Nghiên cứu về bệnh xuất huyết trên vi, xoang miệng của cá tra Pangasianodon hypophthalamus

́ trình nuôi cá thương phẩm từ 5 – 10% (Phan Văn Ninh và cộng tác viên, 1991). Theo báo cáo số: 06/CV/TS ngày 01/4/1997 của Công ty Thủy sản An Giang (AGIFISH), gần 100% bè cá thu hoạch trong cá tháng 2 và 3 năm 1997 đều có cá nhiễm bệnh với cường độ cảm nhiễm khác nhau. Cá nuôi bè nhiễm các loại bệnh như: phù đẩu xuất huyết, đốm trắng, nấm thủy mi,… ngày càng nhiều. Tại các cơ sở thu mua, cá bệnh thường bị hạ phẩm (cá dạt). Tỷ lệ cá dạt trong quá trình chế biến trung bình là 20%, có thời điểm lên tới 30% lượng cá thu mua. Trường hợp cá tra-basa cung ứng cho các cơ sở chế biến sản phẩm đông lạnh xuất khẩu, khi xẻ cá để philê nếu phát hiện những đốm đỏ tụ huyết trong thịt cá, tùy theo mức độ nghiêm trọng có thể bị loại hoặc trả lại toàn bộ nguyên liệu cho người nuôi. Nhằm khắc phục tác hại của bệnh đối với nghể nuôi cá ở An Giang, ngành thủy sản đã phối hợp với nhiều cơ quan nghiên cứu ở trung ương và địa phương tiến hành nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh và đề xuất các biện pháp khắc phục. Kết quả các công trình nghiên cứu này đã từng bước được ứng dụng vào sản xuất mang lại hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, ảnh hưởng của bệnh đặc biệt là bệnh xuất huyết trên vi và xoang miệng của cá tra-basa vẫn chưa được khắc phục triệt để và tiếp tục gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tại An Giang. Vì vậy, việc nghiên cứu về bệnh cá nuôi, tìm hiểu tác nhân và xác định phương hướng phòng trị hữu hiệu là việc làm cần thiết và cấp bách nhằm góp phần ổn định và phát triển nghề nuôi cá ở An Giang. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Nghiên cứu về bệnh xuất huyết trên vi, xoang miệng của cá tra Pangasianodon hypophthalamus” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu về tác nhân gây bệnh phù đầu xuất huyết trên cá Tra – Basa, đặc điểm sinh học và tính chất gây bệnh của tác nhân, từ đó ứng dụng vào việc xây dựng phương thức phòng trị có hiệu quả, nhằm ổn định và nâng cao năng suất cá nuôi tại địa phuơng. Đồng thời góp phần hiểu biết về bệnh thủy sản vùng đồng bằng sông Cửu long. 1.3 Nội dung nghiên cứu Xác định tác nhân chủ yếu và cơ hội gây bệnh phù đầu xuất huyết trên cá tra – basa và đặc điểm sinh học của chúng. Xây dựng phương thức phòng trị bệnh phù đầu xuất huyết trên cá tra – basa nhằm nâng cao năng suất. CHƯƠNG2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1Sơ lược đặc điểm sinh học của cá tra (Pangasianodon hypophthalamus) Phân loại, phân bố, hình thái, môi trường sống Phân loại Hình 2.1 Cá Tra (Pangasius hyppothalmus ) Ngành: Chordata Lớp: Actinopterigii Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae Giống: Pangasius Loài: Pangasius hyppothalmus  Theo Mai Đình Yên và ctv, (1992) cá tra là loài cá có kích thước tương đối lớn thuộc nhóm cá da trơn, có thân dài, dẹp ngang, màu xám, hơi xanh ở trên lưng, hai bên hông và bụng nhạt. Đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to, miệng rộng, có 2 đôi râu dài. Vây lưng và vây ngực là gai cứng, có vây mỡ nhỏ (Trích bởi Nguyễn Thị Phương Linh, 2008). Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, (1982) giai đoạn cá nhỏ có sọc màu xanh lục chạy theo chiều dọc của thân, sọc thứ nhất chạy thoe dọc đường bên từ lỗ mang đến vi đuôi, sọc thứ hai ở bên dưới đường bên và chạy từ lỗ mang đến khởi điểm vi hậu môn. Các sọc này lợt dần và biến mất khi cá lớn. Ở cá lớn, mặt lưng của thân và đầu có màu xanh xá, hoặc nâu đen và lợt dần xuống bụng, bụng có màu trắng bạc. Gốc vi lưng và vi hậu môn cá màu vàng. Màng da giữa các tia phân nhánh vi đuôi có màu xanh đen nổi bật giữa các tia phân nhánh có màu trắng. Phân bố Cá tra và ba sa phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Cămpuchia và Thái lan. Ở Thái Lan còn gặp cá tra ở lưu vực sông Mekloong và Chao Phraya, cá ba sa có ở sông Chaophraya. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống tra và ba sa được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên địa phận Việt nam, do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Khảo sát chu kỳ di cư của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư về hạ lưu từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm. (Nguyễn Tuần, 2000) Hình thái Cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, có 2 đôi râu dài. Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7-10 ), có thể chịu đựng được nước phèn với pH >5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 150C, nhưng chịu nóng tới 390C. Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các lòai cá khác. Cá có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan. Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng. (Nguyển Tuần, 2000). Môi trường sống Theo Lê Như Xuân và ctv, (1994) nhìn chung 3 loài cá tra, cá vồ đém, cá basa hiện đang nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long có đặc điểm giống nhau: Chúng phân bố ở sông, hồ, kinh, mương, rạch vùng nước ngọt, sống ở các thủy vực nước tĩnh và nước chảy. Cá cũng nuôi được nơi vùng nước lợ có nồng độ muối thấp. Ngưỡng oxy thấp (cá basa có ngưỡng oxy cao hơn cá tra và vồ đém) nên sống được ở ao tù bẩn. Cơ quan hô hấp phụ của cá tra là bóng khí, nhờ cơ quan này mà cá có thể sống được nơi có hàm lượng oxy thấp. Nhiệt độ thích hợp để cá phát triển là 26-30oC. Theo Từ Thanh Dung và ctv, (2005) môi trường sống cho cá tra rất quan trọng. Môi trường nước ổn định, mồi ăn đầy đủ, cá có sức đề kháng cao, ký sinh trùng và mầm bệnh khó xâm nhập, cá khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh. Trong nuôi trồng thủy sản, phần lớn nguyên nhân gây bệnh đầu tiên là những biến đổi về môi trường, gây sốc và tổn thương đến cơ thể làm giảm khả năng kháng bệnh của cá, cá dễ bệnh và chết. Theo Đoàn Khắc Độ, (2008) cá tra là loài cá tượng đối dễ nuôi, sống chủ yếu ở nước ngọt nhưng cũng có thể sống được vùng nước lợ (nồng độ muối 7-10 ‰). Cá có thể chịu đựng được phèn với pH>5, có thể sống được ở nhiệt độ 39oC, nhưng không chịu đưỡc nhiệt độ thấp hơn 15oC. Đặc điểm dinh dưỡng Theo Trần Thanh Xuân và Trần Văn Anh, (1977) cơ quan tiêu hóa của cá tra gồm miệng, răng hàm, gai mang, dạ dày to hình chữ U, cơ rất phát triển. Túi mật lớn, ruột ngắn, không gấp khúc lên nhau và dính vào màng treo ruột. Tỷ lệ chiều dài ruột so với chiều dài thân Li/L = 1,04 đối với cá tự nhiên và Li/L = 1,18-2,24 đối với cá nuôi ao (Trích bởi Lê Như Xuân và ctv, 1994). Sau khi nở được 18-22 giờ cá tra không có khả năng sử dụng thức ăn bên ngoài vì những lý do sau: + Khối noãn hoàng (tương tự như lòng đỏ của trứng) và nó là nguồn thức ăn của cá trong 2-3 ngày sau khi nở. + Miệng cá chưa thể cử động được và luôn ở trạng thái mở + Ống tiêu hóa chưa hoàn chỉnh và là dạng ống thẳng Sau khi nở được 24-36 giờ, miệng cá đã có răng (dạng răng chó), hàm đã có thể cử động được. Khối noãn hoàng đã được cá sử dụng hết và bắt đầu sử dụng thức ăn bên ngoài. Thức ăn của cá lúc này là động vật phù du trong nước và có kích thước nhỏ như luân trùng, trứng nước (Nghiêm Thi Nguyệt Thu, 2010). Ở giai đoạn cá bột cá thích ăn mồi tươi sống và ăn liên tục các loại như luân trùng, trứng nước và các loại động vật nhỏ sống trôi nổi trong nước. Đến ngày thứ 8, cá ăn được lăng quăng, ấu trùng muỗi đỏ, trùng chỉ, mùn bã hữu cơ. Cá bắt đầu xuống đáy tìm thức ăn từ ngày thứ 11, kể từ ngày thứ 25 cá chuyển sang ăn tạp và tính ăn giống cá trưởng thành (Dương Nhựt Long, 2003). Theo Lê Thanh Hùng, (2008) ở điều kiện ương trong bể, cá tra có thể sử dụng nhiều loại thức ăn như: artemia, trùng chỉ, rotifer, thức ăn chế biến…. Nhưng ấu trùng artemia và trùng chỉ chỉ cho tỷ lệ sống cao và sinh trưởng tốt nhất (Trích bởi Dương Thúy Yên, 2003) Theo Menon và Cheko, (2005) khi phân tích thức ăn trong ruột cá ngoài tữ nhiên như sau: Loại thức ăn Tỉ lệ (%) Nhuyễn thể 35.4 Cá nhỏ 31,8 Côn trùng 18,2 Thực vật thượng đẳng 10,7 Thực vật đa bào 1,6 Giáp xác 2,3 Bảng 2 Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên (Trích bởi Phạm Văn Khánh, 2000) Thức ăn trong ương cá tra trong giai đoạn 1 tháng tuổi cần hàm lượng đạm khoảng 28-32% (Thành phần thức ăn trong Bảng 2.2). Có thể sử dụng thức ăn công nghiệp dạng đậm đặc trộn thêm cám. Lượng thức ăn cho cá dao động từ 10-20kg/100kg cá, cho cá ăn 2-4 lẩn trong ngày (Dương Nhựt Long, 2003) Nguyên liệu Tháng thứ 1 (kg) Tháng thứ 2 (kg) Bột cá 4,5 3,0 Cám 2,8 4,3 Tấm 0,8 0,8 Bột đậu nành 1,5 1,5 Premix 0,2 0,2 Chất kết dính 0,2 0,2 Bảng 3 Công thức thức ăn cho cá tra bột (tính cho 10kg thức ăn) Đặc điểm sinh trưởng Theo Trần Như Xuân, (1994) đã công bố thì cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh. Khi hết noãn hoàng cá có chiều dài trung bình từ 1,0-1,1 cm, sau 14 ngày ương đạt 2,0-2,3 cm và trọng lượng 520mg. Sau 1 năm cá đạt 0,7-1,5 kg, đến 3-4 tuổi đạt 3-4 kg. Cá còn nhỏ sẽ tăng trưởng nhanh về chiều dài, khi cá đạt 2,5 kg thì bước vào thời kỳ tích mỡ, cần có chế độ nuôi dưỡng thích hợp để cá phát dục tốt. Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi, chất lượng và số lượng thức ăn cung cấp. Độ béo cũng tăng dần theo sự phát triển của cá, ở những năm đầu tiên, độ béo tăng nhanh, qua những năm sau thì độ béo tăng không đáng kể. Cá có trọng lượng 11,2 kg có độ béo là 0,99%, cá nặng 560g có độ béo là 1,6% nhưng cá 3 tuổi nặng 3,62 kg có độ béo 1,62% (Trích bởi Nguyễn Thị Phương Linh, 2008) Ở thời kỳ cá giống, cá lớn rất nhanh. Sau 35 ngày ương cá đạt chiều dài 5,01cm; nặng 1,28g. Ở thời kỳ cá nuôi thịt thì tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất nhiều vào phương thức và mật độ nuôi (Lê Như Xuân và ctv, 1994). Cá tra lớn nhanh khi nuôi trong ao, sau 6 tháng nuôi đạt trọng lượng 1-1,2kg/con, những năm sau cá lớn nhanh hơn. Cá nuôi trong ao có thể đạt đến 25kg sau 10 năm (Dương Nhựt Long, 2003). Cá tra có tốc độ tăng trưởng nhanh. Trong tự nhiên cá có thể sống trên 20 năm. Và người ta cũng gặp nhiều con cá trong tự nhiên có trọng lượng cỡ 18-20kg dài từ 1,8 đến 2m (Đoàn Khắc Độ, 2008). Đặc điểm sinh sản Khi nuôi vỗ để cá phát triển và có sản phẩm sinh dục tốt cần cung cấp thức ăn đầy đủ về chất và lượng, cân đối thành phần dinh dưỡng. Đặc biệt là hàm lượng protein phải đảm bảo từ 30% trở lên. Theo Trương Tấn Hoàn, (1985) cá tra sẽ thành thục tốt khi thức ăn có hàm lượng protein 30-50% (Trích bởi Nguyễn Thị Phương Linh, 2008). Tuổi thành thục của cá ngoài tự nhiên chưa xác định rõ, vì khó xác định tuổi của chúng. Tuy nhiên, cá thành thục sớm hay muộn còn tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống của chúng. Trong các ao nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long bất gặp cá tra thành thục ở 3 tuổi, song cá thành thục và sinh sản tốt 7-8 tuổi (Lê Như Xuân và ctv,1994). Tuổi thành thục cá tra khi đạt độ tuổi thuần thục thì mới có khả năng tham gia sinh sản. Cá tra đực phải đạt 2 năm tuổi mới thành thục, còn đối với cá tra cái thì phải 3 năm. Trọng lượng cá thành thục lần đầu khoảng 2,5-3kg (Đoàn Khắc Độ, 2008). Theo Cacot, (1998) cá tra đực thành thục ở tuổi thứ 2, cá tra cái tuổi thứ 3 trở lên (Trích bởi Nguyễn Thị Phương Linh, 2008). Theo Trần Thanh Xuân và Trần Minh Anh, (1977) sức sinh sản tưởng đối ở cá có trọng lượng 3,2 kg là 139,69 trứng/g cá cái, sức sinh sản phụ thuộc vào trọng lượng cá và điều kiện dinh dưỡng (Trích bởi Lê Như Xuân và ctv, 1994) bên cạnh đó thì sức sinh sản tùy thuộc vào tuổi cá. Trung bình 1 con cá tra đẻ mỗi lần khoảng 30.000-40.000 trứng. Trứng cá tra khá nhỏ, có tính dính. Đường kính trung bình 1mm. Trứng đẻ ra và trương nước với đường kính là 1.5-1.6mm (Đoàn Khắc Độ, 2008). Đặc điểm chung của vi khuẩn Vi khuẩn (Bacteria từ tiếng Hy lạp Baktron có nghĩa là cái gậy) được hiều theo hai nghĩa: Nghĩa hẹp và nghĩa rộng. Theo nghĩa rộng, vi khuẩn bao gồm tất cá vi sinh vật được xếp trong lớp Schizomycetes. Theo nghĩa hẹp, vi khuẩn không bao gồm các nhóm niêm vi khuẩn (Myxobacteriales), xạ khuẩn (Actiromycetales) và xoắn thể (Sporochaetales). Vi khuẩn có một số đặc điểm sau (Theo Bergey, 1957): Hình thái cấu tạo: Vi khuẩn chia làm 3 loại: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn. Cầu khuẩn: Không có tiên mao, không có khả năng di động. Ở động vật thủy sản gặp: Streptococcus và Staphylococcus. Kích thước 0.5 – 1um. Trực khuẩn: Có hình que. Động vật thủy sản gặp: Pseudomonas, Aeromonas, Virio. Kích thước 0.5 – 1um. Xoắn khuẩn: Có một hoặc nhiều vòng xoắn. Ít gặp ở động vật thủy sản. Kích thước (0.5 – 0.3) x (5 – 10) um ít gây bệnh trên động vật thủy sản. Màng tế bào: Vi khuẩn thường được bao bọc nhiều lớp màng. Ngoài lớp vỏ dày (capsule) hoặc lớp dịch nhày, tiếp là lớp thành tế bào còn gọi là lớp màng tế bào, bên trong là màng tế bào chất. Tế bào chất: Là thành phần chính của tế bào vi khuẩn. Thành phần chủ yếu là phức chất lipoprotein. Khi còn non tế bào chất cấu tạo đồng nhất bắt màu giống nhau khi nhuộm màu. Khi già do xuất hiện không bào và các thể ẩn nhập và các cơ quan con khác: Mezoxom, Ribosom, không bào, các hạt chất dự trữ, các hạt sắc tố. Nhân tế bào: Vi khuẩn thường có nhân dạng nguyên thủy. Không phân hóa thành khối rõ rệt như tế bào vi sinh vật khác (nấm men, nấm mốc, tảo lục,…) Tiên mao và khả năng di động: Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ các cơ quan đặc biệt gôi là tiên mao (flagella). Tiên mao là sợ nguyên sinh chất rất mảnh chiều rộng 0,01-0,05 um, chiều dài 6-9 um có khi tới 80-90 um. Loài vi khuẩn không có tiên mao, chúng không có khả năng di động. Bào tử và sự hình thành bào tử: Một số loài vi khuẩn trong giai đoạn phát triển nhất định có thể hình thành trong tế bào thể hình tròn hay bầu dục gọi là bào tử (Spores) thường gặp ở hai giống Bacillus và Clostridium. Mỗi tế bào chỉ hình thành một bào tử có sức sống rất lâu, chịu được điều kiện bất lợi của noại cảnh ở nhiệt độ 1000C Bacillus cereas chịu được 2,5 phút, Bacillus asterosporus-7,5 phút, B.subtilis-180 phút, bào tử của một số vi khuẩn sống được sau khi đun sôi 5 ngày liền. Thậm chí ở 1800C vi khuẩn gây ngộ độc thức ăn (Clostridium leotulinum) vẫn có thể sống được 10 phút. Do đó muốn tiêu diệt vi khuẩn ta phải khử trùng ở nhiệt độ 65-1700C trong hai giờ. Đặc điểm của tác nhân gây bệnh phù đầu xuất huyết trên cá tra Ở Việt nam, bệnh xuất huyết trên cá tra - basa (Pangasius bocourti), cá tra (Pangasius hypopthalmus) nuôi trong ao – bè, cá bóng tượng (Oxyeleotris marmoratus) và cá trê giống (Claras sp) được xác định tác nhân gây bệnh là A. hydrophila thuộc giống Aeromonas. Ngoài ra, còn tìm thấy các vi khuẩn Aeromonas spp gây bệnh trên cá trám cỏ (Ctenopharyngodon idellus), cá tai tượng (Ophronemus gouramy) (Bùi Quang Tề, 2006). Vi khuẩn Aeromonas a. Phân loại: Theo Bùi Quang Tề (2006), vi khuẩn Aeromonas được phân loại như sau: Ngành: Proteobacteria Lớp: Grammaproteobacteria Bộ: Aeromonadales Họ: Aeromonadaceae Giống: Aeromonas Trong giống Aeromonas chia làm 2 nhóm Nhóm 1: Aeromonas không di động (A. Salmonicida) thường gây bệnh trên cá nước lạnh. Nhóm 2: Aeromonas di động (A. Hydrophyla), (A. Sobria), (A. Caviae). Đặc điểm chung của ba loại vi khuẩn này là di động bằng tiên mao. b. Phân bố: Chúng sống trong môi trường nước ngọt, gây bệnh cho động vật thủy sinh, phát triển trong môi trường yếm khí. (Bùi Quang Tề, 2006) c. Hình thái: Vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn hai đầu tròn. Kích thước 0.5 – 1 um, thành phần Guanin + Cytozin trong ADN là 57 - 63 mol%. Sự hoại tử thử trên máu thỏ của hai loài vi khuẩn A. hydrophyla khác với A. sobria (Olivier vµ ctv, 1981). A. hydrophyla dung huyết trên thạch máu khi nuôi cấy ở nhiệt độ 100C và 300C nhưng A. sobria chỉ dung huyết ở 300C. các vi khuẩn từ Aeromonas đều được phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A. hydrophyla. Hình 2.2 Aeromonas sp 2.3.2 Pseudomonas a. Phân loại: Theo Bùi Quang Tề (2006), vi khuẩn Pseudomonas được phân loại như sau: Ngành: Proteobacteria Lớp: Grammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas b. Phân bố: Chúng phân bố trong môi trường đất – nước, chúng có thể gây bệnh cho người, động vật, thực vật. Chúng phát triển trong môi trường đơn giản và hiếu khí. Đa số chúng có thể oxy hóa hoặc số ít không oxy hóa và không lên men trong môi trường O/F Glucose. (Bùi Quang Tề, 2006) c. Hình thái: Vi khuẩn Gram âm hình que hoặc hơi uốn cong, không sinh bào tử. Di chuyển bằng một hoặc nhiều tiên mao. Chúng sinh sắc tố màu vàng xanh, xanh, xanh nhạt. Giới hạn nhiệt độ phát triển rộng từ 4-430C. Thành phần Guamin, Cytoxin trong DNA là 55-64 mol %. Chúng được phân lập từ da, gan, thận và là tác nhân gây bệnh ở cá (P. fluorescens, P. chlororaphis, P. anguilliseptica, P. dermoalba, P. putida). (Bùi Quang Tề, 2006) Hình 2.3 Pseudomonas Biểu hiện bệnh lý Vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá basa (Pangasius bocourti) được gây cảm nhiễm trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) có trọng lượng trung bình 10gr/con bằng cách tiêm vào xoang bụng và cơ và biểu hiện bệnh lý cũng tương tự như vi khuẩn được phân lập từ cá basa bệnh. Aeromonas, Pseudomonas được phân lập từ da, mang, ruột, tim, gan, thận (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1996). Aeromonas Bệnh nhiễm trùng ở động vật thủy sản thường biểu hiện: Hoại tử da và cơ có đốm đỏ xuất huyết, vây bị phá hủy và xuất huyết, tia rách nát, cụt dần, vẩy (dựng) rộp và bong ra, da xuất huyết, xoang bụng sưng to, các cơ quan nội tạng bị xuất huyết, viêm nhũn (dịch hóa), ruột viêm và chứa đầy hơi (Bùi Quang Tề, 2006). Đối với cá tra - basa có dấu hiệu bệnh lý cụ thể như sau: Dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn hoặc bỏ ăn, nổi lờ đờ trên tầng mặt, da cá đổi màu tối không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp. Xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, các góc vây, quanh miệng, râu xuất huyết hoặc bạc trắng. Xuất hiện vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét thường có nấm, ký sinh trùng bám vào. Phù đầu, mắt lồi đục, hậu môn viêm xuất huyết, bụng chướng to. Vây rách và cụt dần (Bùi Quang Tề, 2006). Giải phẫu nội tạng: Xoang bụng (mô mỡ) cá basa xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật – thận sưng, ruột, dạ dày, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất huyết. Có trường hợp cá basa có 2 đoạn ruột lồng vào nhau (Bùi Quang Tề, 2006). Pseudomonas Cục bộ hoặc đại bộ phận da cá xuất huyết, biểu hiện rõ ở hai bên thân và phía bụng, gốc vây lưng hoặc toàn bộ vây lưng đều xuất huyết, các tia vây rách nát cụt dần. Có lúc ruột xuất huyết và viêm nên gọi là bệnh xuất huyết. Thời kỳ đầu, ở cán đuôi có một điểm trắng sau đó lan dần về trước cho đến vây lưng và vây hậu môn, cả đoạn thân sau màu trắng. Bệnh nặng cá thường cắm đầu xuống, đuôi hướng lên, cá chết hàng loạt (dấu hiệu này thường gặp ở cá giai đoạn cá hương, cá giống) (Bùi Quang Tề, 2006). Phân bố và lan truyền bệnh Bệnh xuất huyết thường gặp ở các đối tượng thủy sản nước ngọt nuôi lồng, bè, ao như: cá mè vinh, cá chép, cá trám cỏ, cá tra,… Bệnh đã xuất hiện ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan,… Bệnh xuất hiện quanh năm, ở miền Bắc vào mùa xuân - thu, ở miền Nam vào mùa mưa. Đối với nhóm vi khuẩn Aeromonas có thể gây bệnh trên baba, bệnh đỏ chân ở ếch với tỷ lệ chết ở ĐVTS 30 – 70%, riêng ở cá giống tỷ lệ chết 100%. Ở Việt Nam, chúng ta đã phân lập được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas gây bệnh trên ĐVTS. Bệnh do Pseudomonas thường xuất hiện quanh năm (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1996). Chẩn đoán bệnh Dựa vào dấu hiệu bệnh lý, mùa vụ bệnh và phân lập vi khuẩn để chẩn đoán bệnh chính xác (Bùi Quang Tề, 2006). 2.7 Tổng quan về bệnh và tình hình nghiên cứu về bệnh phù đầu xuất huyết trên cá Tra – Basa. 2.7.1 Tổng quan về bệnh trên cá tra – cá basa Cùng với sự phát triển về sản lượng và trình độ thâm canh, tình hình bệnh trên cá nuôi gần đây tại An Giang có những diễn biến phức tạp gây tổn thất lớn cho nghề nuôi cá tại địa phương. Theo báo cáo của Agifish (1997), gần 100% cá thu hoạch đều có biểu hiện bệnh lý là những đốm đỏ với những cường độ nhiễm khác nhau. Do cá bị bệnh, tỉ lệ cá dạt (hạ phẩm cấp hoặc loại bỏ) trong quá trình chế biến 1997 lên đến 30%, trung bình 20%, thấp nhất 8 – 10%.. tình trạng cá bị dạt kéo dài gần suốt một năm. Cá fiilet có những đốm đỏ trong thịt, tùy theo mức độ nhiều hay ít mà bị hạ loại hay trả lại chủ bè. Trường hợp cá fillet xuất hiện những đốm trắng, thì chủ bè nhận lại toàn bộ lượng cá bị nhiễm bệnh (Agifish, 1998). Theo các công trình nghiên cứu về bệnh cá nuôi tại An Giang và các cán bộ kỹ thuật ngành thủy sản công tác tại địa phương, các loại bệnh cá phổ biến là: bệnh ký sinh trùng ở mang, da, ruột, bệnh nấm thủy mi, bệnh còi, bệnh đốm trắng, bệnh xuất huyết, trướng bụng, lở loét, cụt đuôi… (Phan Văn Ninh và ctv, 1993). Trong đó các loại bệnh gây tổn thất lớn là: Bệnh cá còi: cá bị bệnh, gầy yếu, sinh trưởng chậm, dài đòn, thân mất nhớt trắng nhợt, mang tái nhợt, các vi lưng, ngực,, đuôi xuất huyết và rách xơ xác, bỏ ăn, bơi lờ đờ, nổi đầu đớp không khí liên tục. Đàn cá mắc bệnh này thường có hiện tượng cá chết lai rai, kéo dài đôi ba tháng. Nhìn chung, tỷ lệ tử vong do bệnh gây ra không cao nhưng các cá thể mắc bệnh không thể hồi phục. Hiện nay, chưa có phương thức phòng và trị bệnh (Đoàn Văn Tiến, 1993). Bệnh lở loét: thân cá lở loét, mắt lồi đục, viêm loét gốc vi lưng, vi ngực, các tia cứng vi lưng, vi đuôi bị đứt, tia vi mềm bị tưa rách hay cụt mất gần hết phần đuôi, vi bụng, vi ngực xuất huyết. Cá bơi lờ đờ trên tầng mật ở cuối bè dưới dòng nước chảy. Cá có thể nhiễm bệnh nặng, bụng trướng to, nổi ngữa bụng trôi xuôi theo dòng nước. Trong thời kỳ bệnh xuất hiện tùy theo mức độ cảm nhiễm mà số lượng cá chết hằng ngày từ vài kilogram đến 50 – 60kg (bè ông Nguyễn Văn Chanh, xã Long An, huyện Tân Châu, tháng 6/1997). Bệnh xuất huyết: cá mắc bệnh kém ăn hay bỏ ăn, bơi lội nhào lộn bất thường, mắt lồi đục, hậu môn đỏ lồi, bụng trướng to, vành môi, xoang miệng và các vi có đốm xuất huyết, biểu hiện rõ nhất ở vi hậu môn và vi đuôi. Trường hợp cấp tính bệnh gây tỷ lệ tử vong cao đến 80 – 90%. Trường hợp mãn tính thịt cá có điễm xuất huyết màu đỏ và bị loại bỏ hoặc hạ phẩm cấp trong quá trình chế biến xuất khẩu. Hiện nay chưa có biện pháp phòng trị hữu hiệu và bệnh xuất huyết (đôi khi còn gọi là bệnh đốm đỏ) tiếp tục gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi cá tại An Giang. Bệnh gan thận mủ: cá mắc bệnh không biểu hiện bệnh lý bên ngoài rõ ràng. Cá gầy, mắt lồi, cá bệnh nặng sẽ bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước và tỉ lệ chết cao. Bên cạnh đó, cá còn biểu hiện xuất huyết hậu môn, các vi và một ít ở lườn bụng. Nội quan xuất hiện nhiều đốm trắng đục trên gan, thận và tỳ tạng. Giai đoạn đầu, cá bệnh thì đốm trắng xuất hiện đầu tiên ở thận kế tiếp là tỳ tạng. 2.7.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh phù đầu xuất huyết trên cá tra – cá basa nói riêng và cá nước ngọt nói chung. 2.7.2.1 Trong nước Các nghiên cứu về bệnh xuất huyết trên đối tượng cá nước ngọt còn hạn chế về số lượng, tập trung chủ yếu trên các loài cá nuôi. Các công trình đã công bố bao gồm: bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas spp. gây ra trên cá trám cỏ (Ctenopharyngodon idellus) nuôi lồng ở miền bắc (viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, 1997; Cục bảo vệ nguồn lợi - Bộ Thủy Sản, 1997). Bệnh xuất huyết trên cá basa (Pangasius bocourti) và cá he (Puntius altus) nuôi tại Châu đốc (Phan Văn Ninh và ctv, 1993), cá trê (Clarias sp.) giống ở Thành phố Hồ Chí Minh (Vũ Thị Tám và ctv, 1994), cá bống tượng (Oxyeleotris marmoeatus) ở hồ Trị An và Tiền Giang (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1995). Theo Phan Văn Ninh và ctv (1993), dấu hiệu bệnh lý của cá mắc bệnh xuất huyết: vành môi trên, dưới bị xuất huyết, hầu hết các gốc vi đều bị xuất huyết. Cá bệnh nặng, vành mắt bị xuất huyết, mắt lồi đục, bụng trướng to. Giải phẩu nội quan: gan xuất huyết, gan sưng to, màu tái. Lách sưng to, màu đen sẩm. Dạ dày, đoạn ruột đầu và giữa xuất huyết, thành bụng mỏng. Xoang bụng chứa dịch máu. Bệnh xuất huyết trên cá he (Puntius altus) nuôi bè do vi khuẩn Aeromonas sp. có dấu hiệu bệnh lý như sau: các gốc vi xuất huyết, cá bệnh nặng các gốc vi viêm loét, thân cá viêm từng vùng, chổ viêm xuất huyết đỏ, vảy dựng và tuột ra, các vùng tuột vẩy, vết loét ngày càng rộng. Quan sát bên trong, ruột bở, gan nhiễm dịch mật (Phan Văn Ninh và ctv, 1993). Từ cá bệnh đã phân lập được các chủng vi khuẩn Steptococcus sp., Staphylococcus epidermidis, Aeromonas sp. (Phan Văn Ninh và ctv, 1993), Aeromonas hydrophila (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1996), Aeromonas salmonicida (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1995). Các chủng vi khuẩn Steptococcus sp., Aeromonas hydrophila phân lập từ cá basa (Pangasius bocourti) được gây cảm nhiễm trên cá tra cũng thấy có xuất hiện dấu hiệu bệnh lý như cá basa bệnh (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1996). Bệnh xuất huyết trên cá trê (Clarias sp.) giống do vi khuẩn A. hydrophila thường xảy ra ở cá trên 2 tuần tuổi, biểu hiện bệnh lý: cá mất nhớt, các gốc vi đều xuất huyết, các râu cong và bị cụt, bụng trướng to chứa đầy dịch máu, cá treo trên mặt nước hay nằm sát đáy bể. Có trường hợp, cá bị u loét trên đều (gần xương trẩm), nổi hạch trắng hai bên gốc vi ngực. Cá nhiễm bệnh sẽ tách bầy và họat động yếu ớt. Bệnh lây lan nhanh chóng, từ khi phát hiện bệnh xảy ra trong bầy nuôi đến 2, 3 ngày là gây chết hàng loạt (Vũ Thị Tám và ctv, 1994). Cá trê giống bệnh được điều trị dựa vào kháng sinh đồ của vi khuẩn đã phân lập. Bệnh xuất huyết trên cá bống tượng do vi khuẩn A.salmonicida, A. hydrophila được mô tả biểu hiện bệnh lý lâm sàng như sau: cá bị mất nhớt, bắt đầu ở phần đuôi, sau lan dần lên phần thân, vây đuôi tưa cụt, gốc vây hậu môn, vây lưng xuất huyết, phần đuôi cứng và ửng đỏ, một số trường hợp trên thân xuất hiện đốm đỏ. Trường hợp nặng, các đốm này lan rộng và làm hoại tử cơ, bụng trướng phồng, hậu môn lồi ra ngoài và sưng đỏ. Khi mổ cá thấy đa số mẫu gan bị xuất huyết hay sậm màu, lách chuyển màu sậm, bong bóng xuất huyết, cơ quan tiêu hóa không chứa thức ăn mà chứa đầy các chất dịch nhầy. Vi khuẩn A. salmonicida, được thực nghiệm gây cảm nhiễm trở lại, xác định vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1995). Ngoài ra, còn một số công bố về bệnh xuất huyết do Pseudomonas spp. ở cá trám cỏ, trắm đen, cá trê (viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, 1997; Cục bảo vệ nguồn lợi - Bộ Thủy Sản, 1997). 2.7.2.2 Trên thế giới Bệnh xuất huyết do vi khuẩn gây ra trên nhiều loài cá nuôi và tự nhiên trong sông, ao, hồ, đầm nước ngọt. Bệnh được khảo sát từ hiện tượng dịch bệnh lở loét ở cá EUS (Epizootic Ulcerative Syndrome) thuộc khu vực Đông Nam Á. Biểu hiện bệnh lý bên ngoài của cá chép (Cyprinus carpio) bị nhiễm bệnh là mất vẩy, những đốm đỏ do xuất huyết không đều trên da, cơ quan bên trong trướng lên và có màu tái. Các vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh là A. salmonicida, A. hydrophila, Pseudomonas fluorescens. Khi tiêm những vi khuẩn này vào cá khỏe, thì có những dấu hiệu bệnh lý như cá bệnh được khảo sát ban đầu (Angka S.L 1983). Dấu hiệu xuất huyết và hoại tử cũng được ghi nhận ở gan, thận, tụy, ruột cá trê giống (Clarias batrachus) nhiễm A. hydrophila; và những biến đổi tồ chức bệnh học LD50 cũng được mô tả ( Angka,1990). Sự bộc phát của bệnh nhiễm trùng máu xảy ra ở những trại nuôi cá xung quanh Jakarta và Bogor (Indonesia). Bệnh xuất hiện phổ biến trên cá tai tượng Osphronemus gouramy, làm xuất huyết, tổn thương trên da. Các vi khuẩn phân lập được là Pseudomonas sp., Micrococcus sp., Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens và Bacillus sp., những vi khuẩn này được thí nghiệm cảm nhiễm và lập kháng sinh đồ (Angka S.L and K.G. Lioe 1982). Bệnh đốm đỏ cho cá nuôi xảy ra thuộc miền tây Java, gồm các loại vi khuẩn đã được phân lập và xác định xem như tác nhân gây bệnh A. salmonicida, A. punctata và P. fluorescens, chúng gây bệnh hầu hết cho các loài cá nuôi trong những ao có thay nước, ao nước tù động và bè (Angka và ctv, 1982). Bệnh vi khuẩn bọc phát ở cá vào cuối năm 1980 được xem là trận dịch động vật nghiêm trọng nhất từng xày ra ở (Indonesia). Tổng lượng cá chết là 125 tấn cá chép (Cyprinus carpio), trong đó gồm 50% cá bố mẹ. Những nghiên cứu cho thấy hầu hết những loài cá nuôi và cá tự nhiên đều bị cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila. Các loài cá nước ngọt khác nhau từ những địa phương khác nhau: cá chép (C. carpio), cá lóc (Ophicephalus striatus), cá trê (Clarias batrachus), cá tai tượng (Osphronemus gouramy) cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, Pseudomonas sp., P. fluorescens, Flexibacter columnaris, Streptococcus sp., Vibrio sp. và V. anguillarum (Supriyadi,1988). Các giống vi khuẩn có khả năng gây bệnh được phân lập từ hai loài cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) và cá mè hoa (Aristichthys nobilis) của Malaysia nhập khẩu, được nghiên cứu trong thời gian 5 tháng. Phần lớn các vi khuẩn có roi và bắt màu Gram âm thuộc các giống Aeromonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Pseudomonas, Flavobacterium và Chromobacterium phân lập trên các cơ quan thận, gan, ruột và mang. Nhiểu vi khuẩn dạng cầu Gram dương như Micrococcus, Staphylococcus cũng có khả năng gây bệnh cho cá. Riêng giống Bacillus được xem không gây bệnh (Shamsudin, 1986). Cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus) nuôi bè dọc theo sông Nan, tỉnh Nakornsawan - Thailand, trong thời gian 2 năm (1984 -1985) bị bệnh nghiêm trọng, vi khuẩn tìm thấy phổ biến nhất, gần 90% cá bệnh bị nhiễm bởi A. hydrophila, Pseudomonas sp. Hai loài Edwardsiella tarda và Streptococcus sp. cũng tìm thấy nhưng kém ưu thế hơn. Dấu hiệu bệnh lý là mắt lồi với những vết thương xuất huyết trên thân, vẩy dựng lên (Chanchit và ctv, 1986). Vi khuẩn A.hydrophila gây ra những vết loét trên thân cá chép được nghiên cứu bằng cách gây cảm nhiễm trên 100 con cá, có chiều dài 20 cm. Kết quả khoảng 80% cá chết. Khảo sát cá sau khi chết thấy những vết thương đặc trưng của bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết A. hydrophila đã được tái phân lập từ cơ, gan, máu của tim (Saitanu và Wongsawang, 1982). Vi khuẩn A.hydrophila cũng được xác định là tác nhân gây bệnh xuất huyết cho cá lóc (Ophicephalus striatus) (Tonguthai và ctv, 1989). Cá basa (Pangasius bocourti) đực và cái thành thục nuôi trong bè gỗ nhiễm A. hydrophila 50% (25/50) gây những vết tổn thương điển hình trên da (Tanasomwang và Saitanu, 1979). 2.7.2.3 Các nghiên cứu về những loại bệnh do vi khuẩn Aeromonas và Pseudomonas gây ra trên đối tượng thủy sản. Giống Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae gồm các loài vi khuẩn bắt màu Gram âm hình roi với hai đầu tròn, di động trên một tiên mao, không hình thành bào tử. Nhiệt độ tăng trưởng thuận lợi nhất là 22 – 280C và không tăng trưởng ở 350C. Chúng xuất hiện rộng rãi trong nước ngọt, nước thải gây bệnh cho cá, hiếm khi gây bệnh cho người (Munro và Hastings, 1993). Giống Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaccae, bắt màu Gram âm, trực khuẩn hoặc hình roi cong thanh mảnh, không hình thành bào tử, thường di động bằng một hoặc nhiều tiên mao. Phản ứng Oxydase dương tính, nhưng đôi khi xuất hiện những chủng phản ứng Oxydase âm tính. Nhiệt độ tăng trưởng từ 4 – 430C, tăng trưởng tốt ở nhiệt độ thấp. Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước và có thể là tác nhân cơ hội gây bệnh cho người, động vật, thực vật (Inglis và Hendrie, 1993). Ở việt nam bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) - cá basa (Pangasius bocourti) nuôi bè, cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus) và cá trê giống (Claras sp.) được xác định tác nhân gây bệnh là A. hydrophila thuộc giống Aeromonas. Ngoài ra, còn tìm thấy các vi khuẩn Aeromonas spp. gây bệnh trên cá trám cỏ (Ctenopharyngodon idellus), cá tai tượng (Ophronemus gouramy). Aeromonas salmonicida, A. hydrophila trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus). A. hydrophila được biết là loài gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết di động (Lewis và Plumb, 1979) và được xem là một trong những loài gây bệnh trên cá nước ngọt quan trọng nhất. Cơ chế gây bệnh của nó chưa được biết. Bệnh lở loét bộc phát nhiều nơi gây chết cá 80 – 90%, phân lập thì thấy có xuất hiện A. hydrophila chiếm ưu thế. Bệnh bắt đầu từ cá tự nhiên hoặc cá nuôi, khó kiểm soát và gây hại dẫn đến tử vong (Angka, 1990). Aeromonas sp., Pseudomonas sp. và Enterobacteriaceae phân lập từ da, mang, ruột, gan tim, thận từ 48 cá chép (Cyprinus carpio), 12 cá tai tượng (Ophronemus gouramy), 15 cá trê (Clarias sp.). Những vi khuẩn này được cảm nhiễm nhân tạo, kết quả cho thấy tương tự như nhiễm tự nhiên (Bastiawan và ctv, 1982) Những thành tựu về nghiên cứu các vi khuẩn nước ngọt thuộc giống Aeromonas và Pseudomonas ở một số nước Đông Nam Á khá nhiều Shariff .M.J, J.L. Torres, A.T. Law và Shamsudin (1988). Nghiên cứu độc lực (virulence) của vi khuẩn A. hydrophila, được chia làm 3 loại: độc lực mạnh, yếu và không độc. Torres và ctv, (1990). Xác định độc tính của Aeromonas spp. phân lập từ cá khỏe và cá nhiễm hội chứng dịch lở loét (EUS - Epizootic Ulcerative Syndrome). Đồng thời nghiên cứu mối liên quan giữa huyết thanh cới Aeromonas spp. di động nhiễm trên cá khỏe và cá bệnh từ hiện tượng EUS (Epizootic Ulcerative Syndrome). Taufik và Wong, (1990). Nghiên cứu vi khuẩn thuộc các giống Aeromonas, Pseudomonas gây bệnh cá trê (Clarias batrachus) và (C. macrocephalus) trên 3 môi trường nuôi cấy chọn lọc (Cytophagar Agar, Rimler - Shotts R-S, Centrimide agar), 1 môi trường không chọn lọc (Tryptic Soy Agar – TSA) với tổng số mẫu 449 Aeromonas chiếm 73,6%; Pseudomonas chiếm 0,4%. Duremjez và Lio Po, (1985). Xác định và mô tả đặc tính sinh lý học của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens gây chết cá (Sarotherodon niloticus) con. Lio Po và ctv (1990). Định lượng vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ da và cơ cá lóc (Ophiocephalus striatus), cá trê (Clarias batrachus) ở mức độ tổn thương khác nhau: bình thường, nhẹ, trung bình, nặng trên môi trường TSA và R-S. kết quả cho thấy A. hydrophila xuất hiện trên mẫu cá lóc 90%, trên mẫu cá trê 30%. Chinabut và ctv, (1988). Nghiên cứu sự nhạy cảm của cá lóc (O. striatus) đối với Aeromonas hydrophila dưới điều kiện khác nhau về chất lượng nước qua những thông số: DO, pH, độ kiềm và độ cứng của nước. Kết quả cho thấy cá chết với số lượng đáng kể trong điều kiện môi trường không thuận lợi. Hình 2.4 Đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra - basa CHƯƠNG3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp thu thập số liệu Số liệu về vị trí địa lý, kinh tế xã hội, tình hình sản xuất phát triển nông nghiệp và thủy sản tỉnh An Giang, thu thập từ các văn bản báo cáo định kỳ, tài liệu lưu trữ của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, cục Thống kê, sở Khoa học Công nghệ và môi trường, công ty xuất nhập khẩu Thủy sản An Giang (Agifishco). Phỏng vấn trực tiếp các cán bộ thủy sản và cán bộ quản lý tại địa phương có nuôi cá tra – basa về tình hình nuôi và hiện tượng bệnh bộc phát. Phỏng vấn người nuôi cá tra – basa bè về kỹ thuật nuôi cá, sự xuất hiện bệnh, triệu chứng mùa vụ. Các số liệu thu thập từ kết quả xử lý, phân tích mẫu cá tra – basa bệnh về vi khuẩn học, thực nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trở lại cá khỏe được thực hiện tại phòng thí nghiệm Thủy sản Trường Đại học Tây đô. 3.2 Thời gian và địa điểm thu mẫu 3.2.1 Thời gian Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 2/2012 đến tháng 6/2012. 3.2.2 Địa điểm thu mẫu Sông tiền: mẫu cá basa bệnh, thu tại các bè nuôi cá tại ấp Long châu, xã Long an, huyện Tân châu và ấp Long thạnh, xã Long sơn, huyện Phú tân Sông hậu: mẫu cá thu tại xí ngiệp đông lạnh thủy sản số 7 thuộc Agifish. 3.3 Phương pháp kiểm tra tổng thể mẫu cá Mẫu còn tươi, cá vừa mới chết được đo chiều dài, cân trọng lượng, quan sát bằng mắt thường những dấu hiệu biểu hiện bệnh lý bên ngoài về hình dạng, trạng thái, mùi, màu sắc cá, các bộ phận như mắt xoang miệng, mang, hậu môn và các vi. Giải phẩu quan sát biểu hiện bệnh lý nội quan ở gan, lách, thận, dạ dày, ruột, bóng hơi, mô mỡ, xoang bụng. 3.4 Phương pháp thu, bảo quản, vận chuyển, xử lý sơ bộ cá 3.4.1 Phương pháp thu Thu mẫu cá bệnh ở bè: cá tra – basa có biểu hiện bất thường như bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước hoặc trôi ngửa bụng dưới dòng nước chảy, cá còn thở thoi thóp và vớt lên bằng vợt. Thu mẫu cá bệnh tại xí nghiệp đông lạnh: cá tra – basa nguyên liệu còn sống, được vận chuyển bằng ghe đụt, trước khi đưa vào xẻ thịt, quan sát bên ngoài thấy có biểu hiện các dấu hiệu bệnh lý và chúng không được sử dụng để chế biến được thu làm mẫu nghiên cứu. 3.4.2 Bảo quản, vận chuyển, xử lý sơ bộ cá. Cá tra - basa thu được, trước tiên phải đánh số mẫu vật, ghi tên cá, thời gian, địa điểm thu mẫu, tên người thu. Mẫu vật thu, nghiên cứu về vi khuẩn định tính được cấy trong môi trường BHI chứa trong ống nghiệm 5ml. Các ống nghiệm được cột bó chặt, gối giấy kín, đựng trong hộp nhưa và tránh nghiêng đổ. Mẫu vật nghiên cứu vi khuẩn định lượng: đựng gan cá trong túi PE, dán kín, giữ lạnh trong thùng xốp. Sau khi xử lý sơ bộ, vận chuyển mẫu vật bằng xe từ nơi thu mẫu đến phòng thí nghiệm Khoa Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Tây Đô. Thời gian từ lúc thu mẫu đến khi xử lý tại phòng thí nghiệm không quá 24 giờ. 3.5 Phương pháp phân lập, nuôi cấy và định danh vi khuẩn 3.5.1 xử lý mẫu phân tích định tính Vi khuẫn phân lập từ các cơ quan gan, thận, lách của cá cấy trực tiếp vào môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth) chứa trong ống nghiệm 5ml được thanh trùng bằng Autoclave, để vào tủ ấm, nhiệt độ 300C, trong 24 giờ. Khi vi khuẩn đã tăng sinh khối, được cấy truyền sang môi trường không chọn lọc (nonselective media) TSA (Tryptone Soya Agar) và chọn lọc (selective media) Aeromonas Isolation Medium Base. Tất cả để trong tủ ấm, nhiệt độ 300C. Khi khuẩn lạc mọc đầy đủ, chọn những khuẩn lạc rời chiếm ưu thế, tiếp tục nuôi cấy tại môi trường TSA, chọn giống thuần rồi cấy sang môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) để lưu giống. Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp Hucker’s Modification. Thực hiện các phản ứng sinh hóa, định danh vi khuẩn theo hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey (1981). Sử dụng các phản ứng sinh hóa thực hiện định danh vi khuẩn 1. Oxydase 2. Catalase 3. OF/O ; OF/ F 4. KIA 5. MR - VP 6. Simons citrate 7. Phenylalanine (agar) 8. Urea 9. Indol 10. Nitrat 11. Arginine 12. Ornithine 13. Lysine 14. H2S Production 15.Motility 16. KCN 17.ONPG 18. Gelatine 19. Glucose (gas) 20. Latose 21. Arabinose 22. Maltose 23. Sucrose (Saccarose) 24. Rhaminose 25. Malnitole 26. Sorbitole 27. Galactose 28.Inositole Sử dụng API 20E định danh vi khuẩn phân lập lần 2 3.5.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ Lập kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy của Kirby – Bauer 3.5.3 Xử lý mẫu định lượng vi khuẩn Bằng phương pháp pha loãng liên tiếp. Cắt một mẫu gan cân trọng lượng 1gr, cho vào cối thủy tinh giã nhuyễn. Cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lý 0,85% NaCl đã thanh trùng, khuấy đều bằng máy lắc. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 1 chứa 9ml nước muối sinh lý, trộn đều, lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm thứ 2 chứa 9ml nước muối sinh lý. Từ ống nghiệm thứ 2, lấy 1ml cho vào ống nghiệm thứ 3, cứ thế tiếp tục ống nghiệm 4, 5, 6. Mỗi ống nghiệm lấy 0.1 ml dàn đều (spread plate method) trên đĩa môi trường PCA (Plate Count Agar) bằng đũa thủy tinh (mổi ống nghiệm đếm 2 đĩa). Giữ các đĩa trong tủ ấm 300C, trong 24 giờ, đếm khuẩn lạc trên 2 đĩa tính trung bình tổng số khuẩn lạc (CFU/gr). 1 mL 1 mL Mẫu nước 9 mL 9 mL 9 mL 10-1 10-2 10-3 Quy trình pha loãng canh khuẩn 3.6 Phương pháp gây nhiễm trở lại 3.6.1 Xác định mật độ vi khuẩn Chủng vi khuẩn thí nghiệm được nuôi tăng sinh trong môi trường BHI, cấy truyển sang môi trường TSA, gạn khuẩn lạc hòa vào 3 ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lý có chứa 0,85% NaCl. Với 3 mật độ khác nhau thể hiện qua 3 độ đục: cao, trung bình, thấp. Mẫu canh khuẩn pha loãng theo qui trình pha loãng liên tiếp đếm khuẩn lạc. Chọn 3 ống canh khuẩn có mật độ thấp nhất trong cùng 1 dãy, mỗi ống canh khuẩn của mỗi mật độ lấy 0.1 ml dàn đều trên 2 đĩa môi trường PCA ủ trong tủ ấm 300C, trong 24 giờ, đếm khuẩn lạc, lấy trung bình tổng số, tính mật độ vi khuẩn/ml. 3.6.2 Ương cá để thí nghiệm 3.6.2.1 Chuẩn bị bể ương Vệ sinh bể ương và cấp nước vào bể qua túi lọc có sục khí, để lắng nhằm loại bỏ Chlorine trước khi thả ương. 3.6.2.2 Nguồn cá thí nghiệm Cá tra – basa được sinh sản nhân tạo sau khi nở 10 ngày tuổi được mua và vận chuyển từ trại giống đến phòng thí nghiệm Khoa Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Tây Đô, ương với mật độ 1con/ 4lít, thể tích nước bể ương là 400 lít 3.6.2.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành trong nhà có mái che sáng tối và sục khí liên tục, thời gian thí nghiệm là 75 ngày, thể tích nước ương là 400L/bể với mật độ 1con/4L. 3.6.2.4 Thức ăn và phương pháp cho ăn Trong quá trình nuôi, thức ăn dùng là trứng nước (Moina) trong tuần lễ đầu, tuần thứ 2 trở đi cá ăn trùng chỉ (Tubifex). Moina, trùng chỉ được xử lý bằng formol trước khi cho ăn. 3.6.2.5 Chăm sóc và quản lý Trong quá trình ương, thường xuyên hút cận do phân, thức ăn thừa, thường xuyên thay nước 1 lần/ngày, mỗi lần 30 – 80% lượng nước trong bể. 3.6.3 Phương pháp gây cảm nhiễm Cá thí nghiệm gồm 100con, chia làm 4 nhóm. Nhóm cá đối chứng 10con, mỗi con tiêm vào xoang bụng 0,1 ml dung dịch muối sinh lý (0,85% NaCl) đã thanh trùng. Các cá thể ở 3 nhóm còn lại (30 con/nhóm) được tiêm vào xoang bụng 0,1 ml canh khuẩn có lượng vi khuẩn lần lượt theo từng nhóm là 103, 105, 107 cfu/ml (bảng ….) 3.6.4 Chăm sóc theo dõi cá Sau khi tiêm, cá được thả trong bể mỗi bể 10 con theo từng nhóm thí nghiệm, hằng ngày chăm sóc, theo dõi theo phương thức nêu trên. Thời gian theo dõi lá 15 ngày hoặc đến khi toàn bộ cá thí nghiệm chết. Trong quá trình theo dõi, ghi nhận thời điểm 50% số cá cảm nhiễm chết, ghi nhận dấu hiệu bệnh lý của cá chết. Nồng độ gây nhiễm Đối chứng 107 cfu/ml 105 cfu/ml 103 cfu/ml Liều lượng tiêm 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Bể thí nghiệm số 1 2 5 8 Bể thí nghiệm số 3 6 9 Bể thí nghiệm số 4 7 10 Bảng 4 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm khuẩn trên cá tra Thí nghiệm được thực hiện 2 đợt của 2 chủng vi khuẩn khác nhau Thu mẫu cá vừa chết tại phòng thí nghiệm, phân lập vi khuẩn, xác định tác nhân gây bệnh 3.7 Phương pháp tổng hợp xử lý số liệu Các số liệu thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý phân tích theo phương pháp thống kê toán học thông dụng. CHƯƠNG4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN Tìm ra tác nhân gây bệnh xuất huyết trên vi, xoang miệng của cá tra Pangasianodon hypophthalamus, đồng thời xác định chính xác tác nhân gây bệnh chủ yếu và thứ cấp khi cá bị bệnh xuất huyết. KẾ HOẠCH THỰC HIỆN Bảng 5 Kế hoạch thực hiện Nội dung cần thực hiện T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 Viết đề cương và chỉnh sửa X Nộp đề cương X Bảo vệ đề cương X Bố trí và theo dõi thí nghiệm X X Báo cáo tiến độ thực hiện đề tài X Thu và xử lý số liệu X X X Viết báo cáo và chỉnh sửa X X X Nộp bài X Báo cáo X DỰ TRÙ KINH PHÍ Nội dung Số lượng Đơn giá Thành tiền (đồng) Văn phòng phẩm Đề cương 6 cuốn 20.000 đồng/cuốn 120.000 Luận văn 6 cuốn 40.000 đồng/cuốn 240.000 Tài liệu liên quan 100.000 Vật liệu và mẫu vật thí nghiệm Cá con 100 con 1.100 110.000 Thức ăn 20 kg 8.300 166.000 Phân tích mẫu Phân tích vi khuẩn 200.000 Chi phí khác 200.000 Tổng 1.136.000 (Một triệu một trăm ba mươi sáu nghìn đồng) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Cacot. , 1998. “Descirpition of the sexual cycle related to the environment and set up of the artificial propagation in Pangasius bocourti (Sauvage, 1880) and Pangasius hypothlamus (Sauvage, 1878) reared in floating cages and in the Mekong delta”, pp. 71 – 90, in M. Legedre and pariselle (Editors), the Biological Diversity and Aquaculture of Clariid and Pangasius Catfishes in South – East Asia. Proceeding of the Mid – term workshop of the “Catfish Asia Project” 11 – 15 May 1998, Can Tho, Viet Nam. Amin, A.K.M Rohul, M.A.J Bapary, M.S. Islam, M. Shajahan and M.A.R. Hossain., 2005. The inpacts of compensatory growth on food intake, growth rate and efficiency of feed utilization in Thai pangas (Pangasius hypothlamus). Pakistan Journal of Biological Sciences 8, pp. 766-770, 2005. Robert, T.R and C. Vidthayanon, 1991. Systematic revition of the asian catfish family Pangasius with Biological observation and decription of threenew species. Proceeding of the Academy of Nature Sciences of the Philadephia, 143:97 – 144pp. Slembrouck J., L. T Hung, J Subadgia and M. legendre, 1980. Effect of prey quality, feeding level, prey assessibility and aeration on growth of survival of Pangasius hypothlamus lavae (Siluriformes Pangasidae), pp 137 – 146. Tiếng Việt Dương Thúy Yên, 2003. Khảo sát một số tính trang hình thái, sinh trưởng và sinh lý của cá basa (pangasius bocourtiI) và cá tra (Pangasius hypothlamus) và con lai của chúng. Luận văn thạc sĩ, khoa thủy sản trường Đại học Cần thơ. Dương Nhựt Long, 2003. Giáo trình nuôi thủy sản nước ngọt, khoa Thủy sản Đại học Cần thơ. Dương Nhựt Long, 2008. Phát triển bền vững mô hình nuôi cá tra thăm canh trong ao đất vùng đồng bằng sông Cửu Long. Tài liệu tập huấn, khoa thủy sản Đại học Cần thơ. Đoàn Đắc Độ, 2008. Kỹ thuật nuôi cá tra – basa trong bè. Nhà xuất bản Đà Nẵng. Lê Như Xuân và ctv, 1994. Kỹ thuật nuôi cá nước ngọt, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần thơ. Sở khoa học công nghệ và môi trường tỉnh An Giang. Nguyễn Thị Phương Linh, 2008. Một số đặc điểm sinh học của năm dòng cá tra (Pangasius hypothlamus) ở An Giang và Đồng Tháp. Nghiêm Thị Nguyệt Thu, 2010. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ ương lên sự phát triển của cá tra, khoa Thủy sản Đại học Cần thơ. Phạm Văn Khánh, 2000. Kỹ thuật nuôi cá tra – basa trong bè. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2. Trần Thị Bé, 2006. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mức độ và hiệu quả sử dụng thức ăn của cá tra (Pangasius hypothlamus) giai đoạn cá giống, khoa Thủy sản trường Đại học Cần thơ. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản, trưởng Đại học Cần thơ. Bùi Quang Tề, 2006. Giáo trình bệnh học Thủy sản – Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1. Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007. Miễn dịch học động vật thủy sản, trường Đại học Cần thơ. Melba G. Bondad-Reantaso NACA, Bangkok, Thailand, Sharon E. McGladdery DFO-Canada, Moncton, New Brunswick, Iain East AFFA, Canberra, Australia, và Rohana P. SubasingheFAO, Rome, 2005. Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên Động vật thủy sản Châu Á – tài liệu kỹ thuật thủy sản FAO.