- Phương pháp nuôi cấy bề mặt dần dần được thay thế bằng
phương pháp nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.
- Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng
môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men
(fermento). Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ thống
điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh PH
và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí
và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn.
40 trang |
Chia sẻ: lylyngoc | Lượt xem: 3558 | Lượt tải: 3
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Nguồn thu nhận và ứng dụng Protease, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
n thành dạng tinh chế sau đó cho vào trong chượp
8) Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa
- Công dụng của proteaza là phân hủy vết bẩn dạng protein trên
vải.
- Tên thương mại: Savinase và Relase.
- Proteaza có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng,
sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn,..... và chỉ có hoạt tính trong dung
dịch giặt.
- Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất
tẩy rửa:
+ Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy.
+ Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh
+ Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp.
+ Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao.
+ Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có
thể phân hủy sinh học.
+ Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại.
9) Trong công nghiệp sản xuất bia rượu
- Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế
- Giảm thời gian lên men
- Hiệu suất thu hồi tăng
- Bia, rượu thành phẩm đạt các chỉ tiêu quy định tốt hơn khoảng
30%
- Nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm chi phí sản xuấT
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 7
PROTEASE NGUỒN GỐC
THỰC VẬT
I. PAPAIN
1.Định nghĩa – Cấu tạo:
- Papain là một enzym thuộc loại proteaza thực vật có nguồn gốc từ
cây đu đủ, là chuỗi polipeptit gồm 187 gốc aminoaxit.
- Papain gồm có nhiều amin acid, theo thứ tự nhiều ít (từ 11,35-
12,43 xuống 2,14-3,57 g/100g) : tyrosin, glutamic acid, aspartic acid,
glycin, valin, arginin, leucin, isoleucin, lysin, serin, alanin, prolin,
tryptophan, threonin, phenylalanin, cystin, histidin
- Papain là chất bột màu trắng hoặc xám nhạt; dễ hút nước; tan
trong nước và glixerin; không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
papain
2. Tính chất
- Papain có khả nǎng thủy phân protein thành các tiểu phân nhỏ
như acid amin và các peptid ngắn. Khả nǎng thủy phân của chúng rất
khác nhau tùy thuộc vào điều kiện phản ứng.
- Khi chưa được hoạt hoá, Papain có hoạt lực rất yếu; dưới tác
dụng của các chất có tính khử, nhất là kèm theo sự có mặt của các chất
kết hợp với kim loại, Papain được hoạt hoá thành dạng hoạt động.
- Điểm đẳng điện của Papain vào khoảng pH 9; khối lượng phân tử
khoảng 20.700.
- Papain có tính đặc hiệu rộng,
- Ở pH = 5 ÷ 7,5, Papain thuỷ phân thành các peptit, amit và este
của aminoaxit.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 8
Vùng
pH
Protein LTTC bị thủy phân Casein bị thủy phân (%)
Pepsin Papain Hh
Pep+Pa
Pepsin Papain Hh
Pep+Pa
2 ± 0,5 38,00 - 39,50 40,83 - 39,28
4 ± 1,0 20,50 28,00 47,00 22,17 28,27 38,01
7 ± 0,5 - 43,50 38,50 - 38,04 43,80
- Dựa vào bản trên ta thấy Papain hoạt động thủy phân mạnh ở môi
trường có tính trung tính hoặc kiềm yếu
- Ngoài ra quá trình thủy phân này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ,khi
nhiệt độ càng cao thì khả năng thủy phân của Papain càng tăng
- Papain có độ bền đặc biệt cao đối với tác dụng của nhiệt độ và ít
chịu ảnh hưởng của dung môi
3. Nguồn cung cấp papain:
- Papain có nhiều trong quả đu đủ,do đó đu đủ là nguồn cung cấp
Papain chủ yếu
- Nhựa đu đủ có chứa Papain là một loại men tiêu huỷ protein
(proteolytic enzymes)
- Đu đủ xanh chứa 4% chất nhựa mủ latex màu trắng đục là hỗn
hợp của nhiều proteaza (loại men tiêu hóa chất đạm) trong đó chất chủ
yếu là papain. Một cây đu đủ trong 1 năm cho khoảng 100g nhựa mủ.
Lấy nhựa khi quả còn non trên cây.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 9
Một số phương pháp lấy enzyme Papain từ cây đu đủ
- Có thể sản xuất Papain thô bằng cách sấy khô nhựa trực tiếp lấy
từ quả đu đủ. Sản phẩm thô này có hoạt lực thấp. Dạng sản phẩm sạch
hơn thu được nhờ sự kết tủa phân đoạn bằng dung môi hoặc muối trung
tính enzim đã được hoạt hoá, sau đó sấy khô ở nhiệt độ thấp.
- Để lấy nhựa mủ (papain thô) dùng dao bén sắc rạch dọc quả đu
đủ xanh, cho mủ chảy vào bát, sau đó phơi nắng hoặc sấy khô ở 40-60ºC.
Tinh chế papain bằng cách hòa tan papain thô vào nước thành dung dịch,
sau đó rót vào cồn 90º, papain kết tủa, lọc, sấy.
- Ngoài ra ta cũng có thể thu thập và chế biến enzym phân giải
papain từ trái đu đủ với số lượng lớn bằng cách cắt quả đu đủ xanh còn
nguyên vỏ hoặc phần vỏ xanh bên ngoài thành các miếng nhỏ có kích
thước thích hợp và sấy khô dưới ánh nắng mặt trời hoặc bằng nhiệt tạo
thành nguyên liệu thô.
3. Công dụng của papain:
a) Tác dụng dược lý
- Làm vi trùng gram dương, gram âm chậm phát triển, những vi
trùng như tụ cầu, thương hàn rất nhạy cảm đối với tác dụng của papain.
- Papain có tác dụng đồng vận với những muối Mg và Al của
aspirin để chống viêm và hạ sốt.
- Với nhựa papain thô và papain tinh chế được sử dụng thay thế
pepsin và pancreatin trong điều trị rối loạn tiêu hóa, do thiếu men tiêu hóa
giúp tiêu hóa tốt chất đạm trong thức ăn.
- Papain có trong nhựa và hạt đu đủ còn là thuốc tẩy giun tốt cho
nhiều loại giun, trừ giun móc (ankylostome)
- Papain còn có tác dụng làm đông sữa và tác dụng làm giảm độc
đối với toxin và toxanpunin: 18mg papain trong dung dịch 2% trung hòa
được 10mg gricin là chất độc trong hạt thầu dầu (bằng 10 liều độc của
grinsin), 2mg papain trung hòa được 4 liều độc của toxin uốn ván và 10
liều độc của toxin bạch hầu. Papain còn trung hòa được độ độc của
ancaloit như 12,5mg papain trung hòa được một liều độc strychnin bằng
2,5mg
- Cùng với lysozym, papain tác dụng lên màng tế bào và tạo điều
kiện dễ dàng cho tác dụng những chất kháng sinh như bacitracin,
steptomycin.
- Chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật (là một loại “dao phẫu
thuật tự nhiên” để mở đĩa đệm cột sống) cột sống. Hiệu quả lâu dài của
papain trong công cuộc trị chứng thoát vị đĩa đột sống thắt lưng được
xem như tương đương với giải phẩu.
- Nghiên cứu còn cho thấy chiết xuất papain còn có hoạt tính kháng
sinh, có tác dụng chống vi khuẩn gram dương
- Nó còn được dùng để điều trị lở loét; làm tiêu giả mạc trong bệnh
Bạch hầu ; chống kết dính sau phẫu thuật; thuốc giúp tiêu hóa.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 10
- Papain chiết suất từ quả đu đủ xanh có tác dụng ngừa thai đối với
cả nam giới và nữ giới, tuy nhiên trong thời kì thai nghén papain có thể
gây xẩy thai.
- Papain một mình hay hỗn hợp với những enzym phân giải protein
khác cũng được dùng để chữa trị viêm vú, những viêm tụy mạn tính,
viêm ruột mạn tính, ung thư tế bào biểu mô .
- Papain là thành phần thuốc đánh răng, nhắm phân hủy protein
thức ăn, chống mảng răng, cao răng
- thuốc xức chữa bệnh lý học xơ như sẹo lồi, sẹo phì đại, hay bệnh
gây gấp ngón tay
- Một hỗn hợp papain và muxin dạ dày (10/90) được dùng có kết
quả để giảm hạ mỡ và cholesterol.
- Papain từ quả đu đủ xanh nghiền nát với nước dùng bôi mặt hoặc
tay để chữa các vết tàn nhang và bệnh eczema
b) Trong công nghiệp
- xử lý len và lụa trước khi nhuộm;
- là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su
c) Trong công nhệ thực phẩm
- Trong công nghiệp papain được dùng để tinh chế bia
- khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước
khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vit A và D hơn. Khoảng 1500
quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650 gram papain.
- Lá đu đủ xanh chứa papain có tác dụng làm mềm thịt do đó lá đu
đủ được dùng để gói thịt trong chế biến để thịt nhanh chóng mềm
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 11
II. BROMELIN
1) Định nghĩa – Cấu tạo
- Bromelin là một enzym có tác dụng thủy phân protein thành các
acid amin .
- Bromelin thủy phân protid rất mạnh.
- Bromelin được chiết xuất từ dứa.
- Dạng độc lập của enzyme này lần đầu tiên được tách ra năm 1891
bởi Vicente Marcano; năm 1892 được trích ly dạng đầy đủ.
- Bromelin là một protease bền với nhiệt độ, sau khi đun 1 giờ có
thể còn hoạt tính, hoạt động trong giải pH rộng từ 3-6, một số nghiên cứu
cho thấy bromelin hoạt động tốt trong dịch tiêu hóa có pH thấp khoảng
3,3-3,5
- Ở pH 3,3, chất này có tác dụng như men pepsin của dịch vị; còn ở
pH 6, nó có tác dụng như men trypsin của dịch tụy
- Có hoạt độ vào khoảng 5000 – 10000 UI/g (cơ chất Hb).
- Chế phẩm bromelin thường không bền nhiệt bằng papain
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 12
2) Nguồn cung cấp
- Được sản xuất từ quả và thân cây dứa
- Toàn bộ cây dứa từ lá, quả… đều có bromelin nhưng tập trung
nhiều trong lõi quả. Tuy nhiên,người ta đã xác định lượng bromelin trong
thân dứa gấp 20 lần quả
3) Ứng dụng
- Ngành công nghiệp thực phẩm dùng bromelin làm mềm thịt. Chỉ
cần một phần bromelin đã có khả năng thủy phân 1.000 phần thịt, tương
tự như papain và pepsin
- thúc đẩy quá trình thủy phân protein trong sản xuất nước chấm.
- bromelin còn có tính tiêu viêm, giảm phù nề và tụ huyết, hỗ trợ
tiêu hóa, giảm triệu chứng sổ mũi, giúp mau lành những vết thương nhỏ,
đặc biệt là căng nhức cơ, bong gân
- bromelin của dứa làm tăng hệ miễn dịch, ức chế quá trình viêm,
bôi lên nơi tổn thương (vết thương, vết bỏng, vết mổ) để làm sạch các mô
hoại tử, mau lành sẹo.
- Bromelin làm tăng hiệu quả kháng sinh và thuốc chữa hen. Nó
cũng có tác dụng làm giảm di căn ở các bệnh ung thư
- phối hợp với thuốc ngủ natri pentobarbitar tăng thời gian gây ngủ
- Bromelin trong quả dứa có tác dụng khử mùi rất hiệu quả
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 13
PROTEASE CÓ NGUỒN GỐC
ĐỘNG VẬT
I. TRYPSIN (EC 3.4.21.4)
1) Định nghĩa – Cấu tạo
- Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp, men này do tuyến
tụy tiết ra, tiền thân của nó là trypsinogen, được hoạt hóa bởi
Enterokinaza của ruột
- Là một loại serine protease
- Hoạt động tối ưu ở khoảng pH 8 và nhiệt độ 370C
- Sau khi được enterokinaza hoạt hóa, trypsin sinh ra tiếp tục tự
động hoạt hóa trypsinogen
2) Hoạt động
- Trypsin là một enzim có chức năng phân cắt các protein ta ăn vào
thành mảnh nhỏ (nhân của sự phân cắt) đồng thời tự phân cắt nó ra mảnh
nhỏ (quả của sự phân cắt).
- Đối với cá không có dạ dày (cá chép, mè trắng, rôhu...) thì trypsin
là men chủ yếu phân giải protein.
- Trong dịch tụy và dịch ruột
+ Trypsin khi mới tiết ra ở dạng chưa hoạt động là
trypsinogen.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 14
+ Dưới tác động của enzyme enterokinase, trypsinogen biến
thành trypsin hoạt động, sau đó quá trình này có thể xảy ra theo phương
thức tự hoạt hóa, nghĩa là chịu tác động ngay của enzyme trypsine.
+ Trypsine hoạt động tốt nhất trong môi trường pH 7 - 8.
+ Dưới tác dụng của trypsin, các protein còn sót, các peptide
lớn sẽ bị thủy phân đến dạng peptide có phân tử trọng thấp hơn và một
phần thành amino acid.
+ Trypsin thể hiện hoạt lực cao nhất đối với các liên kết
peptide có chứa nhóm carboxyl của amino acid diamin (lysine, arginine).
+ Trypsin còn hoạt hoá các enzyme khác cùng nhóm tiêu
hoá của dịch tuỵ :
● Kymotrypsin cũng được tiết dưới dạng
kymotrypsinogen và được hoạt hoá bởi trypsin, cắt liên kết peptid mà
nhóm –CO thuộc aa có nhân thơm
● Cacboxypolypeptidase được bài tiết dưới dạng
Procacboxypylypeptidase và được hoạt hoá nhờ trypsin
3) Ức chế trypsin
- Chất ức chế protease còn gọi là anti-trypsin vì ức chế hoạt động
của enzyme trypsin và chymotrypsin của tuyến tụy.
- Khi có mặt của các chất anti-trypsin thì hoạt động của trypsin và
chymotrypsin bị ức chế làm bội triển tuyến tụy để tăng cường sản xuất ra
các enzyme nhiều hơn vì vậy gây mất các protein và axit amin cần thiết
cho sự sinh trưởng của cơ thể.
- Sự có mặt của chất này đã làm giảm giá trị sinh học của protein,
giảm khả năng tiêu hóa của peptit, nhưng chất này có thể bị phá hủy bởi
nhiệt độ.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 15
- Các anti-trypsin chỉ bị mất hoạt tính khi sử lý nhiệt ở 105ºC trong
vòng 30 phút.
- Cần lưu ý khi xử lý nhiệt, nếu xử lý quá mức sẽ gây phản ứng
đường hóa các axit amin gọi là phản ứng Maillard làm mất giá trị dinh
dưỡng của thức ăn.
4) Nguồn cung cấp
- Trích từ tuyến tụy của heo
- Từ phế phụ liệu lò mổ động vật để sử dụng trong công nghệ thực
phẩm
5) Ứng dụng
- Làm giảm các triệu chứng viêm (sưng, nóng, đỏ, đau) do những
bệnh lý sau gây ra như gãy xương, bong gân, trĩ nội, trĩ ngoại, viêm trực
tràng và sau khi cắt trĩ, tụ máu, huyết khối.
- Trypsin còn được dùng chung với rutin và bromelain để trị sưng
xương khớp (osteoarthritis)
IV. ALPHA CHYMOTRYPSIN
1) Cấu tạo
- (A. chymotrypsin), loại proteinaza xúc tác phản ứng thuỷ phân
liên kết peptit, trong đó có nhóm - CO - của các axit amin thơm và axit
amin kị nước.
- Chymotrypsin là enzim tiêu hoá của dịch tuỵ, góp phần phân giải
protein trong ruột non.
- Ở tuyến tuỵ, chymotrypsin được tổng hợp ở dạng không hoạt
động là chymotrypsinogen, sau đó chuyển thành dạng hoạt động dưới tác
dụng của chymotrypsin hoặc tripxin.
- Trung tâm hoạt động của a-chymotrypsin bao gồm nhóm
hydroxyl của Ser - 195, imidazol của His-57 và nhóm carboxyl của Asp-
102. Các gốc này ở khá xa nhau trong chuỗi polypetid nhưng giữa các
nhóm chức năng của chúng chỉ cách nhau từ 2,8 - 3,0Å.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 16
2) Hoạt động
- Alpha - chymotrypsin là enzym thủy phân protein có tác dụng
xúc tác chọn lọc đối với các liên kết peptid ở liền kề các acid amin có
nhân thơm.
- Chymotripsin chứa trong dịch tụy ở dạng chưa hoạt động là
chymotripsinogen. Dưới tác động của enzyme trypsin và chymotrypsin,
chymotrypsinogen biến thành dạng hoạt động. Enzyme này hoạt động tối
ưu ở pH = 8,0, chúng thủy phân liên kết peptid có nhóm -CO- thuộc
amino acid nhân thơm (Phe, Tyr và Trp).
3) Nguồn cung cấp
- Alpha chymotrypsin là enzym được điều chế bằng cách hoạt hóa
chymotrypsinogen, chiết xuất từ tụy bò.
- Tìm thấy ở cơ thể động vật có xương sống bậc thấp và côn trùng.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 17
- Trích từ tuyến tụy của heo.
- Enzym từ cây cỏ thực vật có nguồn gốc từ trái cây nhiệt đới như
trái thơm.
- Từ phế phụ liệu lò mổ động vật để sử dụng trong công nghệ thực
phẩm
4) Ứng dụng
Enzym thủy phân protein trợ giúp phẫu thuật.
- Enzym này được dùng trong nhãn khoa để làm tan dây chằng
mảnh dẻ treo thủy tinh thể, giúp loại bỏ dễ dàng nhân mắt đục trong bao
và giảm chấn thương cho mắt.
- Dung dịch enzym 1:5.000 thường có tác dụng phân hủy dây
chằng treo thủy tinh thể trong khoảng 2 phút và dung dịch 1: 10.000 trong
khoảng 4 phút.
- Chymotrypsin cũng được sử dụng nhằm giảm viêm và phù mô
mềm do áp xe và loét, hoặc do chấn thương và nhằm giúp làm lỏng các
dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh
phổi và viêm xoang.
- Chymotrypsin dùng hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể để
lấy bỏ nhân mắt dễ dàng. Dùng trong điều trị phù nề sau chấn thương
hoặc sau mổ.
- Giảm đau, hạ sốt, kháng viêm.
- Đẩy nhanh hoạt động tuyến bã và đào thải chất ứ.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 18
III. CHYMOSIN (RENNIN)
1) Định nghĩa
- Thuộc loại aspartic acid protease
- là enzim proteolytic làm đóng cục sữa bằng cách làm đông cazein
của nó.
- thường ở dạng dung dịch, bột hoặc viên.
- có thể chứa muối (ví dụ, clorua natri, clorua canxi, sunphat natri),
còn lại từ quá trình sản xuất hoặc phụ vào cho chuẩn hoá, và chất bảo
quản (ví dụ, glycerol).
2) Hoạt động
- hoạt động trong môi trường acid yếu (pH 5,0 - 5,3) và cần sự có
mặt của Ca++
- Renine làm đông vón sữa bằng cách biến caseinogen thành
caseinate calcium
- Rennin bẻ gãy liên kết peptide giữa phenylalanine và methionine
của casein trong sữa, gây đông tụ sữa nhưng không lảm thủy phân sâu sắc
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 19
3) Nguồn cung cấp
- được lấy từ những con bê nuôi bằng sữa.
- Sau khi làm thịt, ngăn bao tử thứ tư trong dạ cỏ được lấy ra và đổ
hết những thức ăn chứa bên trong. Sau đó phần bao tử này được qua
nhiều tiến trình bao gồm ướp muối khô, rửa, cạo mỡ bề mặt, kéo căng
trên khung để lấy hết hơi ẩm, sau đó cuối cùng là xay và trộn với một
dụng dịch muối cho đến khi chiết ra được men dịch vị (rennet)
- Phương pháp hiện đai hơn dùng hệ enzyme đặc hiệu để tách
rennin từ bao tử bê
4) Ứng dụng
- dùng chủ yếu cho công nghiệp làm pho mát. Người ta đang cố
gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay thế một phần
rennin
- Dùng sản xuất các loại sữa đông
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 20
IV. PEPSIN
1) Cấu tạo
- Là enzim được tách ra từ dịch vị hoặc từ tế bào chính của dạ dày
động vật (vd. dạ dày lợn)
- có phân tử khối khoảng 35.000
- Điểm đẳng điện khoảng pH = 1
2) Hoạt động :
- Là xúc tác cho quá trình thuỷ phân một số liên kết peptit nhất
định trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptit phân tử thấp.
- Tiền enzim là pepsinogen do dạ dày tiết ra ở dạng không có hoạt
tính xúc tác.
- Dưới tác dụng của axit clohiđric (HCl) (hay ion H+) hoặc chính
của bản thân Pepsin xúc tác, pepsinogen được hoạt hoá thành hoạt động.
- Thuỷ phân mạnh các liên kết peptit nối mạch do các nhóm amin
của các axit amin thơm trong phân tử protein và peptit tạo thành, sản
phẩm được tách ra là các peptit chứa 5 - 8 axit amin và một ít axit amin tự
do.
- Hoạt động trong môi trường axit, thích hợp nhất trong khoảng pH
1,5 - 2; ở điều kiện này Pepsin không bền do có sự tiêu enzim ( 1 gam
pepsine của dịch dạ dày có thể thủy phân 50 kg albumine trứng trong
vòng 2 giờ ở những điều kiện thích hợp.)
- Có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạt lực của P thấp;
từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease.
- Pepsine có thể thủy phân collagen và elastine nhưng không thủy
phân keratin của tóc, lông và các protein đơn giản có nguồn gốc thực vật
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 21
3) Nguồn gốc :
- Pepsin được sản xuất nhờ phương pháp chiết suất hoặc tự phân.
- Enzim hoạt động lấy từ dịch vị hoặc từ các dịch tự phân, dịch
chiết được kết tủa bằng dung môi hoặc muối trung tính rồi sấy khô ở
nhiệt độ thấp.
4) Ứng dụng :
- Nghiên cứu protein
- Điều chế môi trường nuôi vi sinh
- Sản xuất phomat
- Làm đồ uống để chữa một số bệnh về đường tiêu hoá.
- Men tiêu hoá T-pepsin : là sự phối hợp giữa pepsin và thiamin
nitrat
+ Men Pepsin có tác dụng làm tăng khả năng dung nạp và
tiêu hoá protid ở thực phẩm kích thích tiêu hoá và hấp thụ chất đạm nhất
là thức ăn giàu chất đạm.
+ Thiamin nitrat (vitamin B1) là Coenzym thúc đẩy quá trình
chuyển hoá glucoza ở hệ thần kinh, hệ thống tiêu hoá và tim mạch.
+ Ngoài tác dụng trực tiếp đến quá trình tiêu hoá, men còn
có tác dụng điều hoà PH dịch vị Æ có tác dụng tốt trong điều trị đau dạ
dày và các trường hợp cần phẫu thuật dạ dày.
+ Tiêu hoá tốt, ăn ngon miệng, tăng cân, chóng phục hồi sau
khi ốm.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 22
THU NHẬN ENZYM
PROTEASE TỪ VI SINH VẬT
I. NGUYÊN NHÂN PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP NÀY:
Sản xuất enzym theo qui mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh
vât.So với động vật và thực vật,VSV có rất nhiều ưu điểm.Những ưu
điểm đó được tóm tắt như sau:
1. Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh:
_Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh khối rất
lớn. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tạo sinh
khối ở VSV cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động
vật và thực vật. Để đạt được tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, VSV phải
chuyển hóa một khối lượng cơ chất rất lớn. Cũng từ những nghiên cứu
trên E.coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong vòng 24h, vi khuẩn
E.coli có thể chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn lần
khối lượng cơ thể chúng. Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như
vậy, chúng phải tổng hợp ra được lượng enzym rất lớn. Bởi vì, mọi
chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzym đảm nhận. Chính vì thế, nếu
sử dụng VSV như nguồn sinh học để sản xuất enzym rất có lợi. Trong
một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn
(để thu enzym nội bào) mà còn thu được lượng enzym ngoại bào vừa
nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất cao.
2. Enzym thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao:
_Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với
tốc độ sinh sản và phát triển của VSV.
3. VSV là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô
công nghiệp:
_Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp
enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài.
Trong khi đó, sản xuất enzym từ nguồn thực vật và động vật không thể
đưa vào quy mô công nghiệp được.
4. Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công
nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm:
_Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm
giá thành sản xuất ở mọi nơi trên thế giới.
5. VSV có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym
khác nhau:
_Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải
thực hiện tất cả mọi chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 23
loại enzym khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt. Trong khi đó, cơ
thể đa bào được phân hóa thành các cơ quan riêng, mỗi một cơ quan (hay
mô bào) thực hiện những chức năng riêng. Chính vì thế, ở động vật và
thực vật, việc khai thác enzym có giới hạn ở một vài enzym nhất định.
_Đặc điểm này vừa có lợi và vừa bất lợi cho kỹ thuật tinh chế sau này.
Có lợi vì khi ta sử dụng một loạt phản ứng sinh hóa cần có sự chuyển hóa
liên tục theo một chuỗi phản ứng, ta không cần phải sử dụng nhiều nguồn
enzym khác nhau. Nhưng nếu ta chỉ cần thực hiện một phản ứng, đòi hỏi
phải làm tinh sạch enzym này bằng cách loại các enzym không cần thiết
khác. Nhiều trường hợp công việc này rất phức tạp và tốn kém. Do đó,
những enzym sau khi được tinh sạch người ta thường ứng dụng trong y
học, trong phân tích và trong kỹ thuật di truyền. Trong công nghệ thực
phẩm, người ta chỉ sử dụng các loại chế phẩm enzym tương đối sạch sẽ
và thế phẩm enzym thô.
II. TỔNG QUÁT:
1. Enzyme protease của vi sinh vật là một protease ngoại bào:
Enzyme này khác với Protease của thực vật(fixin,Papain,Bromelin) và
động vật (Tripxin,Pepxin,Renin) hơn nữa nó còn có tính đặc hiệu rộng rãi
Enzyme là những protein đóng
vai trò xúc tác, tức giúp các
phản ứng hóa học xảy ra nhanh
hơn. Enzyme ngoại bào
(ectoenzyme hay exoenzyme
hay extracellular enzyme……)
là bất cứ nhóm enzyme nào
được tiết ra từ các tế bào mà ở
đó chúng được sản xuất vào
trong môi trường bao quanh tế
bào. Nói cách khác, đó là
những enzyme hoạt động bên
ngoài những tế bào sản sinh ra
chúng.
Enzyme (Ảnh: Metallo.scripps.edu)
- Chế phẩm Protease tinh khiết từ vi khuẩn Bacillus có thể thủy
phân hòan tòan nhiều Protein.Chế phẩm này có tên gọi là Subtilizin.Khi
tác dụng trên Cazein thì họat độ sẽ đạt cực đại khi PH trung hòa
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 24
- Điều đáng chú ý là các chế phẩm Protease từ những vi khuẩn này
còn có khả năng làm đông sữa bằng chế phẩm từ Bacillus mesentericus
này.
- Ngòai ra,một số chế phẩm protease của vi khuẩn còn có họat độ
elastaza,nghĩa là chỉ có thể thủy phân các liên kết Peptit kế liền bên gốc
axit amin trung tính.Đây cũng là điểm khác biệt với Protease của nấm
mốc.
2. Protease là nhóm enzyme thủy phân: liên kết peptide của
protein, pepetid tạo ra các sản phẩm như peptone, đi-tri-peptide, acid
amin.Protease của VSV có đủ loại, tùy theo pH thích hợp ta chia ra
protease trung tính, kiềm acid.
- Trong côngnghiệp, người ta có thể thu protease từ nguồn
*Nấm mốc : Asp.moryzae,Asp.flavus,Asp.fumigatus, Asp.
Oryzae,…
*Vi khuẩn : Bac. Subtilispha, Bac. Cireulans, Bac.
Sphaericus, Bac.Thermophilus, Bac. Aerothermophilus…
*Xạ khuẩn : Str. Griseus, Str. Rimosus, Str. Fradiae, Str.
faeca is….
- Protease vsv có đặc điểm là hoạt động được trong khoảng pH khá
rộng, chúng tổng hợp được cả 2 loại enzym endo và exo – peptidase, do
vậy thủy phân được tới 80% liên kết peptide
- Protease của vi khuẩn hoạt động trong vùng pH hẹp hơn (7-8) so
với vsv (2-11). Chế phẩm protease từ mốc đen (Asp.niger,Asp.awamori)
có pH tối ưu 2.5 – 3
- Còn chế phẩm mốc vàng có pH tối ưu lân cận 6.5
- Chế phẩm enzym từ vi khuẩn Bac.subsilis khả năng thủy phân tốt
protein gọi tên subtilizin, Bacillus mensetericus thủy phân protit đến acid
amin và đông tụ được sữa có thể ứng dụng để thay thế 1 phần rennin
trong sản xuất phomat, một số chế phẩm từ vi khuẩn có elactase có khả
năng làm mềm thịt
- Protease cũng như amilase có ứng dụng khá rộng rãi trong công
nghiệp,đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm
3. Ứng dụng:
Những chế phẩm này đều được sản xuất từ các loại nấm mốc,vi khuẩn.
Protease được ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp nhưng nhiều nhất
là ngành công nghiệp thực phẩm như:
- Công nghiệp đồ hộp thịt: có tác dụng làm mềm thịt như enzym
elastaza keratiza…Chế phẩm enzym này thường lấy từ canh trường nuôi
xạ khuẩn actimomyces faradise.Người ta ngâm thịt,hay tim enzim vào
thịt,với liều lượng nồng độ,PH,nhiệt độ nhất định,sau một thời gian nhờ
sự thủy phân một phần protein(mô liên kết) làm thịt mềm ra.
- Trong công nghiệp sữa : Các chế phẩm từ vi
khuẩn(Bac.mesentericus) hay từ nấm mốc(Asp.candidus,Mucor) có họat
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 25
tính enzym tương tự Renin có thể thay thế một phần cho Renin(từ 25-
50%)
- Từ tháng 7-2003, dưới sự hướng dẫn của thạc sĩ trưởng khoa Đỗ
Thị Ứng Sao và thầy Hoàng Xuân Thế, giảng viên của khoa, các bạn đã
tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch cho dịch enzyme
protease acid thu nhận được từ hai điều kiện nuôi cấy bề mặt và bề sâu
của nấm mốc Aspergillus awamori 9 để ứng dụng chúng trong sản xuất
phô mai.
- Phô mai là một sản phẩm lên men từ sữa, rất giàu giá trị dinh
dưỡng, được sản xuất chủ yếu nhờ enzyme rennin cung cấp từ dạ dày bê
con. Thời gian gần đây, do sản lượng phô mai tăng nhằm đáp ứng nhu
cầu của người tiêu dùng đã dẫn đến sự thiếu hụt nguồn cung cấp enzyme
rennin.
- Từ đó, các nghiên cứu khoa học đã được tiến hành nhằm tìm ra
nguồn enzyme thay thế cho việc giết mổ bê con. Và nhóm nấm mốc
Aspergillus awamori đã được chú ý bởi có khả năng sinh ra enzyme
protease acid gây đông tụ sữa cao. Vì thế, việc nghiên cứu tinh sạch và
ứng dụng các chế phẩm enzyme protease acid thu nhận từ nấm mốc dùng
cho sản xuất phô mai đã được tiến hành rộng rãi ở các nước châu Âu,
Nhật Bản và Hoa Kỳ...
- Đặc biệt trong công nghệ sản xuất nước chấm như nước
tương,tương hột, chao…đều sử dụng chế phẩm protease từ vi sinh vật.
- TS Trần Bích Lam (Bộ môn vi sinh Đại học Bách khoa TPHCM)
cũng cho biết để sản xuất nước tương có tới 3 phương pháp công nghệ:
công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công nghệ enzym. Phương pháp
công nghệ vi sinh có thể sử dụng nguồn enzym protease do vi sinh vật
sinh ra trong quá trình lên men. Đặc điểm là hiệu suất thủy phân thấp,
thời gian thủy phân kéo dài, sản phẩm khó bảo quản, mùi vị thường bị
đắng. Còn để sản xuất nước tương “sạch” hoàn toàn thì phương pháp lên
men là tối ưu nhưng cần có thời gian đầu tư mặt bằng, dây chuyền thiết bị
và nhất là làm sao cho người tiêu dùng quen dần với mùi vị nước tương
lên men
- Trong công nghiệp hương liệu mỹ phẩm,dùng chế phẩm protease
pha lẫn xà bông, dầu gội đầu,kem chải tóc…làm cho tóc mềm mại,loại bỏ
biểu bì đã chế t(sạch gầu).
- Trong chế biến các loại bột giặt: Ngày nay, enzym được dùng
nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy vết bẩn
protein, vết máu, vết hồ...
- Trong sản xuất tơ tằm,dịch enzym Protease từ nấm mốc vi khuẩn
có tác dụng làm bóng sợi tơ,tách rời các sợi tơ tằm do thủy phân lớp
xerixin(là một protit). Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin
đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên(luợng xerixin sấp xỉ 30%), làm bong
và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 26
- Trong công nghiệp thuộc da: Dùng chế phẩm Protease thô từ
VSV có thể dùng trong thuộc da,tách lông,làm mềm da(chủ yếu phá bỏ
colagen,protit trong da). Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải
không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của
sợi colagen. Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút
ngắn được quá trình tẩy lông. Lượng lông thu được tăng lên khoảng 25 ¸
30% so với khi sử dụng phương pháp hóa học.Ở Mỹ chế phẩm enzyme
protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da.
- Trong y học: Chế phẩm Protease để điều chế dịch thủy phân
Protein dùng làm môi trường nuôi vi sinh vật(ví dụ Pepton).Cô đặc tinh
chế huyết thanh kháng độc(huyết thanh miễn dịch)
III. NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE:
- Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease.Các enzym
này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy.Một số
protease nội bào đã sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng
rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp ,trong nông nghiệp và y học.Các
lọai VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease được trình bày :
VSV Ghi chú
Vi
khuẩn
Bac.subtilispha
Bac.cireulans
Bac.sphaericus
Bac.thermophilus
Bac.aerothermophilus
Bac.thermoacidurans
Bac.thermmoproteoly
ticus
Bac.brevis
Bac.licheniformis
Bac.mesenlericus
Bac.megaterium
Bac.cerus
Bac.pumilus
Cl.perfringens
Cl.sporogens
......vv
*Protease trung tính,Protease kiềm(subtilizin)
*Colagenase
*Colagenase
*Protease trung tính,Protease kiềm
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 27
Xạ
khuẩn
Str.griseus
Str.rimosus
Strfradiae
Str.faeca is
Str.reetus var.pro-
teolyticus
*Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật ,Mỹ,gồm ít nhất
là 11 enzym với cơ chất procolagen phân giải
70%
Đến amino acid có 5 protease,hai
peptidase(lơxinamino_peptidase,cacboxypepti
dase),hai protease:protease-serin
Nấm
mốc
Asp.oryzae
Asp.satoi
Asp.awamori
Asp.niegr
Asp.shirousami
Asp.fumigatus
Asp.tericola
Pen.chrysogenum
……vv
*Protease-kim lọai protease serin,có ba
lọai:Protease acid,protease tung tính,Protease
kiềm.Protease acid(aspergilopepti-dase A)
*Protease acid
*Hai Protease acid
*Protease acid
*Hai Protease:Protease acid và Protease kiềm
*Protease acid có tác dụng làm đông sữa
*Protease acid có tác dụng làm đông sữa đã
được dùng ở Nhật để thay thế cho rennin
IV. ĐẶC ĐIỂM VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE VI SINH VẬT:
- Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng
nhiều.Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng
một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất.Căn cứ vào
cơ chế phản ứng,pH hoạt đông thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại
các proteinase vi sinh vật thành 4 nhóm như sau:Protease-xerin; protease-
thiol; protease-kim loại;protease-acid
- Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm,dựa vào pH hoạt
động của chúng bao gồm:Protease-acid,protease trung tính,protease kiềm.
- Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease-xerin và protease-
tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất
acid của amino acid.Ngược lại các protease kim loại, protease acid
thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của
amino acid.Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu
tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác
dụng.Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme
này tương đối bé nhất là protease-xerin.
- Các protease-xerin có trọng lực vào khoảng20.000-27.000
dalton.Tuy nhiên, cũng có một số protease-xerin có trọng lượng phân tử
lớn hơn nhu các enzyme của Penicillium cyoneo-
fulvum(44.000),Asp.oryae OUT 5038(52.000).Trọng lượng phân tử của
các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin( vào khoảng 33.800-
48.400 ).Protease-tiol và nhiều loại protease-acid cũng có trọng lượng
phân tử vào khoảng 30.000-40.000.
- Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm protease này ở bảng sau:
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 28
NHÓM NGUỒN ENZYME CHẤT KÌM HÃM
ĐẶC ĐIỂM
TRUNG TÂM
HOẠT ĐỘNG
pH tối
thích
Protease
Xerin
Bac.subsilis
Bac.pumilus
Str.tradiae
Art.hrobacter B22
Asp.oryzae
Asp.sojae
E.coli
Xerin
Proteinas
etiol
Streplococcus
Clostridium histoly-
ticum
Lodoaxeta-mit
Ps.cloromer-curbenzoat -SH
7.5
7.0
Protease
Bac.subtilus
Bac.subtilus NRRL
B3411
Bac.subtilisamy
Losaccarilicis
Bac.megaterium
Pseudomonasaeruginosa
Atreptomyces naraensis
Asp.oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolyticum
EDTA++
1,10ota-fenantrolin
Proteinse
Acid
Asp.niger
Asp.awamori
Asp.sailoi,Peniccillum
Janthinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pusillus
Endothia parasilica
Diazoaxetil
DI norlox-inmetil este COOH acid
- Cách phân loại trên được nhiều tác giả nhất trí và được sử dụng
rộng rãi.Tuy nhiên, trong thời gian sau này, số protease vi sinh vật nghiên
cứu ngày càng nhiều, ngày càng nhận được nhiều enzyme mang các tính
chất trung gian của các nhóm kể trên,nhất là giữa nhóm 1 và nhóm 3.Do
đó người ta bắt đầu có ý kiến về cách phân loại trên.Năm 1975,Morihara
đã thừ phân loại protease vi sinh vật được chia thành 4 nhóm lớn,dựa vào
tính đặc hiệu của nó đối với cơ chất thích hợp hoặc đối với chuỗi -
insulin đã bị oxy hóa:
*Nhóm một có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về
phía nhóm – CO2 của liên kết peptit,do dó còn được gọi là
carboxyendopeptidase
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 29
*Nhóm ba có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid về
phía nhóm –NH- cùa liên kết peptit(aminoendopeptidase).
*Nhóm thứ tư có đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở cả
hai phía của liên kết peptit
- Mỗi nhóm này được phân thành các nhóm nhỏ dựa vào tính đặc
hiệu của chung và một số tính chất khác
- Nói chung,tính đặc hiệu của các protease không chỉ thể hiện đôí
với gốc amino acid chứa nhóm –CO-hoặc nhóm –NH- của liên kết bị
phân giải(đặc hiệu sơ cấp) mà còn cả đối với các gốc amino acid ở xa liên
kết bị phân giải(đặc hiệu thứ cấp hoặc tương tác thứ cấp.Các enzyme
cùng một nhóm, có tính đặc hiệu giống nhau cũng chịu ảnh giống nhau
của tương tác thứ cấp.Nói chung,các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm
ngặt thường chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp ít hơn và ngược
lại.Chẳng hạn các protease-xerin giống trpysine của Streptomyces,
protease kim loại trung tính,…thường ít chịu ảnh hưởng của tương tác
thứ cấp khi chúng tác dụng với cơ chất phân tử bé cũng như các peptit
phân tử lớn hoặc protein.Ngược lại,các protease-xerin kiềm hoặc protease
acid chiụ ảnh hưởng lớn của tương tác thứ cấp mặc dù các enzyme này có
tính đặc hiệu nghiêm ngặt đối với cơ chất phân tử bé.Khi tác dụng trên
các cơ chất phân tử lớn tính đặc hiệu của các enzyme này cũng đựơc xác
định bởi tương tác thứ cấp
- Các protease vi sinh vật mới được nghiên cứu từ năm
1960.Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh
vật đã góp phần mở rông quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng
protease trong thực tế
V. TRUNG TÂM HỌAT ĐỘNG:
- Trong trung tâm họat động của các Protease VSV ngòai gốc
amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid
khác.Ví dụ His thường tham gia trong trung tâm họat động của các
protease-xerin,Protease-tiol,Tyrosine,trong trung tâm họat động của các
Protease kim lọai
- Trung tâm họat động của các Prôtease VSV đủ lớn và bao gồm
một số gố amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim
lọai.Marihara và tập thể (1969-1970) xác định rằng trung tâm họat động
của các subtilisin có kích thước giống nhau,vào khỏang 18 A0,tương ứng
với 5-6 gốc amino acid.
- Các Protease kim lọai có trung tâm họat động lớn hơn váo khỏang
21 ○A
Đối với các Protease acid,theo nhiều tác giả đã nghiên cứu cấu trúc trung
tâm họat động của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis và
Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hai
hạt,giữa chúng có khe hở vào khỏang 20 ○A.Khe hở này là phần xúc tác
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 30
của enzym,các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe
ấy.Dây có lẽ là kiểu cấu túc trung tâm họat động đặc trưng chung cho các
Protease acid.Ngòai nhóm –COOH theo Ichishida và Yoshiđa1986),gốc
Tryptophan cũng đóng vai trò quan trọng đối với Aspergilopeptidase A
- Đối với các Protease không chứa cysteine,trung tâm họat động của
chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không
được giữ vững bởi các cầu disulphide.
- Mặc dù trung tâm họat động của các Protease VSV có khác nhau
nhưng các ezym này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide
theo cùng một cơ chế chung như sau:
E + S E - S E - S + P1 E + P2
E là enzim
S là cơ chất
E-S là phức chất enzym-cơ chất
P1 là sản phẩm đầu tiên của phản ứng(với nhóm amine tự do mới được
tạo thành
P2 là sản phẩm thứ hai của phản ứng(với nhóm carboxyl tự do mới được
tạo thành)
- Theo một số tác giả,cơ chế tác dụng của các protease VSV cũng
giống với Protease xezin động vật,đều tiến hành theo kiểu xúc tác acid-
bazơ theo sơ đồ của Polgar và Bender (1969).Proteinase acid của VSV có
lẽ xúc tác cho phản ứng theo cơ chế giống với pepsin.
VI. CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM PROTEASE:
Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu Protease VSV đã góp
phần mở rộng qui mô sản xuất chế phẩm enzim và ứng dụng enzym trong
thực tế.Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng
của Protease.
- Để thu nhận chế phẩm Protease thừ VSV cũng như các enzym
khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt(phương
pháp nổi) và phương pháp bề sâu(phương pháp chìm).Phương pháp bề
mặt thường dùng để nuôi cấy nấm sợi,phương pháp bế sâu thường dùng
đối với vi khuẩn và nấm sợi.
- Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng,sử dụng phương pháp bề mặt
kinh tế hơn.Vì vậy các cơ sở sản xuất enzim mới xây dựng thường dùng
phương pháp này.Hiện nay phương pháp bề mặt đượ sử dụng rộng rãi ở ở
Nhật.Khi sử dụng phương pháp bề sâuthường dễ bị nhiễ hơn hơn phương
pháp bề mặt
- Ở phương pháp bề mặt,người ta thường sử dụng môi trường có độ
ẩm và giữ ở nhiệt độ không đổi.Trong suốt quá trình nuôi,độ ẩm của môi
trường vào khỏang 50-55%w.Nhiệt độ nuôi cấy tùy thusộc vào VSV,đối
với nấm sợi trong thời gain đầu từ 10-18 giờ giữ ở 29-30 ○C,sau khi có
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 31
mixen thì giảm nhiệt xuống còn 24-25 0C.Đối với vi khuẩn,nhiệt độ thích
hợp là 37-38 0C.
Một số môi trường thích hợp cho VSV tổng hợp protease ngoại bào
Thành phần môi trường(%) Vi sinh vật Tác giả
1- Tinh bột khoai tây 2.00
Nước chiết ngô
1.00
(NH4)2HPO4
0.90
CaCl2
0.10
KCl
0.50
MgSO4
0.15
2- Bột ngô
3.00
Nước chiết ngô
0.50
CaCl2
0.10
(NH4)2HPO4
0.90
Bac.meentericus Inlis, 1969
Nước chiết ngô
0.32
Cám lúa mì
3.31
Bột khoai tây
2.18
CaCO3
0.20
Bac.mesentericu Gatrep và Luisk, 1970
Dịch thủy phân enzyme
0.30
Glucose
1.00
MgSO4.7H2O
0.05
KH2PO4 (tính theo
phospho)
Bac.subtilis
Ortrosoko, 1977
Chứa 50mmg
phospho
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 32
FeCl3.6H2O
vệt
Bột ngô
2.00
Bột đậu tương
1.00
Nấm men ăn
0.50
Nước chiết ngô
0.30
CaCO3
0.20
Asp.oryzae
8FK
Konovalov, 1972
pH ban đầu 6.25
pH cuối cùng 8.25
Bột mì
2.00
KH2PO4
0.500
MgSO4
ZnSO4
0.600
FeSO4
Casein
0.100
Asp.awamori
78.2
Asp.oryzae 8F -
1
Konovalov
Sakhov, 1972
Bột đậu tương
1.120
Nước chiết ngô
0.670
CaCO3
0.100
Asp.oryzae
8F - 1 Gatrep, Vojno, 1970
Bột đậu tương
1.000
Tinh bột
4.000
KH2PO4
(NH4)2HPO4
0.065
ZnSO4.7H2O
0.002
FeSO4.7H2O
0.001
MnCl2.4H2O
0.001
Acl.Fradiae Konovalov, 1972
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 33
Glucose
7.001
C6H5O7Na3
0.425
KH2PO4
(NH4)2HPO4
0.125
ZnSO4.7H2O
0.001
FeSO4.7H2O
0.002
MgSO4.7H2O
0.575
Act.Sphereides Egorov và tập thể, 1976
Pepton
0.500
Nước chiết nấm men
0.500
Casein thủy phân
0.100
NaCl
0.500
Fructose hoặc maltose
1.000
Str.olivaceus Wojskowiez J. 1977 pH = 7.2
1. Nuôi cấy nô bắng phương pháp bề mặt:
- Môi trường thường dùng là cám,có PH từ 5.6-6.2(đối với nấm sợi)
hoặc từ 6.2-7.29đối với vi khuẩn).Đối với đa số nấm sợi mesofil có thể
nuôi từ 32-42 giờ.Sau đó dùng nước hay dung dịch nuôi để chiết rút
enzym khỏi môi trường,lọai bỏ những phần không hòa tan,kết tủa enzym
bằng muối vô cơ hay dung môi hữu cơ
2. Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu:
- Chuẩn bị môi trường thích hợp ngay trong thùng lên men và khử
trùng.Sau khi làm lạnh,cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%.Sau một thời gain
nuôi cấy tiến hành kiểm tra họat độ enzym của dịch môi trường nuôi
cấy.Khi họat độ đã đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzim ra khỏi tế
bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc.
- Để có kết quả tốt cần xác định cho được lượng oxi cần thiết trong
thời gian sinh trưởng của mỗi lọai VSV.Thể tích thùng lên men càng lớn
càng khó khống chế yếu tố này.Ở Nhật thường dùng các thùng lên men
20-30 m3.Theo các tác giả Nhật,nên cấy trực tiếp vi khuẩn vào thùng lên
men (chứ không qua giai đọan nuôi cấy trung gian) sẽ đảm bảo môi
trường khỏi bị nhiễm.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 34
VII. THU NHẬN ENZYM PROTEASE:
Tách enzym: Như trên đã nói, để tách enzym từ môi trường nuôi cấy
VSV theo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp,
dung dịch muối pha loãng hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh
trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch nói trên theo một tỷ lệ thích hợp,
khuấy đều lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc ly tâm,
thu lấy dịch trong. Trong sản xuất thường dùng nước máy để chiết rút với
thể tích gấp hai lần thể tích môi trường, tiến hành chiết rút enzym trong
một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.
Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần
làm lắng tế bào VSV hặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dich enzym.
Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ
thuật sản xuất chế phẩm enzym. Ở Nhật Bản đã tìm được phương hướng
thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường nuôi cấy. Theo các
tác giả Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường làm
giảm đáng kể hoạt độ enzym.
VIII. MỘT SỐ KỸ THUẬT CHUNG TRONG NUÔI CẤY VI SINH
VẬT THU NHẬN ENZYM :
*Quy trình lên men cổ điển được tiến hành theo các giai đoạn
sau :
Chế tạo môi trường
Khử trùng môi trường
Lên men
Thu hồi sản phẩm
Nhân
giống
VSV
Nhân
giống cấp
1, 2, 3
Kiểm tra sự tạo
thành sản phẩm
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 35
Trong nuôi cấy VSV thu nhận enzym có một số kỹ thuật chung và
một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm:
- Kỹ thuật tạo giống
- Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
- Thiết kế thiết bị nuôi cấy
- Kỹ thuật lên men
- Tách, tinh chế thu nhận enzym
- Như vậy, cho đến nay có hai phương pháp nuôi cấy VSV thu nhận
enzym: Phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm.
Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật:
1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt:
_Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho
VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt, người ta
sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (một số sách còn
gọi là môi trường bán rắn).
1.1. Môi trường lỏng
- Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo
thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí).
Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ
không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzym. Enzym ngoại bào sẽ được
tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzym nội bào
sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Không khí Sinh khối VSV Không khí
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Enzym ngoại bào
Dung dịch môi trường
Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay
- Nuôi cấy VSV thu nhận enzym trong môi trường lỏng theo
phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có
chiều cao khoảng 12 – 15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy
theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác.
_Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu
chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa
hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 36
trường nhỏ sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận
enzym sẽ không cao.
- Trong nhiều nhà máy, người ta tạo môi trường trong khay nuôi
cấy có chiều cao moi trường từ 5 – 7 cm là hợp lý.
1.2 Môi trường đặc:
- Phần lớn các nhà máy sản xuất enzym, khi nuôi cấy VSV thu
nhận enzym, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng
xâm nhập của không khí vào lòng môi trường, người ta thường sử dụng
cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.
- Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường,
nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzym nội
bào và ngoại bào. Các enzym ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt
môi trường, còn các enzym noi bào nằm trong sinh khối VSV.
- VSV không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách
pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề
mặt của các hạt môi trường, nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường
nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm
cao quá sẽ làm bết môi trường lại, không khí không thể thâm nhập vào
trong lòng môi trường, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV
phát triển. Thông thường người ta tạo độ ẩm khoảng 55 – 65%W là hợp
lý.
Không khí
Sinh khối
vi sinh vật
Hạt môi
trường Môi trường đặc
Vi sinh vật
phát triển bề Hạt Hạt môi truờng
mặt hạt môi trường
Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc
- Nếu sử dụng cám là nguyên liệu chính để nuôi cấy VSV thu nhận
enzym, người ta phải cho thêm 20 – 25% trấu để làm xốp môi trường, tạo
điều kiện thuận lợi cho không khí dễ dàng xâm nhập vào lòng môi
trường.
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 37
- Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là dễ thực hiện và khi
bị nhiễm bởi VSV lạ, thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ, ta rất dễ
dàng xử lý.
- Nhược điểm: phương pháp nuôi cấy bề mặt có nhược điểm rất lớn
là tốn nhiều diện tích và rất khó cơ giới hóa, tự động hóa. Phương pháp
này chỉ thích hợp cho nuôi cấy nấm sợi (nấm mốc), xạ khuẩn.
2. Phương pháp nuôi cấy chìm:
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt dần dần được thay thế bằng
phương pháp nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.
- Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng
môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men
(fermento). Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ thống
điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh PH
và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí
và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn.
2.1 Tác động của hệ thống thổi khí:
- Người ta thường cung cấp không khí vào bể lên men bằng máy
nén khí (compressor). Không khí sau khi ra khỏi máy nén khí được làm
nguội, làm sạch và khử trùng. Không khí được phân phối vào thiết bị lên
men bằng những ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ. Khi không khí vào trong bể
lên men, chúng có những tác động trực tiếp sau:
* Làm xáo trộn môi trường. Nhờ dòng khí vận chuyển trong
môi trường lỏng, các chất dinh dưỡng, tế bào VSV sẽ phận phối đều khắp
môi trường và chúng luôn luôn ở trạng thái động. Nhờ ở trạng thái động
như vậy, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào VSV sẽ rất cao. Khả
năng tiếp xúc này càng cao bao nhiêu, khả năng sinh tổng hợp enzym sẽ
cao bấy nhiêu.
* Nhờ có máy nén khi hoạt động, không khí được cung cấp
thường xuyên, oxy sẽ tan trong môi trường và VSV sẽ phát triển mạnh
hơn (đối với VSV hiếu khí). Như vậy đây là quá trình thúc đẩy VSV sinh
sản và phát triển.
* Dòng khí được cung cấp liên tục và thải ra liên tục sẽ kéo
theo những chất khí được tạo ra trong quá trình phát triển của VSV.
Những chất khí được tạo ra trong quá trình trao đổi chất này thường gây
ức chế quá trình trao đổi chất, sinh sản và phát triển của VSV. Nhờ có
dòng khí thổi vào môi trường sẽ hạn chế ảnh hưởng xấu của các chất khí
được tạo ra từ quá trình trao đổi chất.
2.2 Tác động của hệ thống khuấy trộn:
- Hệ thống khuấy trộn được thiết kế và lắp đặt trong các thiết bị lên
men không chỉ trong lên men hiếu khí mà cả trong lên men yếm khí.
Khuấy trộn là quá trình cơ học có ý nghĩa rất lớn trong thiết bị thu nhận
chế phẩm enzym. Các tác động đó được tóm tắt như sau:
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 38
- Cánh khuấy làm xáo trộn môi trường nuôi cấy, làm các
thành phẩm môi trường và các tế bào VSV không lắng xuống, tăng khả
năng tiếp xúc của các thành phần môi trường và VSV, từ đó làm tăng khả
năng trao đổi chất của VSV, lượng enzym được tổng hợp sẽ tăng lên.
- Trong lên men hiếu khí có thổi không khí, cánh khuấy hoạt
động sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxy có trong không khí khi được
thổi vào môi trường. Khi đó, các bọt khí, một mặt bị vỡ nhỏ ra, tăng thiết
diện tiếp xúc với dung dịch, một mặt dòng thoát khí khỏi dung dịch sẽ tồn
tại lâu hơn trong môi trường nước. Thời gian tồn tại của các bọt khí lâu sẽ
làm tăng khả năng tan của oxy. VSV chỉ có thể đồng hóa oxy hòa tan chứ
không có khả năng đồng hóa oxy ở dạng tự do.
Cánh khuấy làm tăng nhanh quá trình sinh sản vô tính do tác
động cơ học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Website sinhhocvietnam.com
- Website Từ điển bách khoa trực tuyến
Wikimedia.org
- Giáo trình Hóa Sinh Công Nghiệp – Lê Ngọc Tú
- Công Nghệ Enzymes – Trần Đức Lượng
- Website từ điển bách khoa toàn thư Việt Nam
www.bachkhoatoanthu.gov.vn
- Website hỗ trợ tìm kiếm www.google.com.vn,
www.yahoo.com
PDF by htpp://www.ebook.edu.vn 39
- Báo điện tử www.vnexpress.net
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- baocaohoasinh_2414.pdf