Nguyên lý kỹ thuật gen

PHẦN IINGUYÊN LÝ & PHƯƠNG PHÁPKỸ THUẬT GEN CHƯƠNG VI Nguyên lý kỹ thuật gen Kỹ thuật gen (genetic engineering): các kỹ thuật nghiên cứu gen, bộ gen và các thao tác trên gen, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen hoặc tạo ra gen mới Một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen Chuẩn bị gen cần tách dòng Đoạn xen DNA, DNA insert Gen cần tách dòng chuẩn bị từ bộ gen gen vi sinh vật, thực vật hoặc động vật hoặc tổng hợp nhân tạo từ oligonucleotid 1.1 Tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA bộ gen (tổng số) theo các bước cơ bản sau: Phá vỡ tế bào bằng enzym (lysozyme), chất tẩy mạnh (SDS – Sodium dodecyl sulfat). Phương pháp vật lý như siêu âm, ép, nhiệt. Tủa protein bằng hỗn hợp phenol-chloroform) và proteinase. Sau khi ly tâm trong ống ly tâm hình thành 3 lớp: lớp dịch phenol nằm ở đáy, lớp tủa protein nằm ở giữa, lớp dịch lỏng trên cùng chứa DNA. Hút lớp dịch chứa DNA chuyển sang ống eppendorf sạch, bổ sung 0,3 M sodium acetate. Thêm 2,5 thể tích cồn tuyết đối ở -200C để tủa DNA, ly tâm thu tủa. Rửa vài lần DNA bằng cồn 70%, làm khô và hòa tan trong dung dịch TE (10 mM Tris pH 7,5 và 1 mM EDTA). Kiểm tra độ sạch và bảo quản -200C 1.2 Tách chiết DNA plasmid Nuôi trên mt LB có kháng sinh. Nuôi vi khuẩn ở 370C trên máy lắc với tốc độ 200 v/ph, qua đêm. Ly tâm thu sinh khối. Phá vỡ tế bào. Bổ sung sodium acetate (pH 4,3), ly tâm 12.000 v/ph trong 10 phút. DNA bộ gen và protein kết tủa ở đáy ống. Dịch nổi chứa plasmid, chuyển sang ống mới, thêm ethanol lạnh (hoặc isopropanol) để kết tủa plasmid Ly tâm 14.000 v/ph thu tủa DNA plasmid. Hòa tủa trong dung dịch TE. Kiểm tra độ tinh sạch. 1.3 Tách chiết RNA Tách chiết RNA thông tin dùng mồi oligo-dT Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số bằng bộ kit In Low Salt With 100mM NaCl 1) 2) 3) 4) Tách chiết mRNA 1.4 Kiểm tra độ tinh sạch DNA, RNA bằng điện di gel agarose Chuẩn bị đệm điện di TAE x 1 hoặc TBE x 1 Chạy điện di 90-100v trong 30-40 phút. Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide soi dưới đèn UV Agarose Gel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 An ethidium-stained gel photographed under UV light **Each band that you see is a collection of millions of DNA molecules, all of the same length!! 1.5 Kiểm tra độ tinh sạch bằng quang phổ kế Dựa trên độ hấp thu ánh sáng của các base nitơ. Giá trị mật độ quang ở 260 nm của các mẩu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Protein hấp thu cao nhất ở 280 nm DNA (RNA) tinh sạch khi giá trị A260/A280 = 1,8 – 2,0 2. Enzym giới hạn 2.1 Khái niệm enzym giới hạn Do Smith và cs (1970) phát hiện ở vi khuẩn Hemophilus influenzae. Vi khuẩn có khả năng phân hủy DNA phage ở vị trí đặc hiệu Enzym giới hạn (Restriction enzyme – RE) thuộc nhóm endonuclease có khả năng nhận biết trình tự đặc hiệu (4 - 8 nucleotid) Enzym giới hạn chia làm 3 nhóm. Nhóm thứ 2 bao gồm enzym giới hạn nhận biết các trình tự đặc hiệu và cắt phân tử DNA ngay tại vị trí nhận biết Enzym giới hạn họat động trong dung dịch đệm và điều kiện To, pH thích hợp Enzym giới hạn không mang tính đặc hiệu lòai 2.2 Tên gọi của enzym giới hạn Tên gọi các enzym giới hạn thống nhất bằng 3-5 chữ cái Chữ cái đầu in hoa chỉ tên vi khuẩn Hai chữ kế tiếp in thường chỉ loài sinh vật Chữ cái tiếp theo in hoa chỉ chủng vi khuẩn đã tách chiết enzym giới hạn VD: EcoRI Escherichia coli R (chủng) I (thứ tự) 2.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn Enzyme Trình tự nhận biết EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT BamHI GGATCC EcoRV GATATC Trình tự nhận biết thường từ 4 – 8 cặp nucleotid Cắt kiểu đầu bằng Cắt hai mạch DNA ở cùng một điểm EcoRV 5’….ACTGTACGATATCGCTA….3’ 3’….TGACATGCTATAGCGAT….5’ EcoRV 5’….ACTGTACGAT ATCGCTA….3’ 3’….TGACATGCTA TAGCGAT….5’ EcoRV 5’….ACTGTACGAT ATCGCTA….3’ 3’….TGACATGCTA TAGCGAT….5’ Đầu bằng Cắt kiểu đầu so le Nhận biết và cắt ở vị trí khác nhau BamHI 5’….ACTGTACGGATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGCCTAGGCGAT….5’ BamHI BamHI 5’….ACTGTACGGATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGCCTAGGCGAT….5’ BamHI BamHI 5’….ACTGTACGGATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGCCTAGGCGAT….5’ BamHI A closer look…. BamHI GATCCGCTA….3’ GCGAT….5’ 5’….ACTGTACG 3’….TGACATGCCTAG Đầu so le A closer look…. BamHI 5’….ACTGTACG GATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGCCTAG GCGAT….5’ 3. Các enzym thường dùng trong sinh học phân tử Enzym tổng hợp Enzym nối Enzym thủy phân 3.1 Enzym xúc tác tổng hợp DNA và RNA Polymerase: xúc tác gắn nucleotid mới vào chuỗi mạch đơn Taq DNA Polymerase Pfu DNA polymerase Enzym phiên mã ngược Taq DNA polymerase Ứng dụng rộng rãi để tổng hợp DNA nhân tạo bằng phản ứng PCR Gồm 832 acid amin, trọng lượng PT 94 KDa Tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaricus, sống ở suối nước nóng Hot water bacteria: Thermus aquaticus Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone © 1994 Yellowstone Association for Natural Science Tốc độ tổng hợp 130 – 300 nucleotid/s Ở to = 700C - 60 Nu/s, ở 550C – 24 Nu/s, ở 370C – 1-2 Nu/s. Ion Mg++ có ảnh hưởng mạnh Dung dịch đệm: 50mM Tris-HCl (pH = 9,0), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 200 mM dNTP mỗi loại. Pfu DNA polymerase Tách chiết từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus Trọng lượng PT 92 KDa Nhiệt độ thích hợp: 72 – 780C Tổng hợp DNA chậm 12 Nu/s Enzym phiên mã ngược(Reverse transcriptase) Tổng hợp cDNA từ mạch khuôn RNA của retrovirus 3.2 Enzym nối DNA Xúc tác hình thành các liên kết phosphoester 5’….ACTGTACAGATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGTCTAGGCGAT….5’ DNA Ligase 5’….ACTGTACAGATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGTCTAGGCGAT….5’ DNA Ligase DNA ligase DNA ligase 5’….ACTGTACAGATCCGCTA….3’ 3’….TGACATGTCTAGGCGAT….5’ DNA Ligase 3.3 Các enzym cắt acid nucleic DNase: cắt phân tử DNA, RNase cắt phân tử RNA Một số enzym thông dụng: DNase I, Nuclease S1, Exonuclease Nucleases can chew from the ends or attack the middle of the substrate 4. Vector tách dòng(cloning vector) 4.1 Khái niệm Phân tử DNA có kích thước nhỏ, cho phép gắn các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản Có các điểm cắt đặc hiệu, mang các gen chỉ thỉ: màu hoặc kháng kháng sinh “Phương tiện vận chuyển gen” 4.2 Các loại vector tách dòng a. Vector tách dòng là plasmid Typical Prokaryotic Plasmid:Circular, small, and code for things that are useful to the prokaryote, but not necessary. Plasmid Vector: pBR322 Vector tách dòng đầu tiên(1976) pBR322 colE1 origin of replication (ORI) pBR322 2. Markers chọn lọc: Kháng Ampicillin (β-lactamase gene) và KhángTetracycline (tet gene) pBR322 3. Ít vị trí cắt giới hạn BamH1 BamH1 Đoạn DNA muốn cài pBR322 Ưu điểm: 200 bản sao/ tế bào E. coli Tạo DNA sợi kép Các vector tạo dòng đều dựa vào pBR322 Ưu điểm so với pBR322 Tạo 1000’s bản sao/tế bào Kích thước nhỏ 2.7 kilobase pairs (kb) = dễ hấp thu vào E. coli Thế hệ mới: pUC Plasmids Ưu điểm so với pBR322 3. Vị trí chèn (MCS - Multiple cloning site) pUC Plasmids Multiple Cloning Site(MCS or Polylinker) pUC19 MCS Ưu điểm so với pBR322 4. Dể dàng chọn lọc AmpR & blue/white selection pUC Plasmids Forth improvement blue/white selection Thế hệ mới nhất: pGEM and pBluescript Features similar to pUC plus f1 ori (single stranded DNA) T7 & SP6 Promoters (RNA production) MCS Thế hệ mới nhất : pGEM and pBluescript Features similar to pUC plus f1 ori (single stranded DNA) T7 & T3 Promoters (RNA production) b. Vector tách dòng là phage Phage bao gồm nhiều loại thực khuẩn thể có bộ gen DNA mạch đơn hoặc mạch kép Cải biến bộ gen của phage. VD, phage M13 gắn với gen lacZ và các vị trí cắt giới hạn tạo vector tách dòng khác nhau M13mp1, M13mp7,… Ưu điểm so với plasmid: cài đoạn lớn hơn, tạo nhiều bản sao c. Vector tách dòng là phagemid Cấu tạo gồm 1 số gen của plasmid (gen chỉ thị, đoạn ori,…) và một phần gen của phage (đoạn ori, các gen cần cho bao gói) pBC (Stratagene) Rolling cycle replication FOR DNA SEQENCING ssDNA generator: M13 virus Plasmid form of phage Phage form of phage d. Vector tách dòng là cosmid Thiết kế từ một đoạn của plasmid và đoạn cos của phage. Còn thêm vào đoạn đa cắt nối (MCS), đoạn khởi đầu tái bản (ori) SuperCosmid có kích thước 7,9 kb, gồm 2 đoạn cos của bộ gen phage, 2 gen chỉ thị amp và neomycin, đoạn ori của virus SV40 và đoạn đa cắt nối Cosmid cho gắn DNA kích thước tới 50 kb SuperCos (Stratagene) Cosmid vector Cut with RE cos Inserts Size fractionated; vector-compatible ends cos cos cos Ligate at high conc. Package in vitro etc. cos Infect host Select ampR etc. ampR ori ampR ampR ampR e. Vector tách dòng là NST nhân tạo (Artificial chromosome) Khi thiết lập ngân hàng bộ gen, cDNA các vector như plasmid, phage tạo ra số lượng dòng lớn. NST nhân tạo cho phép gắn đoạn DNA rất lớn: 100 – 1.000 kb BAC (Bacteria Artificial Chromosomes): một phần DNA bộ gen vi khuẩn, gồm đoạn ori, gen chỉ thị, đoạn đa cắt nối và promoter đặc hiệu pBeloBAC11 New England BioLabs YAC (Yeast Artificial Chromosomes) cho phép cài đoạn DNA tới 2.000 kb Thiết kế từ một số trình tự đặc hiệu của bộ gen nấm men: ARS (Autonomous replicating sequences) và CEN (centromer, tâm động) và TEL (telomer) Ngoài ra còn gắn gen chỉ thị nấm men như trpI (auxotrophs), ura 3 (uracin), leu 2 (leucin, his 3 (histidin) g. Vector tách dòng là Ti plasmid Ti plasmid có kích thước tới 200 kb trong tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ti plasmid có một đoạn T-DNA (10-20 kb) mang gen tổng hợp opin, auxin… gây khối u ở thực vật 2 lá mầm. Ti Plasmid T-DNA region Auxin Left border Cytokinin Opine Opine catabolism Right border vir genes ori 12-24 kbp Plant cell Agrobacterium Nucleus Single-stranded copy of T-DNA (protected by ssDNA binding protein) Transfer of T-DNA from Agrobacterium to plant cell wound ‘signal’ T-DNA Plant cell Agrobacterium Nucleus Single-stranded copy of T-DNA (protected by ssDNA binding protein) Transfer of T-DNA from Agrobacterium to plant cell T-DNA pore T-DNA wound ‘signal’ Lúa vàng: Hàm lượng vitamin A tăng Tăng giá trị dinh dưỡng h. Vector tách dòng ở tế bào eukaryot Do các vector như plasmid, cosmid hoạt động kém ở tế bào bậc cao, người ta đã sử dụng vector tách dòng là các virus cải biến SV 40 (Simian virus): loại bỏ gen độc, thêm gen chỉ thị và đoạn đa chèn Vector tách dòng ở tế bào bậc cao sử dụng promoter của cytomegavirus (Pcmv), trình tự ori, đoạn MCS 5. Vector biểu hiện gen(Expression vector) 5.1 Đặc điểm cấu trúc vector biểu hiện gen Cho phép biểu hiện đồng thời gen chỉ thị và gen tách dòng Thành phần gồm promoter mạnh, trình tự sao chép, vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của ribosome, tín hiệu kết thúc dịch mã, đoạn MCS, gen chỉ thị Vector biểu hiện mạnh có đặc điểm như tạo nhiều bản sao, dịch mã tạo nhiều protein, đoạn MCS có nhiều vị trí cắt đặc hiệu, hoạt động vector không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ. 5.2 Các loại promoter thường sử dụng trong vector biểu hiện gen Thực khuẩn thể: T7 promoter, T3 promoter Vi khuẩn: lac promoter, trp promoter, Đối với tế bào eukaryot: dùng promoter của virus CMV (Cytomegavirus), SV 40, Nấm men: PGK promoter (phosphoglyceride), GAL promoter (gen tổng hợp galactose) AOX1 promoter (alcohol oxydase) 6. Các hệ thống biểu hiện gen 6.1 Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn Ưu điểm tế bào E.coli Tốc độ sinh trưởng nhanh. Biểu hiện protein mạnh: 50 – 500 mg/ L Giảm chi phí công nghệ và hóa chất Cấu trúc và và đặc điểm di truyền biết đầy đủ Hạn chế: Khó khăn cho protein có kích thước lớn 50 KDa, giàu cystein hoặc protein có nhiều cầu nối disulfit Protein biến đổi sau dịch mã và glycosyl hóa Có thể gây bệnh hoặc sinh độc tố Tiết protein ngoại bào thấp Codon Usage in E. coli & humans 6.2 Biểu hiện gen trong Baculovirus nuôi trong tế bào côn trùng Kí sinh 600 loài côn trùng Biểu hiện gen mã hóa protein có kích thước trên 50 kDa Gắn promoter cực mạnh Biểu hiện: α-interferon, erythropoietin, interleukin Biểu hiện các protein có phản ứng glycosyl hóa chính xác Thời gian nuôi cấy lâu: 4-5 ngày 6.3 Biểu hiện gen trong tế bào nấm men Sử dụng cả 2 loại vector biểu hiện trong prokaryot và eukaryot Biểu hiện protein có kích thước lớn hơn 50 kDa, thời gian nuôi cấy nhanh (8 h), hiệu xuất: 50 – 5.000 mg/L Sử dụng promoter mạnh AOX (alcohol oxidase). Các protein giàu cystein và cầu nối disulfit biểu hiện tốt Phổ biến Saccharomyces cereviae, Pichia pastoris 6.4 Biểu hiện gen trong tế bào động vật bậc cao Tế bào S2 của ruồi dấm. Tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc CHO (Chinese Hamster Ovary) Nhược điểm: chỉ biến nạp bằng xung điện, thời gian nuôi cấy lâu, giá thành cao. II. Nguyên lý kỹ thuật gen Các bước chủ yếu của kỹ thuật gen + Chuẩn bị gen cần tách dòng Tách chiết (DNA, RNA) từ các sinh vật. Dùng PCR để nhân đoạn gen cần thiết với số lượng lớn Tổng hợp nhân tạo đoạn DNA insert trên cơ sở trình tự đã biết hoặc hoặc dự đoán tự trình tự acid amin đã biết + Tạo (thiết kế) vector tái tổ hợp Dựa vào đặc điểm của gen cần tách dòng lựa chọn vector và enzym giới hạn phù hợp Biến nạp vector vào tế bào chủ: sốc nhiệt, xung điện, bắn gen Sàng lọc các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm: dinh dưỡng, nhiệt độ, pH… thích hợp Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng Bước 2: Chèn gen vào vector Vector – molecule of DNA which is used to carry a foreign gene into a host cell Bước 3: biến nạp vào tế bào chủ 2. Nguyên tắc chọn lọc vector tách dòng Một số nguyên tắc cần lưu ý: + Dựa vào kích thước và bản chất của đoạn DNA cần tách dòng để chọn vector. Đoạn DNA có nguồn gốc prokaryot chọn plasmid, phage, cosmid. Đoạn DNA chèn có nguồn gốc tế bào bậc cao dùng phage, NST nhân tạo, virus… + Lưu ý sự tương đồng các vị trí cắt đặc hiệu giữa đoạn DNA chèn và vector Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings. Fig. 7.3 Cleavage of DNA by the restriction enzyme EcoRI Vector tách dòng cần thích hợp tế bào chủ, tạo nhiều bản sao (>50), nhưng không gây ảnh hưởng tế bào chủ Gen chỉ thị nhận biết dễ dàng (màu sắc hoặc chỉ thị kháng sinh) Blue/White Selection 3. Nguyên tắc tạo vector tái tổ hợp 4. Một số kỹ thuật biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Sốc nhiệt Xung điện Vi tiêm Bắn gen Mandel và Hinga phát hiện vào năm 1970 4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng kỹ thuật sốc nhiệt Chuẩn bị tế bào khả biến (Competent cell): DH5α, BL 21, LE 392, MC 1061 Quy trình biến nạp E. coli CaCl2 cold! + 42oC Recover at 37oC Incubate at 37oC overnight LB Amp+Kan LB Amp+Kan Quy trình biến nạp E. coli CaCl2 cold! + 42oC Recover at 37oC Ủ qua đêm ở 37oC LB Amp+Kan LB Amp+Kan Making cells competent 4.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện (Electroporation) Chuẩn bị tế bào Kỹ thuật xung điện TRANSFORMATION BY ELECTROPORATION 5. Kỹ thuật chọn lọc tế bào tái tổ hợp Dòng tế bào tái tổ hợp là dòng tế bào mang vector tái tổ hợp, nuôi trong môi trường thích hợp để hình thành khuẩn lạc 5.1 Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh 5.2 Chọn lọc dòng tế bào TTH bằng gen chỉ thị màu 5.3 Chọn lọc dòng tế bào bằng phương pháp lai phân tử Chọn lọc tế bào tái tổ hợp III. Các phương pháp tách dòng gen (gene cloning) Tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, đoạn DNA vào tế bào chủ (host cell), tạo nên dòng tế bào mang gen cần tách dòng 1. Tách dòng in vitro 1.1 Tách dòng gen từ DNA Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng Bước 2: Chọn vector tách dòng Bước 3: Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Bước 4: Sàng lọc các dòng tái tổ hợp Bước 5: Nuôi cấy dòng tế bào tái tổ hợp, thu sinh khối và protein tái tổ hợp Tách dòng gen từ DNA 1.2 Tách dòng gen từ RNA thông tin (mRNA) Bước 1: Tách chiết mRNA. Dùng bi từ có mang oligo nucleotid T. Phân tử mRNA có đuôi A tạo liên kết oligo-T, bám trên bề mặt bi. Ly tâm tách mRNA ra khỏi bi. Bước 2: tổng hợp cDNA sử dụng enzym phiên mã ngược để tổng hợp cDNA. Thủy phân sợi khuôn mRNA bằng RNase II. Dùng DNA polymerase và dNTP tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2, tạo phân tử cDNA mạch kép. Các bước tiếp theo tương tự tách dòng gen từ DNA Directional cDNA cloning 2. Tách dòng in silico Hay tách dòng ảo (cloning in silico), là sự tổng hợp, phân tích các kle61t quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu để chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó Chọn phần mềm, chọn vector tách dòng, chọn enzym giới hạn thích hợp… IV. Ngân hàng bộ genGenome bank Khái niệm ngân hàng bộ gen Tập hợp các đoạn DNA bộ gen được tách dòng trong tế bào chủ, tạo nên các dòng tế bào khác nhau, mỗi dòng mang một đoạn DNA khác nhau của bộ gen Ngân hàng bộ gen gồm các đoạn DNA mang mã di truyền (exon) và đoạn không mang mã di truyền (intron) Số lượng và kích thước đoạn cắt DNA phụ thuộc đặc điểm bộ gen của mỗi loài vi sinh vật và số loại enzym giới hạn sử dụng VD, bộ gen vi khuẩn 4 Mb (4x106 bp). Dùng enzym giới hạn cắt đặc hiệu thành các đoạn đặc hiệu có kích thước TB 4 kb, sẽ thu 1.000 đoạn. Các đoạn tách dòng trong tế bào chủ, tạo nên ngân hàng bộ gen gồm 1.000 dòng (clone). Trong trường hợp đoạn DNA có kích thước 8 kb, thì ngân hàng bộ gen là 500 dòng. 2. Thiết lập ngân hàng bộ gen Dùng để thiết lập ngân hàng gen của nhiễm sắc thể, tế bào hay một loài Sử dụng các loại enzym giới hạn Các bước tiến hành Tách chiết và tinh sạch DNA bộ gen. Cắt bằng enzym giới hạn Tách riêng từng đoạn DNA và gắn với vector tách dòng và biến nạp vào tế bào chủ V. Ngân hàng cDNA Số lương gen mã hóa protein chiếm lượng nhỏ (ở người chỉ khoảng 1,7 %). Thời gian hoạt động và biểu hiện của gen thay đổi tùy theo từng mô, tế bào và giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cơ thể. Tách chiết và tinh sạch mRNA của tế bào từng thời điểm tương ứng số gen đang hoạt động trong tế bào Tập hợp tất cả các mRNA thu được từ một loại tế bào, các giai đoạn phát triển khác nhau, tạo nên tập hợp cDNA được tách dòng gọi là ngân hàng cDNA 1. Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA 1.1 Phiên mã ngược bằng phân hủy hoàn toàn sợi khuôn mRNA - Sử dụng kỹ thuật PCR với các mồi đặc hiệu có đuôi oligo-dT Synthesis of cDNA- self priming method 1.2 Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE Kỹ thuật RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) tạo cDNA từ mRNA 5’-RACE (Rapid amplification of cDNA ends) To fill cDNA 5’ missing end 2. Thiếp lập ngân hàng cDNA