Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** Graduation thesis Major: Biotechnology RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE Doctor Student LE DINH DON CHU THI BICH PHUONG Ho Chi Minh City 8/ 2007 4 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:  Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.  TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, Bình Dương đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận.  Anh Nguyễn Văn Lẫm, anh Nguyễn Anh Khoa và các anh chị tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường đại học Nông Lâm.  Chị Kiều, chị Vy, Chị Vân cùng toàn thể các bạn sinh viên cùng thực hiện khóa luận tại phòng 105, khu Phượng Vĩ, Trường đại học Nông Lâm đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học K29 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sau cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc nhất đối với bố mẹ; cám ơn bố mẹ và hai em đã luôn tin tưởng, yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt. Em cũng xin cám ơn anh đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện, Chu Thị Bích Phượng 5 TÓM TẮT Đề tài: "NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC" được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Hiện nay, cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới (Cuba, Ấn Độ, Australia); vì vậy, diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở cây mía có đến 126 loại bệnh xảy ra làm giảm đáng kể đến năng suất và sản lượng của cây, gây thiệt hại to lớn đối với ngành công nghiệp đường trên thế giới (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó, bệnh cằn mía gốc được phát hiện ở hầu hết các khu vực trồng mía, có thể làm giảm đến 50 % sản lượng đối với các giống nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995). Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. Đây là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, đôi khi dài đến 10 m), dạng conryne, kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch của cây, làm giảm sức sống và số lượng chồi tạo thành, đặc biệt là các chồi hình thành sau khi thu hoạch. Cây bị bệnh này thường còi cọc, đường kính cũng như chiều dài thân nhỏ hơn so với cây bình thường (Davis và ctv., 1980). Mục đích của đề tài nhằm khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng và khảo sát thời gian kí sinh gây tắc mạch của vi khuẩn khi xâm nhập vào cây; phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh; sau đó tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. Các thí nghiệm khảo sát trên nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó đưa ra chiến lược xử lý và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nội dung thực hiện (1) Khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng bằng phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method). (2) Chủng bệnh các cây nuôi cấy 6 mô 3 tháng tuổi bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. (3) Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh và thực hiện các phản ứng sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. Các kết quả thu đƣợc (1) Kết quả cho thấy hầu hết mía được khảo sát đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình. Vi khuẩn Lxx tập trung chủ yếu ở lóng thứ nhất từ dưới lên và có mật độ giảm dần trong các lóng ở phía trên. (2) Hầu hết các cây nuôi cấy mô sau khi chủng đều bị nhiễm bệnh. Kết quả khảo sát cho thấy cây bắt đầu bị tắc mạch sau khoảng 30 ngày chủng bệnh, tỉ lệ mạch tắc tăng dần theo thời gian quan sát (45, 60 ngày). (3) Các dòng khuẩn lạc phân lập được sau 28 – 42 ngày nuôi cấy đều có dạng tròn lồi, đường kính 0,1 – 0,3 mm, trong suốt giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền trên môi trường MSC và SC, sau đó tăng sinh trong môi trường lỏng S8 và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy chỉ có một dòng vi khuẩn phân lập được có thể là Leifsonia xyli subsp. xyli. Giới hạn của đề tài (1) Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không thể tiến hành ở giai đoạn sớm mà chỉ có thể tiến hành đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi; do đó, việc kiểm soát bệnh ở giai đoạn cây còn nhỏ rất khó khăn. (2) Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, do môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. (3) Kết quả thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được, cần phải tiến hành các thử nghiệm phân tử để xác định lại kết quả đã đạt được. 7 SUMMARY The thesis titled: "RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE" was submitted to Biotechnology Department, Nong Lam University by CHU THI BICH PHUONG in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in Biotechnology. Ratoon stunting disease (RSD), caused by the xylem–limited coryneform bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), is a major constraint for worldwide sugarcane production. However, RSD is difficult to detect in the field because the typical symptoms of this disease, such as thinner, weaker and fewer stalks per stool, could be due to unknown factors. Since Lxx spread mechanically by infected planting and harvesting equipments, as well as by infected plant materials, it is necessary that the initial planting material be free of RSD. Our research was conducted to investigate the Lxx's distribution along the stalk, the infection level of the inoculated plants and the time for Lxx colonized the vascular; in order to develop the best control strategy to prevent losses from RSD. Although Lxx's colonization in the sugarcane is a systemic infection, the results of staining by Transpiration Method (STM) showed that the titer of the bacterium was different between the internodes. The bacteria titer was highest in the basal internode, it is suitable for conclusions of Dean (1984) and Grisham (2007); so that diagnoses should be conducted on this position. It took about 30 days for Lxx to colonize in the xylem vascular of the inoculated plants. After 28 – 42 days inoculated, bacteria strains isolated from sap of infected plants were subjected to the biochemical tests for identifing Lxx. The preliminary results showed that only one strain was recommended to be Lxx; consequently, molecular biology tools should be used to dissect Leifsonia xyli subsp. xyli, the causal agent of RSD. 8 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt................................................................................................................. iv Summary .............................................................................................................. vi Mục lục ................................................................................................................ vii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... x Danh sách các bảng ............................................................................................ xi Danh sách các hình ............................................................................................. xii 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu ..................................................................... 3 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................... 3 1.2.2. Nội dung ..................................................................................................... 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4 2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía ....................................................................... 4 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển ................................................................. 4 2.1.2. Phân loại học .............................................................................................. 4 2.1.3. Phân bố ....................................................................................................... 5 2.1.4. Đặc điểm thực vật học ................................................................................ 5 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía ......................................................................... 5 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển .................................................. 6 2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía ......................................................................... 8 2.2. Các loại bệnh hại trên mía ............................................................................. 9 2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc ....................................................................... 12 2.3.1. Tác nhân gây bệnh .................................................................................... 12 2.3.2. Triệu chứng ............................................................................................... 13 2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh ........................................................... 14 9 2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh ........................................... 15 2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx .................................. 16 2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống ....................................................... 16 2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi ................................. 16 2.4.3. Phương pháp nhuộm STM ........................................................................ 16 2.4.4. Phương pháp huyết thanh học ................................................................... 17 2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ..................... 18 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc ...................................................... 19 2.5.1. Trên thế giới .............................................................................................. 19 2.5.2. Trong nước ................................................................................................ 20 3. VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP ....................................................................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 21 3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm ................................................................... 21 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 21 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm .................................................................................. 21 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................... 22 3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 22 3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu ........................................................................ 22 3.3.2. Phương pháp nhuộm STM ........................................................................ 24 3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh ........................................................................................ 24 3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được .......................... 24 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn .................................................................. 24 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate ......................................... 26 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật ............................................................................................................. 26 3.4. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 27 10 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 29 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh ..................................................................................... 29 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng ............................................................................ 34 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx ........................................... 38 4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được ..................................................... 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 45 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 45 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 45 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt ............................................................................ 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh ............................................................................ 48 Tài liệu tham khảo Internet ................................................................................. 51 7. PHỤ LỤC ....................................................................................................... 52 Phụ lục 1: Môi trường SC ................................................................................... 52 Phụ lục 2: Môi trường MSC ................................................................................ 52 Phụ lục 3: Môi trường lỏng S8............................................................................ 53 Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth ................................... 53 Phụ lục 5: Môi trường Starch ............................................................................. 53 Phụ Lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx ............................................. 54 11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lxx : Leifsonia xyli subsp. xyli STM : Staining by Transpiration Method RSD : Ratoon Stunting Disease PCR : Polymerase Chain Reaction ctv. : cộng tác viên rRNA : Ribosome ribonuleic acid Mb : Mega bases bp : base pair ITS : Intergenic transcribed spacer region LT – EIA : Liquid Transfer Enzyme immunoassay EB – ELISA : Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay TBIA : Tissue Blot Enzym Immunoassay NCM : Nitrose cellulose membrance TRITC : Tetramethylrhodamine isothiocyanate FAT : Indirect flourescent antibody technique FADCF : Flourescent antibody directed counting filter µl : Micro litre µg : Micro gram µM : Micro mol mM : Mili mol IgG : Immunoglobulin 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến ............................ 11 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây............................................................ 29 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình ......................................................................... 35 Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được .................................................................. 41 13 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Cây mía ............................................................................................ 5 Hình 2.2. Một số bệnh hại phổ biến trên cây mía ........................................... 10 Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx – tác nhân gây bệnh cằn mía gốc .............................. 12 Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli được phân lập từ dịch chiết nước mía ..................................................... 13 Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc ................................ 14 Hình 3.1. Quy trình nhuộm STM để chẩn đoán cây mía bị bệnh ................... 23 Hình 3.2. Phương pháp chủng bệnh cằn mía gốc vào cây mía nuôi cấy mô ................................................................................................... 25 Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM ................. 30 Hình 4.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh ........................................................................ 31 Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc................................................................ 36 Hình 4.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng sinh hóa .......................................... 42 14 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Mía là một loại cây công nghiệp ngắn ngày có vị thế ngày càng quan trọng ở nước ta. Nó là một trong những cây mũi nhọn, có hiệu quả kinh tế cao, là cây có ưu thế trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở vùng đất cao chưa chủ động nước và vùng đồi thấp. Mía là cây có khả năng bảo vệ và bồi dưỡng đất, là cây làm giàu của trung du. Trước mắt, mía là cây lấy đường phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu, trong tương lai mía còn là nguyên liệu quý của ngành năng lượng, ngành giấy và sợi nhân tạo (Trần Văn Sỏi, 2001). Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, vì vậy đây là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày càng đa dạng hơn. Trên thế giới hiện có 126 bệnh hại mía (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó không thể không kể đến bệnh cằn mía gốc (Ratoon Stunting Desease - RSD); đây là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất, đặc biệt đối với những nước nông nghiệp tiên tiến có trình độ cơ giới hóa cao. Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra. Đây là bệnh có tác động nguy hiểm nhất đến sản lượng mía trên thế giới. Bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 – 15 % sản lượng (Comstock, 2005) và mức tổn thất có thể lên đến 50 % đối với vụ mía gốc (Davis, 1980). Vi khuẩn Lxx không gây ra các triệu chứng bên ngoài đặc trưng, hơn nữa sự lan truyền vi khuẩn lại diễn ra rất nhanh trong các ruộng mía làm cho thiệt hại do bệnh gây ra càng nặng nề hơn. Nhìn chung, cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng độ tuổi nên người nông dân thường lầm tưởng các triệu chứng của bệnh là do điều kiện canh tác (cây bị thiếu chất dinh dưỡng, đất trồng thiếu độ ẩm). 15 Lxx kí sinh chuyên tính trong bó mạch nên việc nghiên cứu loại vi khuẩn này rất khó khăn. Trên thế giới, vi khuẩn Lxx mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc như: phân lập thành công vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh (Davis, 1980); thiết lập quy trình phát hiện Lxx trong dịch chiết và dịch khuẩn lạc bằng kĩ thuật PCR (Y Pan và ctv., 1998); giải mã trình tự bộ gen của Lxx (Luis và ctv., 2004). Ở nước ta, bệnh cằn mía gốc là một loại bệnh đã được phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại nặng nề do bệnh gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh này cũng như vi khuẩn Lxx; người nông dân thậm chí không biết ruộng mía của mình bị bệnh, sản lượng thu hoạch mía giảm đáng kể làm cho công suất của các nhà máy đường trong nước chỉ còn 50 – 60 % (Hà Đình Tuấn, 2004). Để phòng tránh được những thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và phẩm chất mía do bệnh gây ra, cần phải đề ra những biện pháp kiểm soát và quản lý bệnh một cách hiệu quả. Do đó, việc phát hiện sớm vi khuẩn Lxx trên cây mía là một yêu cầu cấp thiết trong công tác tuyển chọn và kiểm định giống nhằm tạo ra một nền nông nghiệp ổn định, hiệu quả, trực tiếp thúc đẩy ngành công nghiệp mía đường phát triển, đáp ứng đủ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Do sự thiệt hại về sản lượng đã ra gây tổn thất đáng kể cho ngành công nghiệp mía đường cũng như tính cấp thiết của việc nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc" nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh. Từ đó, đưa ra được một phương pháp phát hiện vi khuẩn nhanh chóng và chính xác, góp phần vào chiến lược kiểm soát và hạn chế bệnh. 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Thực hiện các nghiên cứu cơ bản về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli để tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, 16 dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó tìm ra phương pháp kiểm soát và xử lý bệnh hiệu quả. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm bốn nội dung chính như sau: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng bằng phương pháp nhuộm STM. Chủng bệnh các cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn kí sinh gây tắc mạch và thống kê tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh trên môi trường thạch MSC và SC. Thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. 17 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu sơ lƣợc về cây mía (Saccharum spp.) 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển Qua nhiều năm tranh luận, ngày nay New-Ghine được thừa nhận là nơi nguyên sản của cây mía. Theo các tài liệu nghiên cứu về kiến tạo địa chất, nhiều tác giả cho rằng cây mía xuất hiện trên trái đất từ khi lục địa châu Á và châu Úc còn dính liền, cách đây hàng vạn năm. Ấn Độ và Trung Quốc là hai nước trồng mía có lịch sử lâu đời nhất trên thế giới. Ở Trung Quốc, căn cứ vào những tài liệu ghi chép cổ xưa cùng với sự phân bố rộng rãi của mía dại ở nhiều nơi trong nước và mức độ phong phú của những giống mía thương mại cho thấy cây mía được trồng rất lâu đời, khoảng thế kỉ VI trước công nguyên. Nghề trồng mía ở châu Á được truyền bá đi khắp nơi trên thế giới theo hai con đường: từ Trung Quốc truyền sang phía Đông Nam đến Philippine, Nhật Bản, Indonexia; từ Ấn Độ sang phía Tây tới Iran, Ai Cập, Tây Ban Nha, Ý,... Cây mía được trồng ở các nước vùng Địa Trung Hải vào khoảng đầu thế kỉ XIII. Năm 1940, trong chuyến vượt biển lần 2, Christopher Columbus mới đưa mía sang châu Mỹ, đầu tiên trồng ở đảo Santo Domingo, sau đó tới Mexico (1502), Brazil (1532), Peru (1533), Cuba (1650) (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). 2.1.2. Phân loại học Cây mía thuộc: Ngành có hạt (Spermatophyta) Lớp một lá mầm (Monocotyledoneae) Họ hòa thảo (Gramineae) Giống Saccharum. Trong giống Saccharum có năm loài: Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxh Ement Jesw) Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) 18 Hình 2.1. Cây mía (Nguồn: www.apsnet.org/ online/slideset/sugarcane) Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw) Các giống mía thương mại hiện nay là sản phẩm lai tự nhiên, lai nhân tạo giữa các loài kể trên với nhau hoặc do quá trình tuyển chọn từ ba loài Saccharum officinarum, Saccharum sinence, Saccharum barberi (Trần Văn Sỏi, 2003). Điều này cho thấy sự phong phú của các giống mía trồng hiện nay. 2.1.3. Phân bố Hiện nay, cây mía là cây trồng chính ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới. Nơi có vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là Natal, Argentina, cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), phía tây nam Pakistan (khoảng 34 độ N) và phía nam Tây Ban Nha (37 độ N) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). 2.1.4. Đặc điểm thực vật học 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía Rễ mía: cây mía có hai loại rễ là rễ sơ sinh và rễ thứ sinh. Rễ sơ sinh (rễ hom) mọc ra từ đai rễ của hom trồng; loại rễ này có nhiệm vụ bám đất, hút nước, cung cấp chất dinh dưỡng cho sự nảy mầm ở thời kì đầu sinh trưởng. Khi mầm mía chuyển thành cây con, các rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của cây con tự hút nước và chất dinh dưỡng để cung cấp cho cây, các rễ sơ sinh sẽ teo dần và biến mất. Thân mía: được hình thành bởi nhiều lóng mía hợp lại, có màu sắc và hình dạng khác nhau. Thân mía không chỉ là nơi để giữ bộ lá mà còn có nhiệm vụ dẫn nước, chất dinh dưỡng từ rễ tới lá và dự trữ đường nhờ quá trình quang hợp ở bộ lá. Thân mía là đối tượng thu hoạch và là nguyên liệu chính để chế biến đường ăn. Lá: gồm có bẹ lá và phiến lá. Bẹ lá là phần bao bọc thân mía, bảo vệ mắt mầm; phiến lá có hình lưỡi mác (màu xanh hoặc màu xanh thẩm), có một gân giữa 19 màu sáng và hình dáng, kích thước khác nhau tùy giống. Lá là tổ chức đồng hóa thực sự của cây, lá có nhiệm vụ hô hấp và thực hiện quá trình quang hợp. Hoa (bông cờ): hoa mía có tổ chức sinh sản ngầm với cấu trúc đơn giản. Mỗi hoa bao gồm cả tính đực và tính cái với ba nhị, một bầu noãn và hai nhụy. Khi hoa mía nở, các bao phấn của nhị tung phấn, nhờ gió mà nhụy cái dễ dàng tiếp nhận hạt phấn. Ở cây mía, có giống ra hoa, có giống không ra hoa, có giống ra hoa sớm, có giống ra hoa muộn,... đó là kết quả sinh lý tự nhiên của cây trồng nói chung và cây mía nói riêng. Tuy nhiên, trong sản xuất người ta không thích mía ra hoa. Hạt mía: là vật liệu sinh sản hữu tính của cây mía, đây là kết quả cuối cùng của giai đoạn sinh thực. Hạt mía giống một chiếc vảy nhỏ, hình thoi và nhẵn, độ dài 1 - 1,25 mm, nặng 0,15 - 0,25 mg. Hạt mía chỉ có ý nghĩa trong lai tạo tuyển chọn giống mía (Nguyễn Huy Ước, 1999; Trần Thùy, 1996). 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trƣởng và phát triển Theo Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), chu kì sinh trưởng của cây mía trong một vụ thường kéo dài 1 năm (trường hợp đặc biệt như ở Hawai là 2 năm). Nhưng chu kì khai thác của 1 ruộng mía có thể kéo dài từ 3 - 10 năm tùy vào điều kiện từng vùng. Dù là mía tơ hay mía gốc, chu kì sinh trưởng của cây mía gồm 5 thời kì: Thời kì nảy mầm: thời kì nảy mầm tính từ khi đặt hom trồng cho tới lúc mầm mía nảy thành cây con, mở đầu cho hoạt động sống của cây mía. Hom mía từ trạng thái ngủ chuyển sang trạng thái hoạt động trải qua một loạt biến đổi sinh hóa phức tạp. Trong quá trình nảy mầm, hom mía hô hấp mạnh. Dưới tác dụng của enzyme, đường saccharose và protein được phân giải thành glucose và acid amine cung cấp cho hoạt động sống của mầm, rễ. Nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự nảy mầm là đường glucose và acid amine, do đó hàm lượng các chất này trong hom mía nhiều hay ít có quan hệ trực tiếp đến tốc độ nảy mầm. Giữa hàm lượng đường glucose và số ngày cần thiết cho sự nảy mầm có tương quan nghịch, hàm lượng đạm tan trong hom mía tương quan thuận với tỉ lệ nảy mầm. Thời kì cây con: bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho đến khi phần lớn cây trong ruộng mía có 5 lá thật. Rễ cây bắt đầu phát triển khi cây con có hai lá thật, 20 như vậy trong suốt thời gian đầu cây con sống một phần dựa vào rễ hom. Sau khi rễ cây đã phát triển mạnh thì nhiệm vụ cung cấp dinh dưỡng chính do rễ cây đảm nhiệm. Do đó, trong thời kì này, phải tạo điều kiện cho lá sinh trưởng mạnh để cây quang hợp tốt, đồng thời thúc đẩy rễ cây phát triển nhanh. Thời kì đẻ nhánh (nhảy bụi hoặc đâm chồi): đẻ nhánh thực chất là sự nảy mầm của những mầm ở phần gốc của cây. Khi cây mía có từ 6 - 7 lá thật, các mầm nằm ở dưới mặt đất nảy thành nhánh. Từ thân mẹ đẻ ra nhánh cấp 1, nhánh cấp 1 đẻ ra nhánh cấp 2 và tiếp tục thành một bụi mía. Thời gian đẻ nhánh thường kéo dài từ 3 - 4 tháng tùy thuộc giống mía, thời vụ trồng, kĩ thuật chăm sóc. Thời kì vươn cao (vươn lóng): trong thời kì này, thân vươn cao nhanh, đường kính thân tăng mạnh, rễ, ngọn phát triển, số lá tăng thêm và đổi mới không ngừng. Trong các thời kì trước, mía sinh trưởng chậm vì quá trình quang hợp ở lá và sự hấp thụ ở rễ còn yếu, sản phẩm quang hợp tạo ra có hạn và một phần quan trọng phải dùng để tạo nên thân, lá, rễ. Trong thời kì vươn cao, trên cơ sở bộ lá và bộ rễ đã phát triển hoàn chỉnh, các quá trình sinh lý của cây đạt tới đỉnh cao, hiệu lực sử dụng độ phì đất đai, phân bón, năng lượng ánh sáng mặt trời tăng lên. Trong thời kì này mía sinh trưởng nhanh, tốc độ tăng trưởng chiều cao đạt từ 10 cm/tháng đến 50 cm/tháng. Do đó, thời kì vươn cao là thời kì quyết định trọng lượng thân, tức là thời kì quyết định năng suất mía cây. Thời kì chín công nghiệp và trổ cờ: vào cuối thời kì vươn lóng, nhiệt độ và lượng mưa giảm dần (ở nước ta thường là từ tháng 11 trở đi), cây mía sinh trưởng chậm lại và bước vào thời kì tích lũy đường mạnh mẽ. Sự hình thành và tích lũy đường trong cây mía bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn một là sự kết hợp của CO2 và H2O thành đường đơn glucose với sự có mặt của diệp lục và ánh sáng. Giai đoạn hai là quá trình chuyển hóa đường đơn thành đường saccharose và các đường đa khác, giai đoạn này không cần ánh sáng và diệp lục. Các bộ phận của cây mía như thân, lá đều có thể tổng hợp đường mía từ đường đơn. Đường mía tổng hợp từ lá chuyển vào thân, một phần dùng cho hô hấp và cấu tạo thân, lá, rễ; phần còn lại tích lũy trong thân dưới dạng saccharose. 21 Chín công nghiệp là khi hàm lượng đường trong cây mía đạt mức thích hợp để thu hoạch ép đường. Lúc cây mía đang sinh trưởng hàm lượng đường glucose trong cây thấp, khi cây sinh trưởng chậm lại phần lớn các sản phẩm đồng hóa do bộ lá tạo thành chuyển sang dạng đường tích lũy trong thân, hàm lượng đường trong cây tăng lên nhanh chóng. Quá trình tích lũy đường trong cây mía diễn ra từ dưới lên trên, lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên. Lúc mía sắp chín, tốc độ tăng hàm lượng đường ở những lóng trên nhanh hơn lóng dưới; do đó, hàm lượng đường trong ngọn "đuổi kịp" gốc cho đến lúc bằng nhau. Khi hàm lượng đường của phần thân ngọn tương đương phần thân gốc là đúng độ chín công nghiệp. Trổ cờ là thời kì chín sinh học của cây mía. Ở nước ta, mía thường trổ cờ từ tháng 10 (miền Nam) đến tháng 12 (miền Bắc). Trổ cờ thường không trùng với thời kì chín công nghiệp và có ảnh hưởng không tốt đến nguyên liệu mía cây phục vụ cho nhà máy đường. Khi mía trổ cờ, thân ngừng sinh trưởng, tỉ lệ đường giảm, tỉ lệ xơ tăng. Vì vậy, trong sản xuất mía thường tìm cách hạn chế sự ra hoa kết hạt. 2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía Mía là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất đường. Đường là loại thực phẩm cần thiết trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều dân tộc trên thế giới. Trong cơ thể con người, đường mía được chuyển hóa thành glucose và fructose, các loại đường tham gia vào quá trình oxy hóa để tạo năng lượng cho cơ thể hoạt động. Trung bình 1 kg đường cung cấp năng lượng tương đương 0,5 kg mỡ hoặc 50 - 60 kg rau quả. Ngoài sản phẩm chính là đường, những phụ phẩm của cây mía gồm: Bã mía: chiếm 25 - 30 % trọng lượng mía đem ép. Bã mía chứa trung bình 49 % nước, 48,5 % xơ, 2,5 % chất hòa tan (đường). Bã mía có thể dùng ngay làm nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc. Cao hơn nữa, từ bã mía có thể làm ra furfural là nguyên liệu của ngành sợi tổng hợp. Mật gỉ: chiếm 3 - 5 % trọng lượng mía đem ép. Thành phần mật gỉ gồm nước (10 %), đường saccharose (35 %), đường khử (20 %), tro (15 %). Mật gỉ là nguyên liệu để chưng cất sản xuất rượu Rhums và cồn công nghiệp (từ 1 tấn mật gỉ có thể 22 sản xuất được 300 lít cồn tinh và 3800 lít rượu). Ngoài ra, mật gỉ còn được sử dụng để sản xuất các loại men và các loại acid (acid acetic, acid citric). Bùn lọc: chiếm 1,5 – 3 % trọng lượng mía đem ép, là sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đường. Bùn lọc chứa 0,5 % N, 1,6 % P2O5, 0,4 % K2O, 3 % protein thô và một lượng lớn chất hữu cơ. Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa xerezin làm sơn, xi đánh giày, bản sáp roneo. Sau khi lấy sáp, bùn lọc được tận dụng làm phân bón. Về phương diện nông học, mía là loại cây trồng có khả năng thích ứng mạnh, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, cho phép tận dụng, cải tạo những vùng đất khó khăn. Tóm lại, mía là cây trồng có khả năng cho sinh khối lớn, lại có khả năng tái sinh mạnh (trồng một năm thu hoạch được nhiều năm) nên có hiệu quả kinh tế cao (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). 2.2. Các loại bệnh hại trên cây mía Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày càng đa dạng hơn. Từ năm 1989 đến nay, thành phần bệnh hại mía trên thế giới và các tác nhân gây bệnh chưa có gì thay đổi với 126 bệnh gồm: 9 bệnh do virus, 2 bệnh do phytoplasma, 9 bệnh do vi khuẩn, 68 bệnh do nấm, 3 bệnh do thực vật kí sinh, 2 bệnh do tác động cơ giới và 24 bệnh chưa xác định được nguyên nhân (Joaquin, 2001) (Trích dẫn bởi Hà Đình Tuấn, 2004). Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu và khảo sát bệnh trên cây mía không nhiều. Theo kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004) cho thấy vùng nguyên liệu mía Đông Nam Bộ có 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chưa biết tác nhân và một số bệnh khác do tuyến trùng, thực vật kí sinh, do yếu tố môi trường và dinh dưỡng gây ra. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến được trình bày ở bảng 2.1 23 24 Bảng 2.1. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến Nguồn: Hà Đình Tuấn (2004) Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại I Bệnh do nấm 1 Bệnh sọc nâu Brown stripe Cohliobalus stenospilus Drechs 2 Bệnh mốc sương Downy mildew Peronosclerospora sacchri T. Miyake 3 Bệnh đốm mắt én Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker 4 Bệnh đốm trắng White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo 5 Bệnh cháy lá Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling 6 Bệnh dứa Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau 7 Bệnh xoắn cổ lá Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon 8 Bệnh thối đỏ Red rod Colectotrichum falcatum Went 9 Bệnh rỉ sắt đỏ Rust Puccinia melanopcephala H. & P. Syd 10 Bệnh rỉ sắt vàng Rust orange P. kuehnii Butl 11 Bệnh than Smut Ustilago senaminea Syd 12 Bệnh đốm vàng Yellow spot Mycovellosiella koepket 13 Bệnh đốm vòng Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan II Bệnh do vi khuẩn 14 Bệnh gôm Gumming diease Xanthomonas camestris pv. Vasculorum 15 Bệnh thân ngọn đâm chồi Leaf scald Xanthomonas alibilineans 16 Bệnh cằn mía gốc Ratoon stunting disease Leifsonia xyli subsp. xyli 17 Bệnh sọc đỏ Red stripe Pseudomonas rubrilineans III Bệnh do Phytoplasma 18 Bệnh chồi cỏ Grassy shoot Chưa rõ 19 Bệnh trắng lá White leaf Chưa rõ VI Bệnh do virus 20 Bệnh sọc vàng Chlorotic streak Chưa rõ 21 Bệnh Fiji Fiji disease Fiji disease virus 22 Bệnh khảm Mosaic Sugarcane mosaic virus 23 Bệnh đốm sọc Streak Sugarcane streak virus 24 Bệnh vàng gân lá Yellow leaf disease Sugarcane yellow leaf virus 25 2.3. Sơ lƣợc về bệnh cằn mía gốc 2.3.1. Tác nhân gây bệnh Bệnh cằn mía gốc xảy ra ở hầu hết các khu vực trồng mía trên thế giới: Antigua, Argentina, Australia, Bangladesh, Barbados, Belize, Bolivia, Brazil, Burkina Faso, Cameron, Trung Quốc, Colombia, Congo, Costa Rica, Cuba, Ấn Độ, Indonesia, Nhật, Malaisia, Mali, Mexico, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam,... (Gillaspie và Teakle, 1989; Davis và Bailey, 2000). Đây được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến sản lượng mía trên thế giới, bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 - 15 % sản lượng (Comstock và Lentini, 2005), đôi khi tổn thất lên đến 30 - 50 % tổng sản lượng mía thu được đối với các giống mía nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995; Pan và ctv., 1998, Brumbley và ctv., 2006). Bệnh cằn mía gốc được phát hiện đầu tiên ở Australia từ năm 1944 - 1945 nhưng vào thời điểm đó người ta vẫn chưa tìm ra nguyên nhân. Hughes và Steindl (1955) đã tìm ra tác nhân gây bệnh và cho rằng đó là do virus. Năm 1973, một loại vi khuẩn nhỏ được phát hiện là có liên kết với bệnh cằn mía gốc (Gillaspie và Teakle, 1989; Teakle và ctv., 1978) (Trích dẫn bởi Claudia B. Monteiro-Vitorello và ctv., 2004). Đến năm 1980, Davis và ctv. đã phân lập thành công loại vi khuẩn này từ dịch chiết của cây bị bệnh trên môi trường nhân tạo. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) (Davis và ctv., 1980), dạng coryne, hiếu khí và rất khó nuôi cấy do cần nguồn dinh dưỡng phức tạp. Chúng sống ở các bó mạch gỗ của cây mía gây tắc bó mạch và lây truyền sang cây khác thông qua vật liệu trồng bị nhiễm bệnh hay các dụng cụ trồng và thu hoạch (Taylor và ctv., 2003). Ban đầu, loại vi khuẩn này được xếp vào loài Clavibacter do các đặc Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx - tác nhân gây bệnh cằn mía gốc (Nguồn: www.leifsonia.lncc.br/ lxxsite/index.php) 26 tính kiểu hình nhưng gần đây đã được thay đổi thành Leifsonia dựa vào các kết quả phân tích gen rRNA. Cách phân loại này đã được xác nhận bởi Young và ctv. (2006) (Trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 2006). Vi khuẩn Lxx có dạng thẳng hay gậy mảnh nhưng một vài tế bào lại căng phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào, sinh sản theo hình thức nhân đôi (hình 2.3). Mesosome thường hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn (hình 2.4). Cho đến nay, người ta nhận thấy cây mía là kí chủ tự nhiên duy nhất của Lxx, loại vi khuẩn này kí sinh chuyên tính trên cây mía nhưng không tạo ra các triệu chứng bệnh đặc trưng (Davis và Bailey, 2000). 2.3.2. Triệu chứng Thông thường, triệu chứng cằn cỗi và khả năng mọc chồi kém được cho là hậu quả của sự tắc mạch. Tuy nhiên, Leifsonia xyli subsp. xyli không tạo ra các triệu chứng bên trong hoặc bên ngoài đáng tin cậy (Brumbley và ctv., 2006). Triệu chứng nghi ngờ là cây bị cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, số lượng cây (bụi) ít hơn bình thường. Trong các vụ gốc, cây bệnh sinh trưởng chậm và có thể chết đối với các giống mẫn cảm cao. Ở các giống mẫn cảm cao, cây bị rũ xuống Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đƣợc phân lập từ dịch chiết nƣớc mía (Nguồn: Brumbley và ctv., 2006) Chú thích: Có 4 mesosome rõ ràng (3 trong tế bào dài và 1 trong tế bào ngắn). Đường kính của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đo được là 195 - 220 nm, chiều dài của hai tế bào gắn với nhau là 2610 nm. Tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli không xuyên qua màng lọc 0,22 m nhưng có thể xuyên qua màng lọc 0,4 m. Các vi khuẩn hình que này có thể phồng ra ở một đầu làm cho chúng có dạng hình chùy. 27 trong điều kiện thiếu ẩm độ, bị thối ở đỉnh và mép lá. Hệ thống rễ của cây bị bệnh phát triển kém hơn so với cây khỏe mạnh bình thường. Bệnh gây ra làm cho các bó mạch ở phía dưới đốt mía bị đổi màu, nhưng triệu chứng này thường chỉ xuất hiện trong thời gian rất ngắn. Khi chẻ dọc thân mía của cây bị bệnh có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn và sự đổi màu này không kéo dài khắp lóng mía như triệu chứng của các bệnh khác (Davis và Bailey, 2000) (Hình 2.5). Ở một số giống, cây mía non cũng có sự đổi màu từ vàng đến nâu đỏ của tế bào mạch dẫn ngay dưới mô phân sinh ngọn; triệu chứng có thể có là làm cho 1 phần thân bị chuyển thành màu hồng ngay tại các đỉnh sinh trưởng của chồi non hay hóa đỏ cam tại các bó mạch ở giữa đốt của những thân mía đã trưởng thành (Brumbley và ctv., 2006). 2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh Vi khuẩn Lxx kí sinh chuyên tính trong cây mía và không có môi giới lan truyền bệnh; bệnh lây nhiễm trong cánh đồng do sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh. Bởi vì triệu chứng của bệnh không thể quan sát được bằng mắt nên vi khuẩn có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác một cách "âm thầm" mà người nông dân vẫn không biết cánh đồng mía của họ đang bị bệnh. Thậm chí, khi thấy ruộng Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Nguồn: www.pakissan.com/english/allabout/crop/sugarcane.shtml) a) Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; b) Đốt thân ngắn; c) Vết đổi màu trong thân cây mía bệnh 28 mía có dấu hiệu chậm phát triển, người ta thường quy cho các nguyên nhân khác như: điều kiện canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng. Vi khuẩn Lxx phát tán, lây lan trong đồng ruộng một cách nhanh chóng thông qua các dụng cụ thu hoạch cơ giới hay thủ công, trong đó sự lây nhiễm do máy móc khi thu hoạch cơ giới rất đáng kể. Các loài động vật ăn mía cũng có thể là tác nhân truyền bệnh khi chúng gặm một thân mía bị bệnh sau đó lại tiếp tục gặm sang một thân mía khỏe khác. Ngoài ra, có một vài báo cáo mới đây cho rằng vi khuẩn Lxx vẫn tiếp tục sống sót trong đất sau khi thu hoạch và tái nhiễm vào rễ cây khỏe mạnh thông qua vết thương; tuy nhiên, quy mô của sự lây nhiễm này vẫn chưa được biết (Comstock và Lentini, 2005; Davis và Bailey, 2000). Theo Bailey và Tough (1992); Damann (1992); Comstock và ctv. (1996), tùy thuộc vào tính mẫn cảm của từng giống mía đối với bệnh mà mức độ lây nhiễm cũng như mức thiệt hại khác nhau trong các cánh đồng. Thêm vào đó, các yếu tố bất lợi về nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ bệnh. Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc sót lại cũng dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003). 2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh Bệnh cằn mía gốc được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến sản lượng mía trên thế giới. Vi khuẩn Lxx chủ yếu làm cản trở sự vận chuyển nước và chất dinh dưỡng của cây (Kao và Damann, 1978; 1980). Bởi vì cây mía có thể phát triển thành 4 - 5 vụ mía gốc từ một vụ mía tơ nên phải thận trọng, tránh sự xâm nhiễm của loại vi khuẩn này lên toàn bộ cánh đồng (Westphal và Mirkov, 2003). Để tiêu diệt hay ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh nên ngâm mía trong nước nóng (50 C) trong hai giờ trước khi đem trồng. Các dụng cụ thu hoạch phải được rửa sạch và sát trùng bằng hóa chất trước khi thu hoạch sang ruộng khác. Các chất diệt trùng hóa học có thể sử dụng đối với dụng cụ cắt mía bao gồm: lysol, dettol, ethanol, mirrol and roccal. Nên cho hóa chất tiếp xúc với bề mặt cắt ít nhất 5 phút để đảm bảo chắc chắn vô trùng. Ngoài ra, sử dụng giống kháng cũng là một biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh; mặc dù không có giống nào được tìm thấy là 29 miễn dịch hoàn toàn đối với sự xâm nhiễm của Lxx nhưng CP 78-1628 và CP 80- 1743 là 2 giống đã được chứng minh là có khả năng kháng đối với bệnh cằn mía gốc (Comstock và Lentini, 2005). 2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx 2.4.1. Phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống Phương pháp chẩn đoán truyền thống dựa vào các triệu chứng biểu hiện bên ngoài như sự cằn cỗi của cây, sự chuyển thành màu hồng tại mô mạch ở các mắt của cây mía trưởng thành và màu hồng nhạt ở các lóng cây non (Hughes và Steindl, 1955). Tuy nhiên cường độ biểu hiện có sự khác nhau rất lớn giữa các giống cây cũng như giữa các cây trong cùng một giống. Thêm vào đó, triệu chứng biểu hiện của bệnh không khác gì mấy so với bệnh do các tác nhân thông thường gây ra trên mía như côn trùng, các nhân tố môi trường và sự hủy hoại cơ học (Gillaspie và Teakle, 1989) (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Do đó, bệnh cằn mía gốc thường được xác định thông qua các kĩ thuật phòng thí nghiệm. 2.4.2. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi Kiểm tra trực tiếp dịch chiết nước mía bằng kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi nền tối ở độ phóng đại X-1000 để phát hiện vi khuẩn nhưng phương pháp này có độ nhạy thấp (khoảng 1 x 106 tế bào/ml) và chậm khi chọn lọc một số lượng mẫu lớn (Taylor và ctv., 2003). Việc phát hiện vi khuẩn dưới kính hiển vi đặc biệt khó khăn đối với cây bị nhiễm Lxx ở giai đoạn đầu, sau khi tưới hoặc trong mùa mưa; bởi vào các thời điểm này, nồng độ vi khuẩn Lxx ở trong dịch chiết nước mía rất thấp (Davis và Bailey, 2000). Do đó, hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người quan sát. 2.4.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method ) Sự kí sinh của các tế bào vi khuẩn Lxx làm ngăn cản sự hấp thu nước và chất dinh dưỡng của cây; sự tạo gel và chất gôm trong bó mạch mộc là dấu hiệu sinh lý quan trọng liên quan đến sự giảm sản lượng ở cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Giglioti và ctv., 1999). Dựa vào các đặc điểm trên, phương pháp nhuộm STM đã được phát triển nhằm chẩn đoán, phát hiện cây mía bị bệnh. 30 2.4.4. Phƣơng pháp huyết thanh học Kĩ thuật huyết thanh bao gồm nhuộm kháng thể huỳnh quang (fluorescent- antibody staining - FAT), kĩ thuật miễn dịch dot blot (dot blot immunoassay) và kĩ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay). Gần đây, người ta đã cải tiến kĩ thuật miễn dịch dot blot thành kĩ thuật phân tích miễn dịch học enzyme liên kết với mô mẫu (Tissue Blot Immunoassay - TBIA) để chẩn đoán bệnh và đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể phát hiện Lxx trong một số lượng lớn mẫu mía một cách nhanh chóng; ngoài ra, kĩ thuật này còn được sử dụng để chọn lọc dòng kháng bệnh và xác định mức độ tác động của bệnh đối với cây giống (Comstock và Lentini, 2005). Nhuộm kháng thể huỳnh quang: Harris và Gillaspie (1978) là những người đầu tiên đưa ra phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (FAT) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Brlansky và ctv. (1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Năm 1985, Davis phát triển kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF) cho độ nhạy gấp 100 lần FAT. Màng lọc được kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần (Trích dẫn bởi Westphal and Mirkov, 2003). Kĩ thuật miễn dịch dot blot: dịch chiết nước mía (50 μl) được trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 (v:v). 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS được lọc qua màng NCM 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80°C trong 60 phút trước khi đem nhuộm bằng phương pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dương tính được nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng. Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu: vi khuẩn được tách ra khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm, được dính lên màng nitrocellulose (NCM) và được nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dương tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học. 31 Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay (EB – ELISA): phương pháp EB - ELISA do Croft và ctv. đưa ra năm 1994 để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Dịch chiết nước