Nghiên cứu xác định các hợp chất phenol trong nước bằng phương pháp sắc kí lỏng - Đầu dò điện hóa

PHẦN TỔNG QUAN 9 CHƯƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN 1.1- Giới thiệu các hợp chầt Phenol và dẫn xuất. Phenol có nhiều dẫn xuất phụ thuộc vào nhóm thế gắn lên vòng hương phương của Phenol. Các dẫn xuất họ Phenol vừa do các phản ứng phân huỷ của thực vật, các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên , vừa do hoạt động sản suất của các nhà máy tạo ra. Theo Tổ chức bảo vệ môi trường của Mỹ - ( EPA ) [ 24] hiện có 11 hợp chất Phenol gây ô nhiễm môi trường chủ yếu hiện nay là: 4-Cloro-3-Methylphenol, 2- Clorophenol, 2,4-Diclorophenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,4-Dinitrophenol, 2-Methyl- 4,6-Dinitrophenol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentaclorophenol, 2,4,6- Triclorophenol và Phenol. Ngoài ra, còn nhiều dẫn xuất họ Phenol khác như : Pyrocatechol, Resorcinol, 3-NitroPhenol, 1,3-Diclorophenol, 2,3,4,6-Tetraclorophenol …. Các dẫn xuất họ Phenol đều rất độc, chỉ một lượng rất nhỏ trong nước ( > 1 ppb ) cũng đã ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ của con người cũng như các loài sinh vật sống trong môi trường nước. Khi nồng độ của Phenol và các dẫn xuất nhỏ hơn 1 ppb tuy có độc tính thấp cũng ảnh hưởng nhiều đến mùi vị, màu sắc của nước và đời sống của các loài sinh vật trong nước. 1.1.1- Tính chất vật lí và tính chất hóa học của các hợp chất Phenol[1-2,24] 1.1.1.1- Tính chất vật lí của các hợp chất Phenol. Phenol có công thức phân tử là C6H5OH. Đa số các hợp chất Phenol tồn tại dạng rắn ở nhiệt độ phòng như Phenol, Nitrophenol, các dẫn xuất Clorophenol ( gồm 2 nhóm thế –Cl trở lên) …, một số hợp chất Phenol khác tồn tại ở dạng lỏng như Cresol, mono-Clorophenol ( gồm chỉ một nhóm thế –Cl ). Bảng 1.1: Tính chất vật lí của một vài hợp chất Phenol. STT Công thức phân tử Khối lượng phân tử Trạng thái vật lý Điểm chảy Điểm sôi Tính tan trong nước (20oC) 10 11 1 C6H5OH Phenol 94 chất lỏng hoặc chất rắn 43oC 181oC 9.3g/100g OH 2 C6H4(OH)2 Resorcinol 110,1 chất rắn màu vàng 110oC 182oC - OH OH 3 C6H4(OH)2 Pyrocatechol 110,1 chất rắn màu trắng 105oC 245.5oC 43g/100g OH OH 4 C6H5NO3 p-nitrophenol 139,11 tinh thể màu vàng 114oC 279.0oC - OH NO2 1.1.1.2- Tính Chất Hoá Học Của Các Hợp Chất Phenol Phenol là dẫn xuất của Hydrocarbon thơm do sự thế một nguyên tử -H trong nhân bằng một nhóm -OH. Tuỳ theo các nhóm thế gắn lên vòng hương phương của Phenol mà có các dẫn xuất khác nhau. Hầu hết các hợp chất Phenol đều có tính acid. 12 Các nhóm thế thường được gắn lên vòng hương phương của Phenol là: nhóm –Nitro, nhóm – Methyl hoặc nhóm –Cloro …. Vòng hương phương của Phenol có thể gắn đồng thời nhiều nhóm thế giống nhau hoặc khác nhau. Một vài loại phản ứng mà các hợp chất Phenol thường tham gia : „- Phản ứng Eter hoá. „- Phản ứng Ester hoá. „- Phản ứng tạo thành muối trong môi trường kiềm. „- Phản ứng trên vòng hương phương như phản ứng Nitro hoá, Halogen hoá, Alkil hoá, Sulfon hóa …. Phản ứng Nitro hoá: MonoNitro hóa Phenol có thể thực hiện với acid Nitric loãng tại nhiệt độ phòng. -H CH3Cl O-OH O-CH3 Phenol PhenylMetyl Eter OH CH3-CO-Cl OOC-CH3 + HCl Phenol Phenylacetate OH- O-+ +OH H2O Phenol Ion Phenolate OH HNO3 OH NO2 Phenol O-Nitrophenol 13 Với acid Nitric đậm đặc, sự đa Nitro hóa Phenol tạo thành 2,4,6- Trinitrophenol. Phản ứng Halogen hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng trí hoán với nước brom ở vị trí orto và para để tạo trầm hiện màu trắng là 2,4,6-Tribromophenol. Đây cũng là phản ứng biểu tánh thông dụng để nhận biết Phenol. Phản ứng Alkil hoá: Phenol phản ứng với halogenur alkil với xúc tác là Phản ứng Sulfon hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng sulfon hoá tạo thành sản phẩm trí hoán orto hoặc para. Sản phẩm chính tuỳ thuộc vào điều kiện nhiệt độ phản ứng. HNO3đđ OH OH NO2 NO2 O2N Phenol 2,4,6-Trinitrophenol + 3 Br2 ( H2O ) OH OH Br Br Br Phenol 2,4,6-Tribromophenol AlCl3 hoặc AlBr3 OH CH3Cl / AlCl3 + HCL OH CH3 Phenol o-Methylphenol H2SO4 đđ , 100 0C OH H2SO4 đđ 250C 1000C SO3H OH HO3S OH o-Sulfonphenol p-Sulfonphenol Phenol 14 Phản ứng Oxid hoá. Các hợp chất Phenol dễ bị Oxid hoá tạo thành các hợp chất Quinon như Benzoquinon. Tác nhân Oxid hoá có thể là Oxi trong không khí. 1.1.2- Nguồn gốc, độc tính, ảnh hưởng, liều lượng cho phép của Phenol và dẫn xuất trong môi trường nước .[9 – 10, 23 – 28, 38 ] 1.1.2.1- Nguồn gốc, độc tính và ảnh hưởng của các hợp chất Phenol và dẫn xuất. Phenol và dẫn xuất có trong các ngành công nghiệp như dệt, nhuộm, nhựa, thuốc, thuốc trừ sâu, chất chống oxi hoá, giấy, công nghệ dầu hoả …. Ngoài ra, hợp chất Phenol cũng được sinh ra tự nhiên như sự phân hủy của thực vật, các hợp chất hữu cơ …. Hầu hết các hợp chất Phenol khi được thải rửa từ các nhà máy đều đi vào môi trường nước. Chúng không những gây ô nhiễm môi trường sinh thái mà còn gây hại đến con người và các loài sinh vật sống trong nước. Con người nếu tiếp xúc trong thời gian dài với các hợp chất Phenol có thể bị bệnh ung thư. Các kết quả nghiên cứu [ 38 ] cho thấy Phenol và dẫn xuất có độc tính cao. Giá trị LC50 ( nồng độ gây chết 50 % số cơ thể người hay động vật khi cơ thể đó được đưa vào một lượng nhất định chất độc ) và EC50 ( nồng độ gây hại 50 % quần thể trong điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng ) đối với giáp xác và cá vào khoảng 3 – 7 mg/l. Những ảnh hưởng chính đến cơ thể con người gồm tác động đến tim, gây đau hệ hô hấp, gây nhiễm acid trong quá trình trao đổi chất, hỏng thận, sự tuần hoàn máu, ảnh hưởng hệ thần kinh…. Liều thấp nhất có thể gây tử vong bằng đường tiêu hoá là khoảng 4.8 g và trong thời gian không quá 19 phút. Những triệu chứng do hít phải Phenol như chán ăn, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt…. Các hợp chất Phenol rất dễ bị phân hủy khi để ở nhiệt độ phòng, trong môi trường tự nhiên ( từ vài ngày đến một tuần ) và phân huỷ rất nhanh dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Do vậy, trong quá trình xác định hay cất trữ, các hợp chất OH O2 O O + H2O Phenol Benzoquinon Phenol cần được bảo quản trong bình chứa xẫm màu, để trong môi trường kín và có nhiệt độ nhỏ hơn 4oC. 1.1.2.2- Hàm lượng cho phép của Phenol và dẫn xuất trong nước. Bảng 1.2: Giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ Phenol và dẫn xuất Đối tượng Hàm lượng Phenol tổng (mg/l) Nước sinh hoạt 0.001 mg/l Nước bề mặt Nước dùng cho nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản 0.02 mg/l Nước ngầm 0.001 mg/l Đổ vào các khu vực dùng làm nguồn nước cấp cho sinh hoạt ≤ 1 mg/l Dùng làm nguồn nước tưới tiêu, bơi lội, nuôi trồng thủy sản ≤ 2 mg/l Nước thải Không được phép đổ ra môi trường ≥ 5 mg/l Theo điều luật 80/778/EC do cộng đồng Châu Âu ban hành thì hàm lượng Phenol tổng cộng được phép hiện diện trong nước uống là 0.5 μg/l và 0.1 μg/l cho mỗi chất 1.2- Một sồ phương pháp được dùng để xác định các hợp chất Phenol. 1.2.1- Phương pháp sắc kí [3-4, 8, 12, 17– 37 ] 1.2.1.1- Nguyên tắc. Sắc ký là một kỹ thuật tách những hỗn hợp gồm nhiều chất thành các thành phần đơn giản và định lượng từng chất. Dựa vào ái lực của các cấu tử với pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký 15 có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất cần phân tích ở lại. Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động. Sự tác động này đối với từng chất khác nhau do đó chất cần phân tích có thể ra nhanh hay chậm. Ngoài ra cột sắc ký phải đủ dài để sự tiếp xúc giữa chất cần xác định và pha tĩnh được lặp lại nhiều lần. Quá trình di chuyển của pha động bên trong cột sắc ký gọi là quá trình rửa giải. 1.2.1.2- Phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ (GC-MS) Dẫn xuất t-butyldimethylsilyl giữa các chất họ Phenol với N-(t- butyldimethylsilyl) - N- methyl-trifluoroacetamid được xác định bằng phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ bẫy ion (IT-MS). Ở chế độ tiêm không chia dòng, 2μL mẫu xác định được cho vào cột DB-5 MS 30 m × 0.25 μm cùng với chương trình nhiệt thích hợp cho phép xác định 11 hợp chất Phenol trong nước sông và nước biển ở giới hạn phát hiện từ 0.010 μg/l đến 0.045 μg/l. Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép xác định 2,4-Dinitrophenol và hợp chất methyl Phenol ở hàm lượng vết. 1.2.1.3- Phương pháp sắc ký lỏng với dầu dò khối phổ (LC-MS) Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế sắc ký phân bố pha đảo. 15 hợp chất họ Phenol trong nước và bùn được xác định bằng phương pháp LC-MS ở chế độ ion hóa hóa học tại áp suất thường (APCI) dưới dạng ion âm. Với chương trình gradient dòng thích hợp cho pha động gồm Metanol, Acetonitrin, acid Acetic 0.005%, việc tách và định lượng đồng thời 15 hợp chất Phenol được tiến hành ở chế độ quét chọn lọc ion (SIM). Phương pháp này có ưu điểm là cho phép nhận danh chính xác các hợp chất Phenol nhờ đầu dò khối phổ, giới hạn phát hiện thấp trong khoảng từ 10-50 ng/l. Tuy nhiên thiết bị phân tích lại đắc tiền. 1.2.1.4- Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò UV o-Cresol, m-Cresol, Phenol, Resorcinol, Cathechol và Hidroquinon trong nước tham gia phản ứng tạo dẫn xuất với Benzoyl clorua trong vòng 15 phút. Các dẫn xuất Benzoyl này được chiết bằng dung môi Diethylether, sau đó được xác định 16 bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ở bước sóng 232 nm với pha động gồm Acetonitrin-Tetrahydrofuran-nước (54:6:40,v:v:v). Phương pháp đơn giản này cho phép xác định hàm lượng Phenol trong rượu và nước uống với giới hạn phát hiện từ 0.05 đến 0.50 μg/l, hiệu suất thu hồi trong khoảng 81 - 94%, độ lập lại của phương pháp cao, thời gian phân tích ngắn. 1.2.1.5-. Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò điện hóa Đầu dò điện hóa là một trong những đầu dò rất chọn lọc do mỗi chất có khả năng oxi hóa hoặc khử tại mỗi thế khác nhau. Đầu dò điện hóa được ứng dụng rộng rãi vì chúng đơn giản, không đắt tiền. Tuy nhiên chúng có khuyết điểm là khó sử dụng, thời gian cân bằng rất dài, nhạy đối với tốc độ dòng và pH. Bề mặt điện cực dễ bị nhiễm bẩn nên cần hoạt hóa lại điện cực sau một thời gian ngắn sử dụng. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò điện hóa là tại một giá trị thế áp thích hợp, quá trình oxi hóa hay khử của chất điện hoạt tại bề mặt điện cực làm việc sẽ sinh ra dòng điện. Dòng điện đó được sử dụng như tín hiệu phân tích và tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với nồng độ chất điện hoạt đi qua đầu dò. Dòng điện sinh ra trong pin điện hóa được tính theo định luật Faraday: Q = nFN Q: Số Coulomb n: số điện tử bị mất đi hoặc nhận được. N: số phân tử chất phân tích F: 96500 C / 1 mol electron Đầu dò điện hóa có gồm ba điện cực: điện cực chỉ thị, điện cực so sánh và điện cực hỗ trợ. Thế làm việc được đo giữa điện cực chỉ thị và điện cực so sánh. Nhờ vào hoạt tính điện cực của các hợp chất Phenol, phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 và đầu dò điện hóa thường được sử dụng để xác định hàm lượng vết các chất họ Phenol bằng các loại điện cực khác nhau. Với thành phần pha động gồm dung dịch đệm có pH thích hợp và Acetonitrin hoặc Metanol, giá trị thế áp ở điện cực làm việc lớn hơn +1V, cho phép xác định hàm lượng vết của các hợp chất Phenol trong nước và trong thực phẩm. Các phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao và ít chất gây nhiễu. 17 1.2.2-Phương pháp quang [ 5, 11, 13 ] Phương pháp Trắc quang [ 13 ]: các hợp chất Phenol được cho phản ứng với 4- Aminoantipyrin ở pH = 10 với sự hiện diện của Kali Hexacyanoferat (III) để tạo phẩm màu Antipyrin. Đo độ hấp thu của dung dịch phẩm màu này trong pha nước ở bước sóng 510 nm, qua đó xác định được nồng độ của các hợp chất Phenol. Phương pháp này có giới hạn phát hiện trong khoảng từ 2 μg/l đến 10 μg/l. Phương pháp Hoá phát quang [ 5 ]: các hợp chất Phenol làm giảm sự phát quang hoá học của p-Chlorobenzen Diazonium Fluoroborat ( p-CBDA ) khi có mặt H2O2 trong môi trường kiềm. Phản ứng giữa p-CBDA và H2O2 tạo ra hoá phát quang mạnh trong môi trường kiềm. Các hợp chất Phenol có thể làm giảm cường độ hoá phát quang của phản ứng này và khi nồng độ các hợp chất Phenol tăng lên, cường độ hoá phát quang cũng giảm theo một cách tuyến tính. Qua đó xác định được hàm lượng của các hợp chất Phenol có trong mẫu phân tích. Giới hạn phát hiện của phương pháp này có thể đạt đến 1 μg/l. Phương pháp Huỳng quang [ 11 ]: các hợp chất Phenol bị kích thích và chuyển lên trạng thái năng lượng cao hơn. Ở trạng thái kích thích, điện tử kém bền, chỉ tồn tại trong khoảng thời gian rất ngắn từ 10-13 đến 10-8 giây và có xu hướng giải phóng năng lượng đã hấp thu để trở về trạng thái cơ bản ban đầu. Quá trình giải phóng năng lượng sẽ phát ra ánh sáng. Đo lượng ánh sáng phát ra, qua đó xác định được hàm lượng của các hợp chất Phenol có trong mẫu phân tích. Phương pháp huỳnh quang có khoảng tuyến tính từ 0.05 μg/l đến 18 μg/l và có giới hạn phát hiện là 0.02 μg/l. 1.2.3-Phương pháp cực phổ xung vi phân [ 28 ] Trong dung dịch nền CaCl2, với sự hiện diện của các cation kim loại nặng như Chì và Cadimi, hàm lượng các hợp chất nitrophenol, dinitrophenol và các dẫn xuất nitrophenol khác trong mẫu nước sông và nước thải công nghiệp được xác định đồng thời bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với điện cực thủy ngân. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, độ nhạy cao, cho phép xác định đồng thời các kim loại nặng thường hiện diện trong nước thải. Tuy nhiên việc sử dụng điện cực thủy ngân độc hại lại là một hạn chế đáng kể của phương pháp. 18 1.3- Giới thiệu sơ lược về hệ thống sắc kí lỏng[ 3 - 4, 8, 17 – 23 ] Sắc kí lỏng được dùng để tách hỗn hợp các chất có trong mẫu phân tích thành từng chất riêng biệt, qua đó định tính và định lượng được từng chất có trong mẫu. Quá trình tách các chất dựa trên ái lực giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động. Trong sắc kí lỏng, pha tĩnh và pha động đóng vai trò rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích. 1.3.1- Một vài thông số quan trọng được sử dụng trong định tính và định lượng các chất phân tích. - Thời gian lưu TR: là thời gian từ lúc bắt đầu cho mẫu vào cột đến lúc mũi xuất hiện trong một điều kiện phân tích nhất định ( pha tĩnh, pha động, tốc độ dòng … ). Một chất có thời gian lưu cố định và không phụ thuộc vào các thành phần khác có trong mẫu. Do vậy, thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho mỗi chất và được dùng để định danh trong kỹ thuật sắc kí. - Hệ số phân bố K : là tỷ số giữa nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh và nồng độ chất đó trong pha động. K = CS/CM CS: Nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh. CM: Nồng độ chất phân tích trong pha động. K càng lớn, chất phân tích càng có ái lực với pha tĩnh. - Hệ số dung lượng K’: K’ = K x VS/VM VS: Thể tích chiếm trong pha tĩnh. VM: Thể tích chiếm trong pha động. Nếu K’ > 20, thời gian rửa giải lâu, mũi bị bành rộng. Nếu K’ < 1, thời gian rửa giải nhanh, các mũi bị chập. - Số đĩa lý thuyết N: là tỷ số giữa chiều dài cột sắc kí với chiều cao đĩa lý thuyết. N = L / H L: Chiều dài cột sắc kí. H: Chiều cao đĩa lý thuyết. 19 20 Số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao. Ngoài ra, số đĩa lý thuyết còn được tính dựa trên sắc lí đồ N = 16 x ( TR/WB )2 TR: Thời gian lưu của mũi sắc kí. WB: Bề rộng đáy của mũi sắc kí. - Độ phân giải RS: biểu thị khả năng tách của hai mũi trên sắc kí đồ. Với TR,A , TR,B : Thời gian lưu của chất A và chất B ( phút ). WA, WB: Bề rộng đáy của mũi A và mũi B ( phút ). : 2 mũi tách được. : 2 mũi không tách được. Hai mũi tách hoàn toàn khi Rs > 1.5. Khi WA = WB và K’A - K’B Với: N: Số đĩa lý thuyết trung bình của 2 mũi A và B kế cận nhau. K’: Hệ số chứa trung bình của 2 mũi A và B kế cận nhau. Để tăng hệ số phân giải, cần phải thay đổi lần lượt 3 yếu tố: Tăng hệ số chọn lọc " bằng cách chọn pha tĩnh thích hợp hoặc thay đổi thành phần pha động. Giảm hệ số chứa K’ bằng cách thay đổi khả năng rửa giải của dung môi. 2 ,, AB ARBR s WW TT R − − = : 2,, BA BRBR WWTT +>− 2,, BA BRBR WWTT +<− N K KRs ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ + ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ ∝ −∝ = '1 '1 4 1 Tăng số đĩa lý thuyết N bằng cách tăng chiều dài cột ( chủ yếu dùng trong sắc kí khí ) hoặc giảm chiều cao đĩa lý thuyết. 1.3.2- Các thiết bị trong hệ thống sắc kí lỏng được sử dụng để xác định Phenol và dẫn xuất. 1.3.2.1- Hệ thống pha động Dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi khác nhau để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Có thể sử dụng chế độ đẳng dòng để rửa giải các chất trong quá trình phân tích. Tuy nhiên, đối với hỗn hợp có nhiều chất phân tích bị chập và nhiều chất có thời gian lưu dài khi dùng chế độ đẳng dòng, ta có thể dùng chế độ gradient dòng để tách các chất phân tích bị chập và rút ngắn thời gian lưu của các mũi ra sau. Yêu cầu đối với pha động được dùng: Dung môi chuyên dùng cho HPLC và được đuổi khí thật kĩ trước khi sử dụng. Không tương tác hoá học với pha tĩnh và làm thay đổi đặc tính của pha tĩnh. Không gây ảnh hưởng trong quá trình thu tín hiệu các chất phân tích. 1.3.2.2- Hệ thống bơm Bơm được dùng để cung cấp áp lực cần thiết giúp pha động di chuyển trong hệ thống. Bơm được sử dụng cho hệ thống HPLC để xác định các hợp chất Phenol là bơm vừa hút vừa đẩy hai piston vì bơm này đạt một số yêu cầu sau: Dòng chảy được loại bỏ xung. Tốc độ dòng chảy linh hoạt, thông thường từ 0.1 đến 10 ml/phút. Điều khiển tốc độ dòng chảy đúng. Có thể tạo ra áp suất cao (6000 psi ) Được làm từ chất liệu chống ăn mòn và chống dung môi 1.3.2.3- Bộ phận tiêm mẫu Bộ phận tiêm mẫu bằng tay gồm 6 cổng và hai vị trí van bao gồm vòng Loop mẫu từ 20 đến 100 :l. 21 22 Hình 1.1: Hệ thống vòng Loop tiêm mẫu. Có hai vị trí tiêm mẫu là vị trí A và vị trí B. Vị trí A là vị trí trước khi tiêm mẫu. Sau khi tiêm mẫu, van được chuyển sang vị trí B và pha động sẽ đưa mẫu vào cột. Hệ thống tiêm mẫu này được dùng phổ biến hiện nay trong hệ thống sắc kí lỏng vì thể tích mẫu tiêm vào có độ lặp lại cao. 1.3.2.4- Cột sắc kí pha đảo Trong HPLC, việc tách hỗn hợp các chất có trong mẫu phân tích thành từng chất riêng biệt được thực hiện bởi ái lực tương đối khác nhau giữa các hợp chất có trong mẫu phân tích với pha tĩnh của cột và pha động rửa giải. Hiện nay, cột sắc kí phân bố pha đảo thường được dùng trong hệ thống sắc kí lỏng để tách các chất phân tích. Cột pha đảo có pha tĩnh là chất lỏng được gắn lên chất mang rắn. Pha tĩnh được cấu tạo gồm một mạch alkyl ( -CH2-CH2-CH2-CH3 ) gắn lên một chất mang rắn, thường là silica. Hình 1.2: Cấu tạo của pha tĩnh dùng trong cột pha đảo. Có 3 loại mạch alkyl thường được dùng là C4, C8 và C18. Trong đó, C4 thường được dùng cho protein, C8 và C18 được dùng cho các phân tử nhỏ. 1.3.2.5- Đầu dò điện hóa (ECD ) Đầu dò được dùng để xác định các hợp chất có trong mẫu phân tích khi ra khỏi cột. Khi rửa giải, một hợp chất có trong mẫu sẽ thực hiện một phản ứng oxi- hoá hay phản ứng khử tại bề mặt điện cực chỉ thị và được xác định như một mũi trong sắc kí đồ. Thời gian lưu của mũi trong điều kiện nhất định được dùng để nhận danh hợp chất. Chiều cao, diện tích mũi tương ứng với lượng hợp chất có trong mẫu. Một đầu dò lý tưởng phải có những đặc tính sau: độ nhạy, độ ổn định, độ đáp ứng cao, khoảng tuyến tính rộng, thời gian đáp ứng ngắn, dễ hoạt động…. Và điện cực Glassy carbon có thể đáp ứng các điều kiện này. Ngoài ra, điện cực Glassy carbon cho tín hiệu cao tại thế làm việc thấp, khoảng thế làm việc rộng, bền cơ học và khả năng chịu dung môi cao. Để chất phân tích trong dung dịch đến thực hiện một phản ứng oxi-hoá hay phản ứng khử tại bề mặt điện cực chỉ thị, nó phải hoàn tất một quá trình gồm 3 bước sau: Bước 1: Chất phân tích khuếch tán đến bề mặt điện cực chỉ thị: sự khuếch tán trong chất lỏng tại nhiệt độ phòng tương đối chậm, do vậy nhiệt độ đầu dò thường được duy trì ở mức cao hơn 5 độ C so với nhiệt độ phòng. Hệ số khuếch tán pha lỏng có giá trị từ 1 đến 10x10-6 cm/sec2. Bước 2: Chất phân tích thực hiện một phản ứng oxi-hoá hoặc phản ứng khử trên bề mặt điện cực chỉ thị. Bước 3: Chất phân tích khuếch tán ra khỏi bề mặt điện cực chỉ thị. Khi vận tốc pha động và độ dày lớp khuếch tán không đổi, dòng điện sẽ tỷ lệ với nồng độ chất phân tích. Khi hệ số phân bố K, hệ số dung lượng K’ và độ phân giải RS của cột không đổi, chiều cao và diện tích mũi tương ứng với nồng độ chất phân tích được tiêm vào cột. 23 24 „- Phản ứng của Phenol trên điện cực chỉ thị và các yếu tố ảnh hưởng. Các hợp chất Phenol dễ bị oxi hóa. Tại một thế thích hợp trên điện cực chỉ thị, các hợp chất Phenol bị oxi hóa thành các gốc tự do Phenoxy [ 23 ] và được khuếch tán ra khỏi bề mặt điện cực. Hình 1.3 Gốc tự do Phenoxy : Phản ứng của Phenol trên điện cực chỉ thị Glassy carbon Đầu dò Điện hóa có độ chọn lọc cao, chỉ những hợp chất có khả năng điện hoạt mới phản ứng trên trên điện cực chỉ thị, do đó khả năng gây ảnh hưởng lên quá trình xác định các hợp chất Phenol sẽ giảm đi. Trong mẫu xác định không được chứa các muối vô cơ vì các muối này sẽ phản ứng tạo thành kim loại rắn và bám lên bề mặt điện cực chỉ thị, khi đó sẽ làm giảm độ nhạy trong quá trình phân tích. „- Một số lưu ý khi dùng đầu dò điện hoá Khi sử dụng đầu dò điện hoá, một số vấn đề sau cần làm và cần tránh để không làm hư điện cực trong quá trình sử dụng: Dung môi động phải được đuổi khí Oxi thật kỹ bằng máy đuổi khí chuyên dụng vì trong dung môi động có khí Oxi và sẽ làm hư điện cực trong quá trình sử dụng. Trong dung dịch pha động luôn chứa ion Cl- với nồng độ nhất định, phù hợp với điều kiện làm việc. Nếu không sẽ làm hư điện cực so sánh. Rửa điện cực khi thấy độ nhạy bị giảm xuống. Quá trình rửa điện cực được thực hiện như sau: - Rửa và làm sạch bề mặt điện cực bằng dung dịch kim cương ( diamond slury ) và bộ rửa chuyên dụng. - Tạo kết tủa AgCl trên điện cực so sánh bằng dung dịch chuyên dụng. - Điện cực tiếp tục được rửa bằng acid Nitric 10-2 M tại tốc độ dòng là 0.2 ml/phút. - Quét thế để làm sạch bề mặt điện cực. Thế quét từ (-) 500 mV đến(+)1.2 V. - Rửa lại bằng nước cất hai lần đến trung tính. Quá trình làm sạch điện cực như trên đã cho kết quả phân tích có độ lặp lại tốt ( độ lệch nhỏ hơn 5 % ) giữa ba lần rửa điện cực. Thời gian sử dụng điện cực trước khi làm sạch khoảng 300 giờ. Đầu dò Điện hoá có thời gian để ổn định dài. Thông thường, để đầu dò Điện hoá ổn định phải mất từ 90 đến 120 phút. 1.4- Giới thiệu sơ lược về chiết pha rắn SPE [ 28 - 37 ] Kỹ thuật chiết pha rắn đã được phát triển mạnh trong thời gian gần đây để tách làm giàu trước khi xác định các chất ô nhiễm hữu cơ độc hại trong môi trường. Cơ sở lý thuyết của kỹ thuật chiết pha rắn chính là sự kết hợp giữa chiết lỏng và tách sắc ký. Khi nồng độ chất phân tích trong mẫu thật nhỏ, việc làm giàu là rất quan trọng. Kỹ thuật SPE có ưu điểm so với phương pháp chiết lỏng-lỏng cổ điển là ít tiêu tốn dung môi, qui trình chiết nhanh, đơn giản, hiệu suất chiết cao, độ chọn lọc tốt hơn. Để đảm bảo quá trình chiết pha rắn cho kết quả phân tích tốt, quá trình chuẩn bị chiết pha rắn cần được thực hiện qua 5 giai đoạn cơ bản sau: Tính chất của chất phân tích như độ phân cực, kích thước phân tử … cần phải được biết rõ để lựa cho cột chiết pha rắn phù hợp. Chất phân tích tồn tại trong môi trường: nước, dung môi hữu cơ hay một môi trường khác để lựa cho cột chiết phù hợp. Cột chiết pha rắn được hoạt hoá bằng một dung môi hữu cơ phân cực và được cân bằng bằng nước hay đệm. Sau đó, cho dung dịch mẫu cần phân tích qua cột. Rửa tạp chất có trong mẫu bằng nước, đệm hay dung môi hữu cơ phân cực. Rửa giải chất phân tích bằng dung môi hữu cơ phân cực hay không phân cực. 25 Trong cột chiết pha đảo, nước là dung môi rửa giải yếu nhất. Một số dung môi hữu cơ thường được dùng để rửa giải là: Methylenchloride, EthylAcetate, Acetonitril, Methanol…. Hiện nay có 2 cách làm giàu trên cột chiết pha rắn là làm giàu trực tiếp và làm giàu gián tiếp 1.4.1- Kỹ thuật chiết pha rắn gián tiếp Các hợp chất phenol phân cực trong nước thường được chiết và làm giàu trên pha tĩnh các loại pha tĩnh khác nhau như C18, Carbopack, Polydivinylbenzen, Polydivinylbezen-N-vinylpyrolidon HLB Oasis [ 26 ], hoặc trên pha tĩnh Polyme Styren-divinylbezen như EnviChrom P, LiChrolut EN… [ 27- 29]. Gần đây, việc nghiên cứu chế tạo các pha tĩnh mới như Polystyren-divinylbenzen có bổ sung nhóm phân cực carboxylic nhằm nâng cao hiệu suất chiết các chất Phenol có độ phân cực cao [34]. Sau khi rửa giải với dung môi thích hợp như Acetonitril, Methanol, Dicloromethan, các hợp chất Phenol định lượng bằng phương pháp sắc ký với đầu dò UV, khối phổ, điện hóa… 1.4.2- Kỹ thuật chiết pha rắn trực tiếp Kỹ thuật này cho phép làm giàu trực tiếp và xác định đồng thời các hợp chất phenol trong quá trình phân tích. Mẫu sau khi được làm giàu trên pha tĩnh SPE, pha động rửa giải và vận chuyển các chất này đến cột phân tích để tách và định lượng các chất cần phân tích bằng đầu dò thích hợp. Phương pháp này có ưu điểm hơn so với phương pháp chiết pha rắn thông thường là ít tiêu tốn dung môi, đơn giản và việc phân tích có thể tiến hành hoàn toàn tự động. Tuy nhiên, kỹ thuật này có thể dẫn đến sự bành rộng của các mũi phân tích trên sắc ký đồ nếu pha tĩnh dùng trong SPE có tính chất khác với pha tĩnh dùng để chế tạo cột phân tích. Gần đây việc chế tạo pha tĩnh thích hợp cho kỹ thuật này là một lĩnh vực nghiên cứu rất được quan tâm. Pha tĩnh polyme có bổ sung nhóm Benzoyl [31-32] được dùng để làm giàu và xác định trực tiếp hàm lượng vết các hợp chất Phenol cũng như thuốc trừ sâu trong nước. 26