Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên tài nguyên thực vật rất dồi dào, với diện tích rừng của Việt Nam chúng ta thấy được sự đa dạng các loài trong hệ sinh thái thực vật là vô cùng phong phú. Với mục tiêu trồng rừng phát triển kinh tế, tạo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp cũng như các làng nghề thì sản phNm từ rừng của chúng ta phải ngày càng được nâng cao cả về chất lượng và sản lượng. Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) là một trong những loài lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao. Song mật có đường kính lớn, dài, bền, dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt nên đây là nguyên liệu sử dụng trong các làng nghề mây tre đan trên cả nước. Với sự quan tâm đầu tư của nhà nước cho các cơ sở sản xuất tiểu thủ công nghiệp thì số lượng sản phNm từ các làng nghề mây tre đan ngày càng tăng nhưng tỷ lệ nghịch với sự gia tăng này chính là sự giảm sút nghiêm trọng của nguyên liệu đầu vào. Theo thống kê, khoảng 35 – 42% các cơ sở mây tre đan đang phải sản xuất cầm chừng và có nguy cơ đóng cửa vì thiếu và không chủ động được nguyên liệu. Việc thiết lập những vùng nguyên liệu chuyên canh tập trung Song mật là một nhu cầu bức bách đối với nước ta hiện nay. Trên cả nước đã có nhiều tỉnh triển khai việc nhân giống Song mật nhưng công tác nhân giống chỉ mang tính gây trồng và bằng hình thức gieo ươm hạt tạo cây con rồi đưa vào trồng rừng sản xuất nhưng với song mây trong giai đoạn phát triển của chúng luôn phải trải qua giai đoạn cỏ. Đây là giai đoạn mà cây con tạo nhiều chồi, thời gian để các chồi phát triển là rất lâu, điều này kéo theo sự chậm phát triển của cây trồng. Để khắc phục giai đoạn cỏ này hiện nay chỉ có thể bằng các phương pháp nuôi cấy invitro. Giải quyết vấn đề thiếu nguồn nguyên liệu và suy giảm nhanh chóng nguồn tài nguyên thực vật này ngày 12 tháng 5 năm 2008 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số 1462/QĐ/BNN-KHCN về việc: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” 2 phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và nhân giống Song mật đưa nhanh vào trồng rừng sản xuất. Nhận thức được tầm quan trọng của nguồn nguyên liệu đưa vào nhân giống sản xuất. Để có nguồn nguyên liệu tốt cho công tác nhân giống thì việc đánh giá, kiểm tra chất lượng nguồn giống là vô cùng quan trọng. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả, độ chính xác cao, rút ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bởi nó cho chúng ta biết về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng 1 loài và giữa các loài khác nhau. Đến nay các nghiên cứu về tính đa hình cũng như tính đa dạng di truyền của Song mật để phục vụ công tác chọn giống ở Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ. Vì vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD.” Đề tài đặt mục tiêu là đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu từ đó làm cơ sở cho việc xác định xuất xứ, giúp các nhà chọn giống có kết luận chính xác về tính di truyền của các tính trạng mang phNm chất tốt của đối tượng. Phục vụ cho công tác tuyển chọn và nhân giống các dòng Song mật có thời gian nuôi trồng ngắn, phNm chất tốt, sản lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất và chất lượng sản phNm đầu ra. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Vấn đề chung về sinh học phân tử trong phân tích đa dạng di truyền Sự ra đời và phát triển của sinh học hiện đại đã cung cấp những công cụ thích hợp cho phân tích, nghiên cứu di truyền một cách nhanh chóng và hiệu quả. Đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhờ đó mà sự biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ ADN và có thể phát hiện ra lượng lớn tính đa hình tạo ra do đột biến. Vì vậy, làm cho kết quả của việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phong phú, chính xác hơn so với chỉ thị hình thái. Một số kỹ thuật ADN hiện đang được sử dụng phổ biến là đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) như: đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism ADN – RAPD); Microsatellite hay còn gọi là đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR); Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP); . . . Tuy nhiên, không có kỹ thuật sinh học phân tử lý tưởng nào đáp ứng được tất cả các chỉ tiêu, mỗi loại đều có những thế mạnh và hạn chế riêng. 1.1.1. Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) Kỹ thuật RFLP (Bot Stein, et al., 1980), dùng các cADN hoặc ADN ngẫu nhiên trong hệ gen như các mẫu dò, các mẫu dò này được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc enzyme tiếp hợp để phát hiện các đoạn ADN có độ dài khác nhau được tạo ra khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt ADN hệ gen và phân tách bằng phương pháp điện di trên gel [26]. Nếu trình tự nhận biết có mặt ở một vị trí trên hệ gen của một cá thể nhưng không có mặt ở cá thể khác, enzyme sẽ tạo ra các đoạn hạn chế có kích thước khác nhau ở vị trí này. Kết quả làm phát sinh hàng ngàn đoạn ADN có kích thước khác nhau. 4 RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, các đoạn ADN từ tất cả các nhiễm sắc thể (NST) đồng dạng đều được phát hiện. Vì vậy, RFLP là chỉ thị rất đáng tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống. RFLP có thể xác định một đặc điểm liên kết ở trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của một cá thể, đây là điều đặc biệt lý tưởng đối với các tính trạng lặn. RFLP được ứng dụng có hiệu quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập bản đồ phân tử. Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng ứng dụng của chỉ thị RFLP lại tốn kém về kinh tế và thời gian. Phương pháp này cần sử dụng lượng lớn ADN nên đòi hỏi sự thành thạo về kỹ thuật và các điều kiện phòng thí ngiệm đặc biệt. 1.1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR). Phản ứng PCR được Mullis và cộng sự đưa ra năm 1986. Đây là phản ứng tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase của vi khuNn với một mồi đặc trưng như một điểm xuất phát cho sự nhân lên của ADN khuôn. Quá trình tổng hợp diễn ra trên một máy điều chỉnh nhiệt, quy trình chạy PCR gồm 25 – 40 chu kỳ. Sản phNm ADN đặc trưng được nhân lên theo cấp số nhân với công thức tính: N = (2n – 2n). x Trong đó: n: số chu kỳ chạy phản ứng 2n: số phân tử có chiều dài không xác định x: số phân tử khuôn ban đầu N: số sợi tổng hợp được trong phản ứng. 2n: số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa 2 mồi [3]. Kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở là các đoạn nucleotide với kỹ thuật PCR để phát hiện các locus đơn gen hoặc đa gen trong hệ gen sinh vật, có thể đòi hỏi hoặc không đòi hỏi không trình tự, có thể khác nhau về mức độ 5 tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng như bản chất của sự đa hình mà chúng phát hiện. Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lượng lớn sự đa hình tạo ra do đột biến, vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị hình thái. Để phân biệt các xuất xứ khác nhau, có thể dùng nhiều phương pháp. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả cao, chính xác, rút ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bởi nó cho phép chúng ta hiểu biết về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau làm cơ sở cho việc xác định xuất xứ [1, 4]. Sự ra đời của PCR đã làm thay đổi lớn trong sinh học phân tử, đánh dấu sự ra đời của hàng loạt chỉ thị phân tử: RAPD, AFLP, SSR. 1.1.2.1. Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP). AFLP được phát triển bởi Zabeau và Vos (1993) [30] và được mô tả chi tiết bởi Vos và cộng sự (1995) [28]. AFLP là kỹ thuật di truyền mới dựa trên cơ sở PCR, AFLP đã phối hợp được sự tin cậy của RFLP và sự thuận lợi của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm ba bước: (1) : Cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter). (2) : Nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn. (3) : Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên. Đây là kỹ thuật có nhiều ưu điểm trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều đối tượng khác nhau: đậu tương [24], lập bản đồ hệ gen và định vị các gen, phát triển chỉ thị chuNn ở khoai tây [8], ở lúa mỳ, xác định các gen kháng virus ở đậu tương [28], ở khoai tây [11], ở lạc [13]. 6 AFLP là một kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống có sự trợ giúp của chỉ thị [10, 21]. Tuy nhiên, phân tích AFLP trước đây có giá thành cao, đòi hỏi có kỹ thuật phòng thí nghiệm thành thạo vì AFLP thường dùng đồng vị phóng xạ để phát hiện các đoạn ADN được nhân lên trong phản ứng PCR, song điều này đã được khắc phục khi sử dụng các kỹ thuật nhuộm huỳnh quang và nhuộm bạc thay cho việc sử dụng đồng vị phóng xạ. Sự thay thế này giúp cho giá thành khi sử dụng kỹ thuật giảm đi rất nhiều, không đòi hỏi những thiết bị quá đắt, các thao tác kỹ thuật đơn giản hơn mà vẫn đảm bảo độ nhạy và tính chính xác của kết quả. Với việc thay thế bằng nhuộm huỳnh quang và nhuộm bạc AFLP đã trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay trong nghiên cứu di truyền và lập bản đồ liên kết phân tử. 1.1.2.2. Trình tự vị trí đánh dấu (STS - Sequence Tagged Sites) STS được tạo ra đầu tiên bởi Olson và cộng sự (1989) dựa vào một loại locus đã biết (gen, cADN, hoặc gen tách dòng) được nhân lên bởi mồi PCR thiết kế dựa vào trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này. Dựa trên cơ sở PCR nó phát hiện một điểm có trình tự xác định, nó không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự. Mồi có 18 – 20bp được thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn, duy nhất trên ADN đã biết trình tự (có thể là trình tự của sản phNm PCR với chỉ thị RAPD hoặc RFLP) sự đa hình nói chung được xác định như sự khác nhau về kích thước của sản phNm PCR trên gel agarose. EST (Expressed Sequence Tag) là một chỉ thị dựa trên cơ sở PCR với mồi dài 18 – 20 nucleotide được thiết kế từ những phần trình tự đã biết trên hệ gen như các đoạn cADN, nó không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự và phát hiện vùng biểu hiện duy nhất của hệ gen nên thích hợp đối với lập bản đồ. Sự đa hình nói chung được phát hiện bởi sự khác nhau về kích thước của 7 sản phNm PCR. Tuy nhiên việc thiết kế và chuNn hoá mồi có thể đòi hỏi sự đầu tư đáng kể. Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCARs (Sequence Characterised Amplified Regions). Các chỉ thị này dựa trên việc tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD được quan tâm (có thể vì chúng liên kết với gen được quan tâm), từ trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thường dùng trong RAPD (24 nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của đoạn RAPD ban đầu. Khi các mồi này được dùng trong PCR, một locus đơn được xác định tương ứng với đoạn ADN ban đầu của locus này. SCARs tiến bộ hơn RAPD là các kết quả có khả năng lặp lại (dùng mồi dài hơn) và là các chỉ thị đồng trội. Chỉ thị CAPS hay "Cleaved Amplified Polymorphic Sequences" [15] cũng là một ví dụ của STS, được tạo ra bằng cách cắt các sản phNm PCR với một enzym hạn chế. Chỉ thị ADN này vẫn mang những ưu điểm cơ bản của PCR là chỉ cần một lượng nhỏ nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ kết quả huỳnh quang. Các mồi PCR dài hơn (15 – 25 nucleotide) dùng cho CAPS có xu hướng tạo ra những sản phNm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ thuật mồi ngẫu nhiên khác. Tuy nhiên, CAPS cũng có mặt hạn chế là các cá thể có liên hệ gần gũi thường chứa các alen giống nhau. Điều này gây trở ngại nghiêm trọng trong việc tạo cặp lai giữa các dạng khác nhau. 1.1.2.3. Chỉ thị đoạn lặp đơn giản (Simple sequence reapeats – SSR) SSR còn gọi là Microsatillite được Litt và Luty (1989) [20] phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử. Microsatellite là đơn vị lặp lại rất ngắn 1 – 5bp, chúng xuất hiện và phân bố ở gần tâm động hoặc đầu mút của các NST, có vai trò giữ tính ổn định của bộ NST ở các quá trình phân bào trong hệ gen của tất cả sinh vật nhân thực [5, 26]. Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn 8 đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide. Đa hình về độ dài các đoạn microsatellite cũng có thể được phát hiện khi lai với ADN trên gel hoặc có thể được nhân bằng PCR để tách dòng, đọc trình tự với mồi là các đoạn oligonucleotide phụ cận. Các vị trí microsatellite là các chỉ thị đồng trội vì vậy chứa đựng thông tin cao. Microsatellite cũng là một chỉ thị trong lập bản đồ và xác định chỉ thị chuNn. Ở động vật microsatelllite với trình tự CA/GT lặp lại là phổ biến nhất, trình tự này ít thấy ở nhiều thực vật vì ở thực vật trình tự lặp lại AT/TA phổ biến hơn nhiều, tiếp đó là trình tự GA/CT. Trong hệ gen lúa (GA)n lặp lại cứ 225kb một lần và (GT)n lặp lại cứ 480kb một lần. Sự phân tích trình tự lặp lại là hết sức quan trọng đối với phân tích hệ gen thực vật vì trình tự lặp lại đặc trưng cho ADN hệ gen của cá thể. Perry Creengam đã sử dụng kỹ thuật SSR để phát hiện ra sự khác nhau giữa các thứ đỗ mà không phân biệt được bằng kỹ thuật RADP. Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị khác. Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ, sử dụng một lượng ADN và ít tốn thời gian vì vậy kỹ thuật SSR có nhiều ứng dụng trong việc lập bản đồ phân tử. Kochert đã sử dụng chỉ thị SSR để lập bản đồ liên kết di truyền ở lúa [29]. Đánh dấu các gen quan trọng, sử dụng trong nghiên cứu ở một vài thực vật bao gồm: Lúa [29] và đậu tương [7], kỹ thuật in dấu ADN và được dùng cho xác định các dòng lai từ các loài hoang dại trong cải biến giống cây trồng. Hạn chế của các chỉ thị SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một lượng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR [16]. Tuy nhiên dựa vào các ngân hàng gen đã có hiện nay có thể thiết kế các tổ hợp mồi cho SSR ở nhiều loài cây khắc phục được phần nào hạn chế này. 9 1.1.2.4. Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism ADN – RAPD) 1.1.2.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD Đây là một kỹ thuật phân tử dựa trên cơ sở của phản ứng PCR do Welsh và Mc ClellADN, 1990; Williams và cộng sự, 1990 đề xuất. Kỹ thuật RAPD sử dụng các mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ 9 – 12 nucleotide các mồi này thường có hơn 60%(G +C) để đạt được liên kết với mẫu đủ mạnh. Các mồi ngẫu nhiên là ngắn nên khả năng nó tìm được những điểm gắn theo nguyên tắc bổ sung trên ADN là không quá khó khăn. Điện di kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những băng, vạch ADN ở những vị trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có sự khác nhau (có đa dạng sinh học) cho kết quả khác nhau trên điện di đồ. Kết quả của phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN khác nhau về độ dài và trình tự. Một mồi ngẫu nhiên có thể cho kết quả là có băng nhân bản với ADN từ nguồn này nhưng lại không xuất hiện băng nhân bản với ADN từ nguồn khác [5, 12]. Sản phNm PCR gồm nhiều đoạn ADN có kích thước từ 200bp đến hơn 3kb. Sự khác nhau của các đoạn ADN được phát hiện khi điện di sản phNm PCR trên gel agarose. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là do đột biến ở vị trí gắn mồi ngăn trở việc bắt cặp của mồi. Các đoạn này được ghi nhận như các yếu tố di truyền Mendel trội trong một cơ thể lưỡng bội. 1.1.2.4.2. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật RAPD RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc. Đây là một kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, sử dụng lượng nhỏ ADN khuôn, không dùng kỹ thuật lai và mẫu dò phóng xạ nên không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Vì vậy, trong những năm gần đây phân tích RAPD trở thành phương pháp phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền và phân loại thực vật, xác định các đặc điểm quan trọng và nguồn gốc. 10 Mỗi mồi cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong hệ gen vì vậy những đa hình hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn với phân tích locus đơn. Tuy vậy, RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp nên RAPD không được sử dụng rộng rãi trong xây dựng bản đồ và do mồi ngắn (10 nucleotide) nên khi chạy phản ứng PCR sẽ chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu tố [6]. Mồi ngắn dễ dàng bị ảnh hưởng của điều kiện gắn mồi nên kết quả có hệ số an toàn không cao, sự nhạy cảm cao với điều kiện phản ứng như: chất lượng, nồng độ ADN khuôn; nồng độ dung dịch đệm (đặc biệt là Mg2+); nồng độ ADN polymerase; nồng độ nucleotide (dNTP: A, U, G, C) là những hạn chế chính của kỹ thuật. Do thiếu sự ổn định, kỹ thuật RAPD bị hạn chế sử dụng trong lập bản đồ QTL các quần thể lai và ít được dùng trong những trường hợp lập bản đồ so sánh. Bên cạnh đó là sự phát sinh đa hình giả ảnh hưởng đến sự thể hiện của các đoạn RAPD do không chắc chắn các đoạn cùng kích thước từ hai mẫu ADN khác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen hay không. Tuy nhiên, kỹ thuật với mồi ngẫu nhiên có nhiều ứng dụng trong các thí nghiệm đòi hỏi một số lượng lớn bản sao để kiểm tra độ tin cậy nên kỹ thuật RAPD vẫn là lựa chọn thích hợp cho công tác đánh giá đa dạng di truyền. 1.1.2.4.3. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD RAPD thường được dùng trong nghiên cứu phát sinh loài và dùng trong phân tích sự phân ly các dòng gần đồng gen (near isogenic lines - NIL) [22], RAPD được dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác định quan hệ di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều loài cây như lúa, đậu tương, lúa mạch đen, kiều mạch, đậu Hà Lan, hoa hồng... [23, 18, 24, 25]. Cùng với RFLP hoặc SSR, RAPD được dùng để xây dựng bản đồ liên 11 kết di truyền (bản đồ có mật độ cao trong nhiều trường hợp) ở nhiều loài cây: rau diếp, củ cải đường, lúa mạch... [17, 27, 29]. Trong một số ít trường hợp RAPD được dùng trong xác định QTL của nhiều đặc điểm nông học như: các đặc điểm về năng suất ở lúa mạch và lúa, trong xác định gen điều khiển các đặc điểm đơn gen ở cà, rau diếp [14, 17]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra RAPD là một phương pháp hữu hiệu để xác định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứu phát sinh loài (hệ thống phát sinh) và lập bản đồ di truyền. 1.2. Tình hình nghiên cứu về Song mật Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) thuộc họ cau (Arecaceae), nằm trong nhóm gỗ trung bình. Với giá trị sử dụng cao và được người dân sử dụng từ rất lâu nên đã có nhiều nghiên cứu về Song mật. 1.2.1. Phân bố, đặc điểm hình thái Song mật Song mật là loài cây ưa sáng và Nm, luôn vươn lên tầng cao nhất của tán rừng. Mọc trên đất feralit vàng, trên núi đá và các loại đất phong hóa trên phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vôi. Cây thường mọc ven thung lũng núi, chân và sườn núi đá, ven và dọc các khe Nm. Nơi có độ dốc 30 – 50o cũng thấy Song mật. Song mật mọc xen lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 100 – 1,500m, tập trung nhiều ở độ cao 400 – 900m. Trên thế giới, Song mật chủ yếu tập trung nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc Song mật chủ yếu phân bố ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900m thành từng cụm lớn. Ở Việt Nam đây là loài cây cận đặc hữu thường gặp ở ở các tỉnh từ Đồng Nai (Nam Cát Tiên) trở ra nhưng tập trung nhất ở các tỉnh: Quảng Nam, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hoá, Ninh Bình, Hòa Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai,Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lai Châu [2]. Cây Song mật có thân ngầm là phần phình lên của gốc thân khí sinh, có dạng giống như củ hành ta và được bao bọc bởi nhiều bẹ lá dày, màu trắng hay vàng nhạt. Các bẹ lá ngoài cùng chết dần và có màu nâu, phía giữa thân 12 ngầm là đỉnh sinh trưởng, mềm màu trắng. Ở cây non, thân được bao bọc bởi bẹ lá hình ống, màu xanh lá cây, trên mặt có nhiều gai dẹt màu vàng. Khi già, bẹ ở gốc thân chuyển thành màu vàng, màu nâu rồi rụng đi, để lộ thân khí sinh màu xanh rêu. Cây một năm tuổi đường kính thân ngầm đạt 1cm, cây trưởng thành đường kính thân ngầm tới 4 – 6cm hay hơn. Thân khí sinh mọc thành bụi nhưng thường rất thưa. Ở cây trên ba tuổi giữa các gốc rễ lớn xuất hiện chồi mầm đầu tiên, chồi cong và hướng lên phía trên sát với thân cây mẹ; quanh gốc thân ngầm mọc ra các rễ dài, cứng; đôi khi ta gặp bụi Song mật chỉ có một thân khí sinh. Thân cây trưởng thành rất dài, có thể đến 40m, trong rừng già có thể đạt 100m. Thân non màu trắng ngà, sau chuyển sang màu xanh; lóng dài 8 – 25cm, đốt hơi nổi, đường kính trung bình đạt 2,3 – 2,8cm; cây to đạt 4 – 5cm. Nếu tính cả bẹ lá bao bọc, đường kính thân phần ngọn đạt 8 – 10cm [2]. Lá Song mật là dạng lá đơn, xẻ gân lông chim, gần giống lá Dừa, gồm: bẹ lá, cuống lá, phiến là và thìa lìa nằm giữa bẹ và cuống lá. Bẹ lá rất dài, bao bọc kín thân khí sinh.Trên bẹ lá có nhiều gai dẹt, dài 8 – 10cm, gai mọc lật ngược về phía gốc; Thường khi cây cao 2 – 3m, từ lá thứ 6 – 7 trở lên xuất hiện roi (flagelle) trên đỉnh cuống lá; roi dài 1,5m hay hơn [2]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa hình bông mo, dài hơn 1m, mọc ở gần nách các lá phía ngọn; mỗi thân thường mang 5 – 10 bông mo. Mỗi bông mo mang nhiều bông nhỏ dài 2 – 2,5cm với 14 – 17 hoa. Hoa đực xếp sát nhau thành 2 dãy, lá đài 3, cánh hoa 3, nhị 6. Hoa cái tập trung 14 – 32 hoa trong một bông nhỏ. Thường chỉ 17 – 20 hoa cái phát triển thành quả. Chồi hoa xuất hiện vào tháng 9 – 10, hoa nở vào tháng 4 – 5 năm sau. Quả chín tháng 10 – 11 dương lịch. Thời gian chín của quả kéo dài khoảng một tháng [2]. Quả hình trứng, dài 15 – 22mm, rộng 9 – 14mm, cuống mập màu xanh vàng, dài 6mm, đỉnh có mũi hình nón dài 4mm; vỏ quả mang 18 hàng vảy dọc, mỗi hàng 8 vảy dẹp, có rãnh kích thước 3 × 3,5mm mép màu nâu. Khi 13 non quả màu xanh lá cây, khi già màu vàng nhạt. Cùi quả màu trắng nhạt, mọng nước, dài 1mm, dễ dóc khỏi hạt, cùi có vị chua [2]. Hạt hình trái xoan hay bầu dục, khi non màu trắng ngà, khi già màu nâu đen. Vỏ ngoài hạt rất cứng, nhăn nheo, màu trắng đục, phía bụng là rốn hạt, phía đầu to có lỗ với nắp đậy, qua đó phôi sẽ xuất hiện khi nảy mầm. Hạt chứa nội nhũ, sừng rất cứng, phôi nằm lệch về một phía. 1.2.2. Giá trị và hiện trạng khai thác Song mật trên cả nước. Thân Song mật dài, rất dẻo, chịu uốn và bền, nên được dùng làm bàn ghế, hàng mây tre đan và cuốn bè. Hiện nay, Song mật là loại nguyên liệu quan trọng trong nhiều cơ sở sản xuất mây tre đan ở các tỉnh phía Bắc. Trên thị trường giá Song mật đắt hơn giá các loài song mây khác từ 2 – 3 lần. Hiện nguồn Song mật dùng cho chế biến, sử dụng vẫn chủ yếu dựa vào việc khai thác từ rừng tự nhiên. Theo đánh giá của các chuyên gia lâm nghiệp, từ những năm 1985 Song mật đã bị khai thác mạnh để làm hàng xuất khNu khiến cho nhiều khu phân bố thu hẹp dần số cá thể và có nguy cơ bị mất nguồn giống. Nguồn tài nguyên Song mật đang cạn kiệt, vì vậy trên cả nước cần xây dựng những rừng giống và khoanh vùng một số khu vực còn nhiều cá thể để khai thác hợp lý, đảm bảo sản lượng ổn định, lâu dài. Song mật rất thích hợp phát triển trong các rừng của Việt Nam nên phải có kế hoạch bảo vệ, khai thác, đNy mạnh công tác gieo trồng và sử dụng bền vững. Trước tiên cần có kế hoạch tích cực bảo vệ cây Song mật trong các khu bảo tồn để làm nguồn giống; đặc biệt cần bảo vệ các cây Song mật đã được trồng ở Trạm nghiên cứu Lâm nghiệp Bình Thanh, tỉnh Hoà Bình và vườn quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ để lấy giống nghiên cứu và phát triển trong giai đoạn đầu. Sớm đưa Song mật vào gây trồng trong các rừng đặc dụng và rừng đầu nguồn. 1.2.3. Những nghiên cứu về Song mật trên Thế giới và Việt Nam Đối với các đối tượng nghiên cứu khác như: mây nếp, xoan, bông, dâu tằm. . . và các loài cây trồng nông nghiệp: đậu tương, đậu xanh, . . . Với kỹ 14 thuật sinh học phân tử, các cơ sở nghiên cứu đã đánh giá được tính đa dạng di truyền ở nhiều đối tượng trên quy mô cả nước cũng như trên thế giới, phục vụ công tác tuyển chọn giống cây nông lâm nghiệp để có nguồn giống chất lượng (kháng sâu, bệnh hại; chịu hạn . . .) và năng suất cao đưa vào sản xuất. Nhận thức rõ vai trò quan trọng của loài cây có giá trị kinh tế cao này, tại nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các nước trong khu vực Đông Nam Á đã tiến hành nghiên cứu: phân loại, kỹ thuật gây trồng, phân tích lợi ích kinh tế của việc gây trồng Song mật (Yin Guangtian, et al., 1998). Các nghiên cứu về nguồn tài nguyên di truyền, xác định những loài có giá trị thương mại đã được tiến hành ở: Bangladesh, Trung Quốc, ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Philippines và Thái Lan (Ramanatha Rao, et al., 1999) nhằm mục đích xác định số lượng, khu vực phân bố, vùng gây trồng phù hợp. Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu ở Thái Lan về phân tích đa dạng di truyền bằng các phương pháp phân tích phân tử (isozyme, RAPD, RFLP, AFLP ... (L.T. Hong, et al., 2002). Với nguy cơ đang mất đi một nguồn gen quý cũng như mất dần nguồn liệu trong sản xuất nên trong những năm qua Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cùng các tỉnh đã và đang xây dựng nhiều dự án trồng, bảo vệ Song mật trong tự nhiên; nhiều dự án trồng vùng nguyên liệu sản xuất và vùng bảo tồn nguồn gen tự nhiên ở nhiều tỉnh. Nguồn giống trong công tác trồng vùng nguyên liệu và bảo tồn nguồn gen trong tự nhiên ở nước ta hiện nay chủ yếu dựa vào hình thái và rất xô bồ, chưa được quan tâm đúng mức. Nhận thấy những tồn tại đó đề tài: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” đã đặt công tác đánh giá chất lượng nguồn giống nuôi trồng là giai đoạn đầu tiên để kết quả, chất lượng đề tài cũng như nguồn giống đạt được là cao nhất. Đối với công tác nhân giống ở Việt Nam, đặc biệt với đối tượng là Song mật thì đây là vấn đề đang được khuyến khích và triển khai trên mọi đối tượng là cây trồng sản xuất cũng như trong bảo tồn nguồn gen thực vật trên cả nước. 15 H ìn h 1. 1. C ác bộ ph ận : th ân , bẹ , đ ốt , ga i, ho a , qu ả củ a So n g m ật (n gu ồn In te rn et ). H ìn h 1. 2. N gọ n v à ro i ( fla ge lle ) c ủa So n g m ật tr o n g tự n hi ên (n gu ồn In te rn et ). 16 Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ˗ Xác định mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Song mật thu thập tại 4 tỉnh phía Bắc. ˗ Cơ sở phân tử cho công tác chọn tạo, nhân giống và bảo tồn các giống Song mật quý, có giá trị cao trong sản xuất kinh tế. 2.2. Nội dung nghiên cứu ˗ Tách chiết ADN tổng số của các dòng Song mật ở 4 xuất xứ khác nhau. ˗ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu ADN tổng số thu được với 20 đoạn mồi ngẫu nhiên. ˗ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của Song mật với các xuất xứ bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02h (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu * Vật liệu thực vật: Mẫu nghiên cứu là lá Song mật sạch bệnh, thu thập từ 4 tỉnh phía Bắc: Hòa Bình, Bắc Giang, Tuyên Quang, Hà Giang. Gồm 15 mẫu Song mật, theo đánh giá của cán bộ điều tra thì đây là 15 cá thể trội trong số 4 xuất xứ được thu thập (bảng 2.1) do Trung tâm Giống và Công nghệ Sinh học Trường Đại học Lâm nghiệp cung cấp. 17 Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu Song mật sử dụng nghiên cứu Ký hiệu Giống Song mật Ký hiệu Giống Song mật S1 Hoà Bình 1 S9 Tuyên Quang 2 S2 Hoà Bình 2 S10 Tuyên Quang 3 S3 Hoà Bình 2’ S11 Hà Giang 1 S4 Hoà Bình 3 S12 Hà Giang 2 S5 Hoà Bình 4 S13 Hà Giang 3 S6 Hoà Bình 5 S14 Bắc Giang 1 S7 Hoà Bình 6 S15 Bắc Giang 2 S8 Tuyên Quang 1 * Hóa chất: ˗ Trình tự mồi RAPD được tham khảo trên ngân hàng Gen thế giới (NCBI) và đặt mua từ hãng OPERON (Mỹ) gồm các mồi có trình tự trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Tên và trình tự 20 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu TT Tên mồi Trình tự nucleotide TT Tên mồi Trình tự nucleotide 1 PC01 5’-GGACTGGAGT 11 PC11 5’-AACCGACGGG 2 PC02 5’-TGCTCTGCCC 12 PC12 5’-GGGGGTCGTT 3 PC03 5’-GGTGACGCAG 13 PC13 5’-TACCACCCCG 4 PC04 5’-TGGGGGACTC 14 PC14 5’-GGCGGACTGT 5 PC05 5’-GTAGACCCGT 15 PC15 5’-CCAGACCCTG 6 PC06 5’-TTCCCCCGCT 16 PC16 5’-CAATCGCCGT 7 PC07 5’-GGACCCTTAC 17 PC17 5’-TCGGCGATAG 8 PC08 5’-TGGACCGGTG 18 PC18 5’-GTCCACACGG 9 PC09 5’-AAGCCTCGTC 19 PC19 5’-CAGCACCCAC 10 PC10 5’-ACTTCGCCAC 20 PC20 5’-GGGAAGGACA 18 ˗ Hóa chất tách chiết ADN tổng số được mua từ hãng Sigma: + Đệm ( dung dịch) Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 100ml gồm: 1g CTAB; 40ml H2O; 10ml Hydroxymethyl aminomethane Hydrochloride (Tris – HCl) 1M, pH 8.0; 28ml Clorua natri (NaCl) 5M; 4ml Ethylene diamine tetra acetate (EDTA) 0.5M, pH 8.0; 1g Polyvilyn polydon (PVP). + Đệm TE 10ml gồm: 10mM Tris - HCl pH 8.0; 1mM EDTA 8.0. + Isopropanol. + Hỗn hợp Phenol/ Chlorofom/ isoamylalcohol (25:24:1). + Agarose. + Ethidium Bromide (EtBr). + Loading buffer 6X (Bromophenol blue 10%; Glycerin 100%; H2O). + Đệm TAE (Tris acetate EDTA) 1X (Tris – acetate; EDTA pH 8.3; H2O). + Cồn 96o. - Hóa chất dùng cho phản ứng PCR được mua từ hãng Invitrogen gồm: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, đệm PCR. * Máy móc thiết bị: - Các thiết bị sử dụng để tách chiết ADN và chạy phản ứng PCR gồm: + Nồi khử trùng: auto clever, HVE – 50 hãng Hirayama, Japan. + Cân phân tích: TE 612 của hãng Satorius, Mỹ. + Pipetman: 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl hãng Biotit. + Tủ lạnh -20oC, 4oC của hãng Sanyo, Toshiba – Japan. + Máy ổn nhiệt: BW – 05G của Lab. Companion, Korea. + Máy PCR: 9800 Fast Thermal Cycler hãng Applied Biosystems, USA + Máy chạy điện di: Fill line, Power station 300 hãng CLP. + Máy soi, chụp gel: Dolphin – doc hãng Wealtec. 19 + Máy đo quang phổ: 8452 Hewllet – Packart hãng Hp, USA + Máy hút chân không: Centrifuge for vancuum Modulspin – Bistron. + Máy ly tâm lạnh: Mikro 22R Hettich zentrifugen. 2.3.2. Phương pháp phân tích RAPD 2.3.2.1. Phương pháp tách ADN hệ gen Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp tách chiết ADN của Shagai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết ADN hệ gen của các dòng Song mật. Quy trình bao gồm các bước: Bước 1: Nghiền 0,2g lá Song mật trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ. Bột đã nghiền cho vào ống ly tâm 1,5ml. Thêm 1ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút. Bước 2: Ủ các ống ở điều kiện 65oC trong 60 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả. Bước 3: Chuyển các ống từ tủ ấm ra, để nguội ở nhiệt độ phòng 15 phút. Sau đó ly tâm trong 10 phút với tốc độ 12.000 vòng/ phút. Bước 4: Chuyển phần dịch phía trên sang ống ly tâm mới. Thêm 500µl dung dịch phenol/ Chloroform/ isoamy alcohol (25:24:1). Trộn đều dung dịch bằng máy Vortex. Bước 5: Ly tâm 5 phút tốc độ 12.000 vòng/phút ở 4oC Bước 6: Chuyển lớp trên cùng vào ống ly tâm mới (1,5ml). Thêm 500µl Chloroform/ isoamy alcohol (24:1), xoay ống nhẹ nhàng 10 phút. Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ là 4oC. Bước 8: Dùng Pipetman hút lớp trên cùng (500µl) sang ống ly tâm mới (1,5ml) thêm 1ml isopropanol lạnh, xoay ống nhẹ vài phút và ủ ở nhiệt độ 20oC trong 60 phút. Bước 9: Ly tâm 15 phút tốc độ 3.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC để thu tủa. Bước 10: Rửa ADN kết tủa bằng 500µl cồn 70%, lắc nhẹ nhàng. Ly tâm 5 phút tốc độ 12.000 vòng/phút. 20 Bước 11: Sau đó đổ cồn ra, úp ống ly tâm trên giấy thấm khô. Bước 12: Bổ sung 50µl TE vào ống ly tâm có chứa ADN, bảo quản -20oC. 2.3.2.2. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế. Nguyên lý: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm của các base purine và pyrimidine, sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu và cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: 50(µg/ml) cho một dung dịch ADN sợi đôi. Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau: CADN (µg/ml) = OD260 nm × 50 × Độ pha loãng Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở bước sóng 280nm (OD280nm). 280nm là bước sóng mà ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic. Một dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Bước tiến hành: ˗ Lấy 1ml dung môi hòa tan ADN (TE pH 8.0 hoặc nước deion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng. ˗ Cho 20µl dung dịch ADN cần định lượng vào 980µl dung môi hòa tan ADN (pha loãng 50 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bước sóng 260nm và 280nm. ˗ Từ kết quả thu được ta tính nồng độ ADN và độ tinh sạch của ADN theo công thức trên. Phương pháp định lượng ADN được đo trên máy quang phổ 8452 Hewllet – Packart và dựa vào nồng độ để pha loãng ADN ra nồng độ 25(ng/ml) bằng nước cất 3 lần để chuNn bị chạy PCR với các mồi RAPD. 21 2.2.2.3. Phương pháp điện di sản ph-m PCR trên gel Agarose Nguyên lý: Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các ADN. Ðó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Các đoạn ADN sẽ di chuyển trong điện trường trên bản gel, với tốc độ tương quan nghịch với kích thước của chúng. Trong cùng một thời gian nhất định (tùy thí nghiệm) các đoạn kích thước nhỏ sẽ di chuyển xa hơn các đoạn lớn, từ đó mà ADN được tách thành các vạch trên bản gel. Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn ADN cần phân tách. Ðoạn ADN có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại. Bảng 2.3 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự ADN có kích thước xác định. Bảng 2.3. Tương quan nồng độ gel agarose và kích thước ADN phân tách Hàm lượng agarose trong gel (%w/v) Kích thước các đoạn ADN cần phân tách (kb) 0,3 5 – 60 0,6 1 – 20 0,7 0,8 – 10 0,9 0,5 – 7 1,2 0,4 – 6 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2 (Nguồn: Sambrook J. và cộng sự, 1989) 22 Trong điện di trên gel agarose, các đoạn ADN được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ Ethidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của ADN phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV. Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng tia UV, các đoạn ADN hiện thành vạch sáng màu trên bản gel. Để ước lượng kích thước các trình tự ADN trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM). Đó là một tập hợp trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN – marker). Buớc tiến hành: Bước 1: ChuNn bị gel agarose 1% (gel phân tách ADN của phản ứng PCR – RAPD có nồng độ là 1,2%). Cân 0,37 g agarose hoà tan trong 37ml dung dịch đệm 1X TAE. Đun dung dịch này trong lò vi sóng trong khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn (nếu trong quá trình đun bị mất nước thì phải bổ sung thêm nước để đạt thể tích 37ml). Để dung dịch agarose nguội dần, nhiệt độ đạt 50 – 60oC , đổ vào khay điện di đã cài sẵn lược, sau đó chờ 20 – 30 phút cho gel agarose đông cứng. Gỡ khay gel và đặt vào bể điện di, đổ dung dịch đệm 1X TAE ngập gel độ 0,5cm, tháo lược ra khỏi bản gel. Bước 2: Tra mẫu ADN Trộn mẫu ADN cần điện di với dung dịch đệm màu - Loading buffer theo tỷ lệ: 1 thể tích dịch đệm + 2 thể tích mẫu ADN. Tra mẫu vào các giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu) và thêm thang ADN chuNn (marker) để giúp xác định độ dài của các băng ADN. Bước 3: Chạy điện di Với hiệu điện thế từ 60 – 80V, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Quan sát sự di chuyển bằng vạch màu Bromophenol blue để ngừng quá trình điện di. 23 Bước 4: Nhuộm mẫu Khi chạy điện di xong, bản gel agarose được lấy ra và ngâm vào dung dịch EtBr ở nồng độ 30(µl/l). Để 20 – 30 phút, sau đó rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước 15 – 20 phút. Sau đó đưa bản gel vào máy soi gel bằng tia UV. Bước 5: Quan sát và chụp ảnh Soi gel agarose trên máy UV, dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 – 260nm. Chụp các ảnh bằng máy chuyên dụng Polaroid (Gel - Doc). 2.2.2.4. Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD Kỹ thuật chạy PCR của ADN hệ gen với các mồi RAPD được thực hiện trên máy PCR 9800 Fast Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ). Thành phần phản ứng PCR – RAPD được nêu rõ trong bảng 2.4. Mỗi phản ứng được thực hiện trong thể tích 25µl (tính cho 16 phản ứng). Bảng 2.4. Thành phần các chất phản ứng PCR - RAPD TT Hóa chất 1 phản ứng (µl) 16 phản ứng (µl) Ghi chú 1 H2O 15 240 2 Buffer 10X PCR 2,5 40 3 Mg2+ (50mM) 2,5 40 4 dNTP (2,5mM) 1 16 5 Primer 1,5 24 6 ADN - template 2 Mỗi phản ứng 1 ADN - template 7 Taq – Polymerase 0,5 8 Trộn đều các hỗn hợp trên rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình RAPD – CT đã cài đặt sẵn với 45 chu kỳ gồm các bước: 24 1. 94 oC trong 3 phút; 5. 45 chu kỳ (2+3+4); 2. 92 oC trong 1 phút; 6. 72 oC trong 10 phút; 3. 35 oC trong 1 phút; 7. 4oC trong 30 phút. 4. 72 oC trong 1 phút; Hình 2.1. Chế độ nhiệt và thời gian chạy phản ứng PCR. 2.2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu RAPD Sản phNm PCR với các mồi RAPD sau khi chạy điện di trên gel agarose 1,2% sẽ được nhuộm và chụp ảnh để phân tích số liệu. Công việc đầu tiên là xác định băng đơn hình và đa hình dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của băng đó giữa các dòng (mẫu) nghiên cứu. Nếu một băng ADN (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở dòng i nhưng không xuất hiện ở dòng j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các dòng khác thì băng ADN này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng ADN này xuất hiện ở tất cả các dòng nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình. Tiếp theo các băng này được mã hoá bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu băng đa hình xuất hiện ở dòng nào thì tại đó ký hiệu là 1 và ngược lại được ký hiệu là 0. Số liệu thu được, được nhập trực tiếp vào phần mềm Excel. Sau đó được xử lý bằng chương trình NTSYSpc version 2.02h để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức: 94oC 92oC 72oC 35oC 4oC 0 3 phút 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút 30 phút to tg 25 Jij = a/(n – d) Trong đó: a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j; d: Số băng ADN có ở dòng i hoặc dòng j; n: Tổng số băng thu được; Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j; Sau đó số liệu lần lượt được xử lý qua các bước trong NTSYS – SIMQUAL, SAHN. và cuối cùng là Tree để vẽ biểu đồ phân tích mối tương quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu. 26 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Mẫu lá Song mật sau khi lấy từ 4 tỉnh phía Bắc được bảo quản lạnh trong tủ -20oC. Khi tách chiết ADN, mẫu bảo quản được lấy ra và nghiền bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng. Tiếp đó tiến hành các bước trong quy trình tách chiết ADN của Saghai Maroof và cộng sự (1984). Tuy nhiên, Song mật là loài cây có chứa hàm lượng hydratcacbon cao ảnh hưởng đến kết quả tách chiết ADN tổng số. Vì vậy, cần phải tiến hành cải tiến một số bước trong quy trình tách chiết ADN tổng số được trình bày ở phần phương pháp. Kết quả tách chiết ADN được thể hiện trên hình 3.1. Hình 3.1. ADN tổng số 15 mẫu Song mật điện di trên gel agarose 1%. Trên ảnh điện di, băng ADN tổng số ở 15 mẫu Song mật thu được đều gọn, tập trung, không dính giếng cũng như không xuất hiện vệt sáng phía sau kéo dài. Điều đó cho thấy ADN ở các mẫu Song mật sau khi tách chiết có độ nguyên vẹn cao, không lẫn protein, ARN (Axit ribonucleic). Tiếp theo ADN tách chiết được xác định nồng độ và độ tinh sạch trên máy quang phổ hấp phụ ở 2 bước sóng: OD260nm và OD280nm; tỷ lệ OD260nm/OD280nm có giá trị 1,8 – 2,0 được xem là sạch. Các mẫu có tỷ số nhỏ hơn 1,8 và lớn hơn 2,0 cho biết ADN tách chiết bị nhiễm tạp hoặc với protein hoặc với phenol. Bảng 3.1 cho thấy kết quả đo tỷ số hấp phụ OD260nm/OD280nm ở các mẫu ADN Song mật tách chiết nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 và từ kết quả đo OD260nm ta tính được nồng độ ADN trong các mẫu. 27 Bảng 3.1. Độ hấp thụ bước sóng 260nm, 280nm và nồng độ ADN tổng số Độ hấp phụ Mẫu đo OD260 OD280 OD260/OD280 Nồng độ ADN µg/ml S1 0,0110 0,0059 1,88 27,5 S2 0,0120 0,0049 1,84 30,0 S3 0,0090 0,0044 1,92 22,5 S4 0,0092 0,0051 1,88 23,0 S5 0,0106 0,0053 1,94 26,5 S6 0,0103 0,0052 2,02 25,8 S7 0,0110 0,0046 1,79 27,5 S8 0,0102 0,0046 1,86 25,5 S9 0,0098 0,0047 1,94 24,5 S10 0,0084 0,0044 1,91 21,0 S11 0,0087 0,0046 1,90 21,8 S12 0,0091 0,0046 1,97 22,8 S13 0,0093 0,0050 1,88 23,3 S14 0,0106 0,0055 1,92 26,5 S15 0,0098 0,0054 1,81 24,5 Từ kết quả điện di và số liệu đo quang phổ hấp thụ của ADN cho thấy ADN tổng số tách chiết được có độ tinh sạch và nguyên vẹn cao, hoàn toàn đáp ứng cho phản ứng PCR – RAPD tiếp theo. Từ nồng độ ADN tính theo công thức ta sẽ pha loãng ADN để sử dụng cho phản ứng PCR – RAPD với nồng độ sau pha loãng là 25(ng/ml). 28 3.2. Kết quả nhân PCR – RAPD ADN tổng số của các mẫu Song mật thu được sau khi tách chiết dùng làm khuôn cho các phản ứng PCR với 20 đoạn mồi RAPD có tên và trình tự tại bảng 2.2. Phản ứng PCR – RAPD được tiến hành gồm các thành phần: ADN khuôn, mồi đơn, Taq polymerase, 4 loại deoxynucleotit triphotphat (dNTPs) và dung dịch đệm, muối MgCl2. Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR được tiến hành trên khuôn là các ADN của các mẫu Song mật thu được ở trên với 20 mồi RAPD để tiến hành phân tích sự biến đổi di truyền của các dòng Song mật. Sau khi hoàn thành phản ứng PCR sản phNm được điện di trên gel agarose 1,2% để phân tích đa hình ADN của các mẫu nghiên cứu. Các phân đoạn RAPD thu được được phân tích dựa trên sự có mặt hay không có mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu. Nếu có thì ký hiệu 1 còn không thì có ký hiệu là 0. Những phân đoạn mà có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu khác gọi là phân đoạn đa hình. Dựa vào mức độ đa hình của các phân đoạn này chúng ta có thể đánh giá mức độ khác nhau và giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Kết quả của phản ứng PCR – RAPD quan sát được sau khi nhuộm bản gel bằng EtBr và soi dưới tia UV. Bằng phần mềm quan sát và chụp ảnh kết quả để thuận tiên hơn trong việc phân tích số liệu. Với 15 mẫu phân tích và 20 đoạn mồi RAPD ta có 300 phản ứng, trong đó có 3 đoạn mồi không xuất hiện phân đoạn ADN nào khi soi bản gel (PC04; PC07; PC15). Các phân đoạn ADN được nhân lên là những băng vạch sáng màu xuất hiện trên bản gel hình 3.2. 29 Hình 3.2. Sản ph-m PCR – RAPD với mồi PC 09; M: Marker 1Kb; S1 – S15: các mẫu Song mật (theo Bảng 2.1). Kết quả của phản ứng PCR – RAPD với mồi PC09 cho kết quả rất tốt, các băng vạch rõ nét mặc dù lượng ADN được nhân lên là không nhiều. Sản phNm ADN nhân lên với mồi PC09 cho kích thước nhỏ, tập trung khoảng 0,4 – 1,4kb. Tại vị trí marker 1,4 kb chỉ có 6 mẫu S1, S2, S3, S4, S5 và S6 xuất xứ từ Hòa Bình có sự xuất hiện các phân đoạn ADN; các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn ADN ở vị trí này, đây là phân đoạn đa hình đầu tiên của mồi PC09 (theo thứ tự từ trên xuống). Theo quy ước băng vạch sáng (xuất hiện) sau khi điện di ở mẫu này mà không xuất hiện ở mẫu khác thì băng vạch đó là được xem là băng đa hình và chỉ vị trí nào xuất hiện băng vạch mới được kí hiệu là 1, còn không xuất hiện băng vạch kí hiệu là 0 (mã hóa số liệu theo bảng nhị phân). Sau khi nhận được kết quả là hình ảnh điện di sản phNm PCR – RAPD của mồi PC09, tiến hành mã hóa kết quả trước khi đưa vào phân tích số liệu bằng việc so hàng 2,0 kb
1,6 kb
1,0 kb
0,5 kb
30 ngang, mẫu nào có băng vạch thì đánh số 1 và mẫu nào không có băng vạch đánh số 0. Tiến hành làm cho đến vạch cuối cùng của bản gel. Mồi PC09 có tổng cộng 7 phân đoạn ADN xuất hiện với các kích thước khác nhau, trong đó có xuất hiện 1 phân đoạn là đơn hình tại vị trí marker 0,6 kb; còn lại 6 phân đoạn là đa hình chiếm 85,7% tổng số phân đoạn ADN. Sử dụng đoạn mồi PC09 phân tích với 15 mẫu Song mật cho tổng số băng ADN xuất hiện là 61 với 46 băng đa hình còn lại 15 băng đơn hình. Vậy số băng đa hình chiếm 75,4% tổng số băng xuất hiện. Với những phân tích trên ta có: Bảng 3.2. Bảng số liệu mã hóa các băng vạch ADN của mồi PC 09 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 3 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 4 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 7 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 Phân tích tương tự đối với sản phNm PCR – RAPD của các mồi PC14, PC16, PC20 (hình 3.3; 3.4; 3.5) và 16 mồi còn lại. Trong 20 đoạn mồi phân tích, kết quả 3 đoạn mồi: PC04, PC07, PC15 không xuất hiện một băng ADN nào. Điều này cho thấy mồi PC04, PC07, PC15 không phù hợp để phân tích đối với Song mật. 31 Hình 3.3. Sản ph-m PCR – RAPD với mồi PC 14; M: Marker 1Kb; S1 – S15: các mẫu Song mật (theo Bảng 2.1). Hình 3.4. Sản ph-m PCR – RAPD với mồi PC 16; M: Marker 1Kb; S1 – S15: các mẫu Song mật (theo Bảng 2.1). 2,0 kb
1,6 kb
1,0 kb
0,5 kb
2,0 kb
1,6 kb
1,0 kb
0,5 kb
32 Hình 3.5. Sản ph-m PCR – RAPD với mồi PC 20; M: Marker 1Kb; S1 – S15: các mẫu Song mật (theo Bảng 2.1). Phân tích kết quả của các mồi PC14; PC16; PC20 cho thấy kích thước của các băng ADN tập trung trong khoảng 0,5 – 1,6kb; ở mồi PC14 và PC20 rất dễ gây nhầm lẫn cho công đoạn mã hóa số liệu vì các băng ADN sau khi điện di có vị trí rất gần nhau. Ở PC14, PC16 các mẫu S2, S3, S4, S5 có xuất xứ Hòa Bình cho tính tương đồng di truyền cao vì các băng vạch xuất hiện tương đối đồng đều, riêng có S1 ở mồi PC16 cho số băng vạch rất ít. Với các xuất xứ khác tính tương đồng di truyền cũng khá cao, đặc biệt ở mồi PC16 và PC20 của S13, S14, S15 tương ứng với xuất xứ Hà Giang 3; Bắc Giang 1; Bắc Giang 2, các băng vạch xuất hiện với tỷ lệ tương đồng lên đến 95%. Số phân đoạn đa hình của PC14 là 11 trên tổng số 12 phân đoạn ADN xuất hiện chiếm tỷ lệ đa hình của mồi lên đến 91,6%, với tổng số băng là 76 trong đó số băng đa hình là 61 chiếm 80,3%. Với PC16 thì tỷ lệ đa hình chiếm 90% với tổng số phân đoạn ADN xuất hiện là 10, mồi PC16 có số băng ADN đa hình là 99 băng. Độ tương đồng của mẫu S2; S3; S4; S5; S13; S14; S15 tương ứng với các xuất xứ Hòa Bình (2; 2’; 3; 4), Bắc Giang (1; 2), Hà 2,0 kb
1,6 kb
1,0 kb
0,5 kb
33 Giang 3 ở mồi PC16 này lên đến 100%. Từ phân tích này có thể đưa ra một kết luận sớm là các mẫu vừa nêu có tính đa dạng di truyền rất thấp. Ngoài ra, các mồi PC03; PC12 có cho xuất hiện các băng vạch nhưng không mang lại kết quả đa hình như mong đợi. Từ những kết quả thu được sau khi điện di sản phNm PCR – RAPD, số liệu tổng hợp được trình bày ở bảng 3.3; 3.4 dùng làm cơ sở để phân tích tính đa dạng di truyền của 15 mẫu Song mật thu thập từ 4 tỉnh phía Bắc. Bảng 3.3. Số phân đoạn ADN xuất hiện và số phân đoạn ADN đa hình với mỗi mồi Mồi Tổng số phân đoạn ADN Số phân đoạn ADN đa hình Tỷ lệ %phân đoạn ADN đa hình PC01 5 3 60,00 PC02 3 1 33,33 PC03 2 0 0,00 PC05 10 6 60,00 PC06 7 5 71,43 PC08 4 2 50,00 PC09 7 6 85,71 PC10 4 4 100,00 PC11 5 4 80,00 PC12 1 0 0,00 PC13 2 1 50,00 PC14 12 11 91,67 PC16 10 9 90,00 PC17 5 4 80,00 PC18 7 5 71,43 PC19 5 3 60,00 PC20 9 9 100,00 Tổng 98 73 Trung bình 5,7 4,3 63,74 34 Bả n g 3. 4. Tổ n g số bă n g A D N n hâ n đ ư ợc kh i p hâ n tíc h v ới 17 đ o ạn m ồi n gẫ u n hi ên M ẫu M ồi S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S1 0 S1 1 S1 2 S1 3 S1 4 S1 5 Tổ n g số PC 01 5 4 4 4 4 4 4 2 4 4 4 4 4 4 4 59 PC 02 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 3 3 3 43 PC 03 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 30 PC 05 7 7 7 6 7 10 4 9 9 9 4 4 6 4 4 97 PC 06 5 5 5 2 5 6 5 7 6 6 6 6 5 6 6 81 PC 08 4 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 45 PC 09 5 5 4 3 5 4 2 6 5 3 5 2 4 4 4 61 PC 10 4 3 3 2 2 1 1 4 2 2 3 1 2 2 2 34 PC 11 3 4 4 2 5 2 2 4 2 1 1 1 3 3 3 40 PC 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 PC 13 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 20 PC 14 8 8 7 6 6 8 1 6 3 7 4 1 4 4 3 76 PC 16 4 10 10 10 10 4 6 5 6 5 7 7 10 10 10 11 4 PC 17 4 5 5 1 4 4 1 4 5 5 4 1 4 4 2 53 PC 18 4 2 3 2 4 5 2 5 2 4 2 2 7 7 2 53 PC 19 3 3 3 5 5 5 2 3 4 5 5 5 5 3 3 59 PC 20 3 5 5 3 4 3 3 4 4 4 3 3 8 6 6 64 Tổ n g số 66 72 71 57 72 67 43