Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng gân lá trên mía (yls) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật rt - Pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN MINH NAM NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN MINH NAM Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student A.Professor. Dr. BUI CACH TUYEN NGUYEN MINH NAM Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 LÔØI CAÛM TAÏ Con xin thành kính khắc ghi cù lao của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con đƣợc ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc vƣợt qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn tất khóa luận này. TS. Bùi Minh Trí đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Nguyễn Ngọc Hải, ThS. Trần Nhật Phƣơng đã giúp đỡ em giải quyết những vƣớng mắc trong quá trình thực hiện khóa luận. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. TS. M. Irey (USDA) đã tận tình cung cấp trình tự primers và protocol RT- PCR cho em. TS. Tania (South African Sugarcane Research Institute) và TS. S. Schenck (HARC) đã tận tình cung cấp antiserum của ScYLV cho em. TS. Becky (itdna company) đã cung cấp cho em những tài liệu quí giá. Anh Hà Đình Tuấn và anh Thống ở Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, các anh ở trại giống Đức Huệ, Long An và các hộ dân ở xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các Thầy, Cô và anh chị tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 08 năm 2006 Nguyễn Minh Nam TÓM TẮT Nguyễn Minh Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM. Tháng 9 năm 2006. “NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Quản lý Môi trƣờng và Tài nguyên Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một từ tháng 3/2006 đến tháng 8/2006. Triệu chứng vàng gân lá trên mía do sugarcane yellow leaf virus gây ra, đây là một tác nhân gây bệnh quan trọng. Bệnh này đã xảy ra ở nhiều vùng trồng mía trên thế giới. ScYLV tập trung trong bó mạch libe của cây. Triệu chứng của bệnh thƣờng xuất hiện ở cây trƣởng thành với biểu hiện vàng ở gân lá. Bệnh này có thể đƣợc chẩn đoán dựa vào biểu hiện triệu chứng, kỹ thuật RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi huỳnh quang. Nội dung của đề tài bao gồm: - Phát hiện sự nhiễm ScYLV dựa vào triệu chứng. - Kiểm tra các bó mạch libe của cây có và không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang. - Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi YLS111 và YLS462. Kết quả của đề tài: - Triệu chứng vàng gân lá trên mía đã xuất hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. - Đối với cây có biểu hiện triệu chứng thì bó mạch libe có sự phát huỳnh quang trong khi bó mạch của cây bình thƣờng thì không. - Xây dựng đƣợc qui trình RT-PCR có thể chẩn đoán ScYLV. SUMMARY The thesis entitled “RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD”. This research was conducted from 3th, 2006 to 8th, 2006 in the laboratory of Biological and Chemical Analysis Center of Nong Lam University; Research Center for Environmental Technology and Nature Resource Management of Nong Lam University; and at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. Sugarcane yellow leaf syndrome is caused by sugarcane yellow leaf virus, being a pathogen of economic importance. The disease has been reported to occur in many sugarcane growing area worldwide. Sugarcane yellow leaf virus resides in the phloem of diseased canes. Symptoms of the disease generally appear in maturing plant as a yellowing of the leaf midrib. The disease can be diagnosed by symptoms, RT- PCR, ELISA, TBIA, ISEM, EM or fluorescence microcopy. The objectives of this research are as follows: - To identify ScYLV infecting plants by symptoms. - To examine the phloem of plant with symptom and symptom less plant by light microcopy and fluorescence microcopy. - To diagnose the ScYLV by RT-PCR with YLS111 and YLS462 primers. The results of this research are as follows: - Sugarcane yellow leaf syndrome has been present in sugarcane grown at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. - In plants expressing disease symptom, the vascular bundles presented fluorescence in the phloem while symtomless plants do not have fluorescence. - Finding out the RT-PCR process that can be used for ScYLV diagnosis. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa LÔØI CAÛM TAÏ ........................................................................................................................ i TÓM TẮT .................................................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................................. iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ ............................................................................. vii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2 Mục Đích .................................................................................................................... 2 1.3 Yêu Cầu ...................................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1 Tổng quan về cây mía ................................................................................................. 3 2.1.1 Về cây mía .......................................................................................................... 3 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía ..................................................................... 5 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus ........................................ 7 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía .................................................................................. 7 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus ................................................................................ 9 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá .................................................... 15 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía .......................................... 16 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV ......................................................... 16 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô .......................................... 17 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV ......................................................... 17 2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam ....................................... 25 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới ...................................................... 25 2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam ...................................................... 26 2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR ........................................................................................ 27 2.4.1 PCR ................................................................................................................... 27 2.4.2 RT-PCR ............................................................................................................ 28 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 30 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 30 v 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................................... 30 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................ 31 3.3.1 Máy móc, thiết bị .............................................................................................. 31 3.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 31 3.4 Hóa chất .................................................................................................................... 32 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR ..................................................................... 32 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di ......................................................................... 32 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ............................................ 33 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR ....................................................... 33 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA .................................................................................. 33 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR ............................................................. 35 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa ............................................................................ 35 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 37 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV ............................................. 37 4.2 Kết quả chuẩn đoán dựa vào triệu chứng ................................................................. 39 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ................................................... 39 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng ................................................................... 40 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống .......................................................... 42 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang ................................................. 43 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey ...................................................... 46 4.5 Kết Quả RT-PCR ...................................................................................................... 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 48 5.1 Kết luận .................................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị ..................................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 50 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp: Base pair BYDV: Barley Yellow Dwarf Luteovirus cDNA: complementary DNA CP: Coat Protein DAS-ELISA: Double Antibody Sandswich - ELISA DBIA: Dot-Blot Immunoassay DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleoside Triphosphate dsRNA: double stranded RNA ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay EM: Electron Microscopy g: Gram ha: Hecta ISEM: Immunosorbent Electron Microscopy k Da: Kilo Dalton kg: Kilogram ml: Mililitre µl: Microlitre µm: Micrometre mm: Milimetre MP: Movement Protein mRNA: Messenger RNA NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification nm: Nanometre ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PEMV: Pea enation mosaic virus PLRV: Potato leaf roll virus PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing PVP: Polyvinylpyrrolidone RdRp: RNA dependent RNA polymerase RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCBV: Sugarcane bacilliform virus ScYLV: Sugarcane Yellow Leaf Virus SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSR: Single Sequence Repeat ssRNA: Single stranded Ribonucleic Acid TIBA: Tissue Blot Immunoassay UTR: Untranslated Region YLS: Yellow Leaf Syndrome vii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ........................................................... 39 Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng ....................................................... 40 Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống .................................................................................................... 42 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ...................................................... 39 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng ................................................................ 41 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống ............................................................... 43 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới .......................................................................... 8 Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính ....................................................................... 9 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. ......................... 11 Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của Luteovirus thuộc nhóm phụ I và II ............................... 12 Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV ............................................... 14 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang.. ......................... 19 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía ........................... 20 Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) ........................... 21 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh ..................... 22 Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV ........................... 22 Hình 2.11. Phân tử Beacon ....................................................................................................... 23 Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR ............................................................................... 27 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR ........................................................................................ 29 Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ....................................................................... 37 Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 .............................................................. 37 Hình 4.3. Cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. .................................................................... 38 Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) ................. 38 Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. ..................... 44 Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) ................ 45 Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) ................................. 45 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR. ......................................................................... 46 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ......................................................................................... 47 iv PHẦN 1. MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ở nƣớc ta hiện nay mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Ngoài ra, mía còn là cây có sản lƣợng cao (có thể đạt tới 200-250 tấn sinh khối/1ha/năm) và hiệu quả kinh tế cao nên mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân (Trần Văn Sỏi, 2003). Tuy nhiên trở ngại lớn trong quá trình canh tác cây mía là bệnh dịch, đặc biệt nhất là bệnh do virus. Trong đó, bệnh do Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) đang là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở nhiều nƣớc trên thế giới. Virus này đƣợc phát hiện và công bố ở hơn 30 nƣớc trên khắp thế giới nhƣ South Afica, Swaziland, Malawi và Zimbabwe (Bailey et al., 1996), Mauritius (Anon 1996, Saumtally and Moutia, 1997), USA và Australia (Borg et al., 1997), Brazil (Anon., 1995), Cuba (Arocha, Y., Gonzalez, L., Peralta, E. L., and Jones, 1999) (trích bởi Schenck, 2001), Ecuador (Freddy, 2006), … Sugarcane yellow leaf virus gây thiệt hại kinh tế lớn trên các vùng trồng mía, thiệt hại ƣớc tính khoảng 40-60% ở Brazil và hơn 20% ở các vùng khác. Việc chẩn đoán sự nhiễm virus và đƣa ra các biện pháp phòng trừ có ý nghĩa kinh tế rất lớn. Diện tích trồng mía ở nƣớc ta lớn, triệu chứng vàng lá do virus Sugarcane yellow leaf virus cũng đã xuất hiện ở nhiều nơi. Tuy vậy, hiện nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào cụ thể đánh giá sự hiện diện và phân bố cũng nhƣ nguồn gốc của virus này ở nƣớc ta. Việc chẩn đoán và đánh giá tình hình, sự hiện diện nguồn gốc và phân bố của Sugarcane yellow leaf virus là rất cần thiết trong việc hạn chế và phòng ngừa thiệt hại do virus này gây ra tại Việt Nam. Với thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật RT-PCR”. 2 Mục đích ­ Đánh giá tình trạng nhiễm virus ScYLV trên tập đoàn giống gốc và tập đoàn giống mới nhập nội từ Thái Lan tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng và các tỉnh Bình Dƣơng, Đồng Nai, Long An dựa vào triệu chứng đặc trƣng của bệnh vàng gân lá. ­ Kiểm tra thiết vật từ gân và bản lá mía bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bƣớc sóng 510nm, từ đó thiết lập mối tƣơng quan giữa kết quả quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang và triệu chứng vàng gân lá trên mía. ­ Thực hiện quy trình RT-PCR để phát hiện virus ScYLV. Yêu cầu ­ Nắm vững các triệu chứng của bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra. ­ Phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các thiết vật có triệu chứng vàng gân lá và thiết vật không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. ­ Nắm vững nguyên tắc và cách tiến hành phản ứng RT-PCR. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây mía 2.1.1 Về cây mía 2.1.1.1 Phân loại học Theo phân loại thực vật cây mía thuộc: Ngành: Spermatophyta Lớp: Monocotyledneae Họ: Gramineae Loại: Saccharum Trong loại Saccharum có năm loài: - Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) - Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) - Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) - Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) - Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) 2.1.1.2 Nguồn gốc a. Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) Số nhiễm sắc thể 2n = 80. Loài này có nguồn gốc từ các đảo phía nam Thái Bình Dƣơng (Niu Ghinê), chỉ có nguồn gốc trong mía trồng không thấy ở dạng hoang dại. b. Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) Số nhiễm sắc thể 2n = 134. Loài này có nguồn gốc ở Trung Quốc, Miến Điện, Ấn Độ, miền bắc Việt Nam. c. Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) Số nhiễm sắc thể 2n = 92. Loài này có nguồn gốc ở bắc Ấn Độ. d. Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) Số nhiễm sắc thể 2n = 112. Loài này mọc dã sinh từ sƣờn núi Himalaya đến vùng Nam Ấn Độ. Từ một nhóm thực vật nhỏ Saccharum spontaneum đã phát triển thành một quần thể rộng lớn bao gồm nhiều loại hình khác nhau. Grassl đã lập một bảng gồm 16 loại hình Saccharum spontaneum khác nhau. e. Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) 4 Số nhiễm sắc thể 2n = 84. Loài này mọc dã sinh ở vùng nhiệt đới, ở Niu Ghinê (Trần Văn Sỏi). 2.1.1.3 Vị trí kinh tế của cây mía Hiện nay ở nƣớc ta mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Đƣờng là thức ăn lành tính dễ tiêu, giàu năng lƣợng. Một cân đƣờng cung cấp năng lƣợng tƣơng đƣơng với 0,5 kg mỡ; 50-60 kg rau quả. Đƣờng cung cấp 10% nhu cầu năng lƣợng của cộng đồng. Trên thế giới năng lƣợng do đƣờng cung cấp bằng 7% năng lƣợng do các loại ngũ cốc cung cấp (Trần Văn Sỏi, 2003) Đƣờng có thị trƣờng tiêu thụ ổn định do nhu cầu về đƣờng trong nƣớc ngày càng tăng cao. Đƣờng lại là mặt hàng chế biến bằng công nghệ hiện đại nên chất lƣợng ổn định, dễ dàng đạt tiêu chuẩn quốc tế, cho nên nếu sản xuất nhiều sẽ xuất khẩu ra bất cứ nƣớc nào trong khu vực. Vì vậy nên ngƣời trồng mía không có gì lo ngại về thị trƣờng tiêu thụ. Mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao. Do mía là cây hàng năm, thích hợp với nhiều loại đất, bộ rễ bám sâu nên có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên đất đồi và trung du miền núi. Vì mía có khả năng lƣu gốc tới vụ sau nên đỡ công và giống trồng. Mía là cây có sản lƣợng cao (200-250 tấn sinh khối/1ha/năm). Nhờ những ƣu thế trên mà cây mía trở thành cây làm giàu cho nhiều gia đình, nhiều khu vực nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi, … Mía là cây năng lƣợng cuối thế kỷ XX và về sau. Do nguồn nhiên liệu địa khai ngày càng cạn kiệt trong khi nhu cầu năng lƣợng trên thế giới càng tăng nên việc tìm ra một nguồn nguyên liệu thay thế có ý nghĩa rất quan trọng. Nguồn năng lƣợng từ thực vật là hƣớng đƣợc nhiều quan tâm vì đây là nguồn năng lƣợng tái tạo đƣợc hàng năm không bao giờ cạn kiệt. Trong đó, cây mía đƣợc coi là cây năng lƣợng hàng đầu trong các loại thực vật có thể sản xuất năng lƣợng lỏng. Từ một tấn mía có thể sản xuất ra 35-50 lít cồn 960, có thể dùng làm nhiên liệu cho động cơ. Ở Brazil từ lâu ngƣời ta đã sản xuất cồn từ mía để thay thế xăng chạy ô tô vận tải. Mía là cây kiêm dụng, ngoài đƣờng, cellulose trong bã mía có thể làm giấy, làm gỗ ép thay cho một phần gỗ rừng. Mía là cây ngắn ngày lại là cây đặc biệt cao sản nên rất có nhiều triển vọng trong lĩnh vực này. 5 Mía với thành phần hóa học rất phong phú nên ngày càng đƣợc nhiều ngành công nghiệp quan tâm khai thác. Saccarose đƣợc ngành đƣờng khai thác để sản xuất đƣờng trắng. Cellulose đƣợc ngành giấy và ngành gỗ ép khai thác. Mật rỉ trong quá trình lên men, chƣng cất và các phƣơng pháp hóa học khác có thể sản xuất ra rƣợu các loại, cồn tinh khiết, acid lactic, acid nitric, acid glutamic, men thực phẩm, … 2.1.1.4 Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía Việc sử dụng cây trồng nhƣ một nhà máy sinh học có năng suất cao đòi hỏi cả một hệ thống chuyển biến nạp và khả năng sản xuất, tích lũy ở mức độ cao các protein tái tổ hợp có giá trị kinh tế cao. Wang và cộng sự (2001) đã tạo ra cây mía chuyển gene tạo ra protein dƣợc liệu có giá trị cao là granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM_CSF). Trên một vài dòng mía đã tạo ra tới 0,03% protein tổng số giống GM-CSF. GM-CSF đƣợc sản xuất từ mía có hoạt tính tự nhiên đƣợc chỉ ra trong thử nghiệm sự tăng sinh tế bào xƣơng ngƣời. Dịch trích từ mía kích thích sự phân chia của tế bào tủy xƣơng (TF-1). 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía 2.1.2.1 Peanut Clump Furovirus Peanut Clump Furovirus (PCV) gây bệnh đốm đỏ trên lá mía đã đƣợc công bố đầu tiên bởi Baudin và Chatenet (1988). Biểu hiện triệu chứng do Peanut Clump Furovirus gây ra thƣờng biến đổi và phụ thuộc vào giống (Baudin và Chatenet, 1988; Baudin và cộng sự, 1994; Rott, 1996). Các triệu chứng thƣờng là xuất hiện những sọc vàng úa với những đốm vàng hay đỏ. Toàn bộ lá sẽ trở thành màu nâu hơi vàng (Braithwaite, 2001). 2.1.2.2 Sugarcane Bacilliform Badnavirus Công bố đầu tiên của dạng virus hình que trên mía là ở Cuba (Rodriguez-Lema và cộng sự, 1985). Sau đó, Lockhart và Autrey (1988) đã công bố rằng dòng Mex.57- 473 trồng ở Morocco và Hawaii và CP44-101 từ Morocco đã chứa virus hình que tƣơng tự banana streak virus (BSV) đƣợc tìm ra gần đó (Lockhart, 1986). Virus có tên là sugarcane bacilliform virus (SCBV) có quan hệ gần với BSV và chúng đƣợc chứng minh là cùng thuộc một loại virus (Lockhart và Olszewski, 1993). Triệu chứng của SCBV thì thƣờng biến đổi và không chắc chắn. Sự đồng nhiễm của SCBV và các virus khác đã đƣợc nhận thấy. Tất cả các dòng nhiễm với sugarcane mild mosaic virus đều nhiễm SCBV (Lockhart và cộng sự, 1992). 6 Ảnh hƣởng của SCBV với năng suất trên mía không đƣợc xác định rõ ràng. Sinh khối sinh ra ở giống mía CP63-588 bị nhiễm SCBV giảm đáng kể từ 23-31% trong khi sinh khối sinh ra tăng ở giống CP65-357 bị nhiễm SCBV. 2.1.2.3 Sugarcane Mild Mosaic Closterovirus Trong quá trình kiểm tra SCVB trên mía bằng kính hiển vi điện tử ngƣời ta đã thấy những dạng hạt dài khúc khuỷu ở Mauritius và Mỹ. Những hạt này trƣớc đây không đƣợc biết đến trên mía và xuất hiện tƣơng tự với Closterovirus. Virus này ban đầu có tên là sugarcane clostero-like virus, nhƣng bây giờ nó đƣợc gọi là sugarcane mild mosaic closterovirus (SCMV; Lockhart và cộng sự, 1992). 2.1.2.4 Ramu Streak Ramu streak đƣợc phát hiện đầu tiên ở vùng đất Ramu, Papua New Guinia vào giữa những năm 1980 nhƣng nó không đƣợc coi là vấn đề cho đến năm 1993 khi nó xuất hiện trên giống Casius (Magarey và cộng sự, 1996). Triệu chứng của Ramu streak tƣơng tự với bệnh sọc vàng trên mía. Ảnh hƣởng của bệnh lên năng suất thì không đƣợc biết đến. 2.1.2.5 Reovirus ở Nam Phi Một bệnh mới đã đƣợc tìm thấy ở Nam Phi năm 1994 (Bailey, 1996). Những nốt nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá và bẹ lá nhƣng thƣờng thƣa thớt và không dễ nhận thấy. Bệnh này không biểu hiện ảnh hƣởng trên cây trƣởng thành. Những hạt virus hình cầu có thể đƣợc quan sát bởi kính hiển vi điện tử từ những nốt bệnh. Hạt virus này có chứa dsRNA và primer của RT-PCR đƣợc thiết kế cho Fiji disease virus (FDV) có thể đƣợc sử dụng để tạo ra sản phẩm PCR. Triệu chứng, kích thƣớc, hình dạng virus và bộ gene RNA sợi đôi (dsRNA) chứng tỏ rằng virus mới này tƣơng tự với FDV và thuộc nhóm Reovirus. 2.1.2.6 Fijivirus Nguyên nhân của bệnh Fiji trên mía là do họ Reoviridae. Bệnh này thƣờng xảy ra ở Australia. Nó đƣợc truyền bởi vector là Perkisiella sp. planthoppers. Bệnh này đƣợc phát hiện dựa vào triệu chứng, RT-PCR hoặc ELISA. 2.1.2.7 Sugarcane mosaic virus (SCMV) Đây là virus đƣợc phân bố rộng rãi, nhƣng sự đột phát thƣờng bị giới hạn ở những vùng lạnh. Sự mất mùa có thể lên tới trên 20%. Bệnh này có thể đƣợc phát hiện dựa vào triệu chứng hoặc kỹ thuật ELISA, PCR, RFLP. 7 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía 2.2.1.1 Nguyên nhân Triệu chứng vàng gân lá đã đƣợc biết đến từ lâu với những tên gọi khác nhau nhƣ “Yellow wilt” ở châu Phi (Ricaud, 1968; Siddiqi, 1969; Rogers, 1970) và “autum decline” ở Brazil (Hughes, 1964) (trích bởi Lockhart và cộng sự, 2000). Triệu chứng này cũng đã đƣợc nhận thấy ở Hawaii trong những năm 1980 và sau đó là nhiều nƣớc khác trên khắp thế giới (Comstock và cộng sự, 2002; Izaguirre-Mayoral và cộng sự, 2002; Lockhart và cộng sự, 1996; Lockhart và Cronje, 2000; Vega và cộng sự, 1997; Viswanathan, 2002). Nhƣng đến những năm 1980 ngƣời ta mới biết rõ về nguyên nhân gây bệnh (Schenk và Hu, 1991; Comstock và cộng sự, 1994). Có hai tác nhân liên quan đến triệu chứng vàng lá trên mía. Một là Sugarcane Yellow Leaf Virus (ScYLV) (Lockhart và cộng sự, 1996; Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000) và tác nhân còn lại là Sugarcane yellows phytoplasma (ScYP) (Cronjé và cộng sự, 1998). Tuy nhiên một vài báo cáo khác chỉ ra rằng triệu chứng tƣơng tự cũng có thể bị gây ra bởi côn trùng, stress sinh lý, thời tiết, một vài phản ứng chống stress và một vài yếu tố vô sinh khác (Bailey và cộng sự, 1996; Matsuoka và Meneghin,1999). 2.2.1.2 Sự phân bố địa lý Bệnh vàng gân lá do ScYLV hiện nay đƣợc báo cáo là hiện diện ở nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Argentina, Australia, Barbados, Brazil, Colombia, Cuba, Dominican Republic, El Salvador, Guadeloupe, Guatemala, Hawaii, India, Iran, Jamaica, Kenya, Martinique, Mexico, Morocco, Mozambique, Nicaragua, Peru, Réunion, Senegal, Nam Phi, Swaziland, Thailand, Uganda, Mỹ, Venezuela, Zambia, Zimbabwe, … (Lockhart và cộng sự, 2000) (hình 2.1). 8 Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới (Nguồn: Salem Saumtally và cộng sự) 2.2.1.3 Triệu chứng Triệu chứng đặc trƣng của bệnh vàng gân lá giống nhau ở tất cả mọi nơi. Gân lá màu vàng tƣơi, đặc biệt ở trên bề mặt và đỉnh của lá trở nên vàng, sau đó hoại tử. Hoại tử lan rộng xuống bản lá cho tới khi toàn bộ lá bị nhiễm. Thƣờng thì lá non nhất không có biểu hiện triệu chứng, nhƣng màu vàng xuất hiện ở những lá thứ tƣ hoặc thứ năm và những lá già hơn. Những cây non thƣờng không biểu hiện trên đồng ruộng mặc dù những cây non trong nhà kính đôi khi có những triệu chứng đặc trƣng dƣới những điều kiện stress (Schenck, 2001). Trong một vài trƣờng hợp thì mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già. Mặt trên của gân lá có thể vẫn giữ màu bình thƣờng (trắng hoặc trắng hơi xanh) hoặc có thể trở vàng, hồng hay hơi đỏ. Sự đổi màu của gân lá thƣờng xảy ra trong khi bản lá vẫn giữ màu xanh. Ở một số giống màu vàng của lá có thể ảnh hƣởng tới toàn bộ lá. Sự thay đổi sang màu vàng cũng có thể lan rộng ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ chóp lá phát triển tới bản lá. Triệu chứng này thƣờng tạm thời và nhạt dần khi cây bắt đầu đƣợc chăm sóc tốt. Sự biểu hiện triệu chứng vàng gân lá trên mía rõ ràng hơn ở những cây trƣởng thành và những cây bị stress. Sự biểu hiện triệu chứng liên quan đến giống, nhiệt độ 9 lạnh hoặc yếu tố stress khác và cây bị nhiễm trên đồng thƣờng không có biểu hiện triệu chứng (Schenck và cộng sự, 2001). Đối với những cây có triệu chứng YLS thì brix cao hơn từ 2 đến 3 lần so với những cây khỏe mạnh. Vega và cộng sự (1997) đã nhận thấy sự tích lũy fenola trong mạch libe, điều đó chứng tỏ có sự rối loạn chức năng của mạch dẫn. Ở những vùng lá khác nhau thì sự giảm tổng lƣợng đƣờng, hàm lƣợng chlorophyl và sự vận chuyển đƣờng đã đƣợc nhận thấy giữa cây có triệu chứng và cây không có triệu chứng nhiễm với virus ScYLV. 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 2.2.2.1 Virus ScYLV Sugarcane yellow leaf virus là một virus mới đƣợc mô tả gần đây, nó nhiễm vào mía và gây ra triệu chứng vàng gân lá (YLS) (Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000). Hạt virus ScYLV có đƣờng kính từ 24-29 nm trong sodium phosphatungstate ở pH5 (hình 2.2). Nó có tỉ trọng là 1,30g/cm3 trong Cs2SO4 và chứa 5,8 kb ssRNA. Protein vỏ có trọng lƣợng 27 kDa và không chứa glycosylate. (Scagliusi và Lockhart, 2000). Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính hiển vi điện tử (24-28nm), tỉ lệ thƣớc 100nm. (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000) 10 2.2.2.2 Huyết thanh học Kháng huyết thanh từ barley yellow dwarf lueovirus (BYDV) kiểu huyết thanh (serotype) PAV, MAV và RPV đã đƣợc kiểm tra cho phản ứng huyết thanh với mô mía bị nhiễm ScYLV (Vega và cộng sự, 1997). Kết quả cho thấy có mối quan hệ huyết thanh học giữa BYDV-PAV và ScYLV. Bằng việc in những vết cắt mô gân lá lên màng nitrocellulose và xử lý chúng với huyết thanh miễn dịch BYDV-PAV, phản ứng miễn dịch dƣơng tính đã đƣợc nhận thấy trong những tế bào libe của những bó mạch (Vega và cộng sự, 1997). Kết quả dƣơng tính chỉ nhận thấy ở những cây bị nhiễm với ScYLV, nhƣng không bao giờ thấy ở những cây khỏe mạnh đƣợc trồng bằng hạt trong nhà kính. Huyết thanh miễn dịch đặc hiệu cho ScYLV đƣợc Lockhart nghiên cứu từ virus đã đƣợc tinh sạch (Scagliusi và Lockhart, 2000). Hiện nay nó đã đƣợc sản xuất thành công từ những mẫu ở nhiều nơi để phát hiện ScYLV bằng cả kỹ thuật ELISA và TBIA (Schenck, 2001). 2.2.2.3 Sự truyền nhiễm của ScYLV Quá trình thử truyền mầm bệnh từ dịch trích của cây mía bị nhiễm với ScYLV vào cây khỏe mạnh và các cây thảo mộc khác thì không thành công (Borth và cộng sự, 1994; Lockhart và cộng sự, 1996 (trích bởi Schenck, 2001); Scagliusi và Lockhart, 2000). Một vài loài rệp ở trên mía đã đƣợc kiểm tra khả năng truyền virus và kết quả là rệp mía Melanaphis sacchari và rệp lá bắp Rhopalosiphum maidis (hình 2.3) là vector của ScYLV trong khi rệp vàng lá mía thì không (Angel và cộng sự, 2006; Scagliusi và Lockhart, 2000; Schenck và Lehrer, 2000). Virus này không bị truyền bởi những hạt thuần hay bởi phƣơng tiện cơ giới mà chỉ có thể lan rộng trên cánh đồng bởi hạt của những cây đã bị nhiễm hoặc bởi những vector (Schenck và cộng sự, 2001). Con rệp bắp (Rhopalosiphum maidis) thƣờng ở trên cây bắp và nó ít khi phá hoại trên cây mía. Theo Schenck và cộng sự (2001) rệp này cũng truyền ScYLV ở tỷ lệ thấp. Rệp ở rễ cây lúa (Rhopalosiphum rufiabdomilanis) đã truyền ScYLV từ cây lúa bị nhiễm ScYLV sang cây lúa không bị nhiễm nhƣng không truyền virus từ mía sang mía (Schenck và cộng sự, 2001). 11 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. (Nguồn: http//:ipm_ncsu_edu-AG295-pics-corn_leaf_aphid_gif.htm) 2.2.2.4 Thời gian và không gian phân bố của ScYLV Ở Lousiana thời gian gia tăng nhanh nhất của ScYLV xảy ra vào cuối mùa thu và đầu mùa hè cùng với sự gia tăng và bắt đầu tàn phá của loài rệp mía Melanaphis sacchari (McAllister và cộng sự, 2006) Ở Hawaii YLS thƣờng xuất hiện nhất vào những tháng mùa hè do stress bởi nƣớc. Ở Florida triệu chứng này biểu hiện do hạn hán, úng nƣớc và lạnh vào mùa đông. Triệu chứng bắt đầu xuất hiện với những gân lá từ thứ 3 đến thứ 6 (tính từ ngọn xuống) trở nên vàng khi thời tiết bắt đầu trở lạnh vào tháng 10 và 11. Sau đó màu vàng lan ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ đỉnh lá lan ra bản lá vào tháng 12 cho đến cuối mùa thu hoạch vào tháng 3. Từ tháng 1 đến tháng 3 toàn bộ cánh đồng trở thành màu vàng (Comstock và Miller, 2003). Borg (1997) đã báo cáo rằng YLS hiện diện rõ ràng nhất suốt những tháng lạnh ở Australia và cũng tƣơng tự ở Brazil. 2.2.2.5 Những kí chủ khác của ScYLV Các cây bắp, lúa, lúa mì, lúa mạch, yến mạch đƣợc lây nhiễm với ScYLV qua rệp đƣợc kiểm tra nhƣ là những kí chủ khác của ScYLV. Những cây này đƣợc trồng từ hạt trong các chậu và đƣợc chủng với những rệp mía có mang virus. Kết quả cho thấy các cây đều có thể bị nhiễm virus (lúa mì (wheat) 96,5%, yến mạch (oat) 94,6%, lúa 12 mạch (barley) 93,7%) nhƣng chỉ có một tỉ lệ thấp của cây lúa và bắp đƣợc kiểm tra là dƣơng tính (lúa (rice) 8,5%, bắp (corn) 10,5%) (Schenck và cộng sự, 2001). 2.2.2.6 Những nghiên cứu về bộ gene của ScYLV Dựa trên những phân tích trình tự nucleotide, ScYLV đƣợc xếp là một giống mới trong họ luteoviridae. Virus này cũng có những đặc tính của giống polerovirus, luteovirus và enamovirus (Moonan và cộng sự, 2000; Smith và cộng sự, 2000). Tuy nhiên, nó đƣợc mô tả rõ ràng là một loài khác vì những đặc tính sinh học độc nhất và sự khác biệt ở mức độ phân tử mà nó đƣợc xem là sự tái tổ hợp giữa các loài khác nhau (Moonan và cộng sự, 2000; Smith và cộng sự, 2000). Dựa vào trình tự và sự sắp xếp của các khung đọc mở (ORF), luteovirus đƣợc chia thành hai nhóm phụ (subgroups I và II). Trình tự bộ gene của ScYLV đã đƣợc chứng minh là thuộc bộ gene của nhóm phụ II (hình 2.4). Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của luteovirus thuộc nhóm phụ I và II (Nguồn: Schenck, 2001) Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của bộ gene ScYLV đƣợc phân lập từ Ấn Độ đã đƣợc xác định. Bộ gene RNA này dài 5899 nucleotide bao gồm 6 khung đọc mở (ORF): ORF1 (72,5 kDa): mã hóa cho protein đa chức năng. ORF2 (64.4 kDa): mã hóa cho RNA polymerase không phụ thuộc RNA (RdRp). ORF3 (21.8 kDa): mã hóa cho protein vỏ (CP). ORF 4 (16.6 kDa): mã hóa cho protein di chuyển giả định p17. ORF5 ORF3 ORF1 ORF2 ORF4 ORF6 5’ 3’ Subgroup I ORF1 ORF4 ORF0 ORF2 ORF5 5’ 3’ Subgroup II 13 ORF5 (52.1 kDa): mã hóa cho yếu tố truyền aphid giả định. ORF0: chức năng chƣa biết. Sự so sánh protein vỏ và trình tự 17kDa cho thấy ScYLV có quan hệ gần với virus trong giống luteovirus. Dựa trên trình tự ở đầu 5’ của ScYLV thì thấy nó tƣơng tự với giống polerovirus, trong khi trình tự ở đầu 3’ thì gần với giống luteovirus. Đây là những mô tả đầu tiên về đặc điểm phân tử của ScYLV ở Ấn Độ (Gaur và cộng sự, 2003). Moonan và cộng sự (2000) đã giải trình tự bộ gene ScYLV. Dựa trên trình tự nucleotide mới của ScYLV và trình tự của luteovirus hiện tại, đồng thời sử dụng phƣơng pháp luận tiến hóa và phát sinh chủng loài để tìm vùng tƣơng đồng của bộ gene luteovirus. Kết quả cho thấy tỷ lệ thay thế các nucleotide và tạo ra loài mới của luteovirus là có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê. Kết quả cũng chỉ ra rằng Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1), Soybean dwarf virus (SbDV), và ScYLV biểu hiện biến dị phát sinh chủng loài địa lý (spatial phylogenetic variation (SPV)) phù hợp với sự tái tổ hợp xảy ra giữa hai tổ tiên là luteovirus và polerovirus sau khi có sự phân li di truyền của hai nhóm tổ tiên này. Toàn bộ trình tự RNA gồm 5895 nucleotide của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida (ScYLV-F) đã đƣợc giải trình tự bao gồm 6 ORF (Smith và cộng sự, 2000). Kết quả cho thấy, đầu 5’ thuộc vùng không dịch mã (UTR, untranslated region) bắt đầu với trình tự ACAAAA thì phù hợp với motif ở đầu 5’ của polerovirus. Bộ gene của ScYLV-F đƣợc sắp xếp giống nhƣ ở poleovirus. ORF0 của ScYLV-F bắt đầu ở codon AUG thứ nhất trong trình tự và nó mã hóa cho một protein 30,2 kDa. ORF1 của ScYLV-F mã hóa cho một protein 72,5 kDa tƣơng tự với gene tƣơng đƣơng ở trên bộ gene của polerovirus và Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1; enamovirus) cũng mã hóa cho một protease. ORF2 của SCYLV-F hầu nhƣ tƣơng đồng với những gene RNA polymerase không phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polymerase (RdRp)) của poleroviruses sobemoviruses, barnaviruses và PEMV-1. Đầu 5’ của ScYLV-F RdRp overlap trên khung đọc 1 ở nucleotide 460. Có một trình tự heptamer, 5’GGGAAAC3’ ở trên overlap ở vị trí 1753 và trình tự ở đầu 3’ của motif heptamer có thể là ở dạng kẹp tóc (pseudoknot) (hình 2.5). Các trình tự này ở trên overlap của ORF 1 và 2 thì đƣợc bảo 14 tồn trên bộ gene của polerovirus và PEMV-1 và cho phép khung đọc dịch chuyển ribosomal 1 từ gene ORF1 đến gene RdRP. Heptamer và pseudoknot có thể là có cùng vai trò trong bộ gene của ScYLV-F và vì thế mà ORF 1 và 2 của ScYLV-F có thể đƣợc dịch mã liền nhau, sự dịch chuyển khung đọc tạo ra protein dung hợp (fusion protein) 120,6 kDa. ORF3 hầu nhƣ tƣơng đồng với gene mã hóa protein vỏ (CP; 22 kDa) của BYDV-PAV. Tƣơng tự ORF4 cũng tƣơng đồng với gene mã hóa protein vận chuyển (MP) (Smith và cộng sự, 2000) của BYDV-PAV. Cũng nhƣ trên bộ gene của các luterovirid khác, gene mã hóa protein vận chuyển (ORF4) nằm hoàn toàn trong trình tự mã hóa ORF3, trong khung đọc 1. Đầu N của protein vỏ (CP) (ORF3) của ScYLV-F thì giàu arginine và gene CP của ScYLV-F kết thúc với một đột biến vô nghĩa, giống nhƣ tất cả các gene CP ở các luteovirid khác và codon này đƣợc theo sau bởi codon đầu tiên của gene mã hóa protein RT (read-through, đọc xuyên: kiểu phiên mã di truyền mà việc tổng hợp RNA của một operon lại bắt đầu từ khởi điểm operon khác) (ORF5). Trình tự quanh vùng đột biến vô nghĩa đƣợc bảo tồn cao (Smith và cộng sự, 2000). . Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV (Nguồn: Smith và cộng sự, 2000) ORF0 của ScYLV mã hóa cho protein 30kDa có ít amino acid tƣơng đồng với các protein P0 của những polerovirus khác. Trong 3 protein P0 của polerovirus (PLRV, BWYV và CABYV) ảnh hƣởng đến sự tích lũy của virus cũng nhƣ sự kìm hãm của posttranscriptional gene silencing (PTGS). Sử dụng Nicotiana benthamiana 15 với cấu trúc GFP reporter, protein P0, và PTGS, Albert và cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng protein P0 của SCYLV cũng im lặng ở vị trí PTGS bị gây ra bởi cấu trúc sense GFP (sGFP). Không giống nhƣ protein P0 của BWYV, PLRV và CABYV, protein P0 của SCYLV ức chế ảnh hƣởng của PTGS bởi sGFP nhƣng nó không đƣợc gây ra bởi cấu trúc inverted repeat GFP (irGFP). Phân tích chức năng protein P0 bằng cách xóa bỏ cấu trúc P0 của SCYLV cho thấy protein này có nhiều vùng cần thiết cho chức năng ức chế của protein này. Thấm lá với protein P0 của SCYLV, kết quả là xuất hiện những vết hoại tử ở trên những đốm đƣợc thấm, sự hủy bỏ hoạt tính ức chế cũng mất đi sự hoại tử, điều đó chứng tỏ những hoạt tính này có thể đƣợc liên kết. Những nghiên cứu về đa dạng di truyền gần đây đã thừa nhận sự tồn tại một vài kiểu gene của ScYLV. Để xác định và mô tả chính xác các kiểu gene của ScYLV, Abu và cộng sự (2006) đã giải trình tự toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion). Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này. Những cặp primer đặc hiệu đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR. Kết quả cho thấy một vài kiểu gene của ScYLV có thể cùng tồn tại trên một vùng địa lý hoặc trên cùng một cây (Abu Ahmad và cộng sự, 2006). 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá ScYLV là một tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley, Colombia. Trong năm 2004, tỉ lệ nhiễm virus này trên toàn bộ cánh đồng trồng mía nguyên liệu là 12,2% (S, J.C Angel và cộng sự, 2006). Ở Brazil virus này đã nhiễm 25% trên giống SP 71-6163 và 750 000 ha trên toàn bộ diện tích trồng mía (Vega và cộng sự, 1997). Giống SP 71-6163 mẫn cảm cao với ScYLV, ƣớc tính làm mất 40- 60% lƣợng đƣờng (Lockhart và cộng sự, 1996). ScYLV đã hiện diện trên toàn bộ các cánh đồng mía công nghiệp ở Lousiana (McAllister và cộng sự, 2006). Năng suất giảm 15 đến 20% cũng đã đƣợc báo cáo do ScYLV ở Louisiana (Grisham và cộng sự, 2002). Sự giảm năng suất (lƣợng đƣờng trên đơn vị diện tích) ở giống LCP 82-89 cao nhất ở vụ gốc thứ hai là 23% (Grisham). Ở Florida có ít nhất 65% diện tích trồng mía thƣơng mại bị nhiễm với ScYLV (Irey và cộng sự, 1997; ). Ở Nam Phi và Hawaii ảnh hƣởng của YLS trên mía đã làm giảm đáng kể hàm lƣợng phức hợp polysaccharide (gums) đƣợc tách chiết (Lockhart và cộng sự, 2000). 16 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía Marker phân tử liên kết với tính kháng đã đƣợc sử dụng để chọn lọc kiểu gene của những cá thể và có thể cung cấp công cụ để xác định tính kháng ở trên mía. Mục tiêu là tìm những quần thể có những cá thể kháng lại bệnh vàng lá. Kết quả là tìm thấy 39 dòng trong quần thể lai Green German x Ind 81-146 là không có bệnh SCYLV trong suốt quá trình thí nghiệm (Comstock và cộng sự, 2005). Comstock và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về marker phân tử liên kết với tính kháng bằng cách sử dụng microsatellite primer. Mục đích là phát triển phƣơng pháp xác định các dòng kháng với ScYLV một cách nhanh chóng và chính xác. Với 216 microsatellite primer đã xác định đƣợc 12 cây nhiễm và 11 cây kháng từ quần thể 65 cây con lai từ Green German (nhiễm) và IND 81-146 (kháng). Trong số 216 microsatellite primer có 167 primer cho ra ít nhất 4 band. Kết quả đã chỉ ra rằng có 3 band đa hình microsatellite liên kết với tính kháng ScYLV. Phân tích kiểu gene trên 47 cây con cho thấy có 2 loci SSR liên kết với tính kháng nhƣng không liên kết với locus SSR khác. Trên một vài giống mía có khả năng kháng lại với ScYLV và tính kháng này có thể di truyền đƣợc (Schenck và Lehrer, 2001). Những nghiên cứu về tính kháng trên mía đã chỉ ra rằng các giống CC 84-75, CC 87-505, PR 61-632 mẫn cảm với ScYLV, nhƣng giống CC85-92 thì kháng tốt với ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). Ở Hawaii các giống H 78-4153, H 78-3567, H 78-7750 và H87-4319 đƣợc báo cáo là kháng với ScYLV (Schenck và Lehrer, 2000). Các giống mía mới, Saccharum officinarum ít mẫn cảm (nhƣ là S. robustum. Saccharum spontaneum, S. sinensis và Erianthus sp.) thƣờng không có virus ở trên cánh đồng mía ở Maunawili, nó đƣợc cho là liên quan đến tính kháng (Schenck và cộng sự, 2001). 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV Giống mía kháng ScYLV có thể đƣợc tạo ra thông qua biến nạp. Sự bất hoạt gene đƣợc coi nhƣ một cơ chế phổ biến cho sự kháng của cây trồng đối với sự nhiễm của virus. Bất hoạt gene sau sao mã (posttranscriptional gene) đã đƣợc hƣớng tới trong cây mía bởi biến nạp với vùng không giải mã của ScYLV. Bộ gene của ScYLV và chức năng các protein của virus đã đƣợc biết đến (F. Moonan, 2000), vì thế chiến lƣợc tạo ra cây mía kháng ScYLV có thể dễ dàng. 17 Giống H62-4671 đã đƣợc biến nạp với một vùng trình tự DNA không dịch mã (non-traslatabe DNA sequence piece) của protein vỏ virus mà nó làm bất hoạt gene RNA của virus để chống lại sự nhiễm virus. Mía có một hệ thống bất hoạt gene rất hữu hiệu (Y. J. Zhu, 2003). Phôi phát sinh từ mô sẹo của giống lai CC 84-75 đƣợc bắn với plasmids pFM395 và pFM396 chứa một đoạn DNA mã hóa protein vỏ của ScYLV. Những cây đã biến nạp đƣợc ủ với ScYLV bởi Melanaphis sacchari. Sự nhiễm đƣợc kiểm tra sau một vài tháng bằng kỹ thuật TBIA và RT-PCR. Kết quả thu đƣợc 37 cây từ 66 cây đƣợc kiểm tra là âm tính với ScYLV (Rangel và cộng sự, 2005). 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Có 3 phƣơng pháp để loại bỏ virus đƣợc sử dụng là xử lý nhiệt, nuôi cấy mô, xử lý bằng hóa chất. Tuy nhiên, xử lý nhiệt và hóa chất thì không có hiệu quả trong việc loại bỏ virus ScYLV (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Có thể tạo cây sạch ScYLV bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (M. Chatenet và cộng sự, 2001; Y. Parmessur và cộng sự, 2002). Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng là phƣơng pháp hiệu quả nhất trong việc sản xuất cây sạch virus và cũng là phƣơng pháp đƣợc chọn để loại bỏ virus khỏi cây bị nhiễm. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng có thể tạo ra 92% cây sạch virus, nhƣng chỉ đạt 29% khi nuôi cấy bằng chồi đỉnh (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, theo Parmessur (2002) khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng chỉ tạo ra 64% cây sạch virus, chỉ có 6% khi nuôi cấy bằng chồi nách. Nhƣng khi nuôi cấy từ mô sẹo sẽ tạo ra 100% cây sạch virus (Y. Parmessur và cộng sự, 2002). 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV 2.2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhƣng đặc biệt hơn là chúng mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu chứng này giúp ta chẩn đoán khá chính xác các bệnh do virus. Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: nhóm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhóm chỉ thị theo hệ thống (systemic). Nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC. Nhóm chỉ thị theo hệ 18 thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). 2.2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bên ngoài: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những lá cuối, mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chóp lá, … Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những