Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesteron

ñộng dục và 87 % thụ thai (Nguyễn Xuân Tịnh và cộng sự, 1996) [14]. e- ðặc ñiểm của kháng nguyên progesteron Progesteron là hormone, giống nhau và có ở tất cả các ñộng vật có vú, vì thế tự nó không thể là kháng nguyên, bản thân nó khi tiêm vào cơ thể con vật không có khả năng kích thích sinh ra kháng thể. Mặt khác, trọng lượng phân tử progesteron nhỏ (PTL = 314,5 Dal). Vì vậy, progesteron muốn trở thành kháng nguyên phải gắn với chất mang (Ví dụ: Albumin huyết thanh) mới có thể mẫn cảm miễn dịch sinh kháng thể. Trong trường hợp này, epitope kháng nguyên mang tải sẽ ñược trình diện cho tế bào T hỗ trợ CD4 còn hapten ñược trình diện cho tế bào T hay tế bào B tùy theo nó gây ñáp ứng miễn dịch tế bào hay dịch thể (Vũ Triệu An, 1998) [01]. 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Hiện nay có hai phương pháp chính ñịnh lượng hormon progesteron ñó là phương pháp ñịnh lượng sinh học và phương pháp miễn dịch cạnh tranh. Phương pháp miễn dịch cạnh tranh dựa trên nguyên tắc cạnh tranh kháng nguyên trong phản ứng liên kết kháng nguyên – kháng thể. Trong ñó, phương pháp ñược sử dụng nhiều nhất trong ñịnh lượng miễn dịch enzyme là ELISA, 34 phương pháp này cho phép xác ñịnh chính xác và nhanh hormon ở nồng ñộ thấp từ ng/ml ñến pg/ml trong huyết thanh, sữa và nước tiểu. a- Trên thế giới Ứng dụng phương pháp ELISA, EIA ñể xác ñịnh hàm lượng progesteron trong sữa và huyết thanh của gia súc cái với mục ñích: - Xác ñịnh hàm lượng progesteron trong thời gian ñộng dục (Maurice. J at al, 1981) [31; (Nakao at al, 1983) [32]; (VanDe Wiel D.F.M at al, 1996) [35]. - Xác ñịnh hàm lượng progesteron trong máu ñể chẩn ñoán có thai sớm ở lợn (Wu.L.S at al, 1997) [36]. - Xác ñịnh hàm lượng progesteron ñể chẩn ñoán nguyên nhân gây chậm sinh và ñiều khiển chu kì sinh dục ở gia súc (Nakao at al, 1983) [32]. b- Trong nước - Ứng dụng kĩ thuật RIA ñể ñịnh lượng progesteron trong huyết thanh trong các trường hợp bò có buồng trứng kém phát triển, bò bị viêm buồng trứng, bò có u nang buồng trứng, buồng trứng có thể vàng tồn lưu, bò bị viêm tử cung ñã cho hiệu quả cao, hạn chế thiệt hại cho người nuôi trâu bò tại khu vực thành phố HCM (Chung Anh Dũng và cộng sự, 2001) . - Ứng dụng kĩ thuật EIA, ELISA xác ñịnh hàm lượng progesteron ñể xác ñịnh nguyên nhân gây chậm sinh ñối với bò cái nuôi tại Ba Vì và khu vực ngoại thành Hà Nội (Phan Văn Kiểm và cộng sự, 2003) [13]. - ðịnh lượng progesteron trong huyết thanh trâu (Trần Tiến Dũng, 2003)[06] nhằm xác ñịnh nguyên nhân gây chậm sinh của gia súc cái. 35 36 3. ðÔI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðỐi TƯỢNG 3.1.1. ðộng vật thí nghiệm Thỏ dòng Newzealand, chuột nhắt trắng dòng BALB/c. Thỏ và chuột thí nghiệm ñược nuôi trong ñiều kiện tiêu chuẩn ở khu chăn nuôi của Viện CNSH. 3.1.2. Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma) Dòng Sp2/0– Ag14 (gọi tắt Sp2/0) và dòng P3X - Ag18 (gọi tắt P3X) nhận từ ngân hàng tế bào ATCC (American Type Culture Collection). 3.1.3. Các thiết bị thí nghiệm - Tủ nuôi tế bào (Sanyo, Nhật) có ñiều hòa nhiệt ñộ và CO2 tự ñộng. - Tủ cấy vô trùng sử dụng ñèn cực tím và màng lọc 0,25µm. (Microflow, Anh) - Chai lọ nuôi cấy, pipet các loại của Costar và Corning. - Kính hiển vi soi ngược (Olyimpus, Nhật) với ñộ phóng ñại 5 – 20×20. - Buồng ñếm tế bào (Newbauer, ðức). - Máy ño ELISA (Thermo labsystem, ðức). - ly tâm lạnh (Hermje -ðức) 3.1.4. Các hóa chất thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy - DMEM (Dulbeco Modifie Medium) - RPMI 1640 - FBS (Fetal Bovine Serum) - HAT (Hypoxanthine aminopterin thimidine) medium
Hóa chất thí nghiệm - PEG (Polyethylene glycol) -FCA ( Freund complex Adjuvant) 37
Kháng nguyên P3- BSA (Progesteron – 3 – (O – carboxymethyl) – oxim – BSA. Các hóa chất này ñều do hãng Sigma, Gybco BRL cung cấp, ngoài ra còn có các hóa chất thông thường khác. 3.1.5. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu Thời gian từ 01/01/2008 ñến 30/07/2008 ðịa ñiểm nghiên cứu: phòng Công nghệ tế bào ñộng vật- Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội. 3.2. NỘI DUNG 3.2.1. ðánh giá kết quả gây ñáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA 3.2.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng progesteron 3.2.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron 3.2.4. Chọn lọc dòng tế bào sinh kháng thể có tính ñặc hiệu và ñộ nhậy cao. 3.2.5. Gây báng cho chuột 3.2.6. Kiểm tra hiệu giá kháng thể 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Gây miễn dịch cho chuột Theo phương pháp của Milstein và Kohler năm (1975), có cải tiến theo Eryl Liddell và A.Cryer, (2000) [28]. Trộn kháng nguyên P3 - BSA với một lượng cùng thể tích của tá dược Freund,s adjuvant có tác dụng làm tăng hoạt tính kháng nguyên. Lượng P3- BSA ñược pha chế có nồng ñộ sao cho thể tích tiêm cho mỗi chuột mỗi lần bằng 0,2ml. Ban ñầu, chuột cái BALB/c (6 tuần tuổi) ñược tiêm dưới da ở 4 vị trí dọc theo lưng. Chuột ñược tiêm nhắc lại vào dưới da bụng với cùng một lượng P3 - BSA lúc 2 và 4 tuần sau lần tiêm thứ nhất. Các mẫu máu ñược lấy từ ñuôi 38 hoặc hốc mắt ở các khoảng thời gian sau mỗi lần tiêm bồi và tách huyết thanh ñể theo dõi hình thành kháng thể bằng ELISA. Chuột ñược tiêm bồi lần cuối cùng với lượng P3 - BSA trong 0,1ml dung dịch sinh lí không trộn với tá dược vào ven ñuôi lúc 3 ñến 4 ngày trước khi lấy tế bào lách ñể dung hợp với tế bào myeloma. 3.3.2. Phương pháp lấy ñại thực bào Theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000)[31] Giết chuột, khử trùng chuột trong cồn 70o. Tiêm vào xoang bụng 3ml dung dịch PBS. Dùng bơm tiêm và hút dung dịch trong xoang bụng ra, ñưa vào ống li tâm. Lặp lại như trên 3 lần. Dịch hút ra từ xoang bụng có chứa tế bào ñược kiểm tra dưới kính hiển vi. Cho dịch tế bào li tâm ở tốc ñộ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau li tâm, hút bỏ dịch nổi, hòa lại cặn (tế bào) với 10 ml dung dịch PBS. Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cùng cặn tế bào ñược hòa trong 1ml DMEM FBS 10%. ðếm tế bào, pha ñiều chỉnh sao cho dịch tế bào có mật ñộ 103 tế bào/ml, trong môi trường DMEM 10% FBS. 3.3.3. Phương pháp lấy tế bào lympho B của chuột Theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000)[31] Giết chuột ñã ñược gây miễn dịch bằng P3 - BSA, khử trùng chuột bằng cồn 70o. Tách lấy thùy lách và các hạch vào ñĩa petri có sẵn 10ml dung dịch PBS. Dùng kéo cắt lách và các hạch thành từng mảnh nhỏ, gạt nhẹ ñể các tế bào rời ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống li tâm, dùng pipet paster hút lên, ñẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. ðể dung dịch lắng cặn, hút lấy dung dịch tế bào sang một ống li tâm khác. Li tâm dung dịch tế bào ở tốc ñộ 1000 vòng/phút trong 5 phút, Sau ñó loại bỏ hết dịch nổi và hòa cặn tế bào trong 10ml PBS. Lặp lại thao tác này 3 lần, lần cuối cùng hòa cặn tế bào với DMEM có bổ sung 10% FBS sao cho có mật ñộ 108 tế bào/ml. 39 3.3.4. Nuôi cấy tế bào myeloma dòng Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18 a- ðánh thức và nhân nuôi tế bào myeloma: Chuyển ống tế bào từ trong nitơ lỏng vào cốc nước 36oC – 37oC. Khi dung dịch bên trong ống cất ñã tan ñá hoàn toàn, lau khử trùng phía ngoài bằng cồn 70o. Chuyển dung dịch bên trong ống sang một ống li tâm, tiến hành li tâm với tốc ñộ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dịch nổi chứa DMSO. Hòa tan cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy rồi chuyển tế bào sang chai nuôi cấy thích hợp. Sau ñó ñể chai nuôi vào tủ ấm 37oC, 5%CO2. Sau khi tế bào ñược ñánh thức thành công, phát triển bình thường, không bị nhiễm khuẩn, nhân nuôi ñể ñạt ñược lượng tế bào cần thiết 104- 105 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Trung bình sau 2- 3 ngày môi trường phải ñược thay mới. Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển tế bào ñã thay ñổi. Nếu môi trường không ñược thay ñúng lúc, tế bào sẽ chết. ðể thay môi trường trước hết cần ly tâm, hút bỏ môi trường cũ, tiếp ñó ñưa từ 5- 7 ml môi trường nuôi cấy phù hợp. ðể tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuôi. b, Bảo quản tế bào trong lạnh sâu Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không bị nhiễm tạp khuẩn. ðổ bỏ môi trường cũ thay vào ñó là môi trường mới, dùng pipet hút lên ñẩy xuống cho tế bào rời ñều trong môi trường. Hút dung dịch tế bào sang ống li tâm, li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ dịch nổi, hòa cặn tế bào với môi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào trong ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi ñạt ñược – 25oC thì ñưa nhanh ống cất vào lạnh – 70oC, sau 20 giờ chuyển vào bình N2 lỏng. 3.3.5. Dung hợp tế bào và tách dòng Dung hợp: Hỗn dịch tế bào lympho B (nồng ñộ 106/ml) ñược ñưa vào cùng với tế bào myeloma . Sau ñó thêm vào 1ml PEG khuấy kĩ trong 1 phút, 5 phút sau thêm vào 3,5 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và ủ qua ñêm ở 37oC 5%CO2, li tâm hỗn dịch tế bào, hòa cặn vào 30ml môi trường 40 huyết thanh có bổ sung HAT và phân phối vào các giếng của ñĩa nhựa Falcon 0,1ml. Sau dung hợp từ 5 – 7 ngày thêm vào mỗi giếng 0,1 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi van dùng phản ứng ELISA ñể phát hiện kháng thể mong muốn. Chọn tế bào từ các giếng có hiệu giá kháng thể cao ñể tách dòng. Tách dòng: Sau khi kiểm tra khả năng tạo kháng thể bằng ELISA, ta biết ñược giếng nào có kháng thể, tuy nhiên ñây là kháng thể ña dòng do nhiều dòng tế bào lai tạo thành. ðể có kháng thể ñơn dòng ta phải tiến hành tách dòng như sau: - Chọn 1 giếng mà dịch nổi có hiệu giá kháng thể cao nhất trộn ñều các tế bào trong giếng ñã chọn thành hỗn dịch tế bào thuần nhất. Hút hỗn dịch tế bào sang ống li tâm có chứa môi trường phát triển ñể pha loãng tế bào sao cho nồng ñộ chỉ ñạt 1 tế bào/ 100µl. - Chuyển tế bào ñã pha loãng sang nuôi trong các giếng ñã có tế bào nuôi, sau ñó chuyển vào nuôi trong tủ ấm CO2 ở ñiều kiện tiêu chuẩn. - Thay môi trường cho tế bào 2 ngày một lần. - Sau khi tế bào phát triển tốt (gần kín ñáy), kiểm tra lại hiệu giá kháng thể. Chọn ra giếng có hiệu giá kháng thể cao nhất nhân lên với lượng lớn ñể bảo quản hoặc tiêm vào ổ bụng chuột, thu dịch báng. 3.3.6. Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể ñơn dòng Quy trình sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể ñơn dòng với nồng ñộ cao tiến hành theo các bước sau ñây: 1. Tiêm cho chuột BALb/c 4 tuần tuổi 0,5 ml pristane vào ổ bụng. 2. Sau 14 ngày, tiêm vào ổ bụng mỗi chuột từ 1-3x106 tế bào lai hoà trong PBS 0,01M chứa ion Ca++ và Mg++. 3. Theo dõi chuột khi nào bụng phồng to chứa nhiều dịch báng thì dùng bơm tiêm vô trùng hút thu hoạch dịch. Sau khi thu hoạch, chuột lại ñược nuôi tiếp ñể tạo dịch báng mới. Có thể thu hoạch dịch báng 4 -5 lần từ mỗi chuột. 41 4. Li tâm dịch ở tốc ñộ 2000 v/phút 10 phút, 4oC. Thu nước nổi ñể làm các bước tiếp theo. 3.3.7. Phương pháp tinh sạch kháng thể Quy trình tinh sạch kháng thể ñược tiến hành bằng phương pháp kết tủa với sulphat amon theo Liddell và Cryer, (1978) [28]. ðược tiến hành theo các bước sau: 1. Nhỏ từ từ sulphat amon bão hoà vào dịch nuôi tế bào hay dịch báng ñể có nồng ñộ 45% sunphat amon bão hoà. Khuấy ở nhiệt ñộ 40C, 30 phút. Sau ñó ly tâm 1000 vòng/phút, 15 phút ở 40C. 2. Rửa phần kết tủa bằng dung dịch sunphat amon bão hòa có nồng ñộ 45% trong PBS và ly tâm 2000 vòng/phút, 15 phút ở 40C. 3. Hoà phần kết tủa vào một thể tích PBS bằng thể tích dịch nuôi tế bào ban ñầu và ly tâm 5000 vòng/phút, 15 phút ở 40C ñể loại bỏ chất thô không hoà tan. 4. Chuyển nước nổi sang ống nghiệm mới, kết tủa lại IgG bằng cách bổ sung sunphat amon bão hoà vào nước nổi ñể ñạt tới nồng ñộ 40% sunphat amon bão hoà. Ly tâm 1000 vòng/phút, 15 phút, 40C. 5. Hoà tan chất kết tủa vào 1 lượng nhỏ PBS (0,5 ml) thẩm tích trong 5lit PBS ở 40C qua ñêm. 6. Xác ñịnh nồng ñộ protein và bảo quản ở -700C Lượng dung dịch sunphat amon bão hoà bổ sung vào mỗi ml dịch nuôi tế bào ñể có nồng ñộ sunphat amon mong muốn ñược tính theo công thức sau: 1 × (Sf – Si) V = 1 – Sf Trong ñó: V: Lượng dung dịch sunphat amon bão hoà tính bằng ml Sf: Nồng ñộ sunphat amon cần ñạt Si: Nồng ñộ sunphat amon ban ñầu 42 Ví dụ: Cần nồng ñộ sunphat amon bằng 45% Theo công thức: 1 (0,45 – 0) 1-0,45 = 0,82 ml 3.3.8. Phương pháp ELISA Nguyên lí: Dùng kháng thể (kháng thể 1) liên kết với kháng nguyên sau ñó liên kết với (kháng thể 2) gắn enzyme, tiếp ñó cho cơ chất vào, cơ chất sẽ bị enzyme tác ñộng tạo nên màu (do enzyme phân hủy cơ chất). Phản ứng ELISA gián tiếp gồm các bước sau: 1- Phủ bản bằng 100 µl kháng nguyên P3- BSA (KN) trong coating buffer ở 4o C qua ñêm (nồng ñộ 125 ng KN/giếng). Kháng nguyên P3 - BSA sẽ gắn cố ñịnh trên bề mặt của bản. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer ñể loại bỏ những KN không gắn vào bề mặt bản. Che chắn bản bằng 300 µl washing buffer + 1% skim milk trong 1h ở 37oC. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer. 2- Bổ sung kháng thể 1 (dịch nổi của môi trường nuôi cấy) ñã pha loãng 5000 lần bằng washing buffer + 1% sữa. Ủ ở 37oC trong 1 giờ. Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer loại bỏ những kháng thể không liên kết ñặc hiệu với KN. 3- ðưa vào mỗi giếng 100µl kháng thể 2 gắn enzyme peroxidase ñược pha loãng 10 000 lần trong ñệm washing buffer + 1% sữa. ðem ủ bản ở 37oC trong 1 giờ. Rửa bản 10 lần bằng Washing buffer 4- ðưa vào mỗi giếng 100 µl dung dịch cơ chất TMB. Ủ bản ở 37oC trong 10 phút. 5- Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 50 µl H2SO4 6- ðo giá trị OD (mật ñộ quang học) bằng ELISA reader. 43 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Quy trình chọn lọc và tạo dòng tế bào sinh kháng thể ñơn dòng có chất lượng cao là quy trình hết sức phức tạp, gồm nhiều giai ñoạn, do ñó cần hoàn thiện phương pháp cho từng giai ñoạn. Trước hết chúng tôi cần xác ñịnh lượng kháng nguyên thích hợp với ñộng vật thí nghiệm ñể có ñáp ứng miễn dịch tối ưu nhằm thu ñược tế bào sinh kháng thể tốt. Sau ñó là quy trình dung hợp tế bào lympho B với tế bào Myeloma. Cuối cùng là việc nhân nuôi và chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể có chất lượng cao bằng phương pháp ELISA. 4.1. ðánh giá kết quả gây ñáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA Tám chuột cái BALB/c ñược chia làm 4 lô thí nghiệm và gây miễn dịch như sau: Sau thời gian gây miễn dịch cho chuột theo quy trình gây miễn dịch ñã trình bày ở phần phương pháp, chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu của từng chuột thí nghiệm, tách huyết thanh của chuột trong mỗi lô thí nghiệm, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp ñể so sánh khả năng ñáp ứng miễn dịch của các cá thể tức là khả năng sinh kháng thể kháng progesteron. Phản ứng ELISA ñược sử dụng ñể phát hiện sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh. Ở cá thể chuột ñã ñược gây miễn dịch sẽ sinh kháng thể kháng ñặc hiệu progesteron, kháng thể này ñược kiểm tra bằng phản ứng ELISA. ðể tiến hành phản ứng ELISA gián tiếp cần phải có: kháng nguyên ñã biết, kháng thể cần kiểm tra có thể kết hợp ñặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme, cơ chất. Quan sát màu thay ñổi khi ñưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tác dụng của enzyme. 44 ðọc kết quả bằng máy ño mật ñộ quang học (OD) tương ứng với bước sóng của màu thể hiện. kết quả phản ứng ELISA ñược trình bày ở bảng 1: Mỗi mẫu huyết thanh của chuột ñược thử nghiện trong 11 giếng (n=11) trên khay ELISA có 96 giếng. Bảng 1. Kết quả ñáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm Lô thí nghiệm I II III IV Chuột số 1 2 3 4 5 6 7 8 Lượng KN(µg/lần) 50 50 100 100 200 200 300 300 Giá trị OD trung bình (n=11) {{ 2,412 ±0,02 1 1,998 ±0,01 8 3,015 ±0.02 4 3,004 ±0.02 7 3,548 ±0.02 5 3,942 ±0.03 5 3,540 ±0.02 9 3,538 ±0.03 6 ðối chứng (-) 0,30 (BSA 0.1% ñược sử dụng làm ñối chứng âm) Phản ứng ELISA hay phản ứng miễn dịch ñánh dấu enzyme là phản ứng dùng enzyme gắn vào kháng thể (gắn Enzym) kết hợp với kháng kháng thể 1 kháng nguyên, dùng cơ chất thích hợp ñể phát hiện. Nếu lượng enzyme ñược giữ lại càng nhiều thì màu thể hiện càng rõ, giá trị OD càng lớn (cũng có nghĩa lượng kháng thể cần xác ñịnh càng nhiều). Nếu trong mẫu không có kháng thể cần xác ñịnh thì không có enzyme nên phản ứng màu không xảy ra. Trong các thí nghiệm ñược thực hiện, chúng tôi sử dụng cơ chất là TMB, enzyme gắn kháng thể là peroxidase, khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì phản ứng sinh màu xanh da trời, màu vàng xuất hiện khi dừng phản ứng bằng 45 H2S04. Bước sóng hấp phụ của màu tương ứng là 450 nm khi ñọc kết quả bằng máy ño mật ñộ quang học (OD). Từ kết quả bảng 1 cho thấy: + Với liều 50 µg P3- Al/ con/ lần thì giá trị OD của mẫu huyết thanh ñược kiểm tra của chuột số 1 là 2,142 ±0,021, của chuột số 2 là 1,998 ±0,018 + Với liều 100 µg/ con/ lần cho giá trị OD ở mẫu cần kiểm tra của chuột số 3 là 3,015 ±0,024, chuột số 4 là 3,004 ±0,027 + Với liều 200 µg/ con/ lần thì giá trị OD ở mẫu huyết thanh kiểm tra của chuột số 5 là 3,548 ±0,025, mẫu huyết thanh của chuột số 6 cho giá trị OD là 3,942 ±0,035 + Với liều 300 µg/ con/ lần thì giá trị OD ở mẫu huyết thanh kiểm tra của chuột số 7 là 3,540 ±0,029, mẫu huyết thanh của chuột số 8 cho giá trị OD là 3,538 ±0,038 Giá trị OD phản ánh hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Giá trị OD càng nhỏ chứng tỏ hàm lượng kháng thể càng ít và ngược lại giá trị OD càng cao thì hàm lượng kháng thể trong huyết thanh càng nhiều. Với giá trị OD ≤ 0,30 ñược coi là không có kháng thể. * Kết quả thu ñược cho thấy: + Khi gây miễn dịch với liều lượng kháng nguyên khác nhau sẽ cho các ñáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng loại kháng nguyên P3-Al. + Với liều 200 µg P3-Al/ con/ lần cho kết quả ñáp ứng miễn dịch tốt nhất (giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 3 cao hơn giá trị OD của các mẫu kiểm tra ở lô 2, lô 1 và lô 4) + Cùng lượng kháng nguyên 200 µg/ con/ lần nhưng chuột số 5 cho giá trị OD là 3,548 ±0,025, chuột số 6 cho giá trị OD là 3,942 ±0,035 Có thể ñưa ra nhận xét là: ðáp ứng miễn dịch của cơ thể phụ thuộc vào lượng kháng nguyên ñưa vào cơ thể chuột. ðồng thời ñáp ứng miễn dịch cũng còn phụ thuộc vào từng cá thể. 46 Dựa trên cơ sở kết quả ñáp ứng miễn dịch, chuột số 5 và chuột số 6 (lô thí nghiệm 3) có ñáp ứng miễn dịch tốt nhất khi dùng liều 200 µg/ con/ lần gây miễn dịch. Vì vậy, chúng tôi chọn liều 200 µg/con/ lần là thích hợp nhất ñể gây miễn dịch cho chuột thí nghiệm nhằm thu ñược những cá thể chuột có ñáp ứng miễn dịch tốt nhất. Như vậy, với liều 200 µg/ con/ lần, chúng tôi tiếp tục tiến hành gây miễn dịch cho 5 chuột cái BALB/c khác theo quy trình gây miễn dịch ñã trình bày ở phần phương pháp. Sau ñó chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu, tách huyết thanh ñể kiểm tra ñáp ứng miễn dịch của từng chuột bằng phản ứng ELISA. Chuột nào có ñáp ứng miễn dịch tốt nhất sẽ ñược chọn ñể thu lấy tế bào lympho B của lách cho quá trình lai tế bào sau này. ðây là bước lựa chọn cá thể chuột có khả năng ñáp ứng miễn dịch tốt nhất, từ ñó thu lấy tế bào lympho B của lách phục vụ cho bước lai tế bào sau này. Bước này rất quan trọng vì nếu chúng ta chọn chính xác cá thể có ñáp ứng miễn dịch tốt, sinh nhiều kháng thể thì sẽ nâng cao chất lượng tế bào lympho B, từ ñó tăng hiệu quả lai tế bào. Với 5 mẫu huyết thanh thu ñược từ 5 chuột BALB/c chúng tôi tiến hành pha loãng 1000 lần trước khi thực hiện thí nghiệm kiểm tra bằng phương pháp ELISA . Kết quả phản ứng ELISA (giá trị OD) ño ở bước sóng 450 nm bằng máy Microplate Reader (BioRad) nhằm kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu progesteron ñược trình bày ở bảng 2. 47 Bảng 2. Sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Progesteron trong các mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây ñáp ứng miễn dịch với P3 – Al (n=5) STT Mẫu kiểm tra Giá trị OD (n=5) ðộ pha loãng 1 Chuột số 1 3,155 ±0,054 1000 2 Chuột số 2 4,203 ±0,03 1000 3 Chuột số 3 3,917 ±0,04 1000 4 Chuột số 4 3,756 ±0,045 1000 5 Chuột số 5 3,543 ±0,037 1000 6 ðối chứng âm (BSA 0,1%) 0,32 1000 BSA: Bovine Serum Albumin Giá trị OD phản ánh nồng ñộ kháng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật ñộ quang học càng nhỏ chứng tỏ lượng kháng thể ñược giữ lại càng ít và ñiều này cũng chứng tỏ rằng hàm lượng kháng thể trong huyết thanh ít. Ngược lại, mật ñộ quang học càng lớn chứng tỏ lượng kháng thể ñược giữ lại càng nhiều và kéo theo hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng nhiều. Từ kết quả bảng 2 cho thấy: - Với giá trị OD ≤ 0,32 ñược coi là không có kháng thể - Với liều tiêm 200 µg P3 – Al/con/lần nhưng mỗi chuột lại cho một kết quả khác nhau cho thấy khả năng ñáp ứng miễn dịch ở các cá thể chuột khác nhau là khác nhau. Kết quả kiểm tra các mẫu huyết thanh của 5 chuột ñều cho giá trị OD cao, chứng tỏ cả 5 chuột thí nghiệm ñều có khả năng ñáp ứng miễn dịch tốt (OD > 3,0). Như vậy có thể nhận ñịnh rằng liều 200 µg P3 – Al/con/lần là phù hợp. - Mẫu huyết thanh kiểm tra của chuột số 1 có giá trị OD thấp nhất (3,155) và mẫu huyết thanh của chuột số 2 có giá trị OD cao nhất (4,203). Kết quả này cho thấy hàm lượng kháng thể kháng P3 – Al trong huyết thanh của chuột số 1 là thấp nhất, hàm lượng kháng thể kháng Progesteron trong huyết thanh của chuột số 2 là cao nhất. 48 Như vậy, ñáp ứng miễn dịch không chỉ phụ thuộc vào liều lượng kháng nguyên ñưa vào mà còn phụ thuộc vào cá thể ñộng vật. Mỗi cá thể ñộng vật có ñáp ứng miễn dịch khác nhau, do ñó nồng ñộ kháng thể trong huyết thanh khác nhau mặc dù tiếp nhận cùng một lượng kháng nguyên như nhau: Kết quả ñáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào hai yếu tố chính: + Liều lượng kháng nguyên ñưa vào cơ thể. + Mỗi cá thể khác nhau sẽ cho ñáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng loại và liều lượng kháng nguyên. Dựa vào kết quả ñáp ứng miễn dịch, ta thấy chuột số 2 và 3 có ñáp ứng miễn dịch tốt nhất nên sẽ ñược lựa chọn ñể lấy tế bào Lympho B và dung hợp với tế bào Myeloma nhằm thu ñược tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng có chất lượng cao. 4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng P3 - Al Dung hợp là quá trình quan trọng trong sản xuất kháng thể ñơn dòng. ðể quá trình dung hợp tạo tế bào lai diễn ra thuận lợi và ñạt kết quả cao cần có 2 loại tế bào chủ yếu là Myeloma và Lympho B. Ngoài ra cần bổ sung các yếu tố thúc ñẩy cho quá trình dung hợp như: tế bào ñại thực bào, FBS, polyethylenglycol (PEG). • Tế bào ñại thực bào (macrophaghe còn gọi feeder cell) Các tế bào ñại thực bào có mặt chủ yếu ở các xoang cơ thể, ñặc biệt là xoang bụng vì thể ta có thể dễ dàng lấy tế bào ñại thực bào từ ổ bụng. Các tế bào ñại thực bào là tế bào của hệ miễn dịch ñã biệt hoá hoàn toàn. Do ñó, chúng không có khả năng sinh sản liên tục khi nuôi cấy in vitro. ðã có nhiều tác giả nghiên cứu và xác ñịnh: Tế bào ñại thực bào ñược chuẩn bị 3 ngày trước dung hợp sẽ ñạt hiệu quả cao nhất. Theo kết quả của chúng tôi thì một con chuột có thể cung cấp một lượng ñại thực bào ñủ cho 200 – 500 giếng nuôi tương ứng với mật ñộ 105 – 107 tế bào/ml. 49 • Tế bào Myeloma Tế bào Myeloma (Sp2/0, P3X) là tế bào ung thư tuỷ của chuột dòng BALB/c. Ở ñiều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp, tế bào sinh sản và phát triển rất nhanh, có thể ñạt nồng ñộ tế bào gấp 5 lần chỉ trong khoảng thời gian 30 giờ. Vì vậy, chúng ñòi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn lấy từ môi trường. ðể có ñược tế bào Myeloma khoẻ mạnh và sẵn sàng cho việc dung hợp tế bào, chúng tôi thấy môi trường có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) là phù hợp. Và môi trường nuôi cấy cần ñược tiến hành thay thường xuyên 3 ngày một lần. A B Hình 7. (A) Tế bào Sp2/0 ở ñộ phóng ñại 10×20; (B) Tế bàoP3X ở ñộ phóng ñại 10×20 • Tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên P3 - Al Là những tế bào Lympho B ñã mẫn cảm, thu từ lách chuột số 2 ñược gây miễn dịch bằng P3 - Al với liều 200 µg P3 - Al/con/lần. Dung hợp tế bào lai: Quy trình dung hợp tế bào ñược thực hiện theo quy trình như ñã trình bày ở phần phương pháp. Tế bào sau dung hợp ñược nuôi trên 3 khay nhựa 96 well – corning (tổng số là 288 giếng). Sau 5 – 7 ngày dung hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc tế bào bằng môi trường chọn lọc HAT ñể thu ñược tế bào lai (Hybridoma). Do tế bào Myeloma không có enzym HPRT (Hypoxanthin - phospho – ribosyl – transferase) dẫn ñến không tổng hợp ñược ADN. 50 Vì vậy, khi môi trường có HAT, bazơ cung cấp cho quá trình tổng hợp ADN ở dạng liên kết nên ñòi hỏi phải có enzym ñể thuỷ phân liên kết này. Như thế, tế bào Myeloma sẽ chết sau vài ngày. Tế bào Lympho B phát triển bình thường trong môi trường HAT vì nó có enzym HPRT nhưng tế bào Lympho B cũng chết sau 1 - 2 ngày do không tiếp tục sinh sản. Do ñó, chỉ các tế bào lai tồn tại ñược trong môi trường HAT và HT nhờ có ưu thế lai. Sau 5 ngày nuôi cấy chúng tôi kiểm tra toàn bộ số giếng dưới kính hiển vi soi ngược và ñánh dấu những giếng có tế bào lai. Chúng tôi ñã thu ñược tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp giữa tế bào lách chuột với hai dòng tế bào Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18 như ñược trình bày ở bảng 3. Từ kết quả bảng 3 cho thấy: Hiệu quả lai trên 2 dòng tế bào myeloma với tế bào lympho B của 2 chuột 2 và 3 ñều ñạt trên 70% cho thấy qui trình lai tế bào của chúng tôi là rất phù hợp. Bảng 3. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp. Chuột Chuột số 2 Chuột số 3 Tổng số Dòng tế bào P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 Số giếng thực hiện dung hợp tế bào 144 144 144 144 288 288 Số giếng có tế bào lai 102 117 109 124 211 241 Hiệu quả lai 70,83 % 81,25 % 75,69 % 86,11 % 73,2 % 83,6 % Như vậy tỷ lệ giếng có tế bào lai dòng Sp2/0- Ag14 của chuột số 2 và số 3 cao hơn hẳn so với với dòng P3X- Ag18. 51 Tế bào lách của chuột số 2 và 3 lai với dòng Sp2/0-Ag14 cho tổng số kết quả lai bằng 83,6% . Trong khi ñó dòng P3X-Ag18 có kết quả lai bằng 73,2%. A B H×nh 8. (A) TÕ bµo lai hybridoma gi÷a dßng Sp2/0-Ag14 víi tÕ bµo lympho B kh¸ng progesteron trªn nÒn tÕ bµo feeder. (B) TÕ bµo lai hybridoma gi÷a dßng P3X-Ag18 víi tÕ bµo lympho B kh¸ng progesteron trªn nÒn tÕ bµo feeder; Trong quá trình nhân nuôi tế bào, chúng tôi nhận thấy tế bào Sp2/0- Ag14 có sức sống mạnh hơn, tế bào sinh sản nhanh hơn so với dòng tế bào P3X-Ag18 trong ñiều kiện bình thường với cả hai loại môi trường DMEM và RPMI 1640, ñiều này có thể giải thích nguyên nhân dẫn ñến sự khác biệt về kết quả lai giữa tế bào lymphoB với tế bào Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18. 4.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron Theo giả thuyết của Burnet (ðặng ðức Trạch và cs, 1987) về quá trình hình thành kháng thể thì mỗi dòng tế bào Lympho B của hệ miễn dịch chịu trách nhiệm sản xuất một loại kháng thể kháng một quyết ñịnh kháng nguyên sau khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể và kích thích quá trình hoạt hoá dòng tế bào này. Tuy nhiên, số dòng tế bào lympho B ñược hoạt hoá và tổng hợp kháng thể là rất nhiều (kháng thể ña dòng) ngay khi cả cơ thể ñược gây 52 miễn dịch bằng một loại kháng nguyên tinh chế. Do ñó, khi có tế bào lai, việc tạo dòng ( một tế bào ban ñầu) và chọn dòng cần ñược thực hiện. Trong thí nghiệm của chúng tôi, tất cả các giếng có tế bào lai ñược kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng progesteron bằng phương pháp ELISA. Các giếng có giá trị OD nhỏ hơn hoặc bằng 0,3 ñược xem là âm tính. Kết quả cụ thể ñược trình bày ở bảng 4. Trong phản ứng ELISA sàng lọc này, chúng tôi sử dụng progesteron làm kháng nguyên thay vì progesteron -Al. Sở dĩ như vậy vì mục tiêu của chúng tôi là chọn ñược những dòng tế bào lai sinh kháng thể kháng progesteron ñể phục vụ cho việc phát hiện sự có mặt cũng như xác ñịnh hàm lượng progesteron ở các ñộng vật, nhất là ở ñộng vật có chửa. Kết quả bảng 4. cho thấy: - Số giếng có sinh kháng thể khi lai với tế bào Sp2/0-Ag14 cao hơn so với dòng P3X-Ag18. - Số giếng có tế bào lai sinh kháng thể mong muốn ñạt tỷ lệ % cao so với tổng số giếng có tế bào lai cho thấy quá trình gây miễn dịch của chúng tôi là phù hợp, ñạt hiệu quả cao. - ðồng thời kháng nguyên P3-Al mà chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này là ñạt tiêu chuẩn của kháng nguyên. Do vậy, có thể sử dụng P3-Al trong các thí nghiệm tiếp sau này. 53 Bảng 4. Tỷ lệ giếng có kháng thể kháng progesteron trên tổng số giếng có tế bào lai Chuột thí nghiệm Chuột số 2 Chuột số 3 Tổng số Dòng tế bào myeloma P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 Số giếng có kháng thể kháng progesteron 18 22 15 20 33 42 Số giếng có (kháng thể kháng P3 -Al) 42 51 39 43 81 94 Số giếng có tế bào lai 102 117 109 124 211 241 Tỷ lệ giếng có KT/giếng có tế bào lai 58,8% 62,4% 49,5% 50,8% 54,0% 56,4% A B H×nh 9. (A) tÕ bµo lai hybridoma gi÷a dßng Sp2/0-Ag14 víi tÕ bµo lympho B kh¸ng progesteron sau qu¸ tr×nh t¸ch dßng; (B) Clone tÕ bµo lai hybridoma gi÷a dßng P3X- Ag18 víi tÕ bµo lympho B kh¸ng progesteron sau qu¸ tr×nh t¸ch dßng. 54 Như vậy: Tỷ lệ số giếng cho kháng thể của chuột 2 cao hơn của chuột 3, ñiều này cho thấy, kết quả tế bào lai có sinh kháng thể phụ thuộc nhiều vào sự ñáp ứng miễn dịch của chuột, chuột có hiệu giá kháng thể cao sẽ cho nhiều giếng có kháng thể hơn chuột có hiệu giá kháng thể thấp. + Bằng phương pháp ELISA, chúng tôi cũng sàng lọc ñược những giếng có kháng thể kháng ñặc hiệu progesteron (chứ không phải kháng P3- Al) ñể tiến hành tách dòng phục vụ cho các bước tiếp theo. + Do nhận thấy các ñặc tính tế bào lai của dòng Sp2/0-Ag14 trội hơn so với dòng P3X-Ag18 nên chúng tôi lựa chọn giếng tế bào lai sinh kháng thể kháng Progesteron có giá trị OD cao nhất của dòng Sp2/0-Ag14 ñể tách dòng. Bảng 5. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng Progesteron trên 2 dòng tế bào. Dòng tế bào Các chỉ số thí nghiệm P3X Sp2/0 Tổng số giếng nuôi tế bào 288 288 Số giếng có tế bào lai 211 241 Tỷ lệ % tế bào lai so với tổng số giếng 73,2% 83,6% 18(chuột 2) + 15(chuột 3) = 33 22(chuột 2) + 20(chuột 3) = 42 Số giếng có kháng thể kháng Progesteron Giếng E12/ñĩa2 (OD=2,707) BSA (OD= 0,355) Giếng B3/ñĩa1 (OD=3,076) BSA (OD= 0,355) Tỷ lệ % số giếng có KT kháng Progesteron 15,64% 17,43% BSA: Bovine Serum Albumin (ðối chứng âm) 55 Sau khi kiểm tra khả năng sinh kháng thể kháng Progesteron của các giếng có tế bào lai bằng phương pháp ELISA, chúng tôi chọn ñược một giếng có giá trị OD cao nhất (giếng B3/ñĩa 1/ tế bào Sp2/0, OD =3,076) ñể tiến hành tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn sao cho có không quá 1 tb/giếng. Kết quả tách dòng ñược thể hiện ở bảng sau: Bảng 6. Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn Số clone/giếng ðĩa TN 0 clone/giếng 1 clone/giếng ≥2 clone/giếng ðĩa 1 30/96 50/96 16/96 ðĩa 2 15/96 70/96 11/96 ðĩa 3 42/96 36/96 18/96 Tổng số 87/288 156/288 45/288 Hiệu quả 30,21% 54,17% 15,63% Như vậy trong tổng số 288 giếng ở 3 khay thì có 156 giếng có mật ñộ 1clone/giếng, ñạt hiệu quả tách dòng là 54,17%. Tế bào ñược nuôi trong khoảng thời gian 2 tuần, sau ñó thu dịch nổi và sử dụng phương pháp ELISA ñể kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Pogesteron trong dịch nổi của các giếng có 1clone tế bào/ giếng sau khi tách dòng. Sau khi kiểm tra 156 giếng có 1clone/ giếng bằng phương pháp ELISA thì chúng tôi chỉ thu ñược 35 giếng có dịch nổi có phản ứng dương tính với kháng nguyên progesteron. Như vậy chỉ có 35 clone tế bào sản xuất kháng thể kháng lại progesteron. ðây chính là kháng thể ñơn dòng (01 clone tế bào) mà chúng ta mong muốn. Kết quả tách dòng với 35 giếng có phản ứng dương tính cho thấy sự có mặt của kháng thể kháng progesteron ñược thể hiện ở bảng 7 56 Bảng 7: Giá trị OD của dịch nổi của các giếng dương tính kháng progesteron có 1 dòng tế bào STT Tên giếng ðĩa TN Giá trị OD (n=3) 1 A8 1 0,927 ± 0,019 2 A11 1 0,878 ± 0,018 3 C2 1 0,619 ± 0,012 4 C4 1 0,509 ± 0,010 5 D7 1 0,796 ± 0,016 6 E3 1 0,76 ± 0,015 7 E7 1 1,983 ± 0,040 8 E9 1 0,732 ± 0,015 9 F1 1 0,468 ± 0,009 10 F9 1 0,680 ± 0,031 11 G2 1 0,462 ± 0,015 12 G9 1 1,542 ± 0,013 13 H3 1 0,764 ± 0,011 14 H6 1 0,650 ± 0,010 15 B9 2 0,531 ± 0,015 16 C6 2 0,502 ± 0,017 17 E6 2 0,864 ± 0,010 18 F2 2 0,504 ± 0,015 19 F11 2 0,742 ± 0,017 20 F12 2 0,872 ± 0,018 21 G4 2 0,889 ± 0,033 22 G12 2 1,673 ± 0,029 23 H4 2 1,437 ± 0,040 24 H8 2 1,979 ± 0,015 25 H12 2 0,745 ± 0,014 26 A3 3 0,678 ± 0,012 27 B5 3 0,579 ± 0,010 28 C7 3 0,491 ± 0,013 29 C8 3 0,647 ± 0,012 30 F9 3 0,608 ± 0,016 31 G5 3 0,648 ± 0,010 32 G10 3 0,789 ± 0,012 33 G11 3 0,502 ± 0,016 34 H2 3 0,613 ± 0,038 35 H6 3 0,787 ± 0,019 ðC + 1,921 ðC - 0,355 57 Kết quả cho thấy: Trong 35 giếng dương tính, các giếng khác nhau có giá trị OD khác nhau. ðiều này chúng tỏ mỗi dòng tế bào khác nhau thì khả năng sinh kháng thể cũng khác nhau. Vì vậy có thể thấy các giếng có tế bào lai sinh kháng thể có chất lượng cao phụ thuộc nhiều vào dòng tế bào lympho B có ñáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên hay không và dòng tế bào Myeloma (qua thực nghiệm ñã chứng minh dòng tế bào Sp2/0-Ag14 tốt hơn dòng P3X-Ag18). Từ kết quả của bảng 7: chúng tôi chọn ra 5 dòng tế bào sinh kháng thể ñơn dòng kháng ñặc hiệu Progesteron tốt nhất tương ứng với 5 giếng có giá trị OD cao nhất là: + Giếng E7 ñĩa 1 với giá trị OD = 1,983 ñặt tên là MCAP1 + Giếng G9 ñĩa 1 với giá trị OD = 1,542 ñặt tên là MCAP2 + Giếng G12 ñĩa 2 với giá trị OD = 1,673 ñặt tên là MCAP3 + Giếng H4 ñĩa 2 với giá trị OD = 1,437 ñặt tên là MCAP4 + Giếng H8 ñĩa 2 với giá trị OD = 1,979 ñặt tên là MCAP5 Với 5 dòng tế bào ñã chọn lọc, chúng tôi tiến hành nuôi in vitro ñể có số lượng lớn tế bào. ðể quá trình nhân nuôi ñạt kết quả tốt, từ 5 dòng tế bào chọn ñược chúng tôi ñưa vào 5 chai nuôi cấy sao cho ñạt nồng ñộ 1× 105 tế bào/ml. Các chai nuôi cấy ñược bổ sung môi trường thích hợp cho các tế bào lai phát triển tốt và nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Môi trường nuôi cấy chúng tôi sử dụng gồm các thành phần: DMEM và bổ sung FBS 10%. 4.3.1 Chọn lọc dòng tế bào sinh kháng thể có tính ñặc hiệu và ñộ nhạy cao * Tính ñặc hiệu ðể khẳng ñịnh tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng kháng progesteron của 5 dòng tế bào thu ñược ở trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp ELISA. Kiểm tra tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng sinh ra là kiểm tra khả năng kết hợp của kháng thể ñơn dòng với kháng nguyên và các chất 58 khác có cấu trúc phân tử tương tự như Progesteron và có trong huyết thanh là hormon steroid như progesteron, estradiol, testosteron, corticosteron và pregnenolon. Ngoài progesteron ra trong máu ñộng vật còn các hormon steroid trên có cấu tạo hoá học gần giống với progesteron. Chúng tôi dùng kháng thể ñơn dòng mới thu ñược lần lượt thử nghiệm với ñại diện các nhóm kháng nguyên có cấu tạo hoá học gần giống với Progesteron nói trên và thu ñược kết quả qua bảng 8 như sau: Bảng 8. Tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra S TT Kháng nguyên Dòng tế bào Progesteron Estradiol Testosteron Corticosteron Pregnenolon 1. MCAP1 + - - - + 2. MCAP2 + - + + - 3. MCAP3 + - - - - 4. MCAP4 + - - - + 5. MCAP5 + - + - - Ghi chú: (+): dương tính; (-) âm tính Kết quả ở bảng 8. cho thấy: - Các dòng MCAP1 và MCAP4 ñều cho kết quả dương tính với 2 loại kháng nguyên là progesteron và pregnenolon. Dòng MCAP2 MCAP5 cho kết quả dương tính với progesteron nhưng cũng dương tính với cả testosteron và corticosteron. Như vậy, kháng thể do 4 dòng tế bào này sinh ra có tính ñặc hiệu không cao không phân biệt ñược giữa progesteron với các dạng hormon gần giống với chúng. - Chỉ có dòng MCAP3 cho kết quả âm tính với Estradiol, Testosteron, Corticosteron, Pregnenolon và chỉ dương tính với progesteron chứng tỏ rằng kháng thể do dòng tế bào này sinh ra có tính ñặc hiệu cao. Chúng ñã phân biệt 59 ñược các loại hormon gần giống với progesteron và chỉ kháng ñặc hiệu progesteron. Chúng ta thấy rằng kháng thể ñơn dòng là kháng thể chỉ có khả năng kết hợp ñặc hiệu với một loại kháng nguyên duy nhất mà không kết hợp với các loại kháng nguyên khác cho dù chúng có cấu tạo hoá học gần giống với kháng nguyên ñó. * Khả năng sinh kháng thể của các dòng tế bào Một dòng tế bào có chất lượng cao ngoài khả năng sinh kháng thể có tính ñặc hiệu cao còn cần phải có sức sống tốt, khả năng sinh kháng thể nhiều từ ñó mới ñảm bảo tạo ñược một lượng lớn kháng thể trên quy mô công nghiệp, ñủ ñể phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế. - Dựa trên kết quả kiểm tra tính ñặc hiệu và khả năng phát triển của 5 dòng tế bào, chúng tôi chỉ chọn dòng MCAP3 có tính ñặc hiệu cao, tiếp tục nhân nuôi thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Nitơ lỏng và gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao. 4.4. Gây báng cho chuột Kháng thể ñơn dòng có thể thu nhận từ dịch nổi của chai nuôi tế bào hybridoma. Tuy nhiên theo Karsten và Rudloph (1985) thì ta có thể thu nhận ñược kháng thể cao hơn từ 100 ñến 1000 lần nếu tiêm các tế bào lai vào xoang bụng của chuột ñã ñược tiêm pristane trước ñó 2 tuần. Sau khoảng từ 7 ñến 12 ngày bụng chuột có báng to thì thu dịch báng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi ñã gây báng thành công ñược 2 con chuột (số 5 và số 10)/ 10 chuột cái BALB/c bằng dòng MCAP3 và thu ñược khoảng 5ml/con/lần ñược 3-5 lần/con. 4.5. Kiểm tra hiệu giá kháng thể Dịch báng thu ñược lưu giữ ở 4ºC qua ñêm trước khi ñược chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phương pháp kết tủa với Saturated Amonium Sulphate (SAS) hoặc bằng Propur Kit của hãng Nunc. 60 ðối với dịch nổi nuôi cấy của dòng MCAP3 chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy ñặc biệt không có huyết thanh (Hybridoma Medium) của hãng GIBCO BRL. Chúng tôi nhận thấy tế bào phát triển tốt trong loại môi trường này ñạt 1x106 tế bào/ 3 ngày. Sau 3 ngày nuôi cấy, dịch nổi ñược thu giữ và cất ở 4oC qua ñêm trước khi tinh sạch bằng phương pháp SAS hoặc bằng Propur Kit. Trước khi tiến hành tinh sạch, dịch nổi và dịch báng ñược chúng tôi tiến hành kiểm tra hiệu giá kháng thể. Kết quả ñược trình bày ở bảng 9. Bảng 9. So sánh hiệu giá kháng thể của dịch nổi và dịch báng. STT ðộ pha loãng Mẫu TNo 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000 lần 1 Dịch nổi (nguyên) ++++ +++ +++ ++ ++ + - 2 Dịch báng (pha loãng 20 lần) ++++ +++ +++ ++ ++ + - (++++): màu rất ñậm (++): màu ñậm vừa (-):không màu (+++): màu ñậm (+): màu nhạt A B H×nh 10. KiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ®¬n dßng ë c¸c ®é pha lo·ng kh¸c nhau; (A) DÞch næi; (B) DÞch b¸ng pha lo·ng 20 lÇn. 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần 61 Quan sát bảng 9. ta thấy hiệu giá kháng thể của dịch nổi và dịch báng thể hiện là như nhau nhưng hiệu giá kháng thể của dịch nổi là nguyên bản trong khi ñó hiệu giá kháng thể của dịch báng ñã pha loãng 20 lần. Như vậy có nghĩa là hiệu giá kháng thể ñơn dòng trong dịch báng cao gấp khoảng 20 lần so với dịch nổi. ðồng thời kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu giá kháng thể thu ñược là cao (500 lần của dịch nổi) và 10.000 lần của dịch báng, từ ñó có thể phục vụ cho mục ñích thương mại. Sau khi thu ñược dịch nổi và dịch báng của dòng tế bào MCAP3 chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng SAS và Propur Kit. Kết quả tinh sạch ñược trình bày ở bảng 10. Nhìn vào bảng 10, ta thấy tổng lượng kháng thể ñơn dòng kháng Progesteron tinh sạch ñược bằng SAS là 1,808mg. Trong khi ñó tinh sạch bằng Propur Kit là 2,55mg. Bảng 10. Kết quả tinh sạch kháng thể ñơn dòng bằng (SAS) và Propur Kit. Sử dụng SAS Sử dụng Propur Kit Dòng tế bào Dịch nổi (100ml) Dịch báng pha loãng 10 lần (50ml) Tổng lượng MoAb thu ñược Dịch nổi (100ml) Dịch báng pha loãng 10 lần (50ml) Tổng lượng MoAb thu ñược MCAP 3 0,43 µg/ml x 100 ml (43µg) 35,3 µg/ml x 50 ml (1,765mg) 1,808 mg 0,45 µg/mlx 100 ml (45µg) 50,1µg/ml x 50 ml (2,505mg) 2,55 mg Tổng lượng KTðD kháng Progesteron thu ñược là 4,358 mg Như vậy có sự khác nhau rõ rệt khi tinh sạch bằng SAS và sử dụng Propur Kit. Sử dụng Propur Kit ñể tinh sạch kháng thể sẽ thu ñược lượng kháng thể cao hơn so với phương pháp SAS. Lượng kháng thể ñơn dòng thu ñược ở trên ñược chúng tôi lưu giữ bằng ñệm PBS ở nồng ñộ 1mg/ml và cất ở -80oC. 62 Với mục ñích là sử dụng kháng thể ñơn dòng trong thực tiễn sản xuất ví dụ phát hiện ñộng vật có chửa nên chúng tôi ñã sử dụng kháng thể ñơn dòng thu ñược ở trên ñể kiểm tra huyết thanh của 6 thỏ thí nghiệm bằng phương pháp ELISA. Kết quả ñược trình bày ở bảng 11. Kết quả từ bảng 11. cho thấy kháng thể ñơn dòng mà chúng tôi thu ñược ñã phản ứng ñặc hiệu và phát hiện ñược Progesteron trong huyết thanh của thỏ thí nghiệm. Không những thế do ở thỏ không chửa thì trong máu vẫn tồn tại progesteron nên kháng thể ñơn dòng ở dịch nổi và dịch báng cũng như kháng thể ñơn dòng tinh sạch vẫn phát hiện ñược do vậy có phản ứng dương tính. Tuy nhiên ở thỏ không chửa thì hàm lượng prgesteron thấp hơn nhiều so với thỏ chửa. Do vậy các dịch nổi, dịch báng và kháng thể ñơn dòng tinh sạch bị pha loãng ñã không thể hiện phản ứng dương tính với thỏ không chửa trong khi vẫn thể hiện dương tính với các thỏ chửa. Bảng 11. Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thí nghiệm Thỏ chửa Thỏ không chửa ðộng vật TN Dịch kháng thể C1 C 2 C 3 K 1 K 2 K 3 Không pha + + + + + + Dịch nổi Pha loãng 10 lần + + + - - - Pha loãng 10 lần + + + + + + Dịch báng Pha loãng 50 lần + + + - - - Pha loãng 100 lần (10 µg/ml) + + + + + + Kháng thể tinh sạch Pha loãng 500 lần (2 µg/ml) + + + - - - ðiều này cho phép chúng tôi kết luận rằng kháng thể ñơn dòng chúng tôi thu ñược có phản ứng ñặc hiệu với progesteron và phân biệt ñược ñộng vật có chửa và ñộng vật không có chửa ở tỷ lệ pha loãng phù hợp (500X). 63 5. KẾT LUẬN 5.1 KẾT LUẬN Qua quá trình làm việc nghiêm túc với các nội dung: gây ñáp ứng miễn dịch cho chuột, dung hợp tạo tế bào lai, tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng ñặc hiệu progesteron, chọn lọc dòng tế bào lai theo mong muốn, tinh sạch kháng thể, dùng kháng thể ñơn dòng ñã sản xuất ñể kiểm chứng phát hiện ñộng vật có chửa, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Tiến hành gây miễn dịch với liều lượng kháng nguyên P3 - Al bằng 200µg/con/lần tiêm sẽ cho ñáp ứng miễn dịch tốt nhất. ðáp ứng miễn dịch của cơ thể không những phụ thuộc vào liều lượng kháng nguyên gây miễn dịch mà còn phụ thuộc vào cá thể ñộng vật. 2. Sau dung hợp và tách dòng chúng tôi, ñã chọn ra ñược 05 dòng tế bào có khả năng sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron như mong muốn. 3. Trong quá trình nhân nuôi và dung hợp tế bào, chúng tôi nhận thấy tế bào lai giữa tế bào lympho B với tế bào Sp2/0-Ag14 có sức sống mạnh hơn, tế bào sinh sản nhanh hơn so với dòng tế bào P3X-Ag18 trong ñiều kiện bình thường với cả hai loại môi trường nuôi cấy là DMEM và RPMI 1640. 4. Trong 5 dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng ñược chọn lọc dòng tế bào MCAP3 có khả năng sinh sản tốt, kháng thể có tính ñặc hiệu và hiệu giá kháng thể cao ñể nhân nuôi, gây báng trên chuột và bảo quản trong nitơ lỏng. 5. Có sự khác nhau rõ rệt khi tinh sạch bằng hai phương pháp SAS và sử dụng Propur Kit. Sử dụng Propur Kit tinh sạch kháng thể sẽ cho hiệu suất cao hơn so với SAS. 6. Kháng thể ñơn dòng chúng tôi thu ñược có phản ứng ñặc hiệu với progesteron và sử dụng trong ELISA ñã phân biệt ñược ñộng vật có chửa và ñộng vật không có chửa. 64 5.2 ðỀ NGHỊ Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng gồm nhiều giai ñoàn khác nhau, trong quá trình ñó việc sử dụng phương pháp ELISA ñể sàng lọc, kiểm tra và ñánh giá kháng thể ñơn dòng là cần thiết và thực sự ñã ñem lại hiệu quả. Tuy nhiên ñể hoàn thành các bước của quy trình và có ñược kháng thể ñơn dòng chất lượng cao hơn ñáp ứng ñược việc tạo kít ñịnh lượng progesteron thì cần phải nghiên cứu sâu hơn nữa. ðặc biệt, việc phân tích các ñặc tính quan trọng của kháng thể ñơn dòng thu ñược như xác ñịnh isotope ñặc hiệu, xác ñịnh ái lực kháng nguyên - kháng thể vv. ðề tài của chúng tôi mới chỉ có ñược những kết quả bước ñầu, tạo ñược những dòng tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng progesteron năng suất cao, chất lượng tốt. Chúng tôi mong muốn ñược tiếp tục nghiên cứu theo hướng này ñể tạo ra ñược sản phẩm cuối cùng là bộ kít chuẩn ñể ñịnh lượng progesteron trong dịch sinh học (máu, nước tiểu...) phục vụ cho nghành chăn nuôi nước nhà. 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Vũ Triệu An, Lê ðức Cơ, Văn ðình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh, ðỗ Trung Phấn, Phạm Hoàng Phiệt (1981), Những kỹ thuật cơ bản dùng trong miễn dịch học, NXB y dược học.Tr5-284 2. Vũ Triệu An, Jean Claude Homber (1998), Miễn dịch học, NXB Y học Hà Nội. Tr 7- 277. 3. Nguyễn Tấn Anh (1998), Sinh lí sinh sản gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng các các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB KHKT Hà Nội 5. Trần Tiến Dũng, Dương ðình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002), Sinh sản gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Tr: 65, 107, 227- 231 6. Trần Tiến Dũng (2003), “ðịnh lượng một số hormon sinh sản và sử dụng hormon tổng hợp Estrumate khắc phục hiện tượng rối loạn sinh sản ở trâu”, Tạp chí KHKT thú y, Hội thú y Việt Nam.Tr: 71- 74. 7. Nguyễn Thị Hà (2001), Hóa sinh hormone, NXB Y học Hà Nội. Tr: 527. 8. Lê Văn Hùng (2002), Miễn dịch học thú y, NXB Nông nghiệp Tr7- 189 9. Phan Văn Kiểm, Nguyễn Quý, Quỳnh Hoa (2003), “ Kết quả nghiên cứu hàm lượng progesteron ở bò lai hướng sữa bằng kĩ thuật miễn dịch enzyme”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr: 607- 610. 66 10. Phan Văn Kiểm, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý, Quỳnh Hoa, Tăng Xuân Lưu (2003),“ Ứng dụng kết quả nghiên cứu hàm lượng progesteron ñể chẩn ñoán và ñiều trị rối loạn sinh sản ở bò sữa”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr: 708-711. 11. Võ Thương Lan (2002), Sinh học phân tử, NXB ðại Học Quốc Gia Hà Nội. 12. ðỗ Phương Liên (1999), Miễn dịch học cơ sở, NXB ðại Học Quốc Gia Hà Nội. 13. Nguyễn ðỗ Quyên (2004), Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sản xuất kháng thể ñơn dòng, Luận án tiến khoa học sĩ y dược 14. Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi, Lê Mộng Loan (1996), Sinh lí học gia súc, NXB Nông Nghiệp. Tr: 63- 68. 15. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. Tr: 112- 116. 16. Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thú y, NXB Nông nghiệp. Tr: 7 - 10, 40- 45. Tiếng Anh 17. Anil TM, Shankar TM, Mohan CV (2002) "Monoclonal Antibodies developed for sensitive detection and comparision of white spot syndrome virus isolates in India". Di Aquat Organ, 51(1)pp 67-75. 18. Ariana Celis, Kurt Dejgaard and Julio E.Celis(1994), Production of moucse monoclonae antibodies cell biology V.2, pp. 269-275. 19. Christopher Daen, Philip Shepkerd (2000)."Monoclonal Antibodies". Cell biology (10-12, 26-28, 118). 67 20. Cole. S.P.C, Kozbor D and Roder J.C.C (1985), “Hybrodoma technology-Bioscicsees and midicine”, Springer- New York, pp.258- 266 21. Engvall E, PerlmanP (1971), Enzyme Linked Iimunosorbent Assay (ELISA).Quantitative assay of immunoglobulin G , Immunochemistry, Sep; 8(9):871-874PMID:5135623 22. Galjre G,Howe S.C, Milstein C, (1977), "Antibodies to major histology compability antigens producced by hybrid cell line. Nature (550-532). 23. Galjre G, and Milstein C, (1981), “Preparation of monoclonal antibodies strategies and procedures”, Method enzymeol, pp. 34- 36. 24. Gefter.M.L et al (1977). "Simple method for PEG promoted hybridization of mouse myeloma cell" Somat cell Genet (231-236) 25. Goncalves – S.C, Horta – A.E.M (1999), “The efect of blocking progesterone in superovulated ewes”, Colectanea – da – EZN 26. Huang, C, X.Zhang, Q.Lin, X.Xu, Z.H.Hu, and, C.L.Hew (2002), ''proteomic analysic of shrimp white spot sydrome viral proteins and characterization of a noval envolope protein VP 466". Mol. Cell. Prot.1, pp 223-231. 27. Hunter.R (1972), “ Ovaries response of the pig to gonadotropin infeted at diference stage of oestrus cycle”, Animal Sience, pp. 457. 28. J. Eryl Liddell and A. Cryer (2002), A practical guide to Monoclonal Antibody, pp. 25- 27. 29. John Wiley and Sons (2000), Immunology (11.4.2-11.8.2) 30. Juan. S, Bonifacino at al (2000), "Currennt protocols, Cell Biology (1.1.1-16.1.0,16.1.0-16.9.9A) 68 31. Maurice J. Sauner, John A. Foulkes and Alan D. Cookson (1981), “Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk”, Steroids, volume 38, number 1. UK, pp 45- 52. Nakao .T, Sugihashi . A, Saga .N, Tsunda .N and Kawata . K (1983), “An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk”, Br. Veterinary Japan, pp. 109- 117. 31. Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000), Monocnonal Antibodies, Cell Feeder (10-30, 150) 32. Philip Shepker, Chiristopher Dean (2000), Monoclonal Antibodies, Cell 0biology, pp. 10- 12, 26- 28, 118 33. Shuman M, Wild.c.d and Kohler G (1978), A better cell line for marking hybridoma seereting specific antibodies, Nature c. 276, pp. 269- 270. 34. Van De Weil .D.F.M and Koops. W (1986), “Development and validation of an Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma”, Annimal Reproduction Sience, pp. 201- 203. 35. Wu L.S, Guo I.C, Lin J.H (1997), “Pregnancy diagnosis on sows by using an on farm blood progesterone test”, Asia- Australasian journal of Animal Science, pp. 603- 608. 36. . 37. 38. 39. (