Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây bảy lá một hoa – Paris polyphylla var. chinensis thu thập tại Việt Nam

lin/ H2SO4 đặc, là hỗn hợp của 2 hợp chất RE2A và RE2B Hợp chất RE2A 1 H-NMR (CDCl3&CD3OD, 500 MHz) δH: 3,60 (1H, m, H-3), 5,24 (1H, brs, H-6), 0,72 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-19), 0,94 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21), 5,17 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz, H-22), 5,04 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz, H-23), 0,79 (3H, d, J= 7,0 Hz, H- 26), 0,87 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27), 0,80 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-29). Glc: 4,40 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1), 3,41 (1H, dd, J= 5,0; 8,5 Hz, H-2), 3,22 (1H, dd, J= 5,0; 8,5, Hz, H-3), 3,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, H-4), 3,29 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J= 12,0; 2,0 Hz, H-6a), 3,74 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6b). 13 C-NMR (CDCl3&CD3OD, 125 MHz), δC: 140,2 (C-5), 138,2 (C-22), 129,2 (C-23), 121,9 (C-6), 75,7 (C-3), 56,7 (C-14), 55,8 (C-17), 51,1 (C-24), 50,1 (C-9),42,1 (C-13), 40,3 (C-20), 39,6 (C-4), 38,5 (C-12), 37,1 (C-1), 36,5 (C-10), 31,7 (C-7), 31,7 (C-8), 31,7 (C-25), 29,4 (C-2), 28,7 (C-16), 25,2 (C-28), 24,2 (C-15), 20,9 (C-11), 20,9 (C- 21), 20,8 (C-27), 11,9 (C-29), 19,5 (C-19), 18,7 (C-26), 11,8 (C-18). Glc: 100,9 (C-1), 79,0 (C-3), 79,0 (C-5), 73,4 (C-2), 69,7 (C-4), 61,3 (C-6). Hợp chất RE2B 1 H-NMR (CDCl3&CD3OD, 500 MHz), δH: 3,60 (1H, m, H-3), 5,04 (1H, brs, H- 6), 0,70 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-19), 0,94 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21), 0,81 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-26), 0,83 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27), 0,86 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-29). Glc: 4,40 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1), 3,41 (1H, dd, J= 5,0; 8,5 Hz, H-2), 3,22 (1H, dd, J= 5,0; 8,5, Hz, H-3), 3,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, H-4), 3,29 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J= 12,0; 2,0 Hz, H-6a), 3,74 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6b). 13 C-NMR (CDCl3&CD3OD, 125 MHz), δC: 140,2 (C-5), 121,9 (C-6), 75,7 (C-3), 56,6 (C-14), 55,9 (C-17), 50,1 (C-9), 45,7 (C-24), 42,2 (C-13), 39,5 (C-4), 38,5 (C-12), 37,1 (C-1), 36,5 (C-10), 35,7 (C-20), 33,8 (C-22), 31,7 (C-7), 31,7 (C-8), 29,4 (C-2), 29,0 (C-25), 28,1 (C-16), 25,9 (C-23), 24,1 (C-15), 22,9 (C-28), 20,9 (C-11), 19,5 (C-19), 19,0 (C-27), 18,8 (C-26), 18,5 (C-21), 11,6 (C-18), 11,7 (C-29). Glc: 100,9 (C-1), 79,0 (C-3), 69,7 (C-4), 79,0 (C-5), 73,4 (C-2), 61,3 (C-6). Hợp chất RE3 (PE07): bột màu trắng HR-ESI-MS m/z 885,4837 [M+H] + IR (KBr) υmax: 3429, 2935, 1450, 1048cm -1 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 5,13 (1H, H-1Rha), 4,43 (1H, d, J = 7.5 Hz, H- 1GlcI), 4,27 (1H, J = 8,0 Hz H-1GlcII), 3,71 & 3,36 (2H, m, H-GlcI), 3,62 & 3,44 (2H, m, H-GlcII), 3,52 (1H, t, J = 6,0, 17,0 Hz, H-3), 1,07 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,73 (3H, s, H-18), 0,73 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,3 (C-6), 108,4 (C-22), 80,2 (C- 16), 76,0 (C-3), 65,9 (C-26), 61,8 (C-17), 55,8 (C-14), 49,6 (C-9), 41,1 (C-20), 40,1 (C- 13), 39,1 (C-12), 37,4 (C-4), 36,9 (C-1), 36,2 (C-10), 31,5 (C-7), 31,5 (C-15), 31,0 (C- 8), 31,0 (C-23), 29,8 (C-25), 29,0 (C-2), 28,5 (C-24), 20,4 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 27), 16,0 (C-18), 14,7 (C-21). GlcI: 98,0 (C-1), 88,3 (C-3), 76,0 (C-5), 75,2 (C-2), 68,5 (C-4), 61,0 (C-6). Rha: 100,5 (C-1), 72,0 (C-4), 70,5 (C-2), 70,3 (C-3), 68,1 (C-5), 17,8 (C-6). GlcII: 103,3 (C-1), 77,0 (C-3), 76,8 (C-5), 73,4 (C-2), 70,0 (C-4), 60,8 (C-6). Hợp chất RE4 (PE09): bột màu trắng, mp. 265-266oC : -77,5 (c 0,72, MeOH) APCI – MS m/z = 935,3 (M+Cl)- 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, d, J=4,0Hz, H-6), 5,13 (1H, brs, H- 1Rha), 5,05 (1H, H-Glc), 4,43(1H, d, J=8,0 Hz, H-1Glc), 3,9 (1H, t, J=6,5Hz, H- 3GlcI), 3,53 (1H, m, H-3), 3,51 (1H, t, J=8,0 Hz, H-16), 3,41&3,73 (2H, m, H-6GlcII), 3,38 & 3,68 (2H, m, H-6GlcI), 1,08 (3H, d, J=6,5Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,79 (3H, d, J=7,5Hz, H-21), 0,74 (3H, d, J=6 Hz, H-27), 0,73 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,2 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C- 17), 88,3 (C-16), 76,0 (C-3), 65,8 (C-26), 51,9 (C-14), 49,5 (C-9), 44,6 (C-20), 44,3 (C- 13), 36,9 (C-1), 37,4 (C-4), 36,3 (C-10), 30,8 (C-23), 28,9 (C-2), 31,5 (C-7), 31,5 (C-8), 29,6 (C-25), 31,3 (C-12), 31,2 (C-15), 28,0 (C-24), 18,9 (C-19), 16,6 (C-27), 20,0 (C- 11), 17,0 (C-18), 9,3 (C-21). GlcI: 97,9 (C-1), 88,3 (C-3), 76,9 (C-5), 75,1 (C-2), 68,4 (C-4), 60,9 (C-6). Rha: 100,5 (C-1), 71,9 (C-4), 70,3 (C-3), 69,9 (C-2), 68,1 (C-5), 17,7 (C-6). GlcII: 103,2 (C-1), 76,8 (C-3), 76,0 (C-5), 73,3 (C-2), 70,4 (C-4), 60,7 (C-6). Hợp chất RE5: bột màu trắng, mp. 281-283oC APCI-MS m/z: 905,4 [M+Cl] - 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 5,35 (1H, H-6), 5,05 (1H, H-1Ara), 4,89 (1H, d, J =2,0 Hz, H-1Rha), 4,43(1H, d, J =6,0 Hz, H-1Glc), 3,47 & 3,63 (2H, m, H-5Ara), 3,42 & 3,53 (2H, m, H-6Glc), 1,1 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,80 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-21), 0,75 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27), 0,74 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 140,2 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C- 16), 88,3 (C-17), 76,3 (C-3), 65,8 (C-26), 51,9 (C-14), 49,5 (C-9), 44,3 (C-13), 43,6 (C- 20), 37,6 (C-4), 36,9 (C-1), 36,3 (C-10), 31,6 (C-12), 31,5 (C-8), 31,4 (C-15), 31,2 (C- 7), 30,8 (C-23), 29,7 (C-25), 29,0 (C-2), 28,0 (C-24), 20,0 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 18), 16,6 (C-27), 9,3 (C-21). Glc: 98,0 (C-1), 76,2 (C-4), 76,1 (C-5), 75,9 (C-2), 74,9 (C-3), 61,3 (C-6). Rha: 107,8 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-3), 70,4 (C-2), 67,9 (C-5), 17,7 (C-6). Ara: 100,0 (C-1), 84,5 (C-4), 81,4 (C-2), 76,5 (C-3), 60,0 (C-5). Hợp chất AE6: dạng sáp màu vàng nhạt 1 H-NMR (500MHz, metanol-d4) δH: 5,37 (m, H 16, H9, H12, H13, H15&H10); 4,26 (d, J=7,5 Hz, H1ʹ), 4,18 & 4,17 (dd, J=5,0&10,5 Hz, H-Sn1), 4,01 (m, H-Sn2), 3,68 & 3,93 (2H, dd, J=5,0, 10,5 Hz, H-Sn3), 3,74&3,54 (2H, m, H6ʹ), 0,99 ( t, J=7,5Hz). 13 C-NMR (125MHz, metanol-d4) δC: 175,4 (C1), 132,7 (C16), 131,0 (C9), 129,2 (C12), 129,2 (C13), 128,8 (C15), 128,1 (C10), 105,2 (C1ʹ), 76,7 (C3ʹ), 74,7 (C5ʹ), 72,5 (C2ʹ), 71,8 (Sn3), 70,2 (C4ʹ), 69,6 (C-Sn2), 66,5 (C-Sn1), 62,4 (C6ʹ), 34,9 (C2), 30,6 (C7), 30,2 (C6), 30,1 (C4), 30,1 (C5), 28,1 (C8), 26,5 (C11), 26,4 (C14), 25,9 (C3), 21,5 (C17), 14,7 (C18). Hợp chất AE7: tinh thể hình kim màu trắng, mp. 168-170oC 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 5,16 (1H, dd, J = 9,0, 15,5 Hz, H-22), 5,02 (1H, dd, J = 8,5, 15,0 Hz, H-23), 3,52 (m, H-3), 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 1,01 (3H, s, H-18), 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-29), 0,82 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-28), 0,80 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-26). Hợp chất AE8: bột trắng, mp. 219-221oC. APCI-MS m/z: 431 [M+H] + 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-6), 3,99 (1H, t, J = 7,5 Hz H- 16), 3,51 (1H, m, H-3), 1,03 (3H, s, H-19), 0,89 (3H, m, H-21), 0,82 (3H, s, H-18), 0,80 (3H, J = 6,5Hz, H-27). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 140,8 (C-5), 121,3 (C-6), 110,1 (C-22), 90,9 (C-16), 90,2 (C-17), 71,7 (C-3), 66,8 (C-26), 52,9 (C-14), 49,6 (C-9), 44,6 (C-20), 43,7 (C-13), 42,2 (C-4), 37,2 (C-1), 36,6 (C-10), 32,0 (C-23), 31,6 (C-8), 31,6 (C-2), 31,6 (C-12), 31,2 (C-7), 30,7 (C-25), 30,1 (C-15), 28,1 (C-24), 20,7 (C-11), 19,4 (C-19), 17,1 (C- 27), 17,0 (C-18), 8,1 (C-21). Hợp chất AE9 (PE34): bột màu vàng, mp. 313-314ºC 1 H-NMR (500MHz, actone-d6) δH: 7,82 (1H, d, J=2,0 Hz,H2΄), 7,69 (1H, dd, J=8,5, 2,0 Hz, H6΄), 6,99 (1H, d, J=8,5 Hz, H5΄), 6,51 (1H, d, J=2,0 Hz, H8), 6,26 (1H, d, J=2,0 Hz, H6). 13 C-NMR (125MHz, actone-d6) δC: 176,5 (C4), 164,9 (C7), 162,3 (C5), 157,7 (C9), 148,3 (C4΄), 146,9 (C2), 145,8 (C3΄), 136,7 (C3), 123,7 (C1΄), 121,4 (C6΄), 116,2 (C5΄), 115,7 (C2΄), 104,1 (C10), 99,1 (C8), 94,4 (C6). Hợp chất AE11 (PE32): bột màu trắng, mp. 185-187ºC APCI-MS m/z 265 [M+Na] + , 240,9 [M-H] - 1 H-NMR (500Hz, DMSO-d6) δH: 7,68 (1H, s, H-2), 6,15 (1H, t, J = 6,5; 14 Hz, H-1′), 4,23 (1H, s, H-3′), 3,75 (1H, H-4′), 3,55 (2H, m, H-5′), 2,07 (2H, m, H-2′), 1,77 (3H, s, 3-CH3) 13 C-NMR (125Hz, DMSO-d6) δC: 163,9 (C-4), 150,6 (C-6), 136,2 (C-2), 109,5 (C-3), 83,9 (C-1′), 87,3 (C-4′), 70,5 (C-3′), 61,4 (C-5′), 39,5 (C-2′), 12,3 (3-CH3). Hợp chất AE12 (PE38):bột màu kem, mp. 261-263 °C UV (MeOH) λmax: 217, 306 IR (KBr): υmax 3277 (OH), 1583, 1511, 1460 (C-H) ESI-MS m/z: 227 [M-H] - 1 H-NMR (500 MHz, metanol-d4) δH: 6,47 (1H, d, 2 Hz, H-2, H-6), 6,18 (1H, t, H-4), 7,36 (1H, d, 3 Hz, H-2′, H-6′), 6,79 (1H, d, 8,5 Hz, H-3′), 6,78 (1H, d, 8,5 Hz, H-5′), 6,83 (1H, 16,3 Hz, H-a), 6,96 (1H, d, 16,3 Hz, H-b). 13 C-NMR (500 MHz, metanol-d4) δC: 141,3 (C-1), 105,8 (C-2, C-6), 159,6 (C-3, C-5), 102,7 (C-4), 130,4 (C-1′), 128,8 (C-2′, C-6′), 116,5 ( C-3′, C-5′), 158,3 (C-4′), 127,0 (C- a), 129,4 (C-b). Hợp chất AE13 (PE31) 1 H-NMR (500 MHz, metanol-d4) δH: 7,17 (2H, d, J=9,0 Hz, H2, H6), 7,06 (2H, d, J=8,5 Hz, H2 ʹ , H6 ʹ ), 6,84 (1H, d, J=16,0 Hz, H-7 ʹ ), 6,79 (2H, d, J=8,5 Hz, H3, H5), 6,67 (2H, d, J=8,5 Hz, H3 ʹ , H5 ʹ ), 6,65 (1H, d J=2,0 Hz, H-14 ʹ ), 6,59 (1H, d, J=16,0 Hz, H8 ʹ ), 6,27 (1H, d, J=1,5 Hz, H-12 ʹ ), 6,21 (1H, t, J=2,0 Hz, H-12), 6,19 (2H, d, J=2,0 Hz, H10, H14), 5,39 (1H, d, J=6,5 Hz, H-7), 4,37 (1H, d, J=6,5 Hz, H8). 13 C-NMR (125 MHz, metanol-d4) δC: 162,8 (C-11ʹ), 160,0 (C-11&C-13), 159,6 (C13ʹ), 158,4 (C4ʹ), 158,3 (C4), 147,3 (C9), 137,0 (C9ʹ), 133,9 (C1), 130,4 (C7ʹ), 129,9 (C1ʹ), 128,8 (C2ʹ&C6ʹ), 128,2 (C2&C6), 123,7 (C8ʹ), 120,1 (C10ʹ), 116,4 (C3ʹ&C5ʹ), 116,3 (C3&C5), 107,5 (C10&C14), 104,4 (C14ʹ), 102,3 (C12), 96,9 (C12ʹ), 94,8 (C7), 58,3 (C8). Hợp chất AE14 (PE34): bột màu vàng, mp. 181-183OC 1 H-NMR (500MHz, metanol-d4) δH: 7,35 (1H, d, J=2,0Hz, H-2΄), 7,32 (1H, dd, J=2,0, 8,5Hz, H-6΄), 6,93 (1H, d, J=8,5Hz, H-5΄), 6,37 (1H, d, J=1,5Hz, H-8), 6,21 (1H, d, J=1,5Hz, H-6), 5,37 (1H, d, J=1,0Hz, H1''), 4,87 (1H, H-4''), 4,24 (1H, br d, J=3,0, H- 2''), 3,76 (1H, dd, J=3,0, 9,0Hz, H-3''), 3,33 (1H, m, H-5''), 0,96 (3H, d, J=6,0Hz, H-6''). 13 C-NMR (125MHz, metanol-d4) δC: 179,6 (C4), 165,8 (C7), 163,1 (C5), 158,5 (C9), 158,3 (C2), 149,7 (C4'),146,4 (C3'), 136,2 (C3), 122,9 (C1'), 122,9 (C6'), 116,9 (C5'), 116,4 (C2'), 105,9 (C10), 103,5 (C1''), 99,8 (C6), 94,7 (C8), 73,3 (C4''),72,1 (C2''), 72,0 (C3''), 71,9 (C5''),17,6 (C6'') Hợp chất AE15 (PE 25): bột màu trắng, ESI-MS (m/z) 722 [M-H]- 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 3,46 (1H, d, J=5,5Hz, H-3), 5,32 (1H, H-6), 0,74 (3H, s, H-18), 0,97 (3H, s, H-19), 0,91 (3H, d, J=7,0Hz, H-21), 0,73 (3H, d, J=4,5Hz, H-27), 4,27 (1H, d, J=8,0Hz, H-1Glc), 3,75&3,40(2H, m, H-6Glc), 4,70 (1H, H-1Rha), 1,09 (3H, d, J=6,5Hz, H-6Rha). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 36,8 (C-1), 30,9 (C-2), 77,1 (C-3), 38,3 (C-4), 140,4 (C-5), 121,0 (C-6), 31,5 (C-7), 31,0 (C-8), 49,5 (C-9), 36,4 (C-10), 20,4 (C-11), 39,0 (C-12), 39,8 (C-13), 55,7 (C-14), 31,4 (C-15), 80,2 (C-16), 61,8 (C-17), 15,9 (C- 18), 19,1 (C-19), 41,1 (C-20), 14,5 (C-21), 108,4 (C-22), 29,2 (C-23), 28,4 (C-24), 29,8 (C-25), 65,9 (C-26), 17,0 (C-27). Glc: 100,7 (C-1), 73,7 (C-2), 75,2 (C-3), 76,7 (C-4), 75,3 (C-5), 61,0 (C-6). Rha: 100,5 (C-1), 70,7 (C-2), 70,6 (C-3), 71,9 (C-4), 68,3 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AE16 (PE24): Bột màu trắng. ESI-MS m/z= 745,4 [M+Na] + 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 3,48 (1H, m, H-3), 5,32 (1H, H-6), 0,73 (3H, s, H- 18), 0,96 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, d, J=7,0 Hz, H-21), 0,73 (3H, d, J=6,0 Hz, H-27), 4,35 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1Glc), 3,41 (2H, m, H-6Glc), 4,70 (1H, d, J=1,0 Hz, H-1Rha), 1,08 (3H, d, J=6,0Hz, H-6Rha). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 36,8 (C-1), 29,0 (C-2), 76,1 (C-3), 37,6 (C-4), 140,3 (C-5), 121,2 (C-6), 31,5 (C-7), 31,0 (C-8), 49,5 (C-9), 36,4 (C-10), 20,3 (C-11), 39,0 (C-12), 39,9 (C-13), 55,8 (C-14), 30,9 (C-15), 80,2 (C-16), 61,8 (C-17), 16,0 (C- 18), 18,9 (C-19), 41,1 (C-20), 14,5 (C-21), 108,4 (C-22), 31,4 (C-23), 28,5 (C-24), 29,8 (C-25), 65,9 (C-26), 17,0 (C-27). Glc: 98,2 (C-1), 76,3 (C-2), 77,7 (C-3), 70,2 (C- 4), 76,5 (C-5), 61,0 (C-6). Rha: 100,0 (C-1), 70,6 (C-2), 70,5 (C-3), 71,9 (C-4), 67,8 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AB17 (PE29): Dạng bột màu trắng, mp. 167-169OC. HR-ESI-MS m/z: 885,4829 [M+H] + . 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-6), 4,77 (1H, brs, H- 1RhaI), 4,72 (1H, H-1RhaII), 4,43 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1Glc), 4,20 (1H, m, H-16), 3,66 (1H, m, H-3), 3,63&3,43 (2H, m, H-6Glc), 3,50 (1H, m, H-12), 3,46 (1H, H-3Glc), 3,2 (1H, H-2Glc), 1,10 (3H, d, J=6,0 Hz,H-6RhaI), 1,09 (3H, d, J=4,5 Hz,H-6RhaII), 0,98 (3H, d, J=7,0 Hz, H-21), 0,93 (3H, s, H-19), 0,73 (3H, d, J=6,5 Hz, H-27), 0,71 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,4 (C-5), 121,4 (C-6), 108,4 (C-22), 80,0 (C- 16), 76,1 (C-3), 70,1 (C-12), 66,0 (C-26), 52,6 (C-17), 47,2 (C-14), 44,0 (C-13), 43,4 (C-9), 41,3 (C-20), 37,5 (C-4), 36,7 (C-1), 36,1 (C-10), 31,5 (C-15), 31,1 (C-8), 31,0 (C-23), 30,0 (C-2), 29,9 (C-25), 28,5 (C-24), 28,2 (C-11), 18,8 (C-19), 16,6 (C-27), 16,0 (C-18), 14,4 (C-21). Glc: 97,8 (C-1), 85,0 (C-3), 77,2 (C-2), 76,4 (C-5), 69,0 (C- 4), 60,8 (C-6). RhaI: 101,0 (C-1), 71,8 (C-4), 70,6 (C-3), 70,5 (C-2), 68,9 (C-5), 17,8 (C-6). RhaII: 102,0 (C-1), 71,3 (C-4), 70,5 (C-3), 70,5 (C-2), 68,5 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AB18 (PE 36): Tinh thể màu trắng đục, mp. 274-276 OC. APCI-MS: m/z = 903,6 [M+Cl] - . 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, H-6), 5,02 (1H, H-RhaI), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-Glc), 4,93 (1H, H-RhaII), 3,57 & 3,41 (2H, m, H-Glc), 3,38 (1H, m, H3), 1,10 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6RhaII), 1,09 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-RhaI), 0,96 (3H, s, H- 19), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,73 (d, J = 5,5 Hz, 3H), 0,73 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,2 (C-6), 108,4 (C-22), 80,2 (C- 16), 76,3 (C-3), 65,9 (C-26), 61,8 (C-17), 55,8 (C-14), 49,6 (C-9), 41,1 (C-20), 40,0 (C- 13), 39,0 (C-12), 37,4 (C-4), 36,8 (C-1), 36,4 (C-10), 31,5 (C-7), 31,5 (C-15), 31,0 (C- 8), 30,9 (C-2), 29,8 (C-25), 29,0 (C-23), 28,5 (C-24), 20,4 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 18), 16,0 (C-21), 14,6 (C-27). Glc: 98,2 (C-1), 77,0 (C-2), 76,8 (C-4), 76,1(C-5), 75,2 (C-3), 60,1(C-6). RhaI: 100,3 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-3), 70,4 (C-2), 68,0 (C-5), 17,8 (C-6). RhaII: 100,5 (C-1), 71,9 (C-4), 70,7 (C-2), 70,6 (C-3), 68,7 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AB19 (PE22): bột màu trắng, mp. 203-206 C : -91,8 (c 0,0055, pyridine) HR-ESI-MS m/z 1015,5472 (M+H) + , 1037,5292 (M+Na) + 1 H-NMR (500 MHz, pyridin-d5) δH: 6,43 (1H, br s, H-1RhaI), 6,31 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1RhaIII), 5,82 (1H, br s, H-1RhaII), 5,33 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 4,97 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1Glc), 4,25 & 4,2 (2H, m, H-6Glc), 1,79 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6RhaI), 1,63 (3H, d, J = 3,0 Hz, H-6RhaIII), 1,61 (3H, d, J = 3 Hz, H-6RhaII), 1,16 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 1,07 (3H, s, H-19), 0,85 (3H, s, H-18), 0,72 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27). 13 C-NMR (125 MHz, pyridin-d5) δC: 141,3 (C-5), 122,3 (C-6), 109,7 (C-22), 81,6 (C- 16), 78,2 (C-3), 67,3 (C-26), 63,4 (C-17), 57,1 (C-14), 50,8 (C-9), 42,4 (C-20), 40,9 (C- 13), 40,3 (C-12), 39,4 (C-4), 38,0 (C-1), 37,6 (C-10), 32,7 (C-7), 32,7 (C-15), 32,3 (C- 23), 32,1 (C-8), 31,1 (C-25), 30,6 (C-2), 29,7 (C-24), 21,6 (C-11), 19,9 (C-19), 17,8 (C- 27), 16,8 (C-18), 15,5 (C-21). Glc: 100,8 (C-1), 78,5 (C-2), 78,4 (C-3), 78,2 (C-4), 77,5 (C-5), 61,7 (C-6). Rha I: 102,7 (C-1), 74,6 (C-4), 73,8 (C-2), 73,1 (C-3), 70,0 (C-5), 19,1 (C-6). Rha II: 102,7 (C-1), 80,9 (C-4), 73,8 (C-2), 73,3 (C-3), 68,9 (C-5), 19,4 (C- 6). Rha III: 103,8 (C-1), 74,5 (C-4), 73,3(C-3), 70,9 (C-5), 70,3 (C-2), 18,9 (C-6). Hợp chất AB20 (PE26): Bột màu ngà, mp. 240-242 C ESI-MS m/z=1053,3 [M+Na] + 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-6), 5,06 (1H, H- 1RhaIII), 5,02 (1H, H-1RhaI), 4,68 (1H, H-1RhaII), 4,38 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1Glc), 3,58 & 3,41 (2H, m, H-6Glc), 3,48 (1H, m, H-3), 1,12 (3H, d, J = 2,5 Hz, H-6RhaII), 1,11 (3H, d, J = 2,5 Hz, H-6RhaI), 1,08 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6RhaIII), 0,95 (3H, s, H- 19), 0,78 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,74 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27), 0,73 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C- 17), 88,3 (C-16), 76,3 (C-3), 65,8 (C-26), 52,0 (C-14), 49,5 (C-9), 44,3 (C-13), 43,6 (C- 20), 37,6 (C-4), 36,9 (C-1), 36,3 (C-10), 31,6 (C-8), 31,6 (C-12), 31,4 (C-15), 31,2 (C- 7), 30,8 (C-23), 29,7 (C-25), 29,0 (C-2), 28,0 (C-24), 20,0 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 27), 16,6 (C-18), 9,3 (C-21). Glc: 98,2 (C-1), 77,1 (C-2), 76,1 (C-4), 76,0 (C-3), 75,3 (C-5), 60,0 (C-6). Rha I: 100,3 (C-1), 71,9 (C-2), 71,9 (C-4), 71,3 (C-3), 67,9 (C-5), 17,8 (C-6). Rha II: 100,0 (C-1), 77,9 (C-4), 71,3 (C-2), 70,7 (C-3), 66,8 (C-5), 19,0 (C- 6). RhaIII: 101,1 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-2), 70,3 (C-3), 68,9 (C-5), 17,7 (C-6). 3.3. Xây dựng dấu vân tay hóa học Nguyên liệu: 6 mẫu thực vật do Ths. Nguyễn Quỳnh Nga – Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu cung cấp (trong khuôn khổ đề tài quỹ gen cấp Viện Dược liệu) cùng vào thời điểm là 3/2016. Các mẫu được cung cấp có sự tương đồng khá cao như: đối với phần trên mặt đất gồm thân lá và hoa; đối với phần dưới mặt đất gồm từ 5 đến 6 đốt trên phần thân rễ. 05 hợp chất tinh khiết thuộc nhóm saponin spirotan phân lập từ PPC: gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5), paris saponin II (AB19) và paris saponin VII (AB20). Chuẩn bị mẫu: Cân 250 mg gồm 12 mẫu của 6 mẫu dược liệu (được mã hóa số) cho vào ống nghiệm 5 ml metanol chiết nóng trong 10 phút. Sau đó, để nguội tự nhiên rồi lọc dịch chiết qua màng lọc 0,22 µm và bổ sung thêm metanol để đạt 5 ml. Đối với 05 chất tinh khiết gồm: gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5), paris saponin II (AB19) và paris saponin VII (AB20) được tiến hành pha trong MeOH với nồng độ 1 mg/ml. Các mẫu được cho vào lọ sắc ký HPLC 1 ml, để tiến hành sắc ký TLC và HPLC. Tiến hành TLC xây dựng dấu vân tay hóa học được lập chương trình tiêm mẫu tự động trên máy Linomat 5.0. Tiến hành HPLC xây dựng dấu vân tay hóa học Tiến hành khảo sát chương trình chạy và tham khảo các tài liệu tiến hành với mẫu có saponin steroid hệ dung môi chạy HPLC là: axetonitril (A)- axid phosphoric 0,1% nước (B); tốc độ dòng: 1ml/phút; bước sóng phát hiện: 205 nm và nhiệt độ cột là 300C Kết quả được trình bày như trong phần 4.2 3.4. Hoạt tính sinh học 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT a. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT Tiến hành trên 8 mẫu cao phân đoạn và 8 hợp chất tinh khiết spirostan steroid phân lập từ PPC gồm: RE1, RE3, RE4, RE5, AE8, AB18, AB19 và AB20. Kết quả được trình bày ở phần 4.3.1 b. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 bổ sung EGF Tiến hành trên 8 mẫu cao phân đoạn và 6 hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC. Kết quả được trình bày ở phần 4.3.1 3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của paris saponin II lên hoạt độ của hai yếu tố phiên mã NF-κB và Ap-1 gây bởi yếu tố kích thích viêm LPS trong đại thực bào RAW 264.7. Tiến hành các bước như trong kít luciferase (Promega, WI), có sử dụng yếu tố kích thích viêm LPS trong đại thực bào RAW 264.7. Thiết bị đo cường độ sáng Luminometer (LB941, Berthold Technologies) xác định hoạt độ của enzym luciferase. Thông qua mức độ hoạt độ của luciferase cho quy đổi hoạt độ tương đương của hai yếu tố NF-κB và Ap-1. Phép thử tiến hành tại các nồng độ hợp chất paris saponin II: 1, 3, 10, 30 µM (-): Chứng âm không bổ sung LPS và mẫu thử. (+): Chứng dương có bổ sung LPS và không bổ sung mẫu thử. Kết quả được trình bày ở phần 4.3.2 3.4.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF- 7 dưới tác dụng paris saponin II Tế bào MCF-7 được nuôi qua đêm trong các đĩa 6 cm ở nhiệt độ 37OC. Hợp chất paris saponin II tại các nồng độ 1, 3, 10 và 30 µM được thêm vào mỗi đĩa rồi ủ trong 24h, sau đó thu lại rồi rửa sạch với nước muối đệm phosphat lạnh (PBS). Các tế bào được ly giải trên băng trong 30 phút trong 100 ul dung dịch ly giải [60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol]. Dịch chiết tế bào sau đó được đun sôi trong 5 phút (1000C) và ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 30 phút. Nồng độ dịch chiết tế bào được xác định bằng phương pháp BCA (Pierce, Rockford, IL) và điện di trên gel SDS – polyacrylamid 10%. Sau khi điện di kết thúc, protein trong gel được chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó được ủ với kháng thể nguyên cấp (p53, p21, p27, bax, cyclin D1, phospho-Rb, Rb, E2F1, β-actin). Tiếp đó kháng thể thứ cấp (HRP-conjugated anti-rabbit IgG với độ pha loãng 1:5000) được bổ sung và ủ tiếp trong 1h ở nhiệt độ phòng. Hình ảnh điện di được thể hiện trên phim bằng kit thử chemiluminescence (Amerhasm Bioscience, Mỹ). Kết quả được trình bày tại phần 4.3.3. Các phép thử về hoạt tính sinh học được thực hiện tại phòng thực nghiệm dược học - Đại học Lund, 22184 Lund, Thụy Điển. CHƢƠNG VI. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ bảy lá một hoa Từ phần thân rễ bảy lá một hoa đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 6 hợp chất (RE1, RE2A, RE2B, RE3 – RE5) gồm diosgenin (RE1), RE2 hỗn hợp: stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (RE2A), β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid (RE2B), gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5). Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phần dƣới mặt đất PPC Từ phần trên mặt đất bảy lá một hoa phân lập và xác định cấu trúc hóa học 15 hợp chất (AE6-AB20) trong đó 1 hợp chất mới (AB17) và 7 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ PPC là: 1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol (AE6), stigmasterol (AE7), quercetin (AE9), thymidine (AE11), resveratrol (AE12), ε-viniferin (AE13), quercetrin (AE14), và các hợp chất khác: penogenin (AE8), stigmasterol-3-O-D-glucosid (AE10), diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glycopyranosid (AE15), diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glycopyranosid (AE16), dioscin (AB18), paris saponin II (AB19), paris saponin VII (AB20). Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phần trên mặt đất PPC Biện giải cấu trúc hợp chất AB17 (Hợp chất mới) Hợp chất 17: phân lập có dạng bột màu trắng, có nhiệt nóng chảy 167-169OC. Phổ 1D-NMR phần aglycon cho các tín hiệu đặc trưng của spirostan steroid 4 nhóm metyl trong đó có hai nhóm có tín hiệu singlet tại δ 0,71 (s), 0,93 (s) và hai tín hiệu douplet tại δ 0,88 (d, J=7,0 Hz), 0,73 (d, J=6,5 Hz); một proton thế ba lần tại δ 5,33 (d, J=4,5Hz); và tín hiệu proton nhóm oxymetin tại δ 3,5 (H-3) và 27 cacbon trên phổ 13C-NMR với 1 cacbon spirostan tại δ 108,4. Mặt khác, tín hiệu hai nhóm metin tại δ 80,0 (C-16) và 52,6 (C-17) gợi ý dạng cấu trúc spirostan này là diosgenin. Vị trí của cacbon được xác định bằng tương tác H→C trực tiếp trên phổ HSQC gồm 4 nhóm metyl tại δ 16,0, 18,8, 14,4 và 16,6, một nối đôi thế ba lần tại δ 121,4 (C6) và 140,4 (C5); một nhóm oxymetin tại C3 (δ 76,1). Tuy nhiên, khi so sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất AB17 với dioscin (dioscin là một saponin diosgenin với 3 phân tử đường) và hợp chất (25R)-spiros-5-ene-3β, 12α-diol3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)- [α-L-Rha(1→2)]-β-D-Glc có một số khác biệt: Dữ liệu phổ 1D-NMR cuả dioscin và hợp chất AB17 (xem bảng 4.1) cho các tín hiệu tương tự nhau chỉ khác tại một số điểm như dioscin có 10 nhóm metylen trong khi hợp chất AB17 chỉ có 9 nhóm và thiếu một tín hiệu nhóm này δ tại >20 ppm và có hơn một tín hiệu hydroxymetin tại δ 70,1, kết quả này cho phỏng đoán một nhóm metylen đã bị hydroxy hóa trong cấu trúc của hợp chất AB17. Mặt khác khi so sánh phần dữ liệu phổ phần aglycon của hợp chất (25R)-spiros-5-ene-3β, 12α-diol3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)-[α-L- Rha(1→2)]-β-D-Glc (có liên kết OH tại C12) có tịnh tiến tương dương với phổ của hợp chất AB17. Kết quả phỏng đoán này được khẳng định khi phân tích các tương tác trên phổ HMBC các nhóm metyl H27 (δ 0,71)/C25 (δ 29,9) và C26 (δ 66,0), H21 (δ 0,88)/C20 (δ 41,3) và C17 (δ 52,6), H19 (δ 0,93)/C10 (δ 36,1) và C9 (δ 43,4), H18 (δ 0,71)/C17 (δ 52,6) và C13 (δ 44,0). Đặc biệt phổ HMBC thực nghiệm cho tương tác H18/C12 (δ 70,1), cho kết luận về vị trí hydroxy hóa tại C12. Như vậy, với kết quả phân tích phổ trên có thể khẳng định diosgenin đã bị hydroxy hóa tại vị trí C12 và phần aglycon của hợp chất AB17 là 12- hydroxy-diosgenin. Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu 45 cacbon gồm 27 cacbon thuộc khung steroid và 18 cacbon thuộc 3 phân tử đường có 6 cacbon. Mặt khác trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu 3 proton anome tại δ 4,43 (d, J=8,0 Hz), 4,77 (br s) và 4,72 (br s), dễ dàng xác định vị trí của cacbon anome tương ứng bằng tương tác H→C trực tiếp trên phổ HSQC tại δ 97,8, 101,0 và 102,0. Hằng số tương tác của proton anome là 8,0 Hz xác định cấu hình β của đường glucopyranosyl. Cấu hình α của hai đường rhamnopyranosyl được xác định bằng hằng số tương tác của proton anome là br s. Các tín hiệu proton douplet tại δ 1,10 (d, J=6,0 Hz) và 1,09 (d, J=4,5 Hz) đặc trưng cho 2 nhóm metyl của hai phân tử rhamnose. Từ vị trí của anome xác định các tương tác trên phổ HMBC gồm H-1Glc (δ 4,43)/C3 (δ 76,1) xác định vị trí glycosid hóa phân tử 12hydro- diosgenin tại C3; H-1Rha (δ 4,77)/C2Glc (δ 77,2) và C-5RhaI (δ 68,9); H- 1RhaII (δ 4,72)/C3Glc (δ 85,0) và C-5RhaII (δ 68,9), và tương tác của các metyl trong các phân tử rhamnose H-6Rha/C5Rha và C-4Rha. Kết quả phân tích các tương tác anome xác định cấu trúc phần đường là 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosid. Phổ HR-ESI-MS cho píc ion tại m/z 885,4829 [M+H]+ cho xác định một công thức phân tử là C45H72O17 có M=884,4770. Như vậy, phân tích phổ 1D, 2D-NMR và HR-ESI-MS thực nghiệm kết hợp với so sánh dữ liệu phổ tài liệu có thể kết luận hợp chất AB17 là 12-hydroxy- diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-[α- L-rhamnopyranosyl-(1→3)]- β-D-glucopyranosid Công thức cấu tạo của hợp chất AB17 (12-hydroxy-diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucopyranosid) Tham chiếu cấu trúc của hợp chất AB17 trên phần mềm scifinder không tìm thấy cấu trúc nào tương tự nên có thể kết luận hợp chất này là hợp chất mới trong tự nhiên cũng như trong tổng hợp hữu cơ. 4.2. Xây dựng dấu vân tay hóa học các mẫu thuộc chi Paris 4.2.1. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp TLC Chuẩn bị mẫu cao và pha tinh khiết phân lập từ PPC như phần 3.3, tiến hành mã hóa các mẫu và thực hiện TLC trên máy chấm sắc ký Linomat 5.0 thu được sắc ký đồ sau: Kết sắc ký đồ phần trên mặt đất các mẫu chi Paris Sắc ký đồ TLC các mẫu phần trên mặt đất chi Paris, sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% và hơ nóng. Trong đó: 1 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris vietnamensis 2 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. polyphylla 3 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris caobangenis 4 Hợp chất paris saponin VII (AB20) 5 Hợp chất paris saponin II (AB19) 6 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. yunnanesis 7 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. chinensis trồng tại Sapa – Lào Cai 8 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên Kết sắc ký đồ phần thân rễ các mẫu chi Paris Bàn luận: Đã tiến hành TLC trên pha đảo và pha thường phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất của 6 mẫu thực vật; 3 chất tinh khiết phân lập từ phần dưới mặt đất là gracillin, paris saponin D và paris saponin H; 2 chất tinh khiết phân lập từ phần trên mặt đất là paris saponin II và paris saponin VII. Kết quả sắc ký đồ cho thấy các chất tinh khiết không phát hiện tại UV 254 và 366 nm và chỉ phát hiện với thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng; các hệ dung môi cho sự phân tách của các chất tinh khiết khá tốt: + Đối với phần trên mặt đất hai chất paris saponin II và paris saponin VII có sự phân bố tỉ lệ nghịch trên các mẫu thực vật. + Đối với phần dưới mặt đất nên sử dụng cả TLC trên pha đảo và pha thường để phân tích sắc ký đồ của 3 chất tinh khiết. Kết quả sắc ký đồ trên 6 mẫu thực vật có sự khác biệt và hoàn toàn có thể sử dụng TLC để phân biệt các A, B Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 20x10 cm) phần trên mặt đất các mẫu chi Paris Hệ dung môi: aceton/nước (3/1) C, D Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) phần trên mặt đất các mẫu chi Paris Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1) A, C: Sắc ký đồ dưới ánh sáng thường B, D: Sắc ký đồ chụp tại UV 366nm thường A C B D loài và dưới loài. Sắc ký đồ TLC phần dƣới mặt đất các mẫu chi Paris, sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng Trong đó 1 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên Sapa- Lào Cai (PPCW) 2 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis trồng tại Sapa-Lào Cai (PPC) 3 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. yunnanesis (PPY) 4 Hợp chất paris saponin H (RE5) 5 Hợp chất gracillin (RE 3) 6 Hợp chất paris saponin D (RE 4) 7 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris caobangenis (PC) 8 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. polyphylla (PPP). 9 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris vietnamensis (PV) 4.2.2. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp HPLC Chuẩn bị mẫu cao và các chất tinh khiết như phần phần 3.3 thu được kết quả sắc ký đồ phần trên và dưới mặt đất: A E C A: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01), ánh sáng thường B: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01), bước sóng 366nm C: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1), ánh sáng thường D: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1), bước sóng 366nm E: Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254, Hệ dung môi: MeOH:H2O (20/3), ánh sáng thường F: Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254, Hệ dung môi: MeOH:H2O (20/3), bước sóng 366nm B D F Sắc ký đồ HPLC của các mẫu phần trên mặt đất chi Paris Sắc ký đồ HPLC của các mẫu phần thân rễ chi Paris Trong đó: Nhận xét: - Sắc ký đồ HPLC phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất cho các pic tách nhau rõ nét Đối với phần trên mặt đất: + Sắc ký đồ bằng HPLC đã phản ánh đúng kết quả như trong TLC về sự phân bố tỉ lệ nghịch hai hợp chất paris saponin II và paris saponin VII trong các mẫu: paris saponin II phân bố trong mẫu được sắp xếp: PPC > PPCW, PV và rất ít trong mẫu PC và PPP; paris saponin VII phân bố nhiều trong mẫu PC và PPP nhưng lại có ít trong các mẫu còn lại + Các pic chất nhiều nhất trong mẫu PPC và ít nhất trong mẫu PC. Đối với phần dưới mặt đất: + Hai chất paris saponin D và gracillin là hai saponin chính trong các mẫu thuộc chi Paris. Paris saponin H có trong các mẫu nhưng lượng nhỏ hơn. + Khi so sánh sự tích lũy của 3 chất tinh khiết này trong mẫu PPC trồng và thu hái tự nhiên có sự khác nhau theo chiều hướng loài hoang dại tích lũy cao hơn. Kết quả này phù hợp với sắc ký đồ bằng phương pháp TLC. + Số lượng các pic chất của các mẫu thuộc chi Paris cũng có sự khác biệt theo thứ tự: PPCW>PPC, PPY, PV và ít nhất trong mẫu PPP. 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học 4.3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao chiết, các cao phân đoạn và 8 hợp chất spirostan steroid tinh khiết phân lập từ PPC trên 4 dòng tế bào A549, HL-60, Hela và Caco-2. Sử dụng Adriamycin làm chứng dương Giá trị IC50 của cao tổng, cao phân đoạn và 8 hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC Ký hiệu mẫu IC50 (µg/ml) 1. Hợp chất paris saponin VII (AB20) 2. Hợp chất paris saponin II (AB19) 3. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris vietnamensis (PV) 4. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris polyphylla var. polyphylla (PPP) 5. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris caobangensis (PC) 6. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris polyphylla var. yunnanesis (PPY) 7. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris polyphylla var. chinensis được trồng Sapa- Lào Cai (PPC) Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự 1. Hợp chất paris saponin D (RE 4) 2. Hợp chất gracillin (RE 3) 3. Hợp chất paris saponin H (RE 5) 4. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên (PPCW) 5. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis được trồng tại Sapa-Lào Cai (PPC) 6. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris caobangensis (PC) 7. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. yunnanesis (PPY) 8. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. polyphylla (PPP) 9. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris vietnamensis (PV) A549 HL-60 Hela Caco-2 RPC 10,46 ±0,76 15,55 ±0,98 11,05 ±0,67 23,57 ±1,78 RPCBt 7,54 ±0,55 9,52 ±0,65 10,47 ±0,89 11,92 ±1,05 RPCEt 6,42 ±0,52 7,0 ±0,35 9,467 ±0,53 9,78 ±0,89 RPCW 10,16 ±1,02 18,59 ±0,98 9,144 ±0,43 22,7 ±1,56 PC 7,76 ±0,63 13,46 ±0,89 8,41 ±0,54 20,19 ±1,36 PCEt 9,33 ±0,65 11,77 ±0,97 9,24 ±0,68 8,23 ±0,43 PCBt 10,54 ±0,98 12,4 ±1,23 8,09 ±0,57 8,66 ±0,69 PCW 7,89 ±0,56 15,03 ±1,06 11,6 ±0,78 25,70 ±1,68 Pennogenin 7,62 ± 0,49 6,72 ± 0,52 4,79 ± 0,48 14,94 ± 0,50 Paris saponin D 26,95 ± 1,05 14,80 ± 1,12 19,24 ± 1,05 39,50 ± 1,04 Paris saponin H 30,76 ± 1,01 19,41 ± 1,09 10,96 ± 1,05 43,59 ± 1,25 Paris saponin VII 35,86 ± 1,23 13,06 ± 1,21 13,17 ± 1,14 26,01 ± 1,17 Diosgenin 17,09 ± 0,50 20,05 ± 0,54 10,63 ± 0,49 18,99 ± 0,60 Gracillin 31,26 ± 1,03 11,34 ± 1,07 10,13 ± 1,03 39,68 ± 1,03 Dioscin 85,86 ± 1,07 102,98 ± 1,34 39,90 ± 1,12 50,36 ± 1,02 Paris saponin II 67,14 ± 1,23 52,98 ± 1,32 13,46 ± 1,17 37,28 ± 1,19 Adriamycin 0,95 ± 0,09 0,54 ± 0,07 0,31 ± 0,01 2,04 ± 0,35 Trong đó: RPC: Mẫu cao tổng phần thân rễ; RPCBt: Mẫu cao phân đoạn butanol phần thân rễ; RPCEt: Mẫu cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ; RPCW: Mẫu cao phân đoạn nước phần thân rễ; PC: Mẫu cao tổng phần trên mặt đất; PCEt: Mẫu cao phân đoạn etyl axetat phần trên mặt đất; PCBt: Mẫu cao phân đoạn butanol phần trên mặt đất; PCW: Mẫu cao phân đoạn nước phần trên mặt đất. Nhân xét: Cao tổng phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất có tác dụng gây độc 3 dòng tế bào ung thư A549, Hela và HL-60 với giá trị IC50 từ 7,56 - 15,55 µg/mL, không có tác dụng trên Caco-2 (giá trị IC50 > 20 µg/mL). Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của phần trên mặt đất mạnh hơn cả phần dưới mặt đất kết quả này cho thấy có thể dùng thay thế phần thân rễ bằng phần trên mặt đất trong nghiên cứu ung thư. Phân đoạn etyl axetat trên và dưới mặt đất có tác dụng độc tế bào đối với 4 dòng tế bào ung thư A549, HL-60, Hela và Caco-2 với giá trị IC50 từ 6,42 - 11,7 µg/mL. Phân đoạn butanol trên và dưới mặt đất có tác dụng độc tế bào đối với 4 dòng tế bào ung thư A549, HL-60, Hela và Caco-2 với giá trị IC50 từ 7,54 - 12,4 µg/mL. Trong 8 hợp chất tinh khiết spirostan steroid phân lập từ PPC chỉ có hợp chất pennogenin (AE8) biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh nhất với giá trị IC50 từ 4,79 – 7,62 µg/mL trên 3 dòng tế bào là A549, HL-60 và Hela. Các hợp chất biểu hiện tác dụng trung bình đến yếu. Như vậy, bằng các kết quả thực nghiệm mang tính thống kê cao (mỗi phép thử đều lặp lại 4 lần) và thực hiện trên nhiều dòng tế bào (4 dòng tế bào ung thư ở người) cho ta một cái nhìn tổng quát về khả năng gây độc tế bào ung thư của đối tượng nghiên cứu là Paris polyphylla var. chinensis và gợi ý về việc sử dụng các cao chiết hoặc phân đoạn chiết để sử dụng làm các chế phẩm nghiên cứu tác dụng ung thư. Tuy nhiên, các chất tinh khiết vẫn được sử dụng như là marker để kiểm tra chất lượng của chế phẩm. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 bằng phương pháp MTT có bổ sung EGR Ghi chú: (-): Chứng âm không bổ sung EGF; (+): Chứng dương có bổ sung EGF; (1): Cao tổng phần dưới mặt đất; (2): Cao phân đoạn butanol phần dưới mặt đất; (3): Cao phân đoạn etyl acxetat phần dưới mặt đất; (4): Cao phân đoạn nước phần dưới mặt đất; (5): Cao tổng phần trên mặt đất; (6): Cao phân đoạn butanol phần trên mặt đất; (7): Cao phân đoạn etyl axetat phần trên mặt đất; (8): Cao phân đoạn nước phần trên mặt đất; (9): diosgenin; (10): paris saponin D; (11): gracillin; (12): paris saponin H; (13): paris saponin II; (14): paris saponin VII. Nhận xét: Tại nồng độ thử là 50 µg/ml cao tổng, cao phân đoạn butanol, cao phân đoạn nước phần trên và phần dưới mặt đất không cho tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú có bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) (mức độ sai khác có ý nghĩa thông kê là 0), nhưng phân đoạn etyl axetat của phần trên và phần dưới mặt đất đều thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 (mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê là 0,5 và 0,05). Sự khác biệt không có ý nghĩa giữa phần trên mặt đất, dưới mặt đất. Tại nồng độ thử là 30 µg/mL 6 hợp chất spirostan saponin tinh khiết phân lập từ PPC đều thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào MCF-7, nhưng paris saponin II thể hiện hoạt tính cao nhất với khả năng ức chế tăng sinh MCF-7 giảm 2,2 lần so với đối chứng dương và đạt độ tin cậy so sánh là 0,005. Trên mô hình thử ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú có bổ sung EGF, diosgenin thể Mức độ phát triển tế bào - + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 50 µg/ml 30 µg/ml 50 ng/ml EGF Mức độ phát triển tế bào Ảnh hƣởng của paris saponin II với sự phát triển của tế bào ung thƣ vú MCF7 Ảnh hƣởng của cao chiết và các hợp chất tinh khiết với sự phát triển của tế bào ung thƣ vú MCF7 50 ng/ml EGF Paris II (µM) + 1 3 10 30 - hiện khả năng ức chế tăng sinh tế bào yếu hơn so với các saponin tương ứng của nó. Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của paris saponin II đến khả năng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 cho thấy: hợp chất này ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú phụ thuộc vào nồng độ và tại nồng độ 30 µM thể hiện khả năng ức chế tăng sinh tế bào này mạnh nhất và gần bằng đối chứng âm. Mặt khác, các nghiên cứu sâu về cơ chế tác động của hợp chất này cho đến nay chưa có công bố nào. Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn hợp chất paris saponin II để nghiên cứu cơ chế tác dụng trên một số đích phát sinh ung thư. 4.3.2. Kết quả tác dụng của hợp chất paris saponin II lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và Ap-1 bằng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla Sử dụng kít thử nghiệm hệ thống (Promega, WI, USA) thu được kết quả biểu hiện tương đương hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và Ap-1: Ảnh hƣởng của paris saponin II (paris II) lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và Ap-1 Ghi chú: (-): Chứng âm không có LPS; (+): Chứng dương bổ sung LPS. Nhận xét: Kết quả hình trên cho thấy hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và Ap-1 ở mẫu chứng dương khi tế bào RAW246.7 bị kích thích viêm bởi 5 ng/ml lipopolysaccharid (LPS) thì hoạt độ của cả hai yếu tố phiên mã NF-κB và Ap-1 tăng khoảng 4 lần so với mẫu chứng âm với độ tin cậy là 0,001 đã khẳng định tính đúng của mô hình. Paris saponin II làm giảm hoạt độ của của NF-κB và Ap- 1 khi có mặt LPS phụ thuộc nồng độ và ức chế mạnh nhất tại nồng độ 30 µM. 4.3.3. Kết quả biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF-7 sử dụng kỹ thuật Western Blot. Hoạt độ NF-κB Hoạt độ Ap-1 - - + 1 3 10 30 + LPS 5 ng/ml paris II (µM) - - + 1 3 10 30 + LPS 5 ng/ml paris II (µM) Tác dụng của paris saponin II lên biểu hiện nhóm protein tham gia vào chu trình tế bào Tác dụng của paris saponin II lên biểu hiện nhóm protein tham gia vào quá trình apoptosis Như vậy, bằng kỹ thuật Western Blot hợp chất paris saponin II tác động khác nhau lên biểu hiện hai nhóm protein tham gia vào chu trình tế bào và quá trình apoptosis: Đối với nhóm các protein tham gia chu trình tế bào: Hợp chất paris saponin II có tác dụng làm tăng biểu hiện p21 và p27 và giảm biểu hiện cyclin D1 và p- Rb phụ thuộc nồng độ và không làm thay đổi mức độ biểu hiện Rb và E2F1. Kết quả phân tích vai trò của từng protein trong nhóm tham gia vào chu trình tế bào cho thấy: paris saponin II có tác dụng làm cho tế bào không chuyển sang pha tổng hợp (pha S) và dừng chu trình tế bào tại pha G1, điều này có ý nghĩa trong việc ngăn quá trình nhân lên mất kiểm soát của tế bào ung thư. Đối với protein tham gia quá trình apoptosis: Hợp chất paris saponin II tác dụng làm tăng biểu hiện hai protein Bax và p53 phụ thuộc theo nồng độ 1, 3, 10 µM và nồng độ 30 µM không thấy tác dụng. Kết quả phân tích vai trò của hai protein này đối với quá trình apoptosis cho thấy: chất paris saponin II có tác động trực tiếp và gián tiếp thúc đẩy quá trình apoptosis. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Về thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis Franchet trồng tại Lào Cai. 1.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được. Từ cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ bảy lá một hoa (PPC) đã phân 6 hợp chất tinh khiết (RE1, RE2A và RE2B, RE3 – RE5) gồm: diosgenin (RE1), hỗn hợp hai chất stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (RE2A) và β-sitosterol-3-O-β- D-glucopyranosid (RE2B), gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5). Từ cao phân đoạn etyl axetat và butanol phần trên mặt đất loài PPC phân lập được 15 hợp chất tinh khiết (AE6 – AB20): trong đó có 1 hợp chất mới là 12- p21 p27 Cyclin D1 p-Rb Rb E2F1 β-actin Paris II (μM) - 3 10 301 hydroxy-diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl- (1→3)]-β-D-glucopyranosid (AB17), 5 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Paris gồm 1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol (AE6), stigmasterol (AE7), thymidin (AE11), resveratrol (AE12), ε-viniferin (AE13); 2 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ PPC gồm quercetin (AE9), quercetrin (AE14); và 7 hợp chất khác là pennogenin (AE8), stigmasterol-3-O-D-glucosid (AB10), diosgenin-3-O-α- L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glycopyranosid (AE15), diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glycopyranosid (AE16), dioscin (AB18), paris saponin II (AB19), và paris saponin VII (AB20). 1.2. Bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học để phân biệt một số loài thuộc chi Paris. Đề tài đã bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học bằng phương pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về thành phần hóa học giữa các loài thuộc chi Paris thu ở Việt Nam. Mặt khác, thông qua tín hiệu píc của các hợp chất trên sắc ký đồ bản mỏng và HPLC, sự có mặt của các hợp chất của loài Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên và trồng cũng có những khác biệt. Đặc biệt, hợp chất Paris saponin II trong mẫu trồng có cường độ píc cao hơn loài thu tự nhiên. Những nghiên cứu bước đầu này đã cung cấp 2 phương pháp xác định dấu vân tay khác nhau là HPLC và TLC phục vụ cho các nghiên cứu sâu về lĩnh vực này trong tương lai. 2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ và sơ bộ cơ chế tác dụng của hợp chất paris saponin II trên dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7. Đề tài đã đánh giá tác dụng gây độc 4 dòng tế bào ung thư người A549, HL-60, Hela và Caco-2 của cao tổng, cao phân đoạn và 8 hợp chất spirostan steroid phân lập từ PPC. + Cao chiết tổng phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất thể hiện hoạt tính rõ rệt trên 3 dòng tế bào ung thư A549, Hela và HL-60 với giá trị IC50 từ 7,56- 15,55 µg/mL, không có tác dụng trên Caco-2. Phân đoạn etyl axetat của phần trên và dưới mặt đất thể hiện hoạt tính gây độc trên bốn dòng tế bào ung thư mạnh nhất với giá trị IC50 từ 6,42-11,7 µg/mL. + Pennogenin có hoạt tính cao hơn diosgenin và gây độc tế bào ung thư mạnh nhất với giá trị IC50 < 10 µg/mL trên 3 dòng tế bào là A549, HL-60 và Hela. Các aglycon (diosgenin và pennogenin) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao hơn các saponin tương ứng. Các hợp chất còn lại có hoạt tính từ trung bình đến yếu. Đề tài đã đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 có bổ sung EGF của cao tổng, các cao phân đoạn etyl axetat, butanol, nước và 6 hợp chất spirostan steroid phân lập từ PPC: + Tại nồng độ thử 50 µg/ml, cao tổng, cao phân đoạn butanol, cao phân đoạn nước phần trên và phần dưới mặt đất không cho tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú, nhưng phân đoạn etyl axetat của phần trên và phần dưới mặt đất đều thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh tế bào MCF-7 và không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa phần trên mặt đất, dưới mặt đất. + Tại nồng độ 30 µg/ml, 6 hợp chất spirostan steroid đều thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 trong điều kiện có bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF). Trong đó, hợp chất paris saponin II thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh tế bào mạnh nhất tại liều thử nghiệm. + Hợp chất paris saponin II ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 khi bổ sung EGF phụ thuộc nồng độ, tại nồng độ 30 µM ức chế mạnh nhất. Đề tài cũng đã lần đầu tiên đánh giá ảnh hưởng của hợp chất paris saponin II lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và AP-1 bằng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla: Hợp chất Paris saponin II làm giảm hoạt độ NF-kB và Ap-1 khi bổ sung chất kích thích gây viêm lipopolysaccharide (LPS) trong đại thực bào RA W264.7 phụ thuộc nồng độ, tại nồng độ 30 µM có tác dụng mạnh nhất. Đề tài đã lần đầu tiên đánh giá mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF-7 theo nồng độ hợp chất paris saponin II bằng kỹ thuật Western Blot. + Đối với nhóm các protein tham gia chu trình tế bào: Hợp chất paris saponin II có tác dụng làm tăng biểu hiện p21 và p27 và giảm biểu hiện cyclin D1 và p- Rb phụ thuộc nồng độ và không làm thay đổi mức độ biểu hiện Rb và E2F1. Với tác dụng này có thể nghĩ đến hợp chất paris saponin II ức chế tế bào ung thư ở pha G1 của chu trình nhân lên của tế bào ung thư. + Đối với protein tham gia quá trình apoptosis: Hợp chất paris saponin II tác dụng làm tăng biểu hiện hai protein Bax và p53 phụ thuộc theo nồng độ 1, 3, 10 µM và nồng độ 30 µM không thấy tác dụng. Với tác dụng này có thể nghĩ đến paris saponin II có tác dụng thúc đẩy sự chết theo chu trình của tế bào ung thư (apoptosis). NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Luận án đã thành công trong viêc phân lập được 21 chất gồm: RE1 (diosgenin); RE2 hỗn hợp hai chất stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và β- sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid), RE3 (gracillin), RE4 (paris saponin D), RE5 (paris saponin H), AE6 (1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol), AE7 (stigmasterol), AE8 (pennogenin), AE9 (quercetin), AE10 (stigmasterol-3-O-D- glucosid), AE11 (thymidin), AE12 (resveratrol), AE13 (ε-viniferin), AE14 (quercetrin), AE15 (diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D- glycopyranosid), AE16 (diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D- glycopyranosid), AB17 (12-hydroxy-diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)- [α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosid), AB18 (dioscin), AB19 (paris saponin II), AB20 (paris saponin VII). Trong 21 hợp chất phân lập được có một hợp chất mới là AB17; có 5 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Paris là AE6, AE7, AE11, AE12 và AE13 và hai hợp chất mới trong đối tượng nghiên cứu (PPC) là AE9 và AE14. 2. Luận án đã thành công trong việc sử dụng phương pháp TLC và HPLC cho nghiên cứu đa dạng ở mức độ loài và dưới loài các mẫu thuộc chi Paris. Kết quả sắc ký đồ cho thấy có sự khác biệt giữa các mẫu thuộc chi Paris và gợi ý về việc thay thế cho phương pháp tiêu bản gặp khó khăn khi nhận diện các mẫu có tính đồng hình cao hay phương pháp sinh học phân tử đòi hỏi chi phí cao và máy móc phức tạp trong nghiên cứu đa dạng. 3. Luận án đã đánh giá in vitro tác dụng gây độc tế bào ung thư ở người trên 5 dòng tế bào là A549 (tế bào ung thư phổi); HL-60 (tế bào ung thư bạch cầu); Hela (tế bào ung thư cổ tử cung); Caco-2 (tế bào ung trực tràng); và MCF- 7 (tế bào ung thư biểu mô vú) của từng phần trên và thân rễ các cao chiết và hợp chất spirostan steroid phân lập từ loài PPC. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của phần trên và dưới mặt đất, nên có thể sử dụng thay thế các phần trong nghiên cứu ung thư. Kết quả thực nghiệm đã góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loài dược liệu quý này. 4. Luận án đã thành công trong việc lần đầu tiên sơ bộ cơ chế tác dụng của hợp chất paris saponin II trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Hợp chất này có hàm lượng lớn và cũng là chất được sử dụng trong dược điển Trung Quốc để định lượng và nhận diện hai đối tượng là Paris polyphylla var. chinensis và Paris polyphylla var. yunnanesis. Kết quả thực nghiệm bước đầu giải thích con đường mà hợp chất paris saponin gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) là theo con đường apoptosis và chu kỳ tế bào. CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Duyên, Phạm Quốc Long, Đỗ Thị Hà (2016), “Saponin steroid từ cắn ethyl acetat của thân rễ bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) trồng tại Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 21(1+2), tr.30-35 2. Nguyễn Thị Thu, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Đắc Bình Minh, Đào Thùy Dương, Nguyễn Thị Duyên (2016), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây bảy lá một hoa ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 21(4), tr.242-247. 3. Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Thu, Phạm Quốc Long (2016), “Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) họ Trọng lâu (Triliaceae)”, Tạp chí khoa học và công nghệ 56(2C), tr.472-478 4. Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Trần Vũ Thắng, Nguyễn Quyết Chiến, Phạm Quốc Long, “Thành phần hóa học cao dịch chiết etyl acetat cây bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) trồng tại Việt Nam”, Tạp chí Hóa học, chấp nhận đăng tập 55 số 3 năm 2017.