Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương

®Æt vÊn ®Ò HiÖn nay ë n­íc ta, viÖc nghiªn cøu sinh d­îc häc vµ d­îc ®éng häc cña thuèc lµ mét lÜnh vùc t­¬ng ®èi míi, ®ang ngµy cµng ®­îc quan t©m. Trong khi ®ã, ë c¸c n­íc kh¸c, ®©y lµ mét tiªu chÝ b¾t buéc c¸c h·ng D­îc phÈm ph¶i lµm nÕu muèn ®­a thuèc ra thÞ tr­êng. Mét trong nh÷ng vÊn ®Ò ®¸nh gi¸ sinh d­îc häc cña thuèc lµ møc ®é hÊp thu thuèc vµ nång ®é thuèc ®¹t ®­îc trong huyÕt t­¬ng. C¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hay dïng ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é thuèc trong huyÕt t­¬ng (dÞch sinh vËt) lµ s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ), s¾c ký khÝ (GC), s¾c ký khÝ g¾n víi m¸y khèi phæ (GC - MS ), phãng x¹ miÔn dÞch, ®iÖn di mao qu¶n.... Trong ®ã, HPLC ®Æc biÖt lµ HPLC pha ®¶o víi detector UV lµ ph­¬ng ph¸p hay®­îc dïng h¬n c¶, do tinh ­u viÖt næi tréi vÒ ®é nh¹y, tÝnh chÝnh x¸c, ®é chän läc, tÝnh kinh tÕ. §Ó cã mét qui tr×nh dïng HPLC ®¶m b¶o ®é tin cËy ®Ó ph©n tÝch thuèc trong dÞch sinh vËt, chóng ta kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn s¾c ký thÝch hîp nh­ cét; dung m«i pha ®éng; l­u l­îng dßng; b­íc sãng.... quy tr×nh xö lý mÉu, kho¶n nång ®é kh¶o s¸t. Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - lµ thuèc chèng viªm phi steroid; cã t¸c dông gi¶m ®au, chèng viªm, øc chÕ qu¸ tr×nh tæng hîp prostaglandin vµ leukotrien; øc chÕ sù kÕt dÝnh tiÓu cÇu ®­îc dïng nhiÒu trong ®iÒu trÞ thÊp khíp m·n tÝnh, ®Æc biÖt viªm ®a khíp d¹ng thÊp, tho¸i ho¸ khíp nÆng. Ketoprofen lµ thuèc míi ®­îc ®­a vµo s¶n xuÊt ë n­íc ta vµ ch­a cã tµi liÖu trong n­íc nµo ®¸nh gi¸ ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Do ®ã chóng t«i thùc hiÖn ®Ò tµi “ Nghiªn cøu x©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng” víi môc tiªu: -Kh¶o s¸t vµ lùa chän dung m«i chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng cho hiÖu xuÊt chiÕt cao. -Kh¶o s¸t vµ t×m ®iÒu kiÖn s¾c ký thÝch hîp ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng . -X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b»ng HPLC. -¸p dông ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng thuèc vµ theo dâi ®é æn ®Þnh cña ketoprofen theo thêi gian b¶o qu¶n. PhÇn i: tæng quan. 1.1 §¹i c­¬ng vÒ Ketoprofen. 1.1.1 C«ng thøc vµ tÝnh chÊt lý ho¸[1] [ 5]. CH – COOH C O CH3 - Ph©n tö l­îng : 254.29 - Tªn khoa häc :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic - TÝnh chÊt: Bét kÕt tinh tr¾ng, kh«ng mïi. Thùc tÕ kh«ng tan trong n­íc ë 200C, tan hoµn toµn trong kiÒm m¹nh, ethanol 960, aceton cloroform vµ ether. pKa =5,94 trong hçn hîp methanol - n­íc (3 : 1). Cùc ®¹i hÊp thô trong methanol ë b­íc sãng 255 nm. NhiÖt ®é nãng ch¶y kho¶ng 950C. 1.1.2 T¸c dông d­îc lý vµ d­îc ®éng häc [5] [6]. Ketoprofen lµ thuèc chèng viªm phi steroid, thuéc dÉn chÊt cña acid aryl propionic, cã t¸c dông gi¶m ®au, h¹ sèt, chèng viªm. Ketoprofen øc chÕ qu¸ tr×nh tæng hîp prostaglandin vµ øc chÕ sù kÕt tËp tiÓu cÇu. Ketoprofen ®­îc hÊp thu rÊt nhanh vµo m¸u , ®¹t nång ®é tèi ®a sau 45 - 60 phót nÕu ®Æt hËu m«n vµ 60- 90 phót sau khi uèng. Liªn kÕt víi protein huyÕt t­¬ng 99%, thêi gian b¸n th¶i lµ 1,5-2,5 giê. Sau khi uèng 4 giê nång ®é ketoprofen trong bao ho¹t dÞch cao h¬n trong m¸u. Thuèc qua ®­îc hµng rµo nhau thai. Mét phÇn nhá chuyÓn ho¸ b»ng c¸ch hydroxyl ho¸, cßn phÇn lín liªn hîp víi acid glucuronic. Th¶i trõ chñ yÕu qua n­íc tiÓu (75- 90%), mét Ýt qua ph©n( 1-8% ). ë n­íc tiÓu ( 65-75%) lµ d¹ng glucuronyl, 1% lµ d¹ng ch­a biÕn ®æi. Sau khi uèng 6 giê ketoprofen sÏ bÞ th¶i trõ 50% qua thËn. 1.1.3 ChØ ®Þnh [5] [6]: Ketoprofen ®­îc chØ ®Þnh ®iÒu trÞ dµi h¹n c¸c triÖu chøng trong: - Viªm thÊp khíp m·n tÝnh, ®Æc biÖt lµ viªm ®a khíp d¹ng thÊp, viªm cøng khíp cét sèng. - BÖnh cøng khíp g©y ®au vµ tµn phÕ. §iÒu trÞ ng¾n h¹n c¸c triÖu chøng trong c¸c c¬n cÊp tÝnh cña c¸c bÖnh: - BÖnh thÊp khíp ngoµi khíp (®au vai cÊp tÝnh, viªm g©n ... ). - Viªm khíp vi tinh thÓ. - Tho¸i ho¸ khíp. - D¹ng viªn nang cßn dïng ®Ó gi¶m ®au: ®au l­ng, ®au rÔ thÇn kinh... 1.1.4 Chèng chØ ®Þnh [6]: - DÞ øng víi ketoprofen, aspirin, vµ c¸c thuèc chèng viªm phi steroid cïng lo¹i. - LoÐt d¹ dµy-t¸ trµng tiÕn triÓn. - Suy thËn nÆng, suy gan tÕ bµo nÆng. - Phô n÷ cã thai( 3 th¸ng cuèi) vµ cho con bó. 1.1.5 T¸c dông kh«ng mong muèn [6] - T¸c dông phô ë ®­êng tiªu ho¸: khã chÞu vïng d¹ dµy-ruét, ®au d¹ dµy, buån n«n, n«n möa, t¸o bãn, tiªu ch¶y, nÆng th× loÐt d¹ dµy, xuÊt huyÕt tiªu ho¸, thñng ruét. - Nhøc ®Çu, chãng mÆt, buån ngñ. - Ph¶n øng qu¸ mÉn ë da( næi ban, mÒ ®ay, ngøa) vµ ®­êng h« hÊp (suyÔn, nhÊt lµ nh÷ng ng­êi dÞ øng víi aspirin vµ c¸c kh¸ng viªm kh«ng steroid kh¸c). - Gi¶m nhÑ hång cÇu ë ng­êi bÞ thiÕu m¸u, mét vµi tr­êng hîp gi¶m b¹ch cÇu nhÑ ®· ®­îc ghi nhËn. 1.1.6 LiÒu dïng: LiÒu khëi ®Çu: 300 mg chia lµm 3 lÇn, uèng khi no. LiÒu duy tr×: 150-200mg hoÆc n¹p ngµy 1-2 viªn thuèc ®¹n. Tiªm b¾p ngµy100-200mg chia 2 lÇn. Kh«ng nªn phèi hîp Ketoprofen víi thuèc chèng ®«ng m¸u ®­êng uèng vµ c¸c kh¸ng viªm kh«ng steroid kh¸c (kÓ c¶ salicylat liÒu cao) do lµm t¨ng nguy c¬ loÐt vµ xuÊt huyÕt tiªu ho¸. 1.1.7 D¹ng bµo chÕ [5] [6]. - Viªn nang 25mg, 50mg, 75mg. - Viªn nÐn 100mg, 150mg. - ViÕn bao tan ë ruét 50mg. - Viªn bao t¸c dông kÐo dµi 200mg, viªn nang t¸c dông kÐo dµi 100mg, 150mg, 200mg. - Thuèc tiªm 100mg. - Thuèc mì 2,5%. BiÖt d­îc: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron…. 1.1.8 C¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng. A. Ph­¬ng ph¸p acid- baz¬: §Þnh l­îng ketoprofen nguyªn liÖu, x¸c ®Þnh ®iÓm t­¬ng ®­¬ng b»ng chØ thÞ ®á phenol [18] hoÆc b»ng ph­¬ng ph¸p ®o ®iÖn thÕ [ 10] [18]. TiÕn hµnh: Hoµ tan kho¶ng 200mg Ketoprofen (c©n chÝnh x¸c) vµo 25ml alcol. Thªm 25ml n­íc vµ vµi giät ®á phenol. ChuÈn ®é víi NaOH 0,1N. Song song lµm mét mÉu tr¾ng trong cïng ®iÒu kiÖn. 1ml NaOH 0,1N t­¬ng ®­¬ng víi 25,43mg C16H14O3. - HoÆc: Hoµ tan kho¶ng 200mg Ketoprofen (c©n chÝnh x¸c) vµo 25ml alcol. Thªm 25ml n­íc ChuÈn ®é víi NaOH 0,1N, x¸c ®Þnh ®iÓm t­¬ng ®­¬ng b»ng b­íc nh¶y ®iÖn thÕ. 1ml NaOH 0,1N t­¬ng ®­¬ng víi 25,43mg C16H14O3. B. Ph­¬ng ph¸p quang phæ [7] [8][10]: Dïng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong chÕ phÈm. Hoµ mét l­îng chÕ phÈm cã chøa kho¶ng 50 mg ketoprofen (c©n chÝnh x¸c) trong 300 ml methanol 75 %, l¾c trong 10 phót, thªm methanol 75 % võa ®ñ 500 ml. Läc. LÊy 5 ml dÞch läc pha lo·ng thµnh 100 ml víi methanol 75 % vµ ®em ®o ®é hÊp thô cña dung dich nµy ë b­íc sãng 258nm; cuvet th¹ch anh cã chiÒu dµy 1 cm víi mÉu tr¾ng lµ methanol 75%. TÝnh kÕt qu¶ dùa vµo A (1%, 1cm) ë b­íc sãng 258 nm lµ 662. C. Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ). Dïng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng vµ x¸c ®Þnh t¹p chÊt trong nguyªn liÖu. stt tµi liÖu pha ®éng cét mÉu thö 1 [10] [18] §Öm phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55) C18 5mm 150*4,6 mm Nguyªn liÖu 2 [10] NH4CH3COO 1% - MeOH - ACN (55:30:15) C18 5mm 200*4,6 mm Nguyªn liÖu 3 [13] §Öm phosphat pH 3,2 - ACN (60:40) C18 2mm 250*4,6 mm HuyÕt t­¬ng 4 [12] NH4CH3COO 20 mM - MeOH; ®iÒu chØnh pH 7,0. C18 4 mm HuyÕt t­¬ng 5 [11] ACN : AcOH 1% ( 38 : 62 ). C18 10mm 3,9*300 mm HuyÕt t­¬ng 6 [16] §Öm Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ). C18 5 mm 4,6*250mm HuyÕt t­¬ng D. Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di mao qu¶n: §Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng [14] vµ t¸ch ®ång ph©n cña ketoprofen [17]. 1.2 Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ). S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( High Performance Liquid Chromatography ) cßn gäi lµ s¾c ký láng cao ¸p hay s¾c ký láng hiÖn ®¹i ra ®êi vµo nh÷ng n¨m cuèi 1960. Nã ®­îc x©y dùng vµ ph¸t triÓn kh«ng ngõng vµ ngµy cµng thÓ hiÖn râ tÝnh ­u viÖt, ®Æc biÖt lµ trong lÜnh vùc nghiªn cøu sinh d­îc häc cña thuèc. Ph©n lo¹i c¸c ph­¬ng ph¸p s¾c ký [ 2]: S¾c ký ph©n bè : + s¾c ký láng- láng. +s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt. S¾c ký hÊp phô hiÖu n¨ng cao. S¾c ký trao ®æi ion hiÖu n¨ng cao. S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao trªn gel ( s¾c ký theo lo¹i cì ). Trong ph©n tÝch sinh d­îc häc vµ kiÓm nghiÖm, ng­êi ta hay sö dông ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng ph©n bè pha liªn kÕt (Bonded Phase Chromatography ). §Æc ®iÓm ph­¬ng ph¸p [2]: Trong s¾c ký láng ph©n bè pha liªn kÕt, pha tÜnh ®­îc g¾n ho¸ häc (liªn kÕt ) víi chÊt mang ( Silicagel ) t¹o nªn hîp chÊt c¬ Siloxan Si CH3 CH3 CH3 Cl CH3 OH Si R Si Si O CH3 CH3 R + H3C H3C Nhãm Silanol DÉn chÊt DÉn chÊt Siloxan cña Silicagel clorosilan - NÕu R lµ mét nhãm Ýt ph©n cùc nh­ octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl vµ dung m«i ph©n cùc nh­ methanol, acetonitril th× cã s¾c ký pha ®¶o (s¾c ký pha ng­îc ). - NÕu R lµ nhãm kh¸ ph©n cùc nh­: alkylamin - ( - CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN vµ dung m«i Ýt ph©n cùc nh­ hexan th× ta cã s¾c ký pha thuËn. - C¸ch chän pha: th­êng chän pha tÜnh cã tÝnh chÊt ph©n cùc gièng c¸c chÊt cÇn t¸ch vµ kh¸c víi pha ®éng. Nguyªn t¾c cña ph­¬ng ph¸p [2] [3]: C¸c chÊt trong hçn hîp ®­îc t¸ch dùa trªn kh¶ n¨ng ph©n bè kh¸c nhau cña chóng vµo hai pha kh«ng hoµ lÉn vµo nhau, lu«n tiÕp xóc nhau: mét pha tÜnh vµ mét pha ®éng. Dung dÞch mÉu thö ®­îc ®­a vµo hÖ thèng s¾c ký qua van tiªm mÉu vµ ®­îc dung m«i pha ®éng kÐo tíi cét ph©n tÝch nhê mét b¬m cao ¸p. T¹i cét x¶y ra qu¸ tr×nh t¸ch, nh÷ng ph©n tö nµo cã ¸i lùc thÊp víi pha tÜnh th× ®­îc röa gi¶i ra tr­íc, cßn nh÷ng ph©n tö nµo cã ¸i lùc m¹nh víi pha tÜnh th× ®­îc röa gi¶i ra sau. ChÊt ra khái cét ®­îc ph¸t hiÖn b»ng detector g¾n víi m¸y ghi, m¸y tÝnh hay m¸y tÝch ph©n. Thêi gian l­u tR lµ ®Æc tr­ng ®Þnh tÝnh cña chÊt, chiÒu cao hay diÖn tÝch pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh l­îng cña chÊt. S¾c ký ®­îc tiÕn hµnh so víi chuÈn. Mét sè th«ng sè ®Æc tr­ng cña HPLC [2]: VÝ dô: Ta cã 1 s¾c ®å sau: - Thêi gian l­u tR ( phót ) lµ thêi gian tÝnh tõ lóc tiªm mÉu vµo hÖ thèng s¾c ký ®Õn lóc xuÊt hiÖn ®Ønh cña pic. So s¸nh thêi gian l­u cña mÉu thö vµ mÉu chuÈn lµm trong cïng ®iÒu kiÖn ta sÏ ®Þnh tÝnh ®­îc chÊt ®ã. - Thêi gian chÕt tM ( phót ) lµ thêi gian cña mét chÊt kh«ng bÞ l­u gi÷ tøc lµ b»ng tèc ®é di chuyÓn trung b×nh cña c¸c ph©n tö dung m«i. Thêi gian l­u hiÖu chÝnh tR, ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ). - Thõa sè dung l­îng k’ dïng ®Ó m« t¶ tèc ®é di chuyÓn cña mét chÊt Qs t’R tR - tM VR -VM k’ = = = = QM tM tM VM - Thõa sè chän läc a : M« t¶ tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt. kB k’B t’R,B a = = = kA k’A t’R,A Qui ­íc B lµ chÊt bÞ l­u gi÷ m¹nh h¬n A nªn a ³ 1. §Ó t¸ch riªng 2 chÊt th× a > 1, th­êng tõ 1,05 – 2,00. Sè ®Üa lý thuyÕt N: BiÓu thÞ hiÖu lùc cét s¾c ký. N = hoÆc N = Trong ®ã: WB chiÒu réng pic ë ®¸y pic. W1/2 chiÒu réng pic ®o ë nöa chiÒu cao cña ®Ønh. - §é ph©n gi¶i RS lµ ®¹i l­îng ®o møc ®é t¸ch hai chÊt trªn mét cét s¾c ký. tR,B – tR,A Rs = 1/2( WB + WA ) §Ó t¸ch riªng hai chÊt, Rs ³ 1,5 ( khi 2 s¾c ®å cã ®é lín cïng cì ). - ChiÒu cao pic hay diÖn tÝch pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh l­îng cña chÊt. Khi so s¸nh chiÒu cao pic hay diÖn tÝch pic cña mÉu thö vµ chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn lµm ta tÝnh ®­îc hµm l­îng ho¹t chÊt trong mÉu thö. Pha tÜnh vµ pha ®éng trong HPLC [3]. *Pha tÜnh trong HPLC chÝnh lµ chÊt nhåi cét ®Ó lµm nhiÖm vô t¸ch mét hçn hîp chÊt ph©n tÝch. Nã lµ nh÷ng chÊt r¾n, xèp vµ kÝch th­íc h¹t rÊt nhá, ®­êng kÝnh cì h¹t tõ 3-10mm, diÖn tÝch bÒ mÆt riªng th­êng tõ 50-500 m2/g.C¨n cø theo b¶n chÊt chÝnh cña qu¸ tr×nh s¾c ký trªn cét t¸ch, ng­êi ta chia nã thµnh nhiÒu lo¹i nh­ hÊp phô, ph©n bè, trao ®æi ion vµ r©y ph©n tö. T­¬ng øng víi lo¹i chÊt nhåi nh­ thÕ ng­êi ta cã mét lo¹i s¾c ký riªng trong kü thuËt HPLC. Trong ®Ò tµi nµy, chóng t«i sö dông ph­¬ng ph¸p s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt. B¶n chÊt chÝnh cña sù t¸ch trong lo¹i s¾c ký nµy lµ dùa trªn kh¶ n¨ng t¸ch cña c¸c chÊt trong hai pha kh«ng hoµ lÉn vµo nhau. C¸c yªu cÇu chung cña pha tÜnh trong kü thuËt HPLC: + Ph¶i tr¬ vµ bÒn v÷ng víi c¸c ®iÒu kiÖn cña m«i tr­êng s¾c ký, kh«ng cã c¸c ph¶n øng ho¸ häc phô víi dung m«i röa gi¶i hay víi chÊt ph©n tÝch. + Cã kh¶ n¨ng t¸ch chän läc mét hçn hîp chÊt tan nhÊt ®Þnh trong ®iÒu kiÖn s¾c ký. + TÝnh chÊt bÒ mÆt ph¶i æn ®Þnh. + C©n b»ng ®éng häc cña sù t¸ch ph¶i x¶y ra nhanh vµ lÆp l¹i tèt. + Cì h¹t ph¶i t­¬ng ®èi dång nhÊt. Pha tÜnh th­êng ®­îc chÕ t¹o trªn c¸c chÊt nÒn sau: + Pha tÜnh trªn nÒn Silicagel ( SiO2 ) + Pha tÜnh trªn nÒn Oxid nh«m ( Al2O3 ) + Pha tÜnh trªn nÒn cao ph©n tö h÷u c¬ ( polystyren, cellulo...) + Pha tÜnh trªn nÒn m¹ch carbon. Trong 4 lo¹i nµy th× nÒn Silicagel ®­îc sö dông nhiÒu nhÊt vµ pha tÜnh ®­îc chÕ t¹o trªn nÒn nµy còng cã nhiÒu ­u viÖt h¬n, nh­ kh¶ n¨ng chÞu ¸p cao, ®é tr­¬ng në nhá khi thay ®æi dung m«i röa gi¶i, bÒn víi nhiÖt. *Pha ®éng lµ dung m«i dïng ®Ó röa gi¶i c¸c chÊt tan ( chÊt ph©n tÝch ) ra khái cét t¸ch ®Ó thùc hiÖn mét qu¸ trÝnh s¾c ký. Pha ®éng trong HPLC cã thÓ chØ lµ mét dung m«i h÷u c¬ nh­ Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay còng cã thÓ lµ hçn hîp cña hai hay nhiÒu dung m«i trén víi nhau theo nh÷ng tû lÖ phï hîp. Nã còng cã thÓ lµ dung dÞch n­íc cña c¸c muèi cã chøa chÊt ®Öm, chÊt t¹o phøc, chÊt lµm chËm. Nãi chung mçi lo¹i s¾c ký sÏ cã c¸c hÖ dung m«i röa gi¶i riªng cho nã, ®Ó cã ®­îc hiÖu qu¶ tèt. Pha ®éng lµ mét trong nh÷ng yÕu tè quyÕt ®Þnh thêi gian l­u gi÷ cña chÊt mÉu vµ hiÖu qu¶ sù t¸ch s¾c ký, ¶nh h­ëng tíi sù ph©n gi¶i cña chÊt trong pha tÜnh. Pha ®éng trong kü thuËt HPLC cÇn ph¶i tho¶ m·n mét sè ®iÒu kiÖn sau: + Ph¶i tr¬ ®èi víi pha tÜnh. + Ph¶i hoµ tan ®­îc chÊt mÉu + Ph¶i bÒn v÷ng theo thêi gian +Ph¶i cã ®é tinh khiÕt cao + Ph¶i nhanh ®¹t c¸c c©n b»ng trong qu¸ tr×nh s¾c ký + Ph¶i phï hîp víi lo¹i detector dïng ®Ó ph¸t hiÖn c¸c chÊt ph©n tÝch. Trong s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt, pha ®éng lµ hÖ dung m«i ph©n cùc, nã lµ nh÷ng dung m«i trén lÉn ®­îcvíi n­íc vµ trong nhiÒu tr­êng hîp th× n­íc l¹i lµ mét thµnh phÇn chÝnh cña pha ®éng. Tiªu biÓu vµ ®­îc dïng kh¸ phæ biÕn trong lo¹i s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt lµ c¸c dung m«i methanol, tetrahydrofuran, acetonitril, hay hçn hîp cña methanol, acetonitril víi n­íc, víi ®Öm. S¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt ®­îc sö dông rÊt phæ biÕn ®Ó t¸ch nhiÒu lo¹i hçn hîp mÉu tõ v« c¬ ®Õn h÷u c¬, chÊt kh«ng ph©n cùc ®Õn ph©n cùc. Trong hÖ pha nµy th× thµnh phÇn cña pha ®éng còng ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶ t¸ch s¾c ký. C¸ch tÝnh kÕt qu¶ trong ph­¬ng ph¸p HPLC. - Ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn - Ph­¬ng ph¸p thªm - Ph­¬ng ph¸p so s¸nh §èi víi viÖc x¸c ®Þnh nång ®é ho¹t chÊt trong dÞch sinh häc, tÝnh to¸n kÕt qu¶ dùa vµo ®­êng chuÈn ®­îc x©y dùng b»ng c¸ch chñ ®éng cho chÊt chuÈn víi nång ®é kh¸c nhau vµo dÞch sinh vËt. Xö lý mÉu vµ ®em ch¹y s¾c ký. PhÇn 2: thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶ 2.1 Nguyªn vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu. 2.1.1 Nguyªn vËt liÖu vµ ho¸ chÊt *Nguyªn vËt liÖu: - Ketoprofen 99,3% (§¹t theo BP 2001). - Ibuprofen 99,0 % (§¹t theo USP 24). - Naproxen 99,6% (§¹t theo USP 24). *Ho¸ chÊt: - Acetonitril ( HPLC grade-Merck ). - Methanol ( HPLC grade- Merck ). - Acid acetic b¨ng ( HPLC grade - Merck ). - Triethylamin ( PA grade - Merck ). *Dông cô: - HÖ thèng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao. + B¬m cao ¸p Merck- Hitachi L-6000. + Detector Merck-Hitachi L-4000 UV. + M¸y tÝch ph©n Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator. + Van tiªm mÉu Rheohyne 1725 - USA. - M¸y quang phæ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mü). - M¸y läc n­íc siªu s¹ch Elga (Anh). - C©n ph©n tÝch Satorius (§øc). - Ly t©m ®iÖn Jouan (Ph¸p). - M¸y siªu ©m Branson (Mü). - M¸y l¾c Labinco. - Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl. - Dông cô thuû tinh, b¬m tiªm, èng nghiÖm, b×nh ®Þnh møc. 2.1.2 Ph­¬ng ph¸p thùc nghiÖm a.Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn s¾c ký Kh¶o s¸t chän dung m«i chiÕt Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng Kh¶ n¨ng chiÕt ho¹t chÊt ®­îc biÓu thÞ b»ng hiÖu suÊt chiÕt vµ kh¶ n¨ng lo¹i t¹p c¶n trë sù ph¸t hiÖn ketoprofen trong mÉu ph©n tÝch. L¾c 1 phót C¾n Dung m«i h÷u c¬ MÉu thö ®­îc xö lý víi c¸c dung m«i kh¸c nhau theo s¬ ®å sau: HuyÕt t­¬ng L¾c 5 phót Ly t©m 15phót(3000 vßng/phót) KhÝ Pha ®éng DÞch chiÕt Läc Ly t©m 15 phót(3000 vßng /phót) DÞch läc H×nh 1: S¬ ®å xö lý mÉu huyÕt t­¬ng ( chiÕt ®¬n ) §Ó t¨ng hiÖu suÊt chiÕt, nh»m môc ®Ých chiÕt kiÖt hÕt ho¹t chÊt trong huyÕt t­¬ng, ta tiÕn hµnh chiÕt lÆp (chiÕt 3 lÇn). TiÕn hµnh nh­ s¬ ®å 1 thùc hiÖn thªm hai lÇn tõ lóc thªm dung m«i h÷u c¬ ®Õn khi thu ®­îc c¾n. TÊt c¶ c¸c dÞch chiÕt cña 3 lÇn ®­îc tËp trung vµo mét èng nghiÖm, ®uæi dung m«i thu ®­îc c¾n nh­ s¬ ®å 1. T×m chÊt chuÈn néi. Dïng nh÷ng chÊt cã c«ng thøc ho¸ häc gÇn gièng víi ketoprofen cho vµo huyÕt t­¬ng ®· chøa ketoprofen, xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1. Ch¹y s¾c ký ®Ó x¸c ®Þnh thêi gian l­u cña chÊt chuÈn néi vµ ketoprofen, tÝnh thõa sè chän läc a ( tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt ) xem møc ®é t¸ch cña hai chÊt. ChÊt chuÈn néi ph¶i t¸ch h¼n víi ketoprofen , hiÖu suÊt chiÕt æn ®Þnh, bÒn v÷ng, ph¸t hiÖn dÔ dµng ë ®iÒu kiÖn s¾c ký trªn. Kh¶o s¸t chän hÖ dung m«i ( pha ®éng ) ch¹y s¾c ký. Trong s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt, pha ®éng lµ mét hÖ dung m«i ph©n cùc, hay dïng lµ c¸c dung m«i methanol, acetonitril, hay hçn hîp cña methanol, acetonitril víi n­íc, víi ®Öm. ChuÈn bÞ c¸c hÖ dung m«i kh¶o s¸t, tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi tõng hÖ dung m«i mÉu huyÕt t­¬ng cã chøa ketoprofen vµ chuÈn néi ®­îc xö lý nh­ s¬ ®å h×nh 1.TÝnh RS cña tõng hÖ dung m«i tõ ®ã chän ®­îc hÖ ®Ó ph©n tÝch ketoprfen trong huyÕt t­¬ng. b.X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng X©y dùng ®­êng chuÈn trong pha ®éng: Pha 1 d·y dung dÞch hçn hîp ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi trong pha ®éng víi nång ®é ketoprofen lÇn l­ît lµ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml vµ nång ®é chÊt chuÈn néi lµ 25mg/ml. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký, x¸c ®Þnh thêi gian l­u vµ diÖn tÝch pic cña ketoprofen vµ chuÈn néi, tõ ®ã tÝnh ®­îc tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi . X©y dùng mèi t­¬ng quan gi÷a nång ®é ketoprofen vµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi. X©y dùng ®­êng chuÈn trong huyÕt t­¬ng. Chñ ®éng cho ketoprofen vµo huyÕt t­¬ng ®Ó ®­îc mét d·y c¸c nång ®é 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml. TiÕp ®ã cho vµo c¸c èng nghiÖm cïng mét nång ®é chÊt chuÈn néi. Xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1.Ch¹y s¾c ký, tõ ®ã t×m ra mèi t­¬ng quan gi÷a nång ®é ketoprrofen vµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi. X¸c ®Þnh tÝnh chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p (trong cïng mét ngµy vµ gi÷a c¸c ngµy ph©n tÝch). Lµm nhiÒu lÇn ë cïng mét nång ®é ®Ó x¸c ®Þnh sai sè cña ph­¬ng ph¸p ( biÓu thÞ b»ng RSD ). Lµm ë hai nång ®é : 0,5mcg/ml; 4mcg/ml. X¸c ®Þnh tÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p: B»ng ph­¬ng ph¸p thªm Thªm chÝnh x¸c mét l­îng mÉu chuÈn vµo mÉu thö ®· biÕt nång ®é ketoprofen, xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký. TÝnh % ketoprofen chuÈn t×m l¹i ®­îc. øng dông Dïng ph­¬ng ph¸p ®· x©y dùng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen mÉu huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng viªn nang ketoprofen 50 mg; 1,50 giê vµ theo dâi ®é bÒn v÷ng cña ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b¶o qu¶n ë - 300C, sau 1; 2; 3 th¸ng. 2.2 KÕt qu¶ thùc nghiÖm vµ nhËn xÐt 2.2.1 Kh¶o s¸t t×m dung m«i chiÕt xuÊt Dung m«i h÷u c¬ dïng ®Ó chiÕt xuÊt ph¶i cã kh¶ n¨ng hoµ tan tèt ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi, ®ång thêi ph¶i lo¹i ®­îc t¹p chÊt vµ lµm ®«ng vãn protein huyÕt t­¬ng. Kh¶o s¸t kh¶ n¨ng chiÕt cña mét sè dung m«i ta thu ®­îc kÕt qu¶ sau: B¶ng 1: HiÖu suÊt chiÕt ketoprofen tõ huyÕt t­¬ng. Dung m«i HiÖu suÊt chiÕt (%) Cloroform Ether Acetonitril Ethylacetat Dichloromethan 51.5 53.8 91.2 78.3 36,6 Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy acetonitril cã hiÖu suÊt chiÕt ketoprofen cao nhÊt. Dïng Acetonitril chiÕt ketoprofen ë nång ®é 4mcg/ml. ChiÕt 1 lÇn vµ chiÕt 3 lÇn ta thu ®­îc kÕt qu¶ sau: B¶ng 2 : HiÖu suÊt chiÕt Ketoprofen b»ng ACN. LÇn ChiÕt ®¬n ( % ) ChiÕt lÆp ( % ) 1 83,32 96,45 2 84,56 99,91 3 80,44 96,72 4 82,32 95,1 5 81,5 97,12 Trung b×nh 82,43 97,06 RSD 1,934 1,818 Thêi gian chiÕt 60 phót 160 phót §èi víi mÉu chiÕt lÆp, sau khi lÊy riªng dÞch chiÕt lÇn ®Çu, chiÕt lÇn hai, chiÕt lÇn ba, chiÕt lÇn bèn ®uæi dung m«i, hoµ tan trong pha ®éng vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký th× kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc ketoprofen trong dÞch chiÕt lÇn bèn. Nh­ vËy chiÕt ba lÇn lµ phï hîp. NhËn xÐt: ChiÕt lÆp ketoprofen b»ng ACN hiÖu xuÊt chiÕt cao, gÇn nh­ chiÕt ®­îc hÕt (97,06%) ketoprofen trong huyÕt t­¬ng, nh­ng thêi gian xö lý mÉu qu¸ dµi. Cßn chiÕt ®¬n (chiÕt d­íi hîp thøc) ketoprofen trong huyÕt t­¬ng hiÖu xuÊt chiÕt tuy thÊp h¬n ( 82,43% ), nh­ng sai lÖch gi÷a c¸c lÇn lµm kh«ng cao ( RSD = 1,934 ), so víi chiÕt nhiÒu lÇn ( RSD = 1,818 ), vµ thêi gian xö lý mÉu kh«ng qu¸ dµi. Do ®ã, cã thÓ dïng ACN chiÕt mét lÇn ®Ó chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng mµ vÉn thu ®­îc kÕt qu¶ tèt. 2.2.2 Kh¶o s¸t vµ lùa chän ®iÒu kiÖn s¾c ký: Dïng s¾c ký ph©n bè pha ®¶o Cét s¾c ký: TiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn c¸c cét s¾c ký kh¸c nhau: cét C8, cét C18, cét phenyl. Qua c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc thÊy cét C18 phï hîp. Kh¶o s¸t t×m chÊt chuÈn néi : Dïng nh÷ng chÊt cã c«ng thøc ho¸ häc gÇn gièng víi ketoprofen, kh¶o s¸t ®Ó t×m ra chÊt chuÈn néi. ChÊt chuÈn néi ph¶i ®¶m b¶o t¸ch khái ketoprofen vµ æn ®Þnh trong ®iÒu kiÖn s¾c ký. Pha c¸c dung dÞch ketoprofen vµ acid-2-(4-isobutylphenyl) propionic, ketoprofen vµ acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) trong pha ®éng vµ trong huyÕt t­¬ng. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký, x¸c ®Þnh thêi gian l­u tR cña c¸c chÊt, tÝnh thõa sè chän läc a cña c¸c chÊt ®èi víi ketoprofen, tõ ®ã x¸c ®Þnh chÊt néi chuÈn ( chÊt cã a lín nhÊt nh­ng thêi gian lµm mÉu kh«ng qu¸ dµi). KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: ChÊt tR a CH CH3 COOH C O Ketoprofen Acid - 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic 6,77 CH3 CH COOH H3CO Acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) 6,90 1,019 CH3 CH COOH CH2 CH CH3 CH3 Acid - 2- ( 4 -isobutylphenyl ) propionic (IS2) 9,95 1,47 Trong ®ã a lµ tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt ®­îc ®Æc tr­ng bëi ®¹i l­îng thõa sè chän läc hay hÖ sè chän läc. a cµng lín th× hai chÊt cµng t¸ch ra khái nhau, th­êng dïng a trong kho¶ng 1,05- 2,0. ë ®©y aIS2/ket > aIS1/ket nªn kh¶ n¨ng t¸ch cña IS2 vµ ketoprofen sÏ tèt h¬n kh¶ n¨ng t¸ch cña IS1 vµ Ketoprofen. Tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña IS2 vµ ketoprofen a = 1,47 vµ tR,IS2 = 9,96 nªn thêi gian lµm mÉu còng kh«ng qu¸ l©u. V× vËy, cã thÓ dïng acid -2-(4 - isobutylphenyl) propionic lµm néi chuÈn trong ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng . Pha ®éng: TiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn c¸c hÖ pha ®éng kh¸c nhau, x¸c ®Þnh ®é ph©n gi¶i vµ kh¶ n¨ng t¸ch cña ketoprofen víi c¸c t¹p chÊt trong huyÕt t­¬ng vµ kh¶ n¨ng t¸ch cña ketoprofen víi chÊt chuÈn néi. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh s¾c ký, dïng cét C18 víi c¸c hÖ pha ®éng sau: ACN: dung dÞch ®Öm phosphat 0,05M pH = 7 (90 : 10). NH4CH3COO 1%: MeOH: ACN (®iÒu chØnh vÒ pH= 6,5 b»ng CH3COOH b¨ng) ( 55 : 30 : 15 ) MeOH: AcOH: H2O ( 50 : 1 : 49 ). ACN: AcOH : H2O ( 60 : 1 : 39 ). NhËn xÐt : C¸c hÖ 1, 2, 3 cho kÕt qu¶ t¸ch kh«ng tèt, ketoprofen ch­a t¸ch ®­îc khái t¹p chÊt còng nh­ chÊt chuÈn néi. Riªng hÖ 4 ®· cho kÕt qu¶ t¸ch tèt nh­ng c¸c pic cßn bÞ tï vµ ch©n pic t¸ch kh«ng gän. Khi ta cho thªm Triethylamin vµo th× c¸c pic s¾c nÐt h¬n vµ ch©n pic gän h¬n. Kh¶o s¸t hÖ dung m«i gåm 4 thµnh phÇn ( ACN, AcOH, Tri, H2O ) víi c¸c tû lÖ ACN lµ 60, 50, 40, ta thu ®­îc c¸c s¾c ®å sau: H×nh 2: HÖ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 40 : 1 : 0,3 : 58,7 ). H×nh 3 : HÖ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 1 : 0,3 : 48,7 ). H×nh 4 : HÖ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 60 : 1 : 0,3 : 38,7 ). H×nh 2 H×nh 3 H×nh 4 B¶ng 3: KÕt qu¶ RS cña c¸c hÖ dung m«i ®· ch¹y STT ACN AcOH Tri L­u l­îng dßng (ml/phót) RS , 1 RS ,2 RS ,3 Thêi gian (phót) 1 60 1 0,3 0,85 0,97 0,99 0,97 11 2 60 1 0,3 1,2 1,05 1,44 1,22 10,62 3 60 1 0,3 0,5 1,23 1,41 0,98 12,5 4 50 1 0,3 0,5 1,05 1,28 0,99 20,28 5 50 1 0,3 0,85 1,63 1,61 1,09 17,94 6 50 1 0,3 0,85 1,39 2,99 1,35 16,52 7 40 1 0,3 1,2 2,04 6,39 6,39 25,5 8 40 1 0,3 0,5 7,35 17,28 17,28 50,71 9 40 1 0,3 0,85 2,2 8,08 6,96 30,28 NhËn xÐt: §é ph©n gi¶i RS cña c¸c hÖ t¨ng dÇn khi tû lÖ ACN gi¶m dÇn. Nh­ng thêi gian ch¹y s¾c ký còng t¨ng lªn rÊt nhiÒu. HÖ 7, 8, 9 ( tû lÖ ACN lµ 40 ) cã ®é ph©n gi¶i RS cao nhÊt nh­ng thêi gian ch¹y s¾c ký qu¸ l©u. HÖ 6 cã ®é ph©n gi¶i RS,1 =1,39; RS,2 =2,99; RS,3 =1,35 ; c¸c pic t¸ch nhau gÇn nh­ hoµn toµn vµ thêi gian ch¹y s¾c ký kh«ng qu¸ l©u. Do ®ã trong ®Ò tµi nµy chóng t«i chän hÖ dung m«i pha ®éng sè 6. ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 49,2 ). *B­íc sãng: §Ó t¨ng ®é nh¹y khi ph¸t hiÖn ketoprofen trong huyÕt t­¬ng chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh cùc ®¹i hÊp thô cña ketoprofen trong ®iÒu kiÖn gièng nh­ ph©n tÝch mÉu thùc. Pha dung dÞch ketoprofen chuÈn trong dung m«i pha ®éng. QuÐt phæ UV. Ketoprofen cã cùc ®¹i hÊp thô ë b­íc sãng 253 nm. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn, ®iÒu kiÖn s¾c ký ®­îc chän lµ: - Pha tÜnh : Cét Nucleosil ODS 5mm (4,6*250 mm) - Pha ®éng: ACN: AcOH : Tri :H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 48,7). - L­u l­îng dßng: 0,85ml/ phót. - B­íc sãng : 253 nm. - ThÓ tÝch mÉu tiªm : 50ml. 2.2.3. X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. X©y dùng ®­êng chuÈn trong pha ®éng: Pha mét d·y c¸c dung dÞch hçn hîp ket vµ IS trong pha ®éng víi c¸c nång ®é cña ket lµ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml ; 0,8mcg/ml ; 2mcg/ml ; 5mcg/ml vµ nång ®é IS lµ 25mcg/ml. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng diÖn tÝch pic tõ ®ã tÝnh tû sè diÖn tÝch pic cña ket vµ IS . B¶ng 4: KÕt qu¶ x©y dùng ®­êng chuÈn ®Þnh l­îng Ketoprofen trong pha ®éng Nång ®é ( mcg/ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 4245 17779 900375 242424 613525 AIS 118674 110665 127804 119413 114211 RKet/IS 0,036 0,161 0,704 2,030 5,372 §å thÞ 1 : §­êng chuÈn Ketoprofen trong pha ®éng. Ph­¬ng tr×nh håi qui y = 1,085 x - 0,087 Trong ®ã: y lµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a Ket vµ IS x lµ nång ®é Ketoprofen (mcg/ml ). HÖ sè t­¬ng quan håi qui : r = 0,9998. X©y dùng ®­êng chuÈn trong huyÕt t­¬ng . ChuÈn bÞ mét thang chuÈn trong huyÕt t­¬ng víi c¸c nång ®é ket lµ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml, nång ®é IS 25mcg/ml. TiÕn hµnh xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng diÖn tÝch pic, tõ ®ã tÝnh RKet/IS. B¶ng 5 : KÕt qu¶ x©y dùng ®­êng chuÈn Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Nång ®é ( mcg /ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 3882 14047 86292 232658 607150 AIS 105190 105131 105812 104177 106458 RKet/IS 0,037 0,134 0,815 2,233 5,730 §å thÞ 2 : §­êng chuÈn ®Þnh l­îng Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng . Ph­¬ng tr×nh håi qui : y = 1,154x - 0,074 Trong ®ã : y lµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ IS x lµ nång ®é Ketoprofen ( mcg/ml ). HÖ sè t­¬ng quan håi qui : r= 0,9998 y + 0,074 Tõ ®ã suy ra: x = 1,154 Nh­ vËy, ®­êng chuÈn cña ket/ huyÕt t­¬ng cã ®é dèc lín h¬n (1,154) so víi ®­êng chuÈn cña nã trong pha ®éng (1,085), do ®ã ®­êng chuÈn cã xu h­íng ®i lªn. X¸c ®Þnh tÝnh chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p. LÊy c¸c mÉu huyÕt t­¬ng cã chøa ketoprofen víi c¸c nång ®é 0,5 mcg/ml; 4mcg /ml vµ chÊt chuÈn néi cã nång ®é 25 mcg /ml. Xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi c¸c ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng diÖn tÝch pic, tõ ®ã tÝnh ®­îc tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ IS. C 0,5 mcg/ml 4mcg/ml AKet AIS RKet/IS AKet AIS RKet/IS 1 55794 119470 0,4659 484278 115522 4,192 2 61432 128838 0,4768 483315 116414 4,152 3 57239 118666 0,4723 475357 114211 4,162 4 57678 129152 0,4466 483012 115792 4,171 5 58622 125792 0,4660 482356 116534 4,139 6 64353 148740 0,4426 476235 115235 4,132 TB Ph­¬ng sai RSD 0,4617 TB Ph­¬ng sai RSD 4,158 0,0139 0,0219 3,016 0,528 Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh ®é chÝnh x¸c nh­ trªn ë mét ngµy ph©n tÝch kh¸c. KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: 0,5 mcg/ml 4mcg/ml TB Ph­¬ng sai RSD 0,4922 TB Ph­¬ng sai RSD 4,037 0,0123 0,023 2,5 0,581 Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc (trong cïng mét ngµy vµ gi÷a c¸c ngµy ph©n tÝch) ®Ó ®¸nh gi¸ ®é lÆp l¹i cña ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng ë 2 nång ®é 0,5mcg/ml; 4mcg/ml víi n = 6, cho thÊy ph­¬ng ph¸p cã tÝnh chÝnh x¸c cao. TÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p: - MÉu thö: huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng viªn nang ketoprofen 50 mg kho¶ng 90 phót, thªm IS 25mcg/ml. - MÉu chuÈn: Ketoprofen chuÈn 0,8mcg/ml trong huyÕt t­¬ng, thªm IS 25 mcg/ml. - MÉu chuÈn + thö: mÉu thö + ketoprofen chuÈn 0,8mcg/ml + IS 25mcg/ml. Xö lý c¸c mÉu trªn nh­ s¬ ®å h×nh 1. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi c¸c ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. X¸c ®Þnh tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ IS, ta cã c¸c s¾c ®å sau: H×nh 5: MÉu tr¾ng. H×nh 6: MÉu chuÈn trong pha ®éng. H×nh 7: MÉu chuÈn trong huyÕt t­¬ng. H×nh 8: MÉu thùc. H×nh 5 H×nh 6 H×nh 7 H×nh 8 KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng tû sè diÖn tÝch pic gi÷a Ketoprofen vµ chÊt néi chuÈn. MÉu ChuÈn Thö Thö + ChuÈn 1 0,704 1,116 1,867 2 0,684 1,217 1,845 3 0,712 1,119 1,905 4 0,728 1,136 1,83 5 0,685 1,122 1,901 Trung b×nh 0,7032 1,142 1,8696 RSD 2,5506 3,372 1,778 B¶ng 7 : KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p. % T×m l¹i = NhËn xÐt: Nh­ vËy, l­îng ketoprofen chuÈn t×m l¹i lµ 103,5%, RSD = 1,778, n = 5 cho thÊy ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng nµy cã tÝnh ®óng ®¶m b¶o cho phÐp ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. KÕt luËn: Víi tÝnh ®óng ®¶m b¶o, tÝnh chÝnh x¸c tèt vµ sù tuyÕn tÝnh chÆt chÏ gi÷a tû sè diÖn tÝch pic ketoprofen / IS vµ nång ®é ketoprofen trong kho¶ng kh¶o s¸t, cho thÊy ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. * ¸p dông ¸p dông ®Þnh l­îng mÉu thùc: mét ng­êi t×nh nguyÖn khoÎ m¹nh, uèng1 viªn nang 50 mg, sau 90 phót lÊy m¸u ®em ly t©m ®Ó lÊy huyÕt t­¬ng. Xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1, tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký thu ®­îc s¾c ®å h×nh 9. ThÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p dïng Detector UV Diod arrays (Phßng vËt lý- ViÖn kiÓm nghiÖm - Bé Y TÕ) ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong mÉu thùc Chän 5 ®iÓm: ch©n phÝa tr­íc cña pic, 1/2 phÝa tr­íc cña pic, ®Ønh pic, 1/2 phÝa sau cña pic, ch©n phÝa sau cña pic cña Ketoprofen. QuÐt phæ hÊp thô. Song song lµm mÉu chuÈn Ketoprofen trong pha ®éng, chång phæ hÊp thô cña mÉu thùc vµ mÉu chuÈn ë c¸c ®iÓm t­¬ng øng nhau. ë c¸c ®iÓm ®Òu thu ®­îc hÖ sè Match ³ 995. H×nh 10: Chång phæ hÊp thô cña mÉu thùc vµ mÉu chuÈn ë ®Ønh pic. H×nh 9 H×nh 10 KÕt luËn: víi ®iÒu kiÖn xö lý mÉu ®· chän vµ ch­¬ng tr×nh s¾c ký ®· x©y dùng cho thÊy ph­¬ng ph¸p nµy hoµn toµn thÝch hîp ®Ó ®Þnh l­îng Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Theo dâi ®é æn ®Þnh cña ket trong mÉu thö theo thêi gian b¶o qu¶n. MÉu huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng thuèc 90 phót, ®­îc b¶o qu¶n ë -300C, sau thêi gian 1, 2, 3 th¸ng lÊy ra ®em xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi c¸c ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. TÝnh kÕt qu¶ theo ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn ®­îc x©y dùng trong tõng ngµy ph©n tÝch. KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: STT Thêi gian b¶o qu¶n (th¸ng) Nång ®é (mcg/ml) 1 0 4,90 2 1 4,89 3 2 4.92 4 3 4,94 KÕt luËn: Sau 3 th¸ng b¶o qu¶n mÉu thö cã chøa ketoprofen ë –300C, thÊy nång ®é cña ketoprofen trong huyÕt t­¬ng vÉn æn ®Þnh. PhÇn 3:kÕt luËn vµ ®Ò xuÊt Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i ®· thùc hiÖn ®­îc mét sè c«ng viÖc sau: 1. §· kh¶o s¸t 5 dung m«i chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng t×m ®­îc ACN cã kh¶ n¨ng chiÕt tèt nhÊt, cho hiÖu xuÊt chiÕt cao (91,2%). X©y dùng qui tr×nh xö lý mÉu thÝch hîp ®Ó chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng, thêi gian chiÕt ng¾n (60phót), ®é lÆp l¹i tèt (RSD = 1,934). Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn s¾c ký: Cét, pha ®éng, b­íc sãng. - Cét: kh¶o s¸t 3 lo¹i pha tÜnh C8, C18 , phenyl, cho thÊy cét C18 lµ phï hîp nhÊt. - Pha ®éng: Kh¶o s¸t 4 hÖ dung m«i pha ®éng vµ chän ®­îc mét hÖ cho kÕt qu¶ kh¶ quan. Kh¶o s¸t 9 l­ît víi hÖ võa t×m ®­îc víi tû lÖ c¸c thµnh phÇn vµ l­u l­îng dßng kh¸c nhau ®Ó chän ®­îc ®iÒu kiÖn hîp lý ( t¸ch khái t¹p vµ chÊt chuÈn néi, thêi gian lµm mÉu kh«ng qu¸ l©u ) ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. - B­íc sãng: QuÐt phæ hÊp phô x¸c ®Þnh ®­îc lmax = 253nm. Tõ ®ã chän ®­îc ®iÒu kiÖn s¾c ký lµ: Cét: Nucleosil C18. Pha ®éng: ACN: AcOH: Tri: H2O ( 50: 1: 0,3: 48,7 ). B­íc sãng: 253nm. L­u l­îng dßng: 0,85 ml/phót. 3. X©y dùng ®­îc ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b»ng HPLC víi IS lµ acid 2- ( 4- isobutylphenyl )propionic. - §­êng chuÈn trong huyÕt t­¬ng d­îc x©y dùng tõ 0,05 - 5 mcg/ml víi IS lµ acid 2- ( 4- isobutylphenyl )propionic 25mcg/ml cho hÖ sè r = 0,998. - TÝnh chÝnh x¸c: x¸c ®Þnh ®é lÆp l¹i trong cïng mét ngµy vµ gi÷a c¸c ngµy ë 2 nång ®é 0,5 mcg/ml; 4mcg/ml cho kÕt qu¶ tèt RSD ~ 2,5 ( nång ®é 0,5 mcg/ml ), RSD ~ 0,5 ( nång ®é 4mcg/ml ), n =6. - TÝnh ®óng: Dïng ph­¬ng ph¸p thªm cho kh¶ n¨ng t×m l¹i ketoprofen cho vµo lµ 103,5%. 4. ¸p dông: Dïng ph­¬ng ph¸p ®· x©y dùng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng ng­êi t×nh nguyÖn sau khi uèng viªn nang 50 mg cho kÕt qu¶ ®Þnh l­îng ®¸ng tin cËy ( ®· ®­îc kiÓm tra b»ng HPLC g¾n víi detector Diod array ). - §· theo dâi ®é æn ®Þnh cña mÉu thö trong ®iÒu kiªn b¶o qu¶n ë - 300C trong 1, 2, 3 th¸ng. §Ò tµi nµy ®­îc thùc hiÖn trong mét thêi gian ng¾n, do ®ã ch­a ®Þnh l­îng ®­îc nhiÒu mÉu thö. Trong thêi gian tíi, nÕu kinh phÝ cho phÐp cã thÓ sö dông ph­¬ng ph¸p nµy ®Ó nghiªn cøu ®¸nh gi¸ sinh kh¶ dông vµ t­¬ng ®­¬ng sinh häc cña ketoprofen trong c¸c d¹ng bµo chÕ. Tµi liÖu tham kh¶o Bé y tÕ ( 2002 ) - D­îc ®iÓn ViÖt Nam, Nhµ xuÊt b¶n y häc Hµ néi. Ph¹m Gia HuÖ, TrÇn Tö An ( 1998 ) - Ho¸ ph©n tÝch 2, chÕ b¶n vµ in t¹i trung t©m th«ng tin §¹i häc d­îc Hµ Néi. Ph¹m LuËn ( 1989 ) - GT c¬ së lý thuyÕt s¾c ký láng cao ¸p - HPLC, Tr­êng ®¹i häc Tæng hîp Hµ néi. Tµo Duy CÇn ( 1999 ) - Tra cøu vµ sö dông thuèc vµ biÖt d­îc n­íc ngoµi, quyÓn 1. Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kü thuËt Tõ ®iÓn b¸ch khoa d­îc häc ( 1999 ). Nhµ xuÊt b¶n tõ ®iÓn b¸ch khoa Hµ néi. Vidal. C«ng ty dÞch vô y tÕ tæng hîp Q4 TPHCM - TCCS. XNLD Phone - Doulenc Poren - TCCS. AHSF Drug Fuformation. BP 93,98. Chi Yin Wong, Da Peng Wang - Drug development and industrial; Pharmany, 20, 1994, page 1077 - 1078. The transdermal Penetration of a series of Nonsteroidal Ation flammatory Drugs - Journal of pharmaceutical Sciences, 1997, Sè 86, trang 503. John Mc Ewen, Masimo De Luca,Alessandro casini,...(1998 ) - the Effect of Foood and Antacid on the Bioavailability of Dexketoprrofen Trometamol - JournalClinical Pharmacology, page 42. J.R.Veraat et al. - At line Solid- phase extraction for capillary electrophoresis application to negatively charged Solutes (1998 ) - Journal of Chromatography B, No 719, page 199 -208. Martindal: The complete drug reference 32th Edi, 1999. N. Tarimci, D. Ermis (1997) - Sustained release characteristics and pharmacokinetic parameters of ketoprofen suppositories using chitosan, - International Journal of Pharmaceutics, No 147, page 72,73. S. Heitmeier, G. Blaschke (1999) - Direct assay of nonopiod analyesic and their metabolites in human urine by capillary ellectrophoresis and capillary electrophoresis - mass spectrometry- Journal of Chromatography B, No 721, page 124. USP 24.