Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thuần Việt Nam tại Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội

tự phối 20% trong tác phẩm “ Tác động của giao phối và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản năm 1876. Năm 1878 nhà nghiên cứu người Mỹ tên Beal đã áp dụng thực tế ƯTL trong việc tạo giống ngô lai giữa giống. Ông thu được những cặp lai hơn hẳn các giống bố mẹ về năng suất từ 10-15%. Năm 1904 Shull lần đầu tiên tiến hành tự thụ cưỡng bức ở ngô để thu được các dòng chuẩn và đã tạo ra những giống lai từ các dòng chuẩn này. Năm 1913 chính Shull đã đưa vào tài liệu khoa học thuật ngữ “Hetetosis” để chỉ ƯTL (Hetetosis là từ rút gọn của Stimulus of heetrozygosis). Từ năm 1918 Jones đề xuất sử dụng lai kéo trong sản xuất để giảm giá thành hạt giống thì việc áp dụng ƯTL vào trồng trọt, chăn nuôi được phát triển nhanh chóng. ƯTL của những cơ chế dị hợp tử biểu hiện ở tổ hợp lai trên các tính trạng đã được các nhà di truyền chọn giống chia làm 5 dạng biểu hiện chính: - Ưu thế lai về hình thái. - Ưu thế lai về năng suất. - Ưu thế lai về tính thích ứng. - Ưu thế lai về tính chín sớm. - Ưu thế lai về sinh lý, sinh hóa. Đối với cây ngô, ƯTL về năng suất có vai trò quan trọng nhất, thể hiện qua sự tăng của các yếu tố cấu thành năng suất như chiều dài bắp, số hàng hạt, số hạt/hàng, tỉ lệ hạt/cây…Theo Richey (1927) ƯTL về năng suất ở ngô với các giống lai đơn có thể đạt từ 193% đến 263% so với trung bình của bố mẹ (Trích dẫn theo Mai Xuân Triệu, 1998). Trong những năm gần đây, phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các dòng thuần dựa vào chỉ thị phân tử để phân nhóm cách biệt di truyền đã giảm bớt được khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, rút ngắn thời gian đánh giá. Phương pháp này không phụ thuộc vào môi trường và mùa vụ, do đó tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức cho các nhà tạo giống. 1.3.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống 1.3.2.1. Đa dạng di truyền của cây ngô: Sự đa dạng di truyền của cây ngô được thể hiện ở tất cả các tính trạng của cây, bông cờ và bắp. Các nghiên cứu cho thấy: Ngô có mức độ sai khác về di truyền rất lớn trong cùng một quần thể hoặc các quần thể chéo nhau. Các nghiên cứu ở mức độ phân tử cũng cho thấy mức độ đa dạng của ngô cao hơn 3-10 lần so với những loài thân thảo khác (Buckler và cs, 2001) [17]. Các nhà chọn giống đã dựa vào sự đa dạng tự nhiên để lựa chọn các giống /loài tốt, từ đó cải tiến nhằm nâng cao chỉ tiêu về số lượng và chất lượng và chất lượng của giống, ở ngô, năng suất hiện tại cao gấp 55 lần so với năng suất của các giống ngô tổ tiên (Buckler và cs,2001)[17]. 1.3.2.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống Các nghiên cứu về hiện tượng ƯTL cho thấy sự khác biệt di truyền của bố và mẹ có ảnh hưởng rất lớn tới sự biểu hiện ƯTL của các tổ hợp lai đơn, Shull G,H (1948) đã kết luận: ƯTL sinh lý của một cơ thể được biểu hiện qua sự phát triển nhanh, qua chiều cao và ƯTL có mối tương quan thuận với độ không giống nhau trong giao tử mà từ đó con lai được hình thành. Sự khác nhau giữa giao tử càng nhiều thì sự biểu hiện ƯTL ở con lai càng lớn (trích theo Ngô Hữu Tình và cs, 1997) [7]. Cây ngô là loài cây giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng và dị hợp tử về kiểu gen, vì thế những thông tin về đa dạng di truyền của các nguồn gen là rất cần thiết và vô cùng hữu ích trong công tác đánh giá dòng, phân nhóm ƯTL và dự đoán tổ hợp lai ưu tú có khả năng cho năng suất cao. Đa dạng di truyền có tầm quan trọng hết sức to lớn trong chọn tạo giống ngô, đặc biệt là cho chương trình tạo giống ngô lai. Chính vì vậy, cây ngô đã được mô tả, thu thập và bảo tồn rất tốt ở các trung tâm đa dạng di truyền. Ngày nay, có khoảng 15 000 mẫu giống ngô được thu thập từ các nước khác nhau trên thế giới (Ngô Hữư Tình và cs, 1997) [7]. Ở Việt Nam, nguồn gen ngô được bảo tồn tại Viện nghiên cứu Ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự do; 3 000 dòng tự phối và được trồng ở khắp các vùng miền trong cả nước. 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai Nguyên tắc cơ bản trong công tác tạo giống cây trồng là việc xác định và khai thác các kiểu ƯTL giữa các nguồn vật liệu nghiên cứu (Hallauer và Miranda, 1988) [18]. Đối với ngô, thông tin về đa dạng di truyền giữa các dòng sẽ giúp cho các nhà chọn tạo giống quyết định được kế hoạch lai tạo, cải tạo dòng và phân nhóm ƯTL. Công tác này mang tính quyết định chủ yếu để dẫn đến sự thành công trong bất cứ chương trình chọn tạo giống ngô lai nào. Chính vì thế mà các nhà chọn tạo giống ngô mong muốn mô tả được sự đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu trong và giữa các nhóm ƯTL và mối quan hệ di truyền giữa chúng (Messmer và cs, 1992) [20]. Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể được đánh giá thông qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thị hình thái như kiểu nội nhũ, chỉ thị phân tử như: chỉ thị isozyme và gần đây là chỉ thị DNA. Các chỉ thị phân tử DNA có thể được chia làm hai nhóm chính sau: chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP dựa vào các băng DNA trên gel điện di có thể phát hiện các thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử (Becker và cs, 1995) [16] và chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: RAPD, AFLP, SSR, STS…Trong những năm gần đây, nhiều chỉ thị thuộc nhóm này đã thành công trong nghiên cứu đa dạng di truyền. * Chỉ thị RFLP (Restiction Fragment Lengh Polymorphism) Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn) được sử dụng rộng rãi trong đánh giá tính đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến hóa và phân loại các loài của nhiều nhóm thực vật và trong lập bản đồ di truyền. Chỉ thị RFLP được sử dụng như là mẫu chuẩn để xác định sự có mặt hay thiếu vắng các đoạn nhiễm sắc thể nhất định. Khả năng theo dõi quá trình di truyền các đoạn nhiễm sắc thể cho phép sử dụng kĩ thuật RFLP trong chọn tạo giống cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997). Khả năng phân biệt của chỉ thị RFLP đã được nghiên cứu rộng rãi ở ngô, như xác lập mối quan hệ với năng suất và UTL, đánh giá đa dạng di truyền. Chỉ thị này không những phát hiện được những cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử mà còn phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn. Vì thế mà phương pháp này còn được gọi là chỉ thị đồng trội. Tuy nhiên, phương pháp này có quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, yêu cầu số lượng DNA lớn, chất lượng DNA cao, sử dụng chất phóng xạ gây nguy hiểm cho người. Do đó xu hướng sử dụng các chỉ thị phân tử đơn giản hơn trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR. * Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DAN) Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như lập bản đồ di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác định giống cây trồng… Ở Việt Nam chỉ thị RAPD cũng đã được Ts.Bùi Mạnh Cường và cs (2000,2003) nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là quy trình phân tích đơn giản, nhanh, rẻ tiền và cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn, an toàn với người thực hiện, tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là mức độ phát hiện sự đa hình thấp. * Chỉ thị AFLP (Amplified Length Polymorphism) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, DNA nhân được cắt bằng enzym giới hạn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, sau đó được gắn với các đoạn nucleotide ngắn (adapter) vào hai đầu nhờ enzym ligase. Mồi của phản ứng được thiết kế trên trình tự của các đoạn adapter có gắn thêm các đoạn từ một vài nucleotide. Kỹ thuật AFLP cho phép phát hiện được đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân chọn lọc. Trên cây ngô chỉ thị AFLP được các nhà khoa học ứng dụng trong đánh giá mối quan hệ giữa đa hình phân tử với sự biểu hiện ở giống ngô lai (Ajmone-Marsan và cs,1998). * Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) SSR hay còn gọi là vi vệ tinh là sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide đơn giản cực ngắn (chỉ từ 1-6 cặp base). Các SSR xuất hiện phổ biến trong bộ gen của sing vật nhân thực (Eukaryote). Tuy nhiên tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đợn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng trăm ngàn lần và nhiều hơn. Phương thức lặp lại cũng rất phức tạp và đa dạng, chủ yếu có ba dạng sau: (1) lặp lại hoàn toàn; (2) lặp lại không hoàn toàn; (3) lặp lại phức tạp. Kỹ thuật SSR cho phép chúng ta phát hiện được tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotide lặp lại đơn giản. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Do sự khác nhau về số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số lần lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR khuếch đại sẽ được phân tách trong quá trình điện di. Trên đối tượng là cây ngô, các nhà khoa học cũng đã sử dụng chỉ thị SSR trong nhiều nghiên cứu khác nhau, Senior và Heun (1993) đã công bố, do sự biến đổi cao trong số đơn vị lặp lại nên chỉ thị SSR cung cấp mức độ đa hình cao ở ngô. Kết quả dự đoán của chỉ thị SSR nhanh, đáng tin cậy và có khả năng lặp lại, chuẩn xác và có hiệu quả hơn phân tích RFLP. Phân tích SSR sử dụng gel agarose chất lượng cao rất hữu ích trong đánh giá đa dạng di truyền của các dòng tự phối ở ngô. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trên cây trồng được nhiều nhà khoa học đề cập, quan tâm nghiên cứu và đã thu được những kết quả khả quan như công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Liên và cs (2003) “Ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn dòng lúa chịu hạn”. Một số tác giả đã có những công trình nghiên cứu đa dạng di truyền các nguồn vật liệu ngô bằng chỉ thị SSR phục vụ nghiên cứu về khả năng kết hợp và xác định cặp lai: Nguyễn Thị Phương Đoài (2004)[6] đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 30 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau. Kết quả xác định được khoảng cách di truyền của các dòng ngô nghiên cứu biến động từ 0,47-0,86 và được phân thành 3 nhóm ưu thế lai. Phan Xuân Hào và cs (2004)[11] đã sử dụng 41 mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của 88 dòng ngô ( 51 dòng có nguồn gốc Việt Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT). Trong đó có 16 dòng QPM ( Quality Protein Maize), 6 dòng tham khảo từ AMBIONET. Kết quả xác định được sơ đồ phả hệ giữa các dòng nghên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn. Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ cấp. Hiện nay sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở ngô đặc biệt là chỉ thị SSR đang được Viện Nghiên cứu Ngô tiếp tục nghiên cứu và phát triển. Với những ưu điểm vượt trội và lớn mạnh của ngành CNSH, việc áp dụng phương pháp này là cần thiết để hỗ trợ phương pháp truyền thống trong công tác tạo giống ngô lai, góp phần nhanh chóng xác định được các tổ hợp ngô lai có ưu thế lai cao phục vụ sản xuất. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai cây ngô ở Việt Nam Những năm trước đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng di truyền của các dòng ngô thuần và dự đoán ƯTL chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, … Mai Xuân Triệu (1998) [4] đã sử dụng phương pháp phân tích nhóm của Mahalanobis để phân loại dòng thuần theo sự cách biệt về di truyền (phân loại dưới loài) của 24 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau của Viện nghiên cứu Ngô, Kết quả 24 dòng đã được phân thành 4 nhóm. Bùi Mạnh Cường và cs (2000) [1] đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD với 35 cặp mồi để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 7 dòng ngô đường tại Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả đã chia được 7 dòng ngô nghiên cứu thành 2 nhóm cách biệt di truyền. Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007) [10] đã sử dụng 36 mồi SSR để phân tích đa hình của 8 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau trong tập đoàn nguyên liệu của Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả khảo sát đánh giá các tổ hợp lai trên đồng ruộng và chỉ ra mối tương quan thuận giữa khoảng cách di truyền với năng suất của con lai F1 ở 8 dòng ngô nghiên cứu… Gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở các đối tượng cây trồng nói chung và ở cây ngô nói riêng đang ngày càng phát triển. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu Gồm 20 dòng ngô thuần của Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô – Đan Phượng – Hà Nội Bảng 2.1: Danh sách các dòng ngô nghiên cứu TTTênNguồn gốcTTTên Nguồn gốc1C1Cargi U77711C200CP8882C24Syngenta 7022412C208C919 x AC243C40Dekalbgold13C329C919 x AC244C43Dekalbgold14C369C919 x AC245C45NK6715C222C9196C84NK6716C236LVN107C115MB6917C245LVN618C128LVN9918C275HQ20009C133CP99919C477NK4300/06A10C143CP99920C738Pacific747 Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: - Thiết bị thí nghiệm: Máy PCR 9700, máy quang phổ kế Ultrospec, máy chạy điện di gel agarose và polyacrylamide, máy khuấy từ gia nhiệt, máy li tâm, máy đo pH, máy soi chụp gel, tủ lạnh sâu (-80 độ C), tủ lạnh, tủ đông, lò vi sóng, …và các trang thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu. Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống eppendof, đầu côn các loại, lược gel, ống bơm gel, …. - Hóa chất tách chiết DNA: Bao gồm các loại hóa chất như EDTA,CTAB, chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Amino acetic. Đệm tách chiết DNA của mẫu lá: CTAB 2%( Tris-HCl 10mM, pH 8,0, EDTA 10mM, NaCl 100mM, beta-Mercatoethanol 0,5%,), TE( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0 ) - Hóa chất chạy phản ứng PCR: + Đệm PCR 1X( 10mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 5mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen. + MgCl2 của Fementas, Invitrogen. + dNTPs của Fementas, Invitrogen. + Mồi: hệ thống mồi SSR dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi AMBIONET (bảng 2.2). + Marker 1kb + 2Tap polymerase của Fementas + H2O cất vô trùng - Hóa chất chạy điện di và nhuộm gel: TEB 1X, TEB 5X, TEMED, APS 10%, Acrylamide 4,5%, formandehyde 36%, Bind silane, Sigma code, Na2S2O3.5H2O … - Chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đề tài: là hệ thống gồm 20 mồi SSR Bảng 2.2: Danh sách 20 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu TTTên mồiKiểu lặp lạiVị trí gắn mồi trên NST1Phi308707AGG1,102Phi448880AAG9,053Phi109188AAAG5,04Phi84GAA10,045Phi109275AGCT1,006Phi227562ACC1,127Phi83AGCT2,048Phi32AAAG9,049Phi102228AAGC3,04-3,0510Phi374118ACC3,0211Phi029AG/AGCG***3,0412Phi72AAG4,0013Phi108411AGCT9,0614Phi109642ACGG2,015 nc133GTGTC2,0516Phi06ACG4,1117Phi1304(TCGA)48,0218Umc1143AAAAT6,019Phi87ACC5,0620Phi423796AGATG6,01 2.1.2. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô. - Kiểm tra đánh giá độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử. - Dùng chỉ thị phân tử SSR đánh giá khoảng cách di truyền, và xây dựng sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội. - Xác định mức độ đa hình, phân nhóm ưu thế lai và dự đoán các tổ hợp lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm Tách DNA tổng số Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, lấy lá non lúc cây được 3 – 4 lá. Quy trình tách triết theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) [15]. Các bước tiến hành: - Nghiền lá tươi thành thể nhuyễn, bổ sung 2-3ml đệm chiết CTAB, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml, đảo đều mẫu nhẹ nhàng. - Ủ mẫu ở 65°C trong thời gian 45-60 phút, sau đó để nguội ở nhệt độ phòng, đem ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút. - Chiết DNA 2 lần với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly tâm ở 13,000 vòng/phút mỗi lần trong 5 phút. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống eppendorf sang một ống mới. - Kết tủa DNA với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate, đảo đều ở -20°C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13,000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. - Rửa tủa DNA trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút. - Làm khô DNA sau đó hòa tan DNA trong 100µl dung dịch TE và bảo quản ở 20°C. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số Độ tinh sạch và nồng độ của DNA tổng số được đo bằng máy đo quang phổ ( Ultrospec UV/Visible-65 spectrophotomrter) Nồng độ DNA được tính theo công thức: Nồng độ DNA (µg/µl) =( OD260 x 50 x 50 µg/ml)/1000 Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 260 50 là hệ số pha loãng 50 µg/ml là hằng số Tỷ lệ OD260/OD280 (OD280 là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 280nm) phản ánh độ tinh sạch của mẫu. Tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8-2,0 thì DNA được coi là sạch. Chạy phản ứng PCR (PCR- Polymerase Chain Reaction): Bảng 2.3: Thành phần của 1 phản ứng PCR Dung dịch gốcNồng độ sử dụngThể tích (µl)Nước cất vô trùng Đệm PCR 10X MgCl2 25mM dNTP 10mM Primer 5uM Tap DNA polymerase 5U/µl DNA khuôn 10ng/ µl- 1X 2,0mM 0,25mM 0,25mM 0,5U 10ng5,6 1,0 0,8 1,0 0,5 0,1 1,0Tổng thể tích10,0 Chạy chương trình phản ứng PCR: phản ứng được tiến hành trong plate 96 giếng và chạy theo phương trình cụ thể Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bướcPhản ứngChu trình nhiệt1Biền tính đầu tiên940C trong 2 phút2Biến tính940C trong 30 giây3Gắn mồi560C trong 21 phút4Kéo dài chuỗi720C trong 1 phút5 Lặp lại từ bước 2, 29 lần6Kéo dài chuỗi cuối cùng720C trong 1 phút7Bảo quản40C, ∞ Biến tính sản phẩm PCR và marker DNA có khối lượng chuẩn ( thang chuẩn ФX174 DNA/HinfI, 20ŋg /µl) được biến tính ở 20°C trong 5 phút, sau đó ngay lập tức làm lạnh và giữ lạnh cho đến khi tra mẫu vào bản gel. Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR và thang chuẩn sau khi biến tính và sốc nhiệt trong đá lạnh được đưa vào chạy điện di trên gel polyacrylamide 4,5% và sau đó nhuộm bạc để biểu hiện sản phẩm điện di. Gel polyacrylamide gồm các thành phần: + Dung dịch acrylamide 4,5%: 60ml + Dung dịch APS 10% : 60ml + Dung dịch TEMED :60ml Phương pháp nhuộm bạc: - Chuẩn bị dung dịch nhuộm: hòa tan 1g AgNO3 trong 1lit nước cất hai lần khử ion, bổ sung 1,5ml dung dịch fomaldehyde 37%, để lạnh sâu trước khi dùng - Chuẩn bị dung dịch hiện: hòa tan 30g Na2CO3 trong 1 lit nước cất hai lần khử ion, làm lạnh ở nhiệt độ -20°C. Trước khi dùng thì bổ sung 1,5ml dung dịch fomaldehyde 37% + 200ml sodium thiosulfate 10mg/ml. - Sau khi điện di xong, cố định tấm kính bám gel bằng dung dịch cố định gel ( Glacial acetic acid 10%) trong 20 phút, lắc nhẹ. - Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cố định, rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5 phút - Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút, lắc nhẹ - Bản gel được rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5-10 giây - Đưa bản gel vào dung dịch hiện, lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất hiện, sau đó đổ trực tiếp dung dịch cố định (đã dùng ở trên) lên trên bản gel để dừng phản ứng hiện, duy trì trong 4-6 phút. - Rửa sạch lại bằng nước cất hai lần và để bản gel khô ở nhiệt độ phòng 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được thống kê và xử lý theo hướng dẫn của AMBIONET – CIMMYT (2004)[15]. Dựa vào thang chuẩn phiX174/HinfI, số liệu được đọc theo quy ước: các alen xuất hiện băng DNA (1), không xuất hiện băng (0),và khuyết số liệu (9). Kết quả được phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2,1 Hệ số PIC (Polymorphic Information Content- Chỉ số thông tin đa hình), PIC = 1- ΣPi ; Trong đó : Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi dòng ngô Số mồi xuất hiện ≥ 2 alen/1 locus SSR H% = x 100 Tổng số mồi sử dụng – số mồi khuyết số liệu Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) được tính cho từng dòng và từng mồi Số mồi khuyết số liệu M% dòng = x 100 Tổng số mồi sử dụng Số dòng khuyết số liệu M% mồi = x 100 Tổng số dòng nghiên cứu Khoảng cách di truyền (GD) GD = 1 – GS Trong đó: GD là khoảng cách di truyền GS là độ tương đồng di truyền được tính theo hệ số Jaccard( Lanza và cs, 1997) Phân nhóm bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Meyhod with Arithmetical Averages), CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số DNA của các dòng ngô nghiên cứu được chúng tôi tách chiết theo quy trình của Saghai- Maroof và cs (1984)[21] với một vài thay đổi nhỏ phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Sau đó, sản phẩm DNA được kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ trên máy đo quang phổ và điện di trên gel agarose 1%, Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1: Độ tinh sạch và nồng độ DNA của các dòng ngô TTTên dòngĐộ tinh sạch DNA (OD260/ OD280)Nồng độ DNA (µg/,ml)1C11,902,962C241,962,903C401,983,094C431,943,005C451,982,836C841,912,647C1151,972,808C1281,963,209C1331,943,1010C1431,942,9611C2001,932,8612C2081,893,2013C3291,873,1214C3692,002,7415C2221,842,7816C2361,812,9017C2451,872,8618C2751,972,5319C4771,952,4620C7381,862,90Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD260/OD280 biến thiên từ 1,8 -2,0 nằm trong khoảng giới hạn cho phép của mức độ tinh sạch DNA. Kết quả phù hợp với yêu cầu của sản phẩm tách chiết DNA tổng số do AMBIONET-CIMMYT công bố. Ngoài ra chúng tôi còn tiến hành kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.1 Hình 3.1:kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số Hình 3.1 cho thấy các mẫu DNA đều xuất hiện một băng duy nhất, rõ nét, điều đó chứng tỏ DNA tách chiết đạt độ tinh sạch cao. Như vậy, sản phẩm tách chiết DNA tổng số của 20 dòng ngô nghiên cứu đáp ứng được yêu cầu về chất lượng và số lượng, đảm bảo đạt tiêu chuẩn để sử dụng cho các bước tiếp theo của thí nghiệm. 3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của 20 dòng ngô tẻ, chúng tôi tiến hành sử dụng sản phẩm DNA tách chiết được trên làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với 20 mồi nghiên cứu. Sản phẩm PCR của từng mồi được điện di trên gel acrylamide (điện di đứng). 3.2.1. Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô nghiên cứu Theo hướng dẫn của AMBIONET- CIMMYT thì giá trị M% phải nhỏ hơn 15% mới đảm bảo được độ tin cậy cho phép tiến hành các bước xử lý số liệu tiếp theo. Sau khi chạy xong điện di, trước khi đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 20 dòng ngô chúng tôi tiến hành tính tỷ lệ khuyết số liệu của thí nghiệm dựa vào số mồi không được khuếch đại bằng phản ứng PCR thông qua kết quả điện di. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu(M%) của các dòng ngô nghiên cứu TTTên dòngSố mồi khuyết số liệuTỷ lệ khuyết số liệu (M%)Số mồi xuất hiện dị hợp tửTỷ lệ dị hợp tử(H%)1C115002C2400153C40003154C4300155C4515006C84002107C115003158C12815210,59C13315210,510C1430021011C2000031512C2081515,2613C3291515,2614C3690031515C222001516C236001517C245001518C2750021019C4770021020C73800315Tổng trung bình6 0,330 1,534 1,7171,52 8,576 Xét kết quả từ bảng 3.2 cho thấy 20 mồi nghiên cứu có khả năng gắn vào DNA hệ gen của các dòng ngô nghiên cứu và nhân bản bằng phản ứng PCR, tỉ lệ mồi được khuếch đại ở các dòng ngô cao. Nhìn chung đa số các dòng nghiên cứu đều được khuếch đại, chỉ có 5 dòng là C1,C45, C128, C133, C208, C329 có một mồi không được khuếch đại và với tỉ lệ khuyết số liệu là M( dòng) 5%. Bên cạnh đó chúng tôi tiến hành phân tích tỉ lệ khuyết mồi đạt cao nhất là 10% với phi84 và tỉ lệ khuyết dao động từ 0 – 5% đối với 19 mồi nghiên cứu còn lại (bảng 3.3). Vậy trong thí nghiệm này của chúng tôi có 20 dòng ngô đều đạt tỉ lệ khuyết dòng M% <15% và tỉ lệ khuyết mồi <15%. Như vậy, số liệu cho thấy sau khi điện di sản phẩm PCR của 20 dòng ngô nghiên cứu là đáng tin cậy và được sử dụng để tính toán các hệ số quan tâm khác. Bảng 3.3: Tỷ lệ khuyết số liệu (M% mồi) ở 20 mồi nghiên cứu TTTên mồiSố dòng khuyết số liệuM% mồi1Phi308707152Phi448880003phi109188004phi0842105Phi109275006Phi227562007phi083008Phi32009Phi1022280010Phi3741180011phi0291512Phi720013Phi1084110014Phi1096421515nc1330016Phi060017phi13041518umc11430019Phi870020phi42379600 Bước tiếp theo chúng tôi đánh giá độ thuần của 20 dòng ngô thông qua việc tính tỉ lệ dị hợp tử (H%). Trong chương trình chọn tạo giống ngô lai, bước đầu tiên phải tiến hành tạo ra các dòng tự phối từ các nguyên liệu không đồng nhất về mặt di truyền để thu được các thể đồng hợp tử - thường gọi là dòng thuần; hoặc tạo dòng thuần invitro dựa trên kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời và noãn chưa thụ tinh. Dòng thuần là nguyên liệu quan trọng để tạo ra các tổ hợp lai có ƯTL cao cũng như có các tính trạng mong muốn khác. Nhưng vì ngô là cây giao phấn điển hình nên việc tạo ra các dòng thuần 100% là rất khó. Theo AMBIONET- CIMMYT trong nghiên cứu đa dạng di truyền để phục vụ cho công tác chọn tạo giống ngô lai: yêu cầu dòng thuần phải có tỉ lệ đồng hợp tử và kiểu gen lớn hơn 80%[13] thì mới có thể dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho công tác tạo giống lai mới. Điều này có nghĩa là tỷ lệ dị hợp tử ở các dòng nghiên cứu không được vượt quá 20%. Từ những yêu cầu trên mà chúng tôi đã tiến hành đánh giá độ thuần về mặt di truyền của các dòng nghiên cứu thông qua sự xuất hiện của các băng DNA trên gel điện di theo từng locus, locus đồng hợp tử khi xuất hiện một băng DNA(1 alen), locus dị hợp tử khi xuất hiện 2 băng (2 alen khác nhau trên cùng một locus – mồi SSR). Tỷ lệ dị hợp tử được tính đối với mỗi dòng (Bảng 3.3). Kết quả ở bảng 3.3 phản ánh tỷ lệ dị hợp tử thay đổi từ 0 đến 15% giá trị trung bình 8,576%. Trong 20 dòng nghiên cứu, 5 dòng có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất bằng 15% là C40, C115, C200, C369, C738 với số mồi xuất hiện dị hợp tử tương ứng là 3 xuất hiện 2 alen khác nhau trên cùng một locus; 6 dòng cùng có 2 mồi xuất hiện dị hợp tử tương ứng với H% dao động từ 10% đến 10,5% ;5 dòng C24, C43, C222, C236, C245 có giá trị H= 5% và 2 dòng C208, C329 có giá trị dị hợp tử H là 5,26% tương ứng với một mồi xuất hiện 2 alen; có 2 dòng C1 và C45 có tỉ lệ dị hợp tử H thấp nhất bằng 0 điều đó đồng nghĩa với không có mồi nào xuất hiện dị hợp tử. Từ đó cho thấy 20 dòng ngô nghiên cứu có tỷ lệ dị hợp tử dao động từ 0 đến 15% đều có tỉ lệ dị hợp tử nhỏ hơn mức cho phép (20%) thỏa mãn yêu cầu về độ thuần di truyền trong nghiên cứu đa dạng di truyền đảm bảo độ tin cậy cho các phân tích tiếp theo. 3.2.2. Kết quả đánh giá hệ số PIC, số alen và tổng số băng DNA thể hiện trên từng mồi Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được xác đinh dựa vào tần suất xuất hiện của các băng DNA hay các alen trên mỗi locus SSR. Giá trị PIC cao tương ứng với locus đó có nhiều alen và số alen xuất hiện cao. Theo Smith và cs (1997), hệ số PIC được coi như là thước đo tính đa hình của các alen ở từng locus SSR Bảng 3.4: Hệ số PIC, số băng DNA và số alen xuất hiện trên 20 mồi TTTên mồiSố alen xuất hiện/mồiTổng số băng DNA/mồiHệ số PIC1Phi3087074220,362Phi4488803230,523phi1091883200,624phi0842190,245Phi1092754210,556Phi2275624200,617phi0833200,598Phi323240,549Phi1022282210,1410Phi3741184250,5111phi0294210,6312Phi723220,6813Phi1084113260,5914Phi1096422200,3615nc1333210,5416Phi063200,7017phi13042200,1518umc11435220,6619Phi873210,5820phi4237963200,4Tổng574489,92TB2,8522,40,49 Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy giá trị PIC thay đổi từ 0,14 ở locus phi102228 đến 0,70 ở locus nc133, giá trị trung bình là 0,49. Kết quả này thấp hơn kết quả nghiên cứu của Senior và cs (1998) (0,56)[22]. Giá trị PIC thấp có thể do thời gian ngắn với 20 mồi được khảo sát nên hệ số PIC chưa đạt theo như mong muốn. Tuy nhiên giá trị PIC thu được ở trên cũng chứng tỏ các dòng nghiên cứu có sự đa dạng di truyền nhưng ở mức độ không cao. Thống kê số băng DNA xuất hiện trên từng mồi cho kết quả như sau: tổng số băng DNA thu được là 448, đạt trung bình 22,4 băng/mồi. Các mồi xuất hiện nhiều băng DNA nhất như: phi108411 với 26 băng, phi 374118 xuất hiện 25 băng (hình 3.2), phi 32 với 24 băng (hình 3.3) và phi 448880 với 23 băng. Các mồi còn lại dao động từ 19 đến 22 băng DNA Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi374118 Quan sát ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi phi374118 có thể thấy rõ 4 alen với 25 băng DNA thể hiện. Trong tổng số các mồi nghiên cứu, mồi phi374118 có nhiều nguồn thể hiện 2 alen, cụ thể: C115, C128, C143, C245, C738. Các nguồn còn lại chỉ thể hiện 1 alen. Điều đó cũng có nghĩa là với mồi phi374118 các nguồn thể hiện dị hợp tử nhiều. Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi32 Hay ở mồi phi32 thấy rõ 3 alen xuất hiện với 24 băng DNA được thể hiện và cũng có khá nhiều nguồn thể hiện 2 alen trên cùng 1 locus: C43, C200, C477 và C738. Các nguồn còn lại chỉ xuất hiện 1 alen. Hoặc quan sát hình 3.4 của mồi phi109275 chỉ có duy nhất một nguồn xuất hiện 2 alen trên cùng một locus ở nguồn C200, các băng DNA thể hiên một cách rõ nét với 4 alen. Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi109275 Quan sát kết quả trên bản gel điện di sản phẩm PCR của 20 nguồn với 20 mồi cho thấy hầu như các locus chỉ xuất hiện 1 băng DNA, thể hiện ở các mồi như: mồi phi109188, mồi phi227562 (hình 3.5), mồi phi83, mồi phi006… Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi227562 Nhìn vào ảnh bản gel ta thấy rõ với mồi phi227562 xuất hiện 4 alen rõ nét, mỗi nguồn nghiên cứu chỉ xuất hiện một alen duy nhất và có tổng 20 băng DNA, thể hiên không có sự xuất hiện dị hợp tử cũng như khuyết số liệu. 3.2.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các dòng Với mục tiêu sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong việc đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng thuần và phân nhóm ưu thế lai, trên cơ sở đó có thể dự đoán và xác định nhanh các tổ hợp có khả năng cho ưu thế lai cao về năng suất và các tính trạng mong muốn. Chúng tôi sử dụng phần mềm NTSYS để xử lý số liệu và qua đó phân tích mối quan hệ di truyền giữa các dòng. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Hệ số tương đồng di truyền(GS) giữa các dòng ở bảng 3.5 cho thấy, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng C45 với C84 lớn nhất (= 0,667), hệ số tương đồng di truyền giữa dòng C133 với C275 nhỏ nhất (=0,07) và hệ số tương đồng giữa các cặp dòng khác dao động từ 0,128 đến 0,615. Từ kết quả hệ số tương đồng di truyền chúng ta tính đượckhoảng cách di truyền giữa các dòng. Khoảng cách di truyền của 20 dòng ngô nghiên cứu nằm trong khoảng 0,33 đến 0,925 Để nhận thấy rõ hơn mối quan hệ di truyền giữa các dòng, từ kết quả về độ tương đồng di truyền dựa trên cơ sở phân tích 20 mồi SSR, chúng tôi sử dụng chương trình NTSYS để phân nhóm theo UPGMA và thu được sơ đồ phả hệ của 20 dòng nghiên cứu (hình 3.4) Bảng 3.5: Hệ số tương đồng di truyền của 20 dòng ngô nghiên cứu C1C24C40C43C45C84C115C128C133C143C200C208C329C369C222C236C245C275C477C738C11.000C240.5001.000C400.4640.5711.000C430.4440.3130.4671.000C450.2860.2190.2810.4441.000C840.4290.3870.3240.3030.6671.000C1150.4140.5170.3940.2940.3230.4061.000C1280.2670.4140.3440.2810.2670.3550.4831.000C1330.4070.3670.4000.2810.3210.4480.4330.4811.000C1430.4440.4330.4060.3440.3330.3330.4060.3550.5001.000C2000.2810.4190.3530.2570.2060.2500.4380.3870.3870.4061.000C2080.3700.3330.3550.2900.2330.3230.3230.1820.2190.2810.2351.000C3290.5420.3790.4000.3790.3210.4140.2730.2060.3000.3230.3130.5201.000C3690.4640.3330.3940.3750.3670.4520.3530.2650.3550.3640.3140.4140.6151.000C2220.4440.3550.3750.3130.2190.3440.4190.2500.2810.3030.3750.5380.4440.5171.000C2360.4440.3550.2940.2730.3000.3870.3750.2060.2060.3030.3330.4810.4810.3750.5561.000C2450.3450.3550.3330.3550.2580.3030.2570.2810.2420.3030.3330.6000.5380.3750.4480.4481.000C2750.2500.2650.2500.3440.2500.2570.1840.2000.0770.2220.1540.3230.2810.3240.3870.2290.3441.000C4770.3330.3870.3640.2650.2500.2940.5000.2730.2730.4190.5000.4140.2810.3240.5360.5930.3030.2571.000C7380.3230.3750.2430.1280.1710.2860.3940.2290.3550.3240.3940.2730.2000.2110.3330.4190.2220.1250.6071.000Bảng 3.6: Khoảng cách di truyền giữa các cặp dòng trên cơ sở 20 mồi SSR C1C24C40C43C45C84C115C128C133C143C200C208C329C369C222C236C245C275C477C738C10.000C240.5000.000C400.5360.4290.000C430.5560.6880.5330.000C450.7140.7810.7190.5560.000C840.5710.6130.6760.6970.3330.000C1150.5860.4830.6060.7060.6770.5940.000C1280.7330.5860.6560.7190.7330.6450.5170.000C1330.5930.6330.6000.7190.6790.5520.5670.5190.000C1430.5560.5670.5940.6560.6670.6670.5940.6450.5000.000C2000.7190.5810.6470.7430.7940.7500.5630.6130.6130.5940.000C2080.6300.6670.6450.7100.7670.6770.6770.8180.7810.7190.7650.000C3290.4580.6210.6000.6210.6790.5860.7270.7940.7000.6770.6880.4800.000C3690.5360.6670.6060.6250.6330.5480.6470.7350.6450.6360.6860.5860.3850.000C2220.5560.6450.6250.6880.7810.6560.5810.7500.7190.6970.6250.4620.5560.4830.000C2360.5560.6450.7060.7270.7000.6130.6250.7940.7940.6970.6670.5190.5190.6250.4440.000C2450.6550.6450.6670.6450.7420.6970.7430.7190.7580.6970.6670.4000.4620.6250.5520.5520.000C2750.7500.7350.7500.6560.7500.7430.8160.8000.9230.7780.8460.6770.7190.6760.6130.7710.6560.000C4770.6670.6130.6360.7350.7500.7060.5000.7270.7270.5810.5000.5860.7190.6760.4640.4070.6970.7430.000C7380.6770.6250.7570.8720.8290.7140.6060.7710.6450.6760.6060.7270.8000.7890.6670.5810.7780.8750.3930.000  Hình 3.4: Sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô nghiên cứu Dựa trên sơ đồ phả hệ hình 3.4 cho thấy, tại hệ số tương đồng di truyền 0,35 thì 20 dòng nghiên cứu được phân thành 4 nhóm: - Nhóm I: gồm 7 dòng, các dòng này chia làm 2 nhóm phụ ở hệ số tương đồng 0,46 + Nhóm phụ 1: gồm 3 dòng C1, C329, C369 + Nhóm phụ 2: gồm 4 dòng C208, C245, C222, C236 - Nhóm II: gồm 3 dòng, chia làm 2 nhóm phụ ở hệ số tương đồng 0,46 + Nhóm phụ 1: chỉ có 1 dòng C43 + Nhóm phụ 2: có 2 dòng là C45, C84 - Nhóm III: gồm có 9 dòng, ở hệ số tương đồng 0,46 các dòng này được chia làm 5 nhóm phụ + Nhóm phụ 1: gồm 2 dòng: C24, C40 + Nhóm phụ 2: gồm 2 dòng C115, C128 + Nhóm phụ 3: gồm 2 dòng C133, C143 ` + Nhóm phụ 4: gồm 1 dòng C200 + Nhóm phụ 5: có 2 dòng là C477 và C738 - Nhóm IV: gồm có duy nhất 1 dòng là C275 Nhiều kết luận khoa học về sự ưu thế lai đã khẳng định ưu thế lai chịu sự chhi phối mạnh mẽ bởi sự khác biệt di truyền giữa hai dạng bố mẹ. Vì thế việc phân chia nhóm dòng dựa trên khoảng cách di truyền được xác định nhờ chỉ thị phân tử là một trong những cơ sở quan trọng trong vấn đề sử dụng, khai thác dòng nguyên liệu cũng như trong định hướng cho công tác lai tạo. Xác xuất thành công với những tổ hợp có ưu thế lai cao từ việc lai giữa các dòng khác nhóm sẽ cao hơn so với việc lai giữa các dòng cùng nhóm. 3.3. Kết quả phân tích đa hình di truyền của các nhóm trong 20 dòng ngô nghiên cứu: 3.3.1. Kết quả phân tích đa hình cùng nhóm Nhìn vào cây phả hệ, từ bảng số liệu hệ số tương đồng và khoảng cách di truyền, chúng tôi đã chia được 20 dòng ngô nghiên cứu thành 4 nhóm tương ứng ở hệ số di truyền 0,35. Trong đó, có nhóm 4 có duy nhất một dòng, ba nhóm còn lại có từ 3 dòng ngô trở lên. Từ đó, chúng tôi tiến hành phân tích đa hình giữa các dòng trong cùng nhóm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7a, 3.7b và 3.7c. Bảng 3.7a: Hệ số tương đồng(GS) và khoảng cách di truyền(GD) giữa các dòng trong nhóm I Dòng C1C208C329C369C222C236C245GSGDGSGDGSGDGSGDGSGDGSGDC1C2080,3700.630C3290,5420.4580,5200,480C3690,4640,5360,4140,5860,6150,385C2220,4440,5560,5380,4620,4440,5560,5170,483C2360,4440,5560,4810,5190,4810,5190,3750,6250,5560,444C2450,3450,6550,6000,4000,5380,4620,3750,6250,4480,5520,4480,552GS TB0,474GD TB0,526 Bảng 3.7b: Hệ số tương đồng(GS) và khoảng cách di truyền(GD) giữa các dòng trong nhóm II Dòng C43C45C84GSGDGSGDC43C450,4440,556C840,3030,6970,6670,333GS TB0,471GD 0,529 Kết quả tổng hợp ở bảng 3.7a cho ta thấy hệ số tương đồng trung bình của nhóm I là 0,474; khoảng cách di truyền trung bình đạt 0,526. Cặp dòng C329 - C369 có hệ số di truyền lớn nhất là 0,615 và khoảng cách di truyền nhỏ nhất là 0,385; cặp dòng C1 – C245 có hệ số di truyền nhỏ nhất 0,345 và khoảng cách di truyền lớn nhất 0,655; 19 cặp còn lai có GS dao động từ 0,370- 0,600 và GD biến thiên trong khoảng 0,400- 0,630. Bảng 3.7c: Hệ số tương đồng(GS) và khoảng cách di truyền(GD) giữa các dòng trong nhóm III Dòng C24C40C115C128C133C143C200C477C738GSGDGSGDGSGDGSGDGSGDGSGDGSGDGSGDC24C400,5710,429C1150,5170,4830,3940,606C1280,4140,5860,3440,6560,4830,517C1330,3670,6330,4000,6000,4330,5670,4810,519C1430,4330,5670,4060,5940,4060,5940,3550,6450,5000,500C2000,4190,5810,3530,6470,4380,5630,3870,6130,3870,6130,4060,594C4770,3330,6130,3640,6360,5000,5000,2730,7270,2730,7270,4190,5810,5000,500C7380,3230,6250,2430,7570,3940,6060,2290,7710,3550,6450,3240,6760,3940,6060,6070,393GS TB0,362GD TB0,638 Ở bảng 3.7b, 3.7c cũng cho thấy GS trung bình của hai nhóm II và III lần lượt là 0,471 và 0,362; giá trị GD trung bình của hai nhóm đó tương ứng với 0,529 và 0,638. Để thấy sự đa dạng di truyền rõ hơn ta có bảng 3.8 Bảng 3.8: Hệ số tương đồng và khoảng cách di truyền trung bình của các cặp dòng trong từng nhóm NhómSố cặp laiGS trung bìnhGD trung bìnhI210,4740,526II30,4710,529III360,3620,638IV000 Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy có thể lấy dòng C275(nhóm IV) làm cây thử, giữa các dòng trong nhóm III có khoảng cách di truyền lớn nhất 0,638; hai nhóm I, II có giá trị khoảng cách di truyền lần lượt là 0,526 và 0,529. Do đó có thể kết luận rằng các dòng ngô ở nhóm III có sự đa dạng di truyền lớn nhất, và có thể kết hợp lai giữa các dòng trong cùng nhóm. 3.3.2. Kết quả phân tích đa hình khác nhóm Các nghiên cứu về hiện tượng ưu thế lai cho thấy sự khác biệt di truyền của bố mẹ có ảnh hưởng mạnh đến sự biểu hiện ƯTL của các tổ hợp lai đơn. Chính sự khác biệt này tạo nên trạng thái dị hợp tử ở tổ hợp lai, sự khác biệt giữa bố và mẹ càng lớn thì tính trạng dị hợp càng cao cho ƯTL cao ở tổ hợp lai (Ngô Hữu Tình và cs,1997) [7]. Các nhà khoa học cũng đã đưa ra kết luận ƯTL giữa các dòng khác nhóm cao hơn ƯTL của các dòng trong cùng một nhóm. Kết quả phân tích đa hình di truyền khác nhóm được tổng hợp ở bảng 3.9. Bảng 3.9: Khoảng cách di truyền giữa các nhóm NhómIIIIIIIVIII0,613III0,5990,666IV0,690,70,806 Từ bảng 3.9 ta thấy khoảng cánh di truyền giữa nhóm III và nhóm IV là lớn nhất GD = 0,806, và khoảng cách di truyền thấp nhất là giữa nhóm I với III là 0,599. Kết quả thu được thông qua phân tích đa hình cùng nguồn và khác nguồn có thể dự đoán được các nhóm ƯTL. Khi lai giữa các dòng của nhóm III và IV sẽ có khả năng cho ƯTL cao nhất vì khoảng cách di truyền giữa hai nhóm này là lớn nhất(0,806). Tiếp đến là phép lai giữa nhóm II và nhóm IV cũng có khả năng cho ƯTL cao vì khoảng cách di truyền trung bình giữa hai nhóm này cũng khá cao 0,7. Nếu giữa các dòng mà có giá trị khoảng cách di truyền càng cao thì khả năng cho ưu thế lai càng cao và ngược lại, khả năng tạo ưu thế lai sẽ giảm dần khi khoảng cách di truyền giữa các nhóm ngắn đi. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ kết quả phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm bằng chỉ thị phân tử SSR chúng tôi cố những kết luận sau: - Các sản phẩm tách chiết DNA có đọ tinh sạch nằm trong khoảng 1,8- 2,0, đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành thí nghiệm. - Xác định được tỷ lệ dị hợp tử, tỷ lệ khuyết số liệu của 20 dòng ngô nghiên cứu với 20 mồi sử dụng. Các dòng đều có tỷ lệ dị hợp tử H%< 15% nên có thể sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống ngô lai. - Xác định được hệ số PIC chứng tỏ 20 dòng nghiên cứu có sự đa dạng di truyền tuy nhiên ở mức không cao. - Xác định được sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô nghiên cứu và phân ra được làm 4 nhóm ƯTL ở hệ số tương đồng di truyền GS là 0,35. - Phân tích đa hình cùng nhóm và khác nhóm thì rút ra được kết luận khi lai các dòng trong nhóm III với các dòng trong nhóm IV có khả năng cho ưu thế lai cao. 4.2. Đề nghị Do thời gian có hạn nên chúng tôi có một số đề nghị sau: - Tiếp tục thuần hóa một số dòng ngô mới thu thập - Tiếp tục nghiên cứu, đánh giá mức độ tin cậy của phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử SSR trên các nguồn vật liệu khác nhau với số lượng dòng tham gia đủ lớn. - Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được, tiến hành thiết kế sơ đồ lai giữa các dòng có khả năng cho ưu thế lai cao. - Sử dụng các vật liệu trên trong tạo vốn gen theo nhóm cách biệt di truyền, và sử dụng các vốn gen có đặc điểm quý trong lai tạo giống ngô lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Mạnh Cường, Trần Hồng Uy và cộng sự (2000), “Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số dòng ngô đường bằng phương pháp RADP markers”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng (1), Bùi Mạnh Cường (2007), Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống ngô, NXB Nông nghiệp Cao Điểm Đắc (1988), Cây ngô, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Mai Xuân Triệu (1998), Đánh giá khả năng kết hợp của một số dòng thuần có gốc địa lý khác nhau, phục vụ chương trình tạo giống ngô lai, Luận án Tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp, Viện Hàn lâm Nông nghiệp Oxphia, Bungary. Nguyễn Lộc (1997), Nguyên lý tiến hóa của thực vật hạt kín, NXB Khoa học và Kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Đoài, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Cường, Trịnh Đình Đạt (2004), “Sử dụng chỉ thị phân tử SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của một số dòng ngô”, Báo cáo khoa học hội Nghị toàn quốc: Nghiên cứu cơ bản trong Khoa học và sự sống. Ngô Hữu Tình (1997), Cây ngô, NXB Nông nghiệp. Ngô Hữu Tình (2003), Cây ngô, NXB Nghệ An. Ngô Hữu Tình (2009), Chọn lọc và lai tạo giống ngô, NXB Nông nghiệp. Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007), “ Sử dụng chỉ thị SSR trong phân tích đa dạng di truyền để dự đoán ưu thế lai và khả năng kết hợp của một số dòng ngô thuần ”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Kỳ 1, tháng 5/2007. Phan Xuân Hào, Bùi Mạnh Cường, Nguyễn Văn Trường, Đoàn Thị Bích Thảo (2004), “Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn dòng ngô bằng chỉ thị SSR”. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (1). Tổng cục thống kê (2009), Niên giám thống kê, NXB Thống kê Hà Nội Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê, NXB Thống kê Hà Nội Viện Nghiên cứu Ngô (2009), Chiến lược phát triển cây ngô đến năm 2020 TIẾNG ANH AMBIONET – CIMMYT (Maria Luz C,G,, S,R, Ellen) (2004) Laboratory han dbook, protocob for Maize Genotyping using SSR Makers and Data Analysis, AMBIONET Servicie Laboratory - -CIMMYT, Metro Malina, philippines, Becker J,, P, Vos, M, Heun (1995), “Combined mapping of AFLP and RFLP maker in barley”, Mol, Gen, Genet, 269: 65 - 73 Bucker E,S,, et al (2001), “Molercular diversity structure DNA domestication of grasses”, Genet, Res Hallauer A,R,, et al (1988), “Corn breeding”, Corn DNA corn in improvement, American society of Agronomy, USA, Lanza L, L, B,, C, L, J, Souza, L, M, M, Ottoboni, M, L, C, Vieira, A, P, Souza (1997), “Genetic distance of inbred lines and prediction of maize single cross performance using RAPD marker”, Theor, Appl, Genet 94: 1023 - 1030 Messmer M, M,, et al(1992), “Relationships among Early European Maize Inbred: I, Genetic diversity among Flint DNA Dent lines revealed by RFLPS”, Crop Sic , 32. Saghai Maroof M,A,, et al (1984), “Ribosomal DNA spacer legth polymorphism in barley, Mendelian inheritance, chromosomal location DAN population dynamics”, proc, Natl Acad, Sic, USA 81, Senior M,L,, M,M, Murohy, C,W, Stuber (1998) “Utility of SSRs for determinning genetic similarities and relationships in maize using an agarose gel system”, Crop Sci, 38: 1088 - 1098 USDA (2010) – MỤC LỤC  TOC \t "A0,1,A1,1,A2,1,A3,1" PHẦN MỞ ĐẦU  PAGEREF _Toc294097143 \h 1 1. Đặt vấn đề  PAGEREF _Toc294097144 \h 1 2. Mục tiêu của đề tài  PAGEREF _Toc294097145 \h 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn  PAGEREF _Toc294097146 \h 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097147 \h 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC  PAGEREF _Toc294097148 \h 4 1.1. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế  PAGEREF _Toc294097149 \h 4 1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trong và ngoài nước  PAGEREF _Toc294097150 \h 5 1.2.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trên thế giới  PAGEREF _Toc294097151 \h 5 1.2.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô ở Việt Nam  PAGEREF _Toc294097152 \h 6 1.3. Cơ sở khoa học  PAGEREF _Toc294097153 \h 8 1.3.1. Ưu thế lai (ƯTL) - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng trong chọn tạo giống ngô  PAGEREF _Toc294097154 \h 8 1.3.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống  PAGEREF _Toc294097155 \h 10 1.3.2.1. Đa dạng di truyền của cây ngô:  PAGEREF _Toc294097156 \h 10 1.3.2.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống  PAGEREF _Toc294097157 \h 10 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai  PAGEREF _Toc294097158 \h 11 1.3.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai cây ngô ở Việt Nam  PAGEREF _Toc294097159 \h 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  PAGEREF _Toc294097160 \h 16 2.1. Vật liệu và nội dung nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097161 \h 16 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097162 \h 16 2.1.2. Nội dung nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097163 \h 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097164 \h 19 2.2.1. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm  PAGEREF _Toc294097165 \h 19 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu  PAGEREF _Toc294097166 \h 22 CHƯƠNG 3:  PAGEREF _Toc294097167 \h 24 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN  PAGEREF _Toc294097168 \h 24 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số  PAGEREF _Toc294097169 \h 24 3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền  PAGEREF _Toc294097170 \h 26 3.2.1. Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097171 \h 26 3.2.2. Kết quả đánh giá hệ số PIC, số alen và tổng số băng DNA thể hiện trên từng mồi  PAGEREF _Toc294097172 \h 30 3.2.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các dòng  PAGEREF _Toc294097173 \h 34 3.3. Kết quả phân tích đa hình di truyền của các nhóm trong 20 dòng ngô nghiên cứu:  PAGEREF _Toc294097174 \h 39 3.3.1. Kết quả phân tích đa hình cùng nhóm  PAGEREF _Toc294097175 \h 39 3.3.2. Kết quả phân tích đa hình khác nhóm  PAGEREF _Toc294097176 \h 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  PAGEREF _Toc294097177 \h 45 4.1. Kết luận  PAGEREF _Toc294097178 \h 45 4.2. Đề nghị  PAGEREF _Toc294097179 \h 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _Toc294097180 \h 46  DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU TOC \t "B0,1"  Bảng 1.1: Tình hình sản xuất ngô ở một số nước dẫn đầu trên thế giới năm từ 2004 - 2010  PAGEREF _Toc294097184 \h 5 Bảng1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2005 – 2009  PAGEREF _Toc294097185 \h 7 Bảng 1.3. Dự kiến diện tích, năng suất và sản lượng ngô cả nước  PAGEREF _Toc294097186 \h 8 đến năm 2020  PAGEREF _Toc294097187 \h 8 Bảng 2.2: Danh sách 20 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097188 \h 18 Bảng 2.3: thành phần của 1 phản ứng PCR  PAGEREF _Toc294097189 \h 20 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR  PAGEREF _Toc294097190 \h 21 Bảng 3.2: Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu(M%) của các dòng ngô nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097191 \h 26 Bảng 3.3: Tỷ lệ khuyết số liệu (M% mồi) ở 20 mồi nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097192 \h 28 Bảng 3.4: Hệ số PIC, số băng DNA và số alen xuất hiện trên 20 mồi  PAGEREF _Toc294097193 \h 30 Bảng 3.5: Hệ số tương đồng di truyền của 20 dòng ngô nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097194 \h 35 Bảng 3.6: Khoảng cách di truyền giữa các cặp dòng trên cơ sở 20 mồi SSR  PAGEREF _Toc294097195 \h 36 Bảng 3.7a: Hệ số tương đồng(GS) và khoảng cách di truyền(GD) giữa các dòng trong nhóm I  PAGEREF _Toc294097196 \h 40 Bảng 3.7b: Hệ số tương đồng(GS) và khoảng cách di truyền(GD) giữa các dòng trong nhóm II  PAGEREF _Toc294097197 \h 41 Bảng 3.7c: Hệ số tương đồng(GS) và khoảng cách di truyền(GD) giữa các dòng trong nhóm III  PAGEREF _Toc294097198 \h 42 Bảng 3.8: Hệ số tương đồng và khoảng cách di truyền trung bình của các cặp dòng trong từng nhóm  PAGEREF _Toc294097199 \h 43 Bảng 3.9: Khoảng cách di truyền giữa các nhóm  PAGEREF _Toc294097200 \h 44  DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH  TOC \t "C0,1" Hình 3.1:kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số  PAGEREF _Toc294097439 \h 25 Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi374118  PAGEREF _Toc294097440 \h 32 Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi32  PAGEREF _Toc294097441 \h 32 Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi109275  PAGEREF _Toc294097442 \h 33 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi227562  PAGEREF _Toc294097443 \h 33 Hình 3.4: Sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô nghiên cứu  PAGEREF _Toc294097444 \h 37