Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất rượu nếp trắng

a tinh bột trong nước gồm các giai đoạn sau: Hình 2.1: Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái ban đầu có mức độ hydrat hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt độ hồ hóa. Các hạt tinh bột có kích thước và nguồn gốc khác nhau cũng có nhiệt độ hồ hóa khác nhau. Các hạt nhỏ có cấu tạo chặt, liên kết hydro kiểu 1 rất bền nên nhiệt độ hồ hóa các hạt nhỏ lớn hơn các hạt lớn, vì thế nhiệt độ hồ hóa tinh bột (là hỗn hợp các hạt có kích thước khác nhau) thường không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ. Trong quá trình hồ hóa, độ nhớt tinh bột tăng dần đến điểm cực đại rồi giảm xuống (Hoàng Kim Anh, 2007). 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột Nhiệt độ hồ hóa phụ thuộc vào thành phần amylose và amylopectin. Các ion kim loại liên kết với tinh bột cũng ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro bên trong phân tử tinh bột. Các chuỗi trong mạch tinh bột chứa các ion tích điện trái dấu sẽ đẩy nhau làm lỏng lẻo cấu trúc tinh bột dẫn đến thay đổi nhiệt độ hồ hóa. Các muối vô cơ ở nồng độ thấp phá hủy các liên kết hydro nên làm tăng khả năng hòa tan của tinh bột, tuy nhiên ở nồng độ cao nó gây hiện tượng kết tủa tinh bột và giảm sự hydrat hóa. Các chất không điện ly như đường, rượu cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa và làm cho nhiệt độ hồ hóa tăng lên (Hoàng Kim Anh, 2007). 2.2 ENZYME AMYLASE Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy. Amylase đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp năm 1894, nó có nguồn gốc từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh về tiêu hóa. Ngày nay các amylase vi sinh vật đã thay thế thành công acid trong công nghiệp thủy phân tinh bột. Amylase cũng được sử dụng rộng rãi để đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu bia. Các amylase có độ tinh sạch cao và những tính chất phù Hạt tinh bột Hấp thụ nước qua vỏ Ngưng tụ nước lỏng Hydrat hóa và trương nở Phá vỡ vỏ hạt đứt liên kết các phân tử Phân tán Dung dịch Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 6 hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa chất tinh khiết. α-amylase, β-amylase, glucoamylase là những enzyme biến tính tinh bột quan trọng nhất. α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1) là loại enzyme ngoại bào thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucoside của phân tử amylose một cách ngẫu nhiên. Đó cũng là những endo-enzyme phân cắt bên trong mạch tinh bột với sản phẩm chính tạo thành là các dextrin. β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2) là một exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose. Do enzyme này không thủy phân được liên kết α-1,6 glucoside ở amylopectin nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 ÷ 60% maltose và dextrin giới hạn. Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase EC 3.2.1.3) là enzyme thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra đường glucose. Enzyme thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin, glycogen và những polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isoamylase thường được sử dụng kết hợp với β-amylase trong sản xuất siro hay đường glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân. Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase. 2.2.1 - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)  Đặc tính α-amylase từ động vật và vi sinh vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị I như Cl- > Br- > I-, α-amylase từ thực vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị II như Ca2+. α- amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+. Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu enzyme α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó bị mất hoàn toàn khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. α-amylase bền nhiệt hơn các amylase khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 7 Bảng 2.2: Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn khác nhau STT Enzyme Nguồn Khoảng pH tốithích Khoảng nhiệt độ tối thích (0C) 1 α-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis 4,5 - 9(6,5 - 7,5) 70 - 85 (95) 2 α-amylase vi khuẩnchịu nhiệt Bac. licheniformic 5,8 - 8 (7,0) 90 - 105 (120) Aspergillus oryzae 4,0 - 7,0 55 - 60 3 α-amylase nấm sợi Aspergillus niger 5,0 - 6,0 80 Dịch malt 3,5 - 6,5 70 4 α-amylase malt Bột malt 4,5 - 7,0 85 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) α-amylase có nguồn gốc khác nhau có thành aicd amin khác nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, khá giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và acid aspartic. Tâm hoạt động chứa các nhóm -COOH, -NH2. α- amylase là một metaloenzyme, trong phân tử đều chứa từ 1 ÷ 30 nguyên tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1 ÷ 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2,3 của enzyme. Ngoài duy trì cấu hình hoạt động của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Cơ chế tác dụng α-amylase có khả năng phân cắt liên kết -1,4 glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó α-amylase được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme) Quá trình thủy phân này trải qua nhiều giai đoạn:  Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thủy phân nhanh tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.  Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-, trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 8 chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide. Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm malttotetrose, matotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên sản phẩm cuối cùng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrin phân tử thấp và các izomaltose 8% (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Dưới tác dụng của α-amylase, dung dịch hồ tinh bột sẽ bị làm loãng nhanh chóng và các dextrin sẽ được tạo thành cho phản ứng màu với iodine hay cho màu đỏ nâu. Do đó có thể xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột hoặc xác định lượng tinh bột đã bị phân giải dựa vào phản ứng màu với iodine hoặc bằng cách xác định đường khử tạo thành (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)  Đặc tính Enzyme β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc -SH, - COOH, cùng với vòng amidazol, của các gốc histidine. Enzyme β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định. Enzyme β-amylase không bền khi có Ca2+, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như Cu2+, Hg2+, acetanic, iod, ozon. β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 700C. Nhiệt độ tối thích là 550C Hình 2.2 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 9 và pH tối thích là 5,1-5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).  Cơ chế tác dụng Enzyme β-amylase thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside trong tinh bột, glycogen, polysacharid đồng loại. Phân cắt tuần tự gốc maltose ở đầu không khử, maltose có cấu hình β được tạo thành, β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exoenzyme). Enzyme β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có 20 ÷ 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo thành 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4 glycoside gắn với α-1,6 glycoside, β- amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Các dextrin này có chứa liên kết α-1,6 glycoside bắt màu đỏ tím với iod. Tinh bột Maltose (54 ÷ 58%) + Dextrin (42 ÷ 46%) (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.2.3  - amylase ( - 1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)  Đặc tính   - amylase còn có tên gọi là glucoamylase.   - amylase có chủ yếu trong nấm mốc và một số loài vi khuẩn, -amylase bền với acid hơn β-amylase.   - amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+.   - amylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết-1,4 glucoside và-1,6 glucoside.  Cơ chế tác dụng Glucoamylase phân hủy tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo thành glucose mà không cần có một enzyme amylase nào khác. Nó có tác dụng thủy phân tinh bột, glucogen, polysaccharide đồng loạt ở các mối nối liên kết -1,4 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men được và do đó nâng cao hiệu suất nấu rượu từ tinh bột (Nguyễn Đức Lượng, 2004). β - amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 10 Bảng 2.3: Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase được trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau. Nguồn enzyme Khoảng pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu (0C) Aspergillus 3,0 – 6,0(4,5 – 5,0) 55 – 60 90 A. awamori 2,0 – 7,0(3,0 – 5,0) 55 – 65 85 Rhizopus 3,0 - 6,0(3,5 – 5,5) 55 – 60 70 - 80 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hình 2.3: Cơ chế tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột 2.2.4 Oligo-1,6- glucosidase Enzyme oligo-1,6-glucosidase thủy phân liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose và các dextrin thành đường có thể lên men được. Enzyme có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm. Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase và dextrin- 1,6-glucosidase. Amylose Amylopectin Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 11 2.2.5 Pullulanase Enzyme pullulanase thủy phân các liên kết α-1,6-glycoside trong tinh bột và glycogen. Phân tử lượng của nó là 145000. Enzyme này có khả năng thủy phân những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α- 1,6-glycoside. 2.2.6 Transglucosidase Enzyme transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase. Nó có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó thường gây sự nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltosetriose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kết α-1,6-glucoside để tạo thành panose và izomaltose. Cơ chế phân cắt tinh bột của amylase được minh họa trong hình sau: Hình 2.4: Tổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylase 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME 2.3.1 Nồng độ cơ chất Phản ứng khi có enzyme xảy ra 3 giai đoạn: Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 12  Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.  Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.  Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo. Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được. 2.3.2 Nồng độ enzyme Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme. Tốc độ phản ứng V = k [E] Trong đó: V: tốc độ phản ứng [E]: nồng độ enzyme Cũng có trường hợp khi nồng dộ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004). Hình 2.6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng enzyme Nồng độ cơ chất0 Km Tốc độ phản ứng max2 1 V Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 13 Thời gian phản ứng của enzyme amylase sẽ giảm nếu như tăng nồng độ enzyme amylase theo thời gian. 2.3.3 Nhiệt độ Bản chất của enzyme là protein. Do đó, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng. Tốc độ phản ứng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc. Tại khoảng nhiệt độ mà enzyme có thể tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1,4 ÷ 2 lần khi nhiệt độ tăng 100C (Nguyễn Thị Thu Thủy). Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng. Qua đồ thị trên ta thấy nhiệt độ tăng cao thì thời gian phản ứng càng rút ngắn. Tuy nhiên, ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dần protein của enzyme với nhiệt độ, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạt động nữa do khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất Nồng độ enzyme0 Tốc độ phản ứng Hình 2.7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Hình 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến thời gian phản ứng Nhiệt độ (0C)0 Tốc độ phản ứng Hình 2.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme Hình 2.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 14 nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ mất dần và dẫn đến triệt tiêu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 2.3.4 pH môi trường Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. Trong những thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng: nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại. Giá trị pH mà ở đó vận tốc enzyme đạt cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động enzyme. Vượt quá giới hạn pH này hoạt động enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Đối với enzyme amylase, pH hoạt động tối thích tùy thuộc vào nguồn gốc sản xuất enzyme. Ở đây thời gian thủy phân của nó thấp nhất. 2.3.5 Các chất kìm hãm Hoạt tính của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm. Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm một số chất như những ion kim loại Mg2+… các chất vô cơ, hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào. Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Phản ứng enzyme [E] và chất kìm hãm [I] nhanh chóng đạt đến cân bằng: Trong đó: K1, K2: hằng số tốc độ phản ứng Tốc độ phản ứng pH0 Hình 2.11: Ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ phản ứng Hình 2.12: Ảnh hưởng của pH đến thời gian thủy phân của enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 15  Các chất kìm hãm cạnh tranh Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó chúng có khả năng kết hợp với enzyme ở trung tâm hoạt động của enzyme. Chúng choán vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động của enzyme, kết quả là enzyme không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức ES (Nguyễn Đức Lượng, 2002).  Các chất kìm hãm không cạnh tranh Khác với kiểu cạnh tranh trên, kiểu cạnh tranh này là chất kìm hãm sẽ kết hợp với enzyme ở vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme . Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: E + S ES E + P E + I EI ES + I EIS EI + S  EIS (Nguyễn Đức Lượng, 2002)  Kìm hãm do thừa cơ chất Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + S ES  E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004) 2.3.6 Các chất hoạt hóa Chất hoạt hóa là các chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành E + I K1 K2 E I Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 16 hoạt động, từ hoạt động yếu trở nên hoạt động mạnh. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học khác nhau, chúng có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển hóa nhóm, chuyển gốc hóa học. - Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm chất hoạt động của trung tâm hoạt động enzyme. - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptide, tạo điều kiện cho nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động. - Ngoài ra một số kim loại có bán kính 0,34 ÷ 1,65A0 (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa các ion có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa các enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme . - Các chất hoạt hóa này chỉ có tác dụng tốt ở một nồng độ nhất định, vượt qua nồng độ này chúng sẽ ức chế hoạt động của enzyme (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004). 2.4 PHƯƠNG TRÌNH ĐỘNG HỌC – PHƯƠNG TRÌNH MICHALIS- MENTEN Sơ đồ phản ứng enzyme hai giai đoạn theo cơ chế Michalis - Menten có thể viết như sau: Trong đó: k1: hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES. k2: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại chất ban đầu và enzyme. k3: hằng số vận tốc phản ứng phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P. Vận tốc phản ứng tỷ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ phức hợp ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn. Từ phương trình (1) ta có thể thiết lập các phương trình vận tốc phản ứng như sau: - Vận tốc phản ứng tạo thành phức hợp ES là: k1[E] [S] = k1([E0] – [ES]) [S] (2) E S+ k2 k1 ES +E Pk3 (1) Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 17 Với: [E0]: nồng độ enzyme ban đầu [ES]: nồng độ phức trung gian enzyme - cơ chất [E]: nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt đến cân bằng Do đó: [E] = [E0] – [ES] Nồng độ cơ chất ban đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phản ứng đạt đến cân bằng vì nồng độ cơ chất trong phản ứng luôn lớn hơn nhiều lần nồng độ enzyme, do đó có thể bỏ qua lượng [S] ở trong phức chất ES; khi nghiên cứu động học phản ứng enzyme thường xác định vận tốc ban đầu, lượng cơ chất bị chuyển hóa chưa đáng kể so với nồng độ ban đầu của nó. - Vận tốc phân ly phức hợp ES là tổng vận tốc của hai phản ứng.  Phản ứng phân ly phức hợp ES để tạo E và S (ngược lại với phản ứng kết hợp)  Phản ứng biến đổi phức hợp ES thành sản phẩm phản ứng P và giải phóng enzyme ở dạng ban đầu E. Do đó vận tốc phân ly phức hợp ES bằng: k2 [ES] + k3[ES] = (k2 + k3) [ES] (3) Khi hệ thống phản ứng đạt tới cân bằng, vận tốc tạo thành ES bằng vận tốc phân ly ES: k1 ([E0] – [ES]) [S] = (k1+k2) [ES] (4) Để đơn giản dùng hằng số: 1 32 k kkKm  Từ (4) ta suy ra:       SK SEES m   0 (5) Như trên chúng ta có nói, ES càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, thì tất cả các phân tử enzyme có trong phản ứng đều tham gia trong phức ES, vận tốc phản ứng sẽ đạt đến cực đại (Vmax). Do đó ta có thể lập tỷ lệ sau:    0max E ES V V  (6) Từ (5) ta có: Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 18        SK S E ES m   0 Thay vào phương trình (6) ta sẽ có:    SK S V V m   max    SK SVV m   max (7) Đây là phương trình Michaelis – Menten đã được Hoiden và Briggx hoàn thiện. Km được gọi là hằng số Michaelis và đặc trưng cho mỗi enzyme - Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất. Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng enzyme càng lớn (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006). Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 19 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 02/02/2009 đến 03/05/2009 Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ. 3.1.2 Nguyên liệu Nếp trắng được mua ở chợ Xuân Khánh - Thành Phố Cần Thơ, chọn loại không lẫn các loại nếp khác, có mùi thơm đặc trưng. Enzyme α-amylase ở dạng thương mại được mua ở cửa hàng hóa chất - Thành phố Cần Thơ. 3.1.3 Hóa chất  Dung dịch acid acetic 0,2M  Dung dịch natri acetate 0,2M  NaOH 0,1N, HCl  Pb(CH3COO)2 30%, Na2SO4 bão hòa  Fehling A, fehling B, metyl xanh  KI, iod khan  Acid citric dùng để chỉnh pH  Tinh bột tinh khiết 3.1.4 Dụng cụ  Máy nghiền  Cân kỹ thuật  Buret, pipet, micropipette, bình tam giác  Nồi ủ nhiệt  pH kế  Bếp điện  Các dụng cụ cần thiết khác của phòng thí nghiệm: nhiệt kế, ống đong… 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân tích hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 20 Xác định Vmax, Km theo phương pháp Lineweaver – Burk. Các số liệu được xử lý bằng chương trình thống kê StatGraphics – Plus 4.0 và sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị. 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng.  Mục đích Xác định được điều kiện tối ưu về pH và nhiệt độ cho quá trình thủy phân của α- amylase trên nguyên liệu nếp trắng.  Chuẩn bị mẫu - Nguyên liệu nếp trắng đã được nghiền nhỏ. - Enzyme α-amylase  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố là nhiệt độ và pH với 2 lần lặp lại. Nhân tố A: pH được khảo sát ở 5 mức độ, từ 5,5 đến 7,5. A1: 5,5 A3: 6,5 A5: 7,5 A2: 6,0 A4: 7,0 Nhân tố B: nhân tố nhiệt độ (0C), khảo sát ở 3 mức độ, từ 800C đến 900C. B1: 80 B2: 85 B3: 90 Tổng số nghiệm thức:5 x 3 = 15 nghiệm thức. Tổng số mẫu thí nghiệm: 15 x 2 = 30 mẫu. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: A1 A2 A3 A4 A5 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 21 B1 A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1 B2 A1B2 A2B2 A3B2 A4B2 A5B2 B3 A1B3 A2B3 A3B3 A4B3 A5B3  Tiến hành thí nghiệm Sơ đồ tiến hành thí nghiệm  Chỉ tiêu theo dõi: xác định lượng đường khử tạo thành. 3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quátrình thủy phân nguyên liệu nếp trắng.  Mục đích Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (nếp trắng) lên hoạt tính của enzyme α- amylase thông qua hằng số Km.  Chuẩn bị mẫu - Nếp trắng nghiền nhỏ - Enzyme α-amylase  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố. Mẫu nếp trắng xay nhỏ Bổ sung nước (1 nếp : 4 nước) Chỉnh pH theo các mức pH khác nhau Nâng nhiệt đến nhiệt độ cần khảo sát rồi bổ sung 0,3% enzyme α-amylase vào dung dịch Giữ mẫu 15 phút Chuẩn đường khử Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 22 Nhân tố C: Nồng độ tinh bột nếp (%) C1: 5 C3: 15 C5: 25 C7: 35 C2: 10 C4: 20 C6: 30 Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 mẫu.  Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:  Chỉ tiêu theo dõi: Xác định lượng đường khử tạo thành CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH ENZYME α- AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG Tài liệu tham khảo cho thấy, khả năng hoạt động xúc tác phản ứng của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào pH và nhiệt độ. Mỗi enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất của Mẫu nếp trắng xay nhỏ Bổ sung nước theo tỷ lệ đã bố trí Chỉnh pH 6,5 Nâng nhiệt đến 850C rồi bổ sung 0,5% enzyme α-amylase vào dung dịch Giữ mẫu 30 phút Chuẩn đường khử Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 23 nó ở một giá trị pH nhất định và ở một nhiệt độ nhất định.. Chính vì vậy, thí nghiệm này được thực hiện với mục đích là tìm ra pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α- amylase hoạt động thủy phân tinh bột nếp trắng. Trong thí nghiệm này, enzyme α-amylase được sử dụng với nồng độ là 0,3% và thời gian thủy phân là 15 phút. Dung dịch sau khi thủy phân đem phân tích hàm lượng đường khử. Thí nghiệm đươc tiến hành với hai nhân tố và hai lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 4.1 và hình 4.1. Bảng 4.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α- amylase đối với nguyên liệu nếp trắng pH Nhiệt độ (0C) 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Trung bình 80 4,186 4,719 4,815 4,412 4,028 4,431b 85 4,334 5,015 5,058 4,486 4,125 4,604a 90 4,063 4,530 4,678 4,283 3,950 4,283c Trung bình 4,194c 4,754a 4,850a 4,363b 4,034d Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một cột thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5 %. Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5 %. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 24 Hình 4.1: Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α- amylase đối với nguyên liệu nếp trắng. Việc thay đổi pH và nhiệt độ phản ứng có ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase. Trong những thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng: nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại. Giá trị pH mà ở đó vận tốc enzyme đạt cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động enzyme. Vượt quá giới hạn pH này hoạt động enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Khi thay đổi pH của dịch nếp từ 5,5 đến 7,5 để khảo sát hoạt tính của enzyme α- amylase trên nguyên liệu nếp trắng thì ở bất kỳ nhiệt độ khảo sát nào, hoạt tính của enzyme α-amylase cũng thay đổi theo. Kết quả thống kê ở bảng 4.1 và đồ thị hình 4.1 cho thấy pH tối thích cho enzyme α- amylase hoạt động trên nguyên liệu nếp trắng nằm trong khoảng 6,0 ÷ 6,5. Xét về mặt thống kê ở các mức pH khác nhau từ 5,5 đến 7,5 thì hàm lượng đường khử sinh ra đều khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5% chỉ có pH 6,0 và 6,5 thì hàm lượng đường khử sinh ra không khác biệt ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%, nhưng ở pH 6,5 hàm lượng đường khử sinh ra cao hơn ở pH 6,0 nên chọn pH tối ưu cho enzyme α- amylase hoạt động thủy phân tinh bột nếp trắng là 6,5. Ở pH cao hơn hoặc thấp hơn pH tối ưu, hàm lượng đường sinh ra đều giảm. Do đó, có thể nói rằng pH có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme. Khi thay đổi pH môi trường sẽ làm thay đổi khả năng ion hóa của enzyme và cơ chất do đó sẽ 3.5 4 4.5 5 5.5 5.5 6 6.5 7 7.5 pH Hà m lượ ng đư ờn g ( %) 80 85 90 8 0C 8 0C 9 0C Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 25 làm ảnh hưởng đến khả năng tạo phức hợp ES làm giảm vận tốc phản ứng enzyme. Vì thế phải chọn pH tối ưu cho enzyme hoạt động để đạt được hiệu quả cao nhất. Bên cạnh ảnh hưởng của pH thì nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme α-amylase. Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), trong các phản ứng sinh học, khi nhiệt độ tăng thì khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Nhưng tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định. Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh. Kết quả thống kê ở bảng 4.1 và đồ thị hình 4.1 cho thấy hàm lượng đường khử sinh ra sẽ tăng khi tăng nhiệt độ đến 850C và sẽ giảm nếu tiếp tục tăng nhiệt độ đến 900C (có sự khác biệt ý nghĩa ở 3 mức nhiệt độ 80; 85 và 900C). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết. Vì bản chất của protein thường không bền nhiệt. Khi tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệt tiêu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Do đó, ở nhiệt độ 850C thì hàm lượng đường khử sinh ra là nhiều nhất nên chọn nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động thủy phân nguyên liệu nếp trắng là 850C. Điều này cũng phù hợp với đặc tính của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis là chịu được nhiệt độ cao. Kết quả thí nghiệm của các đề tài khảo sát pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme hoạt động thủy phân trên các nguyên liệu tinh bột tinh khiết, nếp trắng, nếp than và gạo nhìn chung thì không khác nhau. Kết quả khảo sát pH và nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase thủy phân tinh bột nếp than (Vy - luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009), tinh bột gạo (Lê Trung Hiếu - luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009), và tinh bột tinh khiết (đề tài đã khảo sát trong thí nghiệm thăm dò) đều là 6,5 và 850C. Không có sự khác biệt trong việc thủy phân của enzyme α-amylase đối với các nguyên liệu khác nhau là do trong những nguyên liệu này không có thành phần nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme. Do đó, các nguyên liệu này không làm ảnh hưởng đến pH và nhiệt độ hoạt động mạnh nhất của enzyme α-amylase.Vì thế, pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase hoạt động trên các nguyên liệu tinh bột tinh khiết, gạo, nếp trắng, nếp than đều giống nhau. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 26 4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYMEα-AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ đã bố trí ở phần bố trí thí nghiệm với mục tiêu là xác định độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme α-amylase, từ đó so sánh độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme α-amylase trên nguyên liệu nếp trắng với các loại nguyên liệu khác như nếp than (Nguyễn Thị Giang Thanh - Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008), gạo (Lê Tung Hiếu – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009) và tinh bột tinh khiết (đề tài đã khảo sát). Trong thí ngiệm này, nồng độ enzyme được sử dụng là 0,5% và thời gian thủy phân là 30 phút thu được kết quả như sau: Bảng 4.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nếp trắng lên hoạt tính enzyme α- amylase. Nếp trắng (%) 5 10 15 20 25 30 35 Đường khử (%) 1,320 2,430 3,360 4,167 4,536 4,636 4,795 )30/(%][ ][*max phútSK SVV m   1,674 2,730 3,457 3,988 4,392 4,711 4,969 Hình 4.2: Đồ thị Michaelis – Menten biễu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nếp trắng sử dụng đến hoạt tính của enzyme α-amylase. Kết quả ở bảng 4.2 và đồ thị hình 4.2 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ tinh bột từ 5% đến 20%. Khi tiếp tục tăng nồng độ tinh bột lên 25%, 30% và 35% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước. Điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độ tinh bột nếp (%) Hà m lượ ng đư ờn g k hử (% ) Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 27 với nồng độ cơ chất và đạt đến điểm cực đại nghĩa là toàn bộ enzyme kết hợp được với cơ chất. Khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lớn hơn nữa thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ không tăng đáng kể do nồng độ tinh bột quá cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch gây khó khăn cho hoạt động xúc tác của enzyme, cũng có thể do giai đoạn này các chất cạnh tranh kết hợp với enzyme nên hàm lượng đường sinh ra giảm. So sánh Vmax, Km của thí nghiệm này với Vmax, Km của enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp than (Nguyễn Thị Giang Thanh – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008) và gạo (Lê Trung Hiếu – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009). Các thông số động học Vmax, Km được xác định theo bằng cách vẽ đồ thị theo phương pháp Lineawever – Burk. Hình 4.3: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng và gạo xúc tác bởi enzyme α-amylase. (Nguồn số liệu gạo: Lê Trung Hiếu – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009 (phụ lục B.3)) Dựa vào phương trình hồi qui của đồ thị hình 4.3 theo từng nguyên liệu ta tính được các thông số: Nếp trắng: Vmax = 7,3926% trong thời gian 30 phút Km = 17,0755% Gạo: Vmax = 8,5815% trong thời gian 20 phút Km = 13,1391% y = 30.622x + 2.3306 R2 = 0.9979 y = 69.284x + 4.0586 R2 = 0.9453 -5 0 5 10 15 20 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 1/[S] 1/V Nếp trắng Gạo0586,4 1284,691  SV R2 = 0,9453 9979,0 3306,21622,301 2   R SV Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 28 So sánh hai hằng số Michaelis của enzyme α-amylase với nếp trắng và gạo ta thấy Km của enzyme α-amylase với nếp trắng (Km = 17,0755%) lớn hơn với gạo (Km=13,1391%). Điều này chứng tỏ ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn gạo. Có sự khác nhau này là do trong thành phần của tinh bột nếp trắng tỷ lệ amylopectin cao hơn gạo, mà enzyme α-amylase không phân cắt được liên kết α- 1,6-glycoside của mạch amylopectin nên kìm hãm vận tốc phản ứng của enzyme. Do đó, ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn đối với gạo. Hình 4.4: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng và nếp than xúc tác bởi enzyme α-amylase. (Nguồn số liệu nếp than: Nguyễn Thị Giang Thanh – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008 (phụ lục B.2)) Dựa vào phương trình hồi qui của đồ thị hình 4.4 theo từng nguyên liệu ta tính được các thông số: Nếp trắng: Vmax = 7,3926% trong thời gian 30 phút Km = 17,0755% Nếp than: Vmax = 9,4262% trong thời gian 30 phút Km = 20,7076% So sánh hai hằng số Michaelis của enzyme α-amylase với nếp trắng và nếp than ta thấy Km của enzyme α-amylase với nếp trắng (Km = 17,0755%) nhỏ hơn với nếp than (Km = 20,7076%). Điều này chứng tỏ độ nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng lớn hơn so với nếp than. Có sự khác nhau này là do trong thành phần của nếp y = 65.904x + 3.1826 R2 = 0.9896 y = 69.284x + 4.0586 R2 = 0.9453 -5 0 5 10 15 20 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 1/[S] 1/V Nếp trắng Nếp than0586,4 12,691  SV R2 = 0,9453 9896,0 1826,31904,651 2   R SV Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang29 than có hợp chất màu anthocyanine. Hợp chất anthocyanine là mono – hay diglucozit do gốc đường glucoza, galactoza hoặc ramnoza kết hợp với gốc aglucon có màu gọi là anthocyanine (Lê Ngọc Tú, 2004). Hợp chất này gây khó khăn cho enzyme α-amylase phân cắt tinh bột thành đường. Do đó, ái lực của enzyme α- amylase với tinh bột nếp trắng lớn hơn với nếp than. Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase được thể hiện ở hình 4.4. Hình 4.5: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase (số liệu được thể hiện ở phụ lục B.1). Từ phương trình hồi qui của đồ thị 4.5 ta tính được: Tinh bột tinh khiết: Vmax = 39,2157 (mg tinh bột tinh khiết bị thủy phân trong 10 phút) Km = 0,7824 % So sánh các kết quả trên ta thấy Km của enzyme α-amylase đối với tinh bột tinh khiết là rất nhỏ so với nếp trắng. Điều này chứng tỏ ái lực hay độ nhạy của enzyme α-amylase với tinh bột tinh khiết là rất lớn. Có sự khác biệt rất lớn giữa độ nhạy của enzyme α-amylase với tinh bột tinh khiết và nếp trắng là do trong tinh bột tinh khiết thành phần chủ yếu là amylose nên enzyme α-amylase dễ dàng kết hợp với cơ chất hơn nên độ nhạy lớn hơn. Như vậy, với tinh bột tinh khiết chỉ cần lượng cơ chất với nồng độ rất thấp thì tốc độ phản ứng của enzyme đã đạt cực đại, chứng tỏ độ nhạy của enzyme α-amylase với tinh bột tinh khiết là rất lớn. y = 0.1995x + 0.255 R2 = 0.9939 -2 -1 0 1 2 3 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 1/[S] 1/V Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang30 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua thời gian tiến hành thí nghiệm, đề tài có một số kết luận sau: Đối với nguyên liệu nếp trắng, nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase thể hiện hoạt tính cao nhất là 850C, giá trị pH cho enzyme α-amylase hoạt động mạnh nhất là 6,5. Trên các nguyên liệu khác nhau như nếp trắng, gạo, nếp than và tinh bột tinh khiết, giá trị pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzyme α-amylase không khác nhau do trong những nguyên liệu này không có thành phần nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme. Hằng số Km của enzyme α-amylase là 17,0755% và Vmax là 7,3926% trong 30 phút. Hợp chất màu anthocyanine trong nếp than làm cho ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng lớn hơn với nếp than. Tỷ lệ amylopectin trong nếp trắng nhiều hơn trong gạo làm cho độ nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn với gạo. Tinh bột tinh khiết rất nhạy đối với enzyme α-amylase nên Km của enzyme α- amylase trên nếp trắng (17,0755%) lớn hơn rất nhiều so với tinh bột tinh khiết (0,7824%). 5.2 ĐỀ NGHỊ Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên còn một số vần đề chưa giải quyết được, đề tài có một số đề nghị sau: Khảo sát nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân trên nguyên liệu nếp trắng. Khảo sát động học của enzyme glucoamylase để ứng dụng enzyme glucoamylase trong sản xuất rượu nếp trắng. Tối ưu hóa quá trình lên men rượu nếp trắng bằng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng. Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease để cải thiện mùi vị và độ trong của rượu nếp trắng. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Kim Anh (2007). Hóa học thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật. Lê Ngọc Tú và ctv (2004). Hóa sinh công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật. Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ vi sinh (tập 2) - Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng (2004). Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Thị Giang Thanh (2008). Ứng dụng chế phẩm enzyme cải tiến quy trình sản xuất rượu vang nếp than. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ ngành Công Nghệ Thực Phẩm. Nguyễn Thị Thu Thủy (2006). Bài giảng Sinh hóa. Đại học Cần Thơ. Trần Đình Toại - Nguyễn Thị Vân Hải (2005). Động học các quá trình xúc tác sinh học. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. Võ Văn Tuấn (2008). Ứng dụng enzyme α-amylase, glucose amylase và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công Nghệ Thực Phẩm. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang32 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH A.1: Phân tích hàm lượng đường khử trong thực phẩm  Nguyên tắc Trong môi trường kiềm các chất khử (glucose, fructose, maltose, …) dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng fehling. Kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch. Lượng Cu2O tường ứng với lượng đường khử. R-CHO + Cu(OH)2  R-COOH + Cu2O + H2O Căn cứ vào lượng đường khử đủ để tác dụng với 10 ml hỗn hợp fehling A và fehling B cho màu đỏ gạch bền vững, tra bảng tính hàm lượng đường cần phân tích.  Hóa chất sử dụng 1. NaOH 10%, 1N 2. Pb(CH3COO)2 30% 3. Na2SO4 bão hòa 4. Metyl xanh 1% trong nước 5. Fehling A: CuSO4 tinh thể 69,28 g thêm nước cất đến 1000 ml. 6. Fehling B: Kalinatritatrate 346g, NaOH 100 g thêm nước cất đến 1000 ml.  Tiến hành 1. Cân m g mẫu cho vào bình tam giác 100 ml. 2. Cho thêm vào bình 50 ml nước cất, dùng dung dịch NaOH với nồng độ giảm dần 10%, 1N để trung hòa dung dịch. 3. Đun sôi cách thủy 15 phút. Sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy. 4. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml. Kết tủa protein với 3 ml dung dịch chì acetate 30%. Loại bỏ acetate chì bằng 10-15 ml dung dịch Na2SO4 bão hòa. Thêm nước cất đến vạch định mức, lắc đều và lọc. 5. Định lượng đường khử trong dịch lọc theo phương pháp sau: Cho vào nình tam giác 100 ml hỗn hợp 5 ml fehling A + 5 ml fehling B, lắc đều, sau đó thêm 15 ml dịch lọc. Đun sôi trên bếp và quan sát màu của dung dịch: - Nếu thấy màu xanh của dung dịch fehling biến mất, nghĩa là đường dư, cần pha loãng dịch lọc và định phân lại. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 33 - Nếu màu xanh của dung dịch fehling chưa mất, thêm từ từ từng ml dung dịch đường vào bình tam giác, đun sôi và quan sát cho đến khi có kết tủa màu đỏ gạch, dung dịch không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ 1 giọt metyl xanh vào dung dịch đang sôi thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc thể tích và tra bảng tính ra hàm lượng đường.  Tính toán Bảng A.1:Bảng tra hàm lượng đường ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển 15 16 17 18 19 20 21 22 23 336 316 298 282 267 254,5 242,9 231,8 222,2 24 25 26 27 28 29 30 31 32 213,3 204,8 197,4 190,4 183,7 177,6 171,7 166,3 161,2 33 34 35 36 37 38 39 40 41 156,06 152,2 147,09 143,9 140,2 136,6 133,3 130,1 127,1 42 43 44 45 46 47 48 49 50 124,2 121,4 118,7 116,1 113,7 111,4 109,2 107,1 105,1 A.2: Xác định các thông số động học theo phương pháp Lineweaver – Burk Để xác định các thông số động học theo phương pháp Lineweaver – Burk lập đồ thị 1/V = f(1/[S]) (Hình A.2): maxmax 1 ][ 1.1 VSV K V m  (*) Hàm lượng đường khử (%) = Khối lượng mẫu * 1000 Số tra bảng * HSPL*100 1/[S] 1/V -1/Km 1/Vmax Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 34 Đồ thị V 1 = f(1/[S]) là đường thẳng có điểm cắt trên trục tung với tọa độ V 1 và điểm cắt trên trục hoành với tọa độ mK 1 . Cho V 1 = 0, từ công thức (*) suy ra hoành độ mKS 1 ][ 1  . PHỤ LỤC B: B.1 Thí nghiệm xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trên tinh bột tinh khiết. 1. Tiến hành thí nghiệm Cho vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch tinh bột và đặt vào máy ủ nhiệt ở 850C, giữ 10 phút. Thêm vào mỗi ống nghiệm 25μl dung dịch enzyme đã pha loãng với nồng độ 0,1%. Khuấy đều và giữ 10 phút. Lấy từ mỗi ống nghiệm 50μl hỗn hợp cho vào ống nghiệm chứa sẵn 5 ml dung dịch iod. Lắc đều. Mỗi mẫu ứng với mỗi nồng độ đều có mẫu đối chứng tiến hành giống như mẫu thí nghiệm nhưng thay dung dịch enzyme bằng nước cất cùng thể tích. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 656 nm. Dựa vào sự giảm cường độ màu của mẫu có sử dụng enzyme so với mẫu đối chứng không có enzyme xác định lượng tinh bột thủy phân, từ đó xác định vận tốc phản ứng thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase. Lượng tinh bột bị thủy phân (a) được tính theo công thức sau: bOD ODODa * 1 21  Trong đó: OD1: mật độ quang của mẫu đối chứng OD2: mật độ quang của mẫu phân tích b: lượng tinh bột phân tích (g) 2. Bảng kết quả thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 35 Bảng B.1: Kết quả thí nghiệm xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trên tinh bột tinh khiết. Nồng độ tinh bột (%) Lượng tinh bột bị thủy phân (mg) Nồng độ tinh bột (%) Lượng tinh bột bị thủy phân (mg) 0,1 8,737 0,8 40,099 0,2 16,286 0,9 43,061 0,3 22,957 1,0 43,307 0,4 28,842 1,1 44,373 0,5 32,384 1,2 43,776 0,6 36,000 1,3 43,398 0,7 37,331 1,4 43,033 B.2 Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát động học enzyme α-amylase trên nếp than (Nguyễn Thị Giang Thanh - luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008). Bảng B.2: Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme α-amylase trên nếp than Nếp than (%) 15 20 25 30 35 Đường khử (%) 3,96 4,57 5,19 5,75 5,76 B.3 Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát động học enzyme α-amylase trên gạo (Lê Trung Hiếu - luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009) Bảng B.3: Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme α-amylase trên gạo Gạo (%) 0 10 15 20 25 30 35 Đường khử (%) 2,36 3,73 4,51 5,34 5,75 5,96 5,96 PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase thủy phân tinh bột nếp trắng. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 36 Phân tích phương sai ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt động thủy phân của enzyme α-amylase trên nguyên liệu nếp trắng Analysis of Variance for Ham luong duong - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:pH 2.98848 4 0.74712 93.63 0.0000 B:Nhiet do 0.514803 2 0.257402 32.26 0.0000 INTERACTIONS AB 0.0689179 8 0.00861473 1.08 0.4266 RESIDUAL 0.119692 15 0.0079795 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 3.69189 29 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Kiểm định LSD ảnh hưởng của pH đến hoạt động thủy phân của enzyme α- amylase trên nguyên liệu nếp trắng Multiple Range Tests for Ham luong duong by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 7.5 6 4.0345 X 5.5 6 4.194 X 7 6 4.3635 X 6 6 4.7545 X 6.5 6 4.85033 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 5.5 - 6 *-0.5605 0.108155 5.5 - 6.5 *-0.656333 0.108155 5.5 - 7 *-0.1695 0.108155 5.5 - 7.5 *0.1595 0.108155 6 - 6.5 -0.0958333 0.108155 6 - 7 *0.391 0.108155 6 - 7.5 *0.72 0.108155 6.5 - 7 *0.486833 0.108155 6.5 - 7.5 *0.815833 0.108155 7 - 7.5 *0.329 0.108155 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động thủy phân của enzyme α-amylase trên nguyên liệu nếp trắng Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 37 Multiple Range Tests for Ham luong duong by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 90 10 4.2829 X 80 10 4.4317 X 85 10 4.6035 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 80 - 85 *-0.1718 0.0851489 80 - 90 *0.1488 0.0851489 85 - 90 *0.3206 0.0851489 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.