14Ethoxylated monoglyceride13Decaglycerol dioleate12Polyoxyethylene (20) sorbitan tristearate11Polyoxyethylene (20) sorbitan trioleate10.5Hexaglycerol dioleate9Sorbitan monolaurate8.6DATEM8Soy lecithin8Decaglycerol hexaoleate7Triglycerol monostearate7Sorbitan monopalmitate6.7Glycerol monolaurate5.2Calcium stearoyl lactylate5.1Sucrose trimester5Sorbitan monostearate4.7Propylene glycol monolaurate4.5Sorbitan monooleate4.3Glycerol monostearate3.8Glycerol monooleate3.4Propylebe glycol monostearate3.4Sorbitan tristearate2.1Sorbitan trioleate1.8Glycerol dioleate1.8ACETEM1.5Oleic acid1.0 Hình 8: Cấu trúc phân tử của monoglyceride Ester của polyol với các monoglyceride Các nhóm hydroxyl tự do trong monoglycerides có thể bị ester hoá với các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic, acid citric, acid succinic, diacetyl tartaric,…tạo thành các ester của monoglycerides hay là dẫn xuất ưa nước hay kỵ nước của monoglycerides. Các chất hoạt động bề mặt này bao gồm: Ester của acid acetic với monoglycerides – ACTEM, (E 472a) Ester của acid lactic với monoglycerides – LACTEM, (E 472b) Ester của diacetyl tartaric với monoglycerides – DATEM, (E 472d) Ester của acid succinic với monoglycerides – SMG, (E 472e) LACTEMM SMG DATEM Hình 9: Coâng thöùc phaân töû cuûa LACTEM, DATEM vaø SMG Các chất hoạt động bề mặt thuộc nhóm này ở dạng lỏng hoặc rắn, màu từ trắng đến vàng nhạt Ester của polyol với các acid béo Một dạng ester khác của chất hoạt động bề mặt là ester của polyol với acid béo. Các polyol có thể là: polyglycerol, propylene glycol, sorbitan, polyoxyethylene sorbitan và sucrose; các acid béo có mạch carbon từ 12 – 18, có thể chứa nối đôi (chưa bão hoà). Hình 10: Coâng thöùc caáu taïo cuûa triglycerol monostearate (PGE) vaø sorbitol monostearate (SMS) Tính hòa tan và những đặc tính chức năng của ester của polyol với acid béo phụ thuộc vào kích thước các nhóm ưa nước và kỵ nước trong phân tử: Những chất hoạt động bề mặt thuộc dạng này trong phân tử có đầu polyol lớn (có chứa nhiều nhóm – OH) thì có giá trị HLB cao. Những chất thuộc dạng này với đầu polyol nhỏ (có chứa ít nhóm -OH) sẽ có giá trị HLB thấp. Tỷ lệ ưa nước và kỵ nước trong phân tử có thể thay đổi được bằng việc thay đổi kích thước nhóm polyol. Các ester của sorbitan với các acid béo thường được sử dụng làm chất bề mặt không ion, hòa tan tốt trong dầu, tên thương mại là “Span TM”. Trong khi các ester của polyoxyethylene sorbitan với các acid béo lại được sử dụng làm chất bề mặt dạng không ion, hòa tan tốt trong nước và có tên thương mại là “TweenTM” hay “Polysorbate TM”. Hai chất thuộc dạng này thường được sử dụng kết hợp để tăng cường tính ổn định của hệ nhũ tương. Polymer sinh học có cấu trúc lưỡng cực (amphiphilic biopolymers) Giới thiệu chung: Các biopolymer được sử dụng trong thực phẩm là các protein và polysaccharides. Protein được tạo thành từ các monomer là amino acid, còn polysaccharide được cấu tạo từ các monosaccharide. Tính năng của các biopolymer như độ tan, hoạt tính bề mặt, khả năng tạo gel, tạo đặc…phụ thuộc vào đặc tính phân tử của các monomer như kích thước, khối lượng và trật tự sắp xếp của các monomer. Các monomer có kiểu cấu tạo rất đa dạng về tính cực như: ion, không ion, lưỡng cực. Cả hai loại protein và polysaccharide đều có chứa một số lượng lớn monomer (từ 20 – 20000), các monomer này liên kết đồng hóa trị với nhau và chúng có thể xoay theo một góc bất kỳ, vì vậy, các biopolymer có rất nhiều cấu trúc khác nhau trong dung dịch. Trong thực tế, chúng thường tồn tại ở hình dạng sao cho năng lượng tự do đạt cực tiểu. Hình dạng này phụ thuộc vào các tương tác kị nước, tương tác tĩnh điện, liên kết Hydro, liên kết Van der Waals, entropy… Hình dáng đặc trưng của các polymer sinh học tồn tại trong dung dịch với ba dạng cơ bản sau: dạng ngẫu nhiên (Flexible Random – coli Biopolymer), dạng cuộn thẳng (Rigit Linear Biopolymer) và dạng cầu (Compact Globular Biopolymer) như hình 11. Trong đó dạng cầu có cấu trúc khá cứng chắc trong khi dạng cuộn thẳng có cấu trúc mở rộng còn dạng ngẫu nhiên thì có cấu trúc linh hoạt cao. Trong phân tử, polysaccharide còn có thể phân nhánh trong khi protein thì không. Nói chung, hình dạng của các polymer trong dung dịch rất phức tạp, có thể ở một số vùng thì dạng cầu, vùng khác thì dạng ngẫu nhiên, vùng khác thì dạng cuộn thẳng. Tuy nhiên, hình dạng này có thể thay đổi nếu chịu sự tác động của nhiều yếu tố như: pH, nhiệt độ, ion, các thành phần trong dung dịch…Tóm lại, hình dạng, trạng thái, sự kết hợp là các yếu tố quyết định những thuộc tính chức năng của các polymer sinh học. Chính vì vậy mà các nhà khoa học thường quan tâm đến đặc trưng phân tử của các polymer sinh học trong hệ nhũ tương. Daïng ngaãu nhieân Daïng cuoän thaúng Daïng caàu Hình 11: Hình daïng ñaëc tröng cuûa caùc polimer sinh hoïc coù caáu truùc löôõng cöïc Hoạt tính bề mặt và khả năng làm bền hệ nhũ tương: Thông thường, các polymer sinh học phải phân tán và tan trong dung dịch và sau đó thực hiện chức năng nhũ hóa (McClements, 2002). Sự solvat hóa các biopolymer là cần thiết trước khi đồng hóa để hình thành hệ nhũ tương. Quá trình này bao gồm một số giai đoạn như: phân tán, thấm ướt, hòa tan, trương nở… Sau khi biopolymer được hòa tan, cần đảm bảo điều kiện môi trường để hạn chế sự hợp giọt trong suốt quá trình đồng hóa hoặc sau khi hệ nhũ tương được tạo thành, ví dụ khi sử dụng protein để ổn định hệ nhũ tương, nếu nồng độ muối cao hoặc giá trị pH của hệ gần với điểm đẳng điện của protein thì lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt phân tán không đủ mạnh để chống sự hợp giọt. Hoạt tính bề mặt của nhiều biopolymer phụ thuộc vào tỉ lệ các vùng ưa nước và ưa béo trong phân tử. Khi biopolymer hấp phụ lên bề mặt của hai pha dầu - nước thì các nhóm ưa dầu sẽ nằm trong pha dầu, nhóm ưa nước thì được định vị trong pha nước. Cách phân bố như trên góp phần làm giảm bề mặt tiếp xúc giữa các phân tử dầu và nước tại mặt tiếp xúc giữa hai pha, do đó làm giảm sức căng bề mặt, hình thành một lớp màng bảo vệ, chống lại sự hợp giọt. Hình dạng các polymer và thuộc tính hóa lý của lớp màng bảo vệ phụ thuộc vào cấu trúc phân tử và các tương tác của chúng. Các biopolymer có cấu trúc lưỡng cực dạng ngẫu nhiên và dạng cuộn thẳng phân bố một cách linh hoạt giữa bề mặt pha dầu, pha nước và các vùng tự do, tạo nên màng bảo vệ có cấu trúc dày và hệ nhũ tương ở đây sẽ có độ nhớt thấp; trong khi đó, các cấu trúc dạng cầu phân bố và sắp xếp kém linh hoạt hơn, tạo nên các màng bảo vệ xung quanh các giọt nhỏ có cấu trúc mỏng và hệ nhũ tương được tạo thành sẽ có độ nhớt cao. Điều này có thể giải thích là do các màng bảo vệ các giọt cầu béo hình thành bởi protein hình cầu bền vững hơn so với màng tạo bởi protein của hai dạng còn lại Caùc phaàn kỵ nöôùc Nöôùc Daïng caàu Caùc phaàn kî nöôùc Daïng ngaãu nhieân Daàu Hình 12: Caáu truùc cuûa caùc maøng baûo veä caùc gioït nhoû phuï thuoäc vaøo caáu truùc phaân töû vaø caùc töông taùc cuûa caùc polymer sinh hoïc Một số biopolymer thường được sử dụng làm phụ gia ổn định hệ nhũ tương trong thực phẩm Protein sữa [6], [13] Một số loại protein từ sữa được dùng làm chất nhũ hóa trong thực phẩm như một số loại thức uống, kem, nước sốt…Có thể chia chất nhũ hóa từ protein sữa làm hai nhóm chính là casein (chiếm khoảng 80% wt) và whey protein (chiếm khoảng 20% wt). Casein có thể thu được bằng cách đông tụ sữa còn whey protein là sản phẩm được thu nhận từ quá trình tách huyết thanh trong sản xuất phô mai. Sự kết tủa casein có thể thu được bằng cách điều chỉnh pH gần điểm đẳng điện ( 4,6) của casein hay bằng cách xử lý với enzyme rennet. Enzyme này sẽ cắt phần ưa nước của kappa casein, có vai trò ổn định các mixen casein. Nếu kết tủa bằng acid thì casein và whey thu được gọi là “acid casein” và “acid whey”, còn nếu kết tủa sử dụng enzyme thì casein và whey protein gọi là “rennet casein” và “sweet whey”. Các chất nhũ hóa có nguồn gốc từ sữa được sử dụng trong thực phẩm bao gồm sữa nguyên (whole milk), casein và whey proteins. Trên thị trường, các dạng chế phẩm này được bán dưới dạng bột gồm hai dạng protein concentrate (25 – 80% protein) và protein isolate ( >90% protein), có màu kem nhạt hoặc màu trắng và có mùi nhẹ. Tuy nhiên, các sản phẩm dạng này thường có giá thành cao nên thường chỉ được sử dụng trong nghiên cứu. Có 4 kiểu protein chính trong casein: (~44%), (~11%), (~32%) và (~11%) (Bylund, 1995). Nhìn chung, những phân tử protein này có cấu trúc tương đối ngẫu nhiên và linh hoạt. Phân tử casein cũng chứa những vùng không phân cực và những vùng tích điện cao. Các yếu tố này đóng vai trò chính trong việc xác định cấu trúc phân tử và thuộc tính chức năng của chúng trong thực phẩm. Ở trạng thái tự nhiên, casein tồn tại dưới dạng mixen và có đường kính từ 50 – 250 nm, một phần liên kết với nhau bằng liên kết ion (chẳng hạn như calcium phosphate). Một số tên casein thương mại bao gồm: sodium caseinate, calcium caseinate, acid casein, rennet casein. Khi dùng casein để ổn định hệ nhũ tương, tại các giá trị pH từ 3,3 – 5,3 và nồng độ muối cao, casein sẽ mất hoạt tính nhũ hóa (Srinivasan et al., 2000). Casein bền nhiệt hơn là whey protein. Whey protein cũng là hỗn hợp của nhiều protein. Trong đó các thành phần đáng lưu ý là: -lactoglobulin (~55%), -lactalbumin (24%), serum albumin (5%) và immunoglobulin (15%). Thông thường -lactoglobulin quyết định đặc tính chức năng của whey protein vì nó thành phần tương đối lớn và có những thuộc tính hóa lý đặc biệt. Khi sử dụng whey protein để làm ổn định hệ nhũ tương thì cần lưu ý những nồng độ muối cao, giá trị pH  45,5 và ở các nhiệt độ cao thì hoạt tính nhũ hóa whey protein sẽ mất. Protein thực vật Đậu và ngũ cốc chứa một số protein có khả năng ổn định hệ nhũ tương. Trong đó protein có nguồn gốc từ đậu nành được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi, chế phẩm làm ổn định hệ nhũ tương có nguồn gốc từ đậu nành là protein isolate. Protein từ thịt cá Cá và thịt chứa một số lượng lớn protein có khả năng làm ổn định hệ nhũ tương như gelatin, myosin, actomyosin, actin và một vài loại protein cơ tương. Tuy nhiên, ngoài gelatin thì khả năng nhũ hóa của các protein cơ không được cao. Tinh bột biến tính Tinh bột tự nhiên có thuộc tính hoạt động bề mặt rất thấp. Người ta có thể sản xuất tinh bột biến tính bằng các phương pháp hóa học, gắn thêm các nhóm kỵ nước dọc theo mạch của chúng. Khi đó khả năng hoạt động bề mặt của tinh bột sẽ tăng lên nhiều. Người ta thường sử dụng nhất là dẫn xuất octenyl succinate của tinh bột ngô sáp (waxy-maize). Chúng bao gồm các nhóm amylopectin đã được gắn thêm các nhóm không cực. Khi sử dụng chúng làm chất nhũ hóa thì các nhóm không cực sẽ định hướng về pha dầu và các nhóm ưa nước dọc theo mạch sẽ định hướng về pha nước và chống lại sự kết tụ của các giọt phân tán. Các hệ nhũ tương được ổn định bởi tinh bột biến tính thì bền trong một khoảng pH rộng từ 3 – 9, nồng độ ion cao (0 – 25 mM CaCl2) và khoảng nhiệt độ từ 30 – 900C. Các tinh bột biến tính được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp đồ uống. 2.4.1.2. Chất ổn định: các chất ổn định có bản chất là các chất keo ưa nước. Các chất loại này bao gồm protein và polyssaccharide. Tính công nghệ của các chất keo ưa nước là có khả năng tạo đặc và tạo gel nên chúng được sử dụng làm bền và làm ổn định cấu trúc của các loại thực phẩm. Một số loại keo ưa nước được dùng trong thực phẩm được cho ở bảng 7: Bảng 7: Các loại chất ổn định thường dùng trong thực phẩm Nguồn gốcCác loại keoThực vậtTừ thực vật: cellulose, pectin, tinh bột Nhựa cây: gum arabic, gum karaya, gum ghatti, gum tragacanth Hạt: guar gum, locust bean gum, tara gumĐộng vậtGelatin, caseinate, whey protein, chitosanVi sinh vậtXanhthan gum, curdlan, dextran, gellan gum, celluloseTảoTảo đỏ: agar, carrageenan Tảo nâu: alginate a. Chất tạo đặc (thickening agents) Đặc tính tạo đặc được thể hiện qua khả năng làm tăng độ nhớt của pha liên tục trong các hệ nhũ tương w/o (Mckenna, 2003). Khả năng này làm thay đổi cấu trúc và chỉ tiêu cảm quan của thực phẩm. Các chất tạo đặc tồn tại trong thực phẩm ở dạng những phân tử mở rộng hay những tổng thể phân tử được hydrate hóa. Khả năng tăng cường tính nhớt phụ thuộc vào phân tử lượng, sự phân nhánh, hình dáng và tính linh động của các phân tử. b. Chất tạo gel (gelling agents) Một số keo ưa nước được sử dụng như là một thành phần chức năng trong các nhũ tương thực phẩm, vì khả năng hình thành gel trong pha nước của các sản phẩm. Sự hình thành gel trong thực phẩm tạo nên cấu trúc và thuộc tính cảm quan đặc biệt cho thực phẩm và quan trọng là chống lại khả năng hợp giọt của các phân tử. Một hệ gel tạo bởi biopolymer gồm các biopolymer liên kết với nhau tạo thành một mạng không gian ba chiều nhốt các phân tử nước. Thuộc tính tạo gel phụ thuộc vào kiểu cấu trúc và những tương tác của các chất tạo gel. Có nhiều phương pháp để tạo gel như thay đổi nhiệt độ, pH, lực ion, sử dụng các chất làm biến tính hoặc các chất giúp tạo liên kết ngang. Các biopolymer có thể tạo liên kết ngang với nhau bằng các liên kết đồng hóa trị, liên kết cầu muối, liên kết hydro, liên kết Van der Waals. Các hệ gel trong thực phẩm có thể chia làm hai loại, gel có cấu trúc dạng hạt (particulate gel) và gel có cấu trúc dạng sợi (filamentous gel). Về mặt quang học, gel có cấu trúc dạng hạt thì không trong suốt do nó có các phần tử có kích thước lớn có khả năng chắn sáng mạnh. Trái lại, gel có cấu trúc dạng sợi thì trong suốt và có khả năng giữ nước tốt. Các loại gel có cấu trúc dạng hạt thường gặp là whey protein, protein đậu nành, protein trứng…Các loại gel có cấu trúc dạng sợi thường gặp là gelatin, pectin, agar. Một số chất tạo đặc và tạo gel thường gặp trong thực phẩm * Xanhthan gum: [29], Xanhthan gum là một loại polysaccharide ngoại bào được tổng hợp bởi loài Xanthomonas campestris. Trong nước lạnh, xanhthan gum có thể hòa tan được dễ dàng hình thành nên một dung dịch có độ nhớt cao ở nồng độ rất thấp (khoảng 1%w/w). Vì vậy, xanhthan gum có tính chất như một chất tạo độ nhớt cho hầu hết các dạng thực phẩm dạng lỏng và được gọi là “chất giả dẻo” (pseudoplastic). Xanhthan gum có thể được coi là một dẫn xuất của cellulose. Trọng lượng phân tử của xanhthan gum > 106 Da. Cấu trúc của xanhthan gum được trình bày trong hình 13. Mạch xanhthan gum chứa các liên kết 1,4 của -glucopyranose. Cứ cách một gốc đường, tại vị trí C3 của đường glucose tiếp theo lại gắn một đoạn mạch nhánh trisacchride có cấu trúc -D-GlcpA(1-2)--D-Manp. Gốc đường mannose nối với mạch chính bị acetyl hóa ở C6, còn khoảng 50% đường mannose ở đầu cuối của đoạn mạch nhánh này liên kết với pyruvate thành 4,6-O-(1-carboxyethylidene)-D-mannopyranose. So với các loại biopolymer khác, dung dịch xanhthan gum có độ nhớt rất bền trong một giới hạn nhiệt độ và pH rộng. Bên cạnh đó, dung dịch này có khả năng chống lại một số tác dụng phân cắt của enzyme. Xanhthan gum khi kết hợp với các loại gum khác ở nồng độ nhỏ (từ 0.05 – 1%) có thể gia tăng khả năng tạo độ nhớt. Hình 13: Công thức phân tử xanhthan gum * Carboxymethylcellulose (CMC) CMC là dẫn xuất của cellulose với acid chloroacetic. Cellulose là một polymer tạo nên từ các đơn phân là phân tử đường -D-glucose bởi các liên kết -1,4-glucoside. Thông thường, CMC có thể tan trong cả nước nóng cũng như nước lạnh tạo nên một dung dịch trong suốt, không màu và không có mùi rõ rệt. Cũng như các dẫn xuất của cellulose khác, độ nhớt của dung dịch CMC cũng phụ thuộc vào chỉ số DP (mức độ polymer hóa). Vì CMC tồn tại ở dạng ion trong dung dịch nên độ hòa tan và độ nhớt của CMC phụ thuộc nhiều vào pH. CMC là một ion polymer nên nó có thể tạo phức với protein hòa tan (casein hay soy protein) hoặc xung quanh điểm đẳng điện của protein. Như trên đã nói, độ nhớt của CMC phụ thuộc chủ yếu vào pH, tuy nhiên, nó cũng phụ thuộc vào thành phần và nồng độ của protein, nồng độ và kiểu CMC. Tại pH 6, CMC có thể phản ứng ở nhiệt độ lạnh với protein trong sữa tạo thành phức chất và có thể loại bỏ như kết tủa. Nếu 3 50%58%Carbohydrate> 5%19%Cu< 0,05 mg/kgKhông phát hiệnAs< 0,5 mg/lKhông phát hiệnCd< 1 mg/lKhông phát hiệnHg< 0,05 mg/lKhông phát hiện Như vậy, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh mẫu sữa dừa của chúng tôi cũng phù hợp với các quy định đã được đặt ra. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu được ở trên, chúng tôi đề xuất một số thông số kỹ thuật sử dụng cho quy trình sản xuất sữa dừa có hàm lượng béo cao như sau: * Hàm lượng phụ gia (tính theo % khối lượng nguyên liệu) Xanhthan gum : 0,3% CMC : 0,4% Tween 80 : 0,2% BHT : 0,025% Natri metabisulphite : 0,005% Natri benzoat : 0,05% * Áp suất đồng hóa: 200 bar * Chế độ tiệt trùng: 1200C – 30 phút 5.2. KIẾN NGHỊ Do thời gian thực hiện luận văn có hạn nên nội dung nghiên cứu trong luận văn này chưa thật phong phú. Chúng tôi xin đề nghị các hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài này gồm các nội dung sau Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đồng hóa đến độ bền hệ nhũ tương trong sản phẩm. Tối ưu hóa các thông số của quá trình trong quy trình sản xuất bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm, Hà Nội, 2001, 136 tr. Hoàng Văn Đức, Cây dừa, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 1991 Vũ Chí Hải, Nghiên cứu sản xuất bột sữa dừa hòa tan, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách khoa TpHCM, 2006. Ngô Minh Hiếu, Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Bách khoa TPHCM, 2007, 79 tr. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia TPHCM, 2006, 296 tr. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống – Tập 1 – Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa, NXB Đại học Quốc gia TPHCM, 2004, 296 tr. Tôn Nữ Minh Nguyệt, Bài giảng môn học Hóa học thực phẩm, Đại học Bách khoa TPHCM, 2004 Nguyễn Văn Tuấn, Phân tích số liệu bằng R - Bài giảng môn Tin học trong hóa học Thực phẩm, 2004. Huỳnh Trung Việt, Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại hoc Bách khoa TPHCM, 2006, 72 tr. AOAC (Association of Official Analytical Chemists), Official methods of analysis of AOAC (16th edition), 1996. Bergenstahl, B. A., & Claesson, P. M, Surface forces in emulsions. In K. Larsson & S. E. Friberg (Eds.), Food emulsions (pp. 41–96). New York: Marcel Dekker Inc, 1990. Branen, A.Larry và cộng sự, Food additives, Marcel Dekker Inc., New York and Basel, 2001, 375p Bylund, G., Dairy processing handbook, Tetra-Pak processing systems AB publisher, Lund, 1995, 436p Chiewchan, N. và cộng sự, Effect of homogenizing pressure and sterilizing condition on quality of canned high fat coconut milk, journal of Food Engineering, vol 73, issue 1, 2006, p. 38 – 44. Codex Stand 240, Codex Standard for aqueous coconut products – coconut milk and coconut cream, 2003, 4p Codex Stand A-2-1973, Codex Standard for milk fat products, 2006, 3p Davis, H.T, Factors determining emulsion type: Hydrophile-lipophile balance and beyond. Colloids and surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 91, 1994, p 9- 24. Fernandez, W.L., và cộng sự, Bihourly bacterial plate count of gata (coconut milk) stored for 24h at 300, 200 and 100, Philippine Agriculturist, vol 54, p 202 - 209. Floury, J. và cộng sự, Effect of high – pressure homogenization on droplet size distributions and rheological properties of model oil-in-water emulsions, Innovative Food Science & Emerging Technology 1, 2000, p. 127 – 134. Friberg, S., Larsson, K., Sjoblom, J., Food emulsions, 4th edition. Marcel Dekker, New York, 2000, 624p. Gwee, C.N., New technologies open the passage into new usage of coconut milk products, Food Science and Technology in Industrial Development, vol 1, 1988, p 157 - 162. Hasenhuettl, G.L., Hartel, R.W, Food emusifiers and their Application, Chapman and Hall, New York, 1997, 302p. Jena, S., Modeling of partical size distribution of sonicated coconut milk emulsion: Effect of emulsifiers and sonocation time, Food Research International, Vol 39, 2006, p 606 – 611. Jonsson, B. và cộng sự, Surfactants and Polymers in Aqueous Solution, 2nd, John Wiley & Sons, Chichester, 1998. Kühnhold, V., Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci, Brill Academic Publishers, Vol 8, 2006, p 641 -645. McClements, D.J, Modulation of globular protein functionality by weakly interacting cosolvents, Critical reviews in Food Science, Vol 42, issue 5, 2002, p. 417-471 McKenna, B.M., Texture in food, Vol 1: Semi – Solid Foods. CRC Press, Boca Raton, 2003, 448p Peamprasart, T., Chiewchan, N., Effect of fat content and preheat treatment on the apparent viscosity of coconut milk after homogenization, Journal of Food Engineering, vol 77, issue 3, 2006, p 653 – 658. Philips, G.O, Handbook of hydrocolloid, CRC Press, Cambridge, England, 2000, 450p Pichivittayakarn, W. và cộng sự, Effects og fluid flowrate on coconut milk fouling at pasteurization temperature (700C – 74,50C), Songklanakarin J. Sci. Techol., Vol 28, issue 6, 2006, p.1275 – 1288. Simuang, J., và cộng sự, Effect of heat treatment and fat content on flow properties of coconut milk, Journal Food Enginerr, vol 64, 2004, p 193 – 197. Seow, C.C., Gwee, C.N., Review: Coconut milk: chemistry and technology, International Journal of Foof Science and Technology, Vol 32, 1997, p. 189 – 201. Srinivasan, M. và cộng sự, The effect of sodium chloride on the formation and stability of sodium caseinate emulsion, Food Hydrocolloids, Vol 14, 2000, p 498-507 Stauffer, C.E, Emusifiers, Eagen Press Handbook, St. Paul, MN, 1999, 102p Vitali, A.A, và cộng sự, Rheological behavior of coconut milk, Journal Food Engineer, Proc. App., vol 1, 1985, p33-38 Waisundara, V.I, Effect of pre - treatments of fresh coconut kernels on some of the quality attributes of coconut extracted, Food Chemistry, vol 101, 2007, p771 – 777. Xu, W. và cộng sự, Fat particle structure and stability of food emulsions, Journal of Food Science, vol 63, issue 2, p183-188  HYPERLINK "" www.wikipedia.com PHỤ LỤC Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định hàm lượng chất béo Adam – Rose – Gottlieb Nguyên tắc Trích ly lipid trong mẫu phân tích bằng diethyl ether và petroleum ether trong môi trường NH3 và cồn. Làm bay hơi hết ether, cần lipid và từ đó xác định hàm lượng lipid trong sản xuất. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: Ống ly tâm 50ml, đĩa petri, pipette 10 ml. Thiết bị: cân phân tích chính xác 0,0001g; tủ sấy; máy ly tâm lắng. Hoá chất Dung dịch cồn – NH3, với thành phần như sau: Cồn ethylic 900 : 208,5 ml NH3 đậm đặc : 7,5 ml Nước cất : 250 ml Diethyl ether, nhiệt độ sôi 34 – 350C, không chứa peroxide. Petroleum ether, nhiệt độ sôi 30 – 600C. Các hoá chất sử dụng phải không để lại vết sau khi bay hơi Tiến hành thí nghiệm Cho vào ống ly tâm các thành phần sau: Mẫu sữa dừa : 10 g Dung dịch cồn – NH3 : 10 ml Diethyl ether : 11 ml Petroleum ether : 10 ml Lắc đều hỗn hợp trên rồi đem ly tâm 5500 rpm – 15 phút. Hỗn hợp sau khi ly tâm sẽ chia làm hai lớp. Tách lấy lớp ether bên trên cho vào đĩa petri đã sấy khô và biết trước khối lượng. Tráng lại ống ly tâm bằng petroleum ether. Để đĩa petri bốc hơi hết ether ở nhiệt độ thường rồi cho vào tủ sấy 1050C. Sấy đĩa petri cho đến khối lượng không đổi và đem cân. Tính kết quả Hàm lượng béo tổng trong mẫu sữa dừa X (%) được xác định theo công thức sau: Trong đó: M1: Khối lượng đĩa petri (g) M2: Khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi trích ly lipid và sấy khô (g) M: Khối lượng mẫu đem phân tích (g) (M= 10g) Phương pháp xác định chỉ số Nizo Nguyên tắc Chỉ số Nizo là một chỉ số dùng để xác định hiệu quả của quá trình đồng hoá. Nguyên tắc của phương pháp là xác định tốc độ phân lớp hai pha dầu và nước trong hệ nhũ tương bằng cách sử dụng lực ly tâm. Xác định lượng chất béo có trong 25ml mẫu đem phân tích và 20 ml mẫu ở phần đáy của mẫu sau khi đam ly tâm. Từ đó ta xác định được chỉ số Nizo. Chỉ số Nizo càng cao thì hệ nhũ tương càng ổn định và ngược lại. Thiết bị, dụng cụ Máy ly tâm xác định chỉ số Nizo: tốc độ quay là 1000 rpm, bán kính trục là 250mm Ống ly tâm Cách tiến hành: Lấy 25 ml mẫu sữa dừa đem ly tâm với tốc độ 1000 rpm trong thời gian 30 phút ở 400C. Tách 20 ml mẫu thu được ở phần đáy ống ly tâm để xác định hàm lượng béo theo phương pháp 3.3.2.1 Tính kết quả Chỉ số Nizo được tính theo công thức sau: Trong đó X1: hàm lượng chất béo trong 20 ml ở đáy ống sau khi ly tâm (%) X2: hàm lượng chất béo trong 25 ml mẫu ban đầu (%) Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30  10C trong thời gian từ 48 – 72 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1 ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các hộp nuôi cấy theo các độ đậm pha loãng. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu Mẫu cần được lấy đặc trưng. Lượng mẫu tối thiểu dùng để pha loãng không ít hơn 1 ml đối với sản phẩm lỏng và 10  0,1 g đối với các sản phẩm khác. Thiết bị và dụng cụ Hộp petri đường kính 90 – 100 mm; micropipette; becher 500 ml, erlen 250 ml, ống nghiệm Nồi cách thuỷ điều nhiệt, nồi hấp autoclave, tủ sấy, tủ ấm, máy pH kế. Hoá chất và môi trường Sử dụng môi trường thạch trypton glucose có các thành phần như sau Trypton : 5g Cao men : 2,5g Glucose : 1g Thạch : 15 – 20g Nước cất : 1000 ml Cách pha chế môi trường: đun nhỏ lửa, khuấy đều để hoà tan các chất đến khi sôi. Để nguội môi trường đến 55  50C, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng pH = 7,0  0,2. Rót vào các erlen lượng môi trường không quá ½ dung tích bình. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C – 15 phút. Nếu môi trường sử dụng ngay thì để nguội đến 45  10C ở nồi cách thuỷ. Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở nơi khô ráo, trong bóng tối với nhiệt độ từ 0 – 50C không quá 3 ngày. Trước khi nuôi cấy đun cách thủy cho môi trường nóng chảy và để nguội đến 45  10C. Các bước nuôi cấy Pha loãng mẫu:Tiến hành pha loãng mẫu cho đến khi có được độ đậm pha loãng cần thiết đủ đếm được số khuẩn lạc trên hộp theo dự tính. Đổ hộp Đối với mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất ba độ đậm, mỗi độ đậm dùng 3 hộp petri. Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những độ đậm khác nhau cho vào giữa từng hộp petri. Rót vào mỗi hộp 12 – 15 ml môi trường thạch trypton glucose, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường. Để các hộp thạch đông tự nhiên trên bề mặt ngang. Ủ ấm: Khi thạch đã đông, lật sấp các hộp petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30  10C từ 48 – 72 giờ. Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các hộp đã nuôi cấy. Sau 72 giờ, tính kết quả chính thức. Tính kết quả Chọn tất cả các hộp petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri có độ pha loãng khác nhau cần thiết phải tuân thủ theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc đếm được trên hộp petri phải càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm. Tính N khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm như sau: Trường hợp 1: chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25 -250. Tất các các hộp còn lại có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên. Khi đó, ta chọn hệ số pha loãng tương ứng với hộp petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 để tính kết quả. Công thức tính: Trong đó: C1, C2: số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn d: hệ số pha loãng mẫu Trường hợp 2: chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25 – 250. Tất cả các hộp petri ở các độ pha loãng khác đều có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên. Khi đó ta sẽ chọn độ pha loãng nói trên để tính kết quả Công thức tính: Trong đó: C1, C2: số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn d: hệ số pha loãng mẫu Trường hợp 3: Ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25 đến 250. Khi đó ta phải tính kết quả cho từng độ pha loãng Công thức tính: Trong đó: C: số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn n1, n2: số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai d: hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất Trường hợp 4: Tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25. Khi đó, ta sẽ chọn độ pha loãng thấp nhất để tính kết quả. Trường hợp 5: Tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn 250. Khi đó ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả. Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri. Khi đó, ta sẽ ghi kết quả là ít hơn (1 x 1/d) khuẩn lạc. Chú ý: Tất cả các kết quả đều được làm tròn, chỉ giữ lại hai số có ý nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 x 10n.