Nhân giống in vitro dứa Cayen

lý ®· t¨ng thu ho¹ch tõ 6 - 20%, cao h¬n 4 - 8% so víi xö lý ABT4. Cã thÓ nãi: ABT6 ®­îc sö dông réng r·i cho nhiÒu lo¹i c©y trång vµ ®em l¹i hiÖu qu¶ cao nhÊt. HiÖn nay, ë ViÖt Nam chÊt kÝch thÝch ABT ®· vµ ®ang ®­îc sö dông ®Ó kÝch thÝch sù ra rÔ cña nhiÒu lo¹i c©y trång, thóc ®Èy qu¸ tr×nh n¶y mÇm cña h¹t gièng, kÝch thÝch sinh tr­ëng vµ t¨ng n¨ng suÊt c©y trång [13]. 1.6. Ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 1.6.1. LÞch sö ph¸t triÓn cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt N¨m 1902, Harberland lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· quan niÖm r»ng bÊt kú mét tÕ bµo nµo cña c¬ thÓ sinh vËt ®a bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó ph¸t triÓn thµnh mét c¸ thÓ hoµn chØnh. ¤ng ®· cho r»ng: “ B»ng c¸ch nu«i cÊy tÕ bµo ®· ph©n lËp, ng­êi ta cã thÓ t¹o ra c¸c ph«i nh©n t¹o tõ c¸c tÕ bµo sinh d­ìng”. ¤ng còng ®· tiÕn hµnh nu«i cÊy mÉu l¸ cña mét sè c©y mét l¸ mÇm nh­: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiªn ®· kh«ng thµnh c«ng. H¬n m­êi n¨m sau, Kotte vµ Robbin (1924) ®· nu«i cÊy ®Ønh sinh tr­ëng rÔ cña mét lo¹i c©y hoµ th¶o. Hä ®· thu ®­îc mét hÖ rÔ nhá cã c¶ rÔ phô nh­ng chØ duy tr× ®­îc hÖ rÔ nµy trong mét thêi gian ng¾n. Tõ n¨m 1934 ®­îc xem lµ giai ®o¹n thø hai cña nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt khi White thµnh c«ng trong viÖc duy tr× m« rÔ c©y cµ chua (Lycopersicon esculentum) trong m«i tr­êng dÞch thÓ cã chøa muèi kho¸ng, ®­êng Saccaroza vµ dÞch chiÕt nÊm men. Qua thÝ nghiÖm, «ng thÊy r»ng cã thÓ thay thÕ dÞch chiÕt nÊm men b»ng c¸c vitamin nhãm B (B1, B3, B6). Cïng thêi gian ®ã, nhµ khoa häc Ph¸p - Gautheret ®· nu«i cÊy thµnh c«ng m« t­îng tÇng cña mét sè c©y th©n gç [17]. Sau khi Went vµ Thimann t×m ra vµ tinh chÕ ®­îc chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng ®Çu tiªn lµ IAA, Gautheret thÊy r»ng viÖc bæ sung c¸c vitamin nhãm B vµ IAA vµo m«i tr­êng ®· n©ng cao kh¶ n¨ng sinh tr­ëng cña m« t­îng tÇng c©y Salix capraea vµ Populus nigra. Vµo n¨m 1939, ®éc lËp víi Nobercourt, Gautheret còng ®· duy tr× ®­îc sinh tr­ëng cña m« sÑo cµ rèt (Daucus carota) trong mét thêi gian dµi. Trong n¨m ®ã, White ®· nu«i cÊy thµnh c«ng con lai c©y thuèc l¸ (Nicotiana glauca vµ N. langdoffi). N¨m 1941, Van Overbeek vµ cs ®· ph¸t hiÖn thÊy n­íc dõa cã ¶nh h­ëng tÝch cùc ®Õn sù ph¸t sinh ph«i vµ t¹o m« sÑo ë c©y hä cµ (Datura) [23]. Còng trong thêi gian nµy nhiÒu chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng nh©n t¹o thuéc nhãm auxin nh­: NAA; 2,4-D ®· ®­îc tæng hîp. NhiÒu t¸c gi¶ ®· x¸c nhËn cïng víi n­íc dõa, 2,4-D vµ NAA ®· gióp t¹o ra m« sÑo th«ng qua ph©n chia tÕ bµo ë nhiÒu ®èi t­îng thùc vËt mµ tr­íc ®ã khã kh¨n nu«i cÊy. N¨m 1954, Skoog bæ sung chÕ phÈm DNA chiÕt tõ tinh dÞch c¸ bÑ (Lerringperm) vµo m«i tr­êng nu«i cÊy m« th©n c©y thuèc l¸. ¤ng nhËn thÊy chÕ phÈm nµy cã t¸c dông kÝch thÝch sinh tr­ëng m« nu«i cÊy râ rÖt. Mét n¨m sau, Skoog vµ cs ®· x¸c nhËn chÊt g©y ra hiÖn t­îng trªn lµ 6-furfuryl amino purine vµ ®Æt tªn lµ Kinetin. Sau ®ã ng­êi ta ®· t×m ra vµ tæng hîp mét sè chÊt cã t¸c dông kÝch thÝch ph©n bµo t­¬ng tù nh­ Kinetin vµ cïng víi Kinetin gäi chung lµ nhãm Cytokinin. Cytokinin ®­îc t¸ch chiÕt tõ thùc vËt bËc cao ®Çu tiªn lµ Zeatin cã trong mÇm ng«. C¸c hîp chÊt nµy cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo cña c¸c m« ®· biÖt ho¸ cao nh­ tÕ bµo thÞt l¸ hoÆc néi nhò cña h¹t ®· ph¬i kh«. N¨m 1957, Skoog vµ Miller c«ng bè kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ ¶nh h­ëng cña tû lÖ (Kinetin/auxin) trong m«i tr­êng nu«i cÊy ®èi víi sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« sÑo c©y thuèc l¸. Khi gi¶m thÊp tû lÖ nµy th× m« sÑo cã khuynh h­íng t¹o chåi. HiÖn t­îng nµy còng ®· ®­îc x¸c nhËn trªn nhiÒu ®èi t­îng kh¸c nhau vµ tõ ®ã ®ãng gãp rÊt lín vµo sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c¸c c¬ quan, m«, tÕ bµo trong nu«i cÊy. Thµnh c«ng cña hai nhµ khoa häc nµy ®· dÉn tíi nhiÒu ph¸t hiÖn quan träng kh¸c nhau më ®Çu cho gian ®o¹n thø ba vÒ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt: kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n, nu«i cÊy tói phÊn, h¹t phÊn, nu«i cÊy t¹o ph«i xoma nh©n t¹o… Trong thêi gian 1954 - 1959, kü thuËt t¸ch vµ nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n ®· ®­îc chó ý rÊt nhiÒu. Muir, Hildebrandt vµ Riker ®· t¸ch tÕ bµo ®¬n ë d¹ng thÓ huyÒn phï b»ng c¸ch nu«i cÊy m« sÑo trong m«i tr­êng láng, cã l¾c. N¨m 1956, Nickell còng nu«i cÊy huyÒn phï tÕ bµo ®¬n cña loµi ®Ëu (Phaseolus vulgaris) liªn tôc trong thêi gian dµi. N¨m 1960, Bergman ®· dïng ph­¬ng ph¸p läc ®¬n gi¶n ®Ó thu ®­îc huyÒn phï c¸c tÕ bµo ®éc lËp. Ng­êi ta cã thÓ cÊy c¸c tÕ bµo nµy vµo m«i tr­êng th¹ch, chóng tiÕp tôc ph©n chia vµ t¹o ra m« sÑo. Ng­êi ta ®· b¾t ®Çu chó ý ®Õn kü thuËt nu«i cÊy bao phÊn vµ h¹t phÊn kÓ tõ khi Guha vµ Maheswari (1964) ph¸t hiÖn ®­îc nh÷ng cÊu tróc gièng ph«i khi nu«i cÊy bao phÊn c©y cµ ®éc d­îc (Datura inoxia). N¨m 1966, hä ®· t¹o ®­îc c©y ®¬n béi ®Çu tiªn th«ng qua nu«i cÊy bao phÊn. N¨m 1967, nhãm Bourgin vµ Nitch t¹o ra c©y thuèc l¸ ®¬n béi tõ bao phÊn. Cho ®Õn nay ph­¬ng ph¸p nµy ®· trë nªn cã hiÖu qu¶ cao trong viÖc t¹o ra c¸c c©y ®¬n béi nh­: lóa, lóa m¹ch, lóa m×, ng«… Mét h­íng kh¸c cña nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®· ®­îc øng dông réng r·i cho nh©n gièng vµ phôc håi gièng. B¾t ®Çu tõ nh÷ng n¨m 1960 khi Morel nhËn thÊy protocorm cña c©y ®Þa lan khi nu«i cÊy ®· h×nh thµnh nªn c¸c protocorm kh¸c. NÕu trong m«i tr­êng thÝch hîp th× c¸c protocorm ®ã cã thÓ ph¸t triÓn thµnh c©y con. ë n­íc ta, cho tíi nay còng cã nhiÒu phßng thÝ nghiÖm nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt vµ ®· hoµn thiÖn ®­îc mét sè quy tr×nh nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt nh­: ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®· hoµn thµnh quy tr×nh nh©n gièng MÝa, ViÖn Khoa häc N«ng nghiÖp ViÖt Nam còng ®· ®­a vµo ®­îc trong s¶n xuÊt quy tr×nh nh©n gièng B¹ch §µn… HiÖn nay, ng­êi ta ®· vµ ®ang ®Èy m¹nh khai th¸c tiÒm n¨ng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt dùa trªn quan ®iÓm sinh häc hiÖn ®¹i: “Mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· ®­îc ph©n ho¸ ®Òu chøa toµn bé th«ng tin di truyÒn (DNA) cÇn thiÕt cña c¶ c¬ thÓ thùc vËt ®ã vµ nÕu gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp th× mçi tÕ bµo ®Òu cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¸ thÓ hoµn chØnh, ®ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo”. 1.6.2. Thµnh tùu cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo Tr¶i qua mét thêi gian ch­a ph¶i lµ dµi nh­ng nh÷ng thµnh tùu mµ c«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®· ®¹t ®­îc lµ rÊt lín, víi hµng lo¹t c©y trång nh­: c©y ¨n qu¶, c©y l­¬ng thùc, c©y c«ng nghiÖp, c©y thuèc quý hiÕm cã gi¸ trÞ cao, c©y hoa. ë n­íc ta, c¸c h­íng nghiªn cøu øng dông ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®­îc ph¸t triÓn m¹nh tõ nh÷ng n¨m 80 vµ ®· ®¹t ®­îc nh÷ng kÕt qu¶ khÝch lÖ. VÝ dô: ë c©y ¨n qu¶ ®· x©y dùng ®­îc quy tr×nh nh©n gièng c¸c c©y ¨n qu¶ cã mói. ë c©y l­¬ng thùc ®· nh©n ®­îc gièng khoai t©y, lóa, ng«. §èi víi c©y c«ng nghiÖp, chóng ta ®· øng dông thµnh c«ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro ë mét sè c©y nh­: B¹ch ®µn, Keo. Kü thuËt nu«i cÊy in vitro còng ®­îc sö dông réng r·i ®Ó nh©n nhanh mét sè c©y d­îc liÖu nh­: Trinh n÷ hoµng cung, Thanh hao, Th«ng ®á nh»m thu nhËn ®­îc nguån nguyªn liÖu æn ®Þnh. Mét sè c©y hoa còng ®­îc nh©n gièng b»ng nu«i cÊy in vitro nh­: Phong lan vµ nhiÒu lo¹i hoa kh¸c nh­: Hång, Cóc, CÈm ch­íng, Lyly, §ång tiÒn. HiÖn nay, thµnh tùu cña c«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt trong s¶n xuÊt mµ nhÊt lµ s¶n xuÊt n«ng nghiÖp ngµy cµng ®­îc thÓ hiÖn râ. Nã ®· trë thµnh mét c«ng cô kh«ng thÓ thiÕu cña c«ng nghÖ sinh häc hiÖn ®¹i, nhÊt lµ trong lÜnh vùc øng dông c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp thùc vËt, c«ng nghÖ t¹o gièng vµ nh©n nhanh gièng hiÖn ®¹i. 1.6.3. Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro cã kh¶ n¨ng kh¾c phôc ®­îc nh÷ng trë ng¹i cña c¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh truyÒn thèng ®ång thêi cßn ®em l¹i nh÷ng lîi Ých thiÕt thùc nh­ sau: T¹o c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn, b¶o tån ®­îc c¸c tÝnh tr¹ng ®· chän läc. T¹o ®­îc dßng thuÇn chñng cña c©y t¹p giao. §iÒu ®ã rÊt cã ý nghÜa ®èi víi c©y thuèc vµ nh÷ng c©y trång ®Ó chiÕt lÊy ho¹t chÊt. T¹o ®­îc c©y cã genotype míi (®a béi, ®¬n béi). L­u gi÷ tËp ®oµn gen. Phôc tr¸ng gièng th«ng qua kü thuËt cÊy ®Ønh sinh tr­ëng vµ c¶i t¹o gièng th«ng qua kü thuËt gen. Cã thÓ s¶n xuÊt gièng c©y quanh n¨m. Nh©n nhanh nhiÒu c©y kh«ng kÕt h¹t trong nh÷ng ®iÒu kiÖn sinh th¸i nhÊt ®Þnh hoÆc nÈy mÇm kÐm. HÖ sè nh©n cùc kú cao. Nãi tãm l¹i, nh©n gièng in vitro mét mÆt t¹o ra c©y con s¹ch bÖnh víi hÖ sè nh©n cao, mÆt kh¸c ®¶m b¶o ®­îc tÝnh æn ®Þnh di truyÒn cña c©y trång [19]. Tuy nhiªn, ph­¬ng ph¸p nµy ®ßi hái trang thiÕt bÞ ®¾t tiÒn vµ kü thuËt cao nªn chØ cã hiÖu qu¶ ®èi víi nh÷ng c©y cã gi¸ trÞ cao hoÆc khã nh©n b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p kh¸c. HiÖn nay, nh©n gièng in vitro ®· ®­îc ¸p dông cho nhiÒu lo¹i c©y. Murashige (1974) ®· chia quy tr×nh nh©n gièng in vitro thµnh 4 giai ®o¹n nh­ sau [7]: Giai ®o¹n 1: Nu«i cÊy khëi ®Çu (t¸i sinh chåi, côm chåi) §­a mÉu vËt tõ bªn ngoµi vµo nu«i cÊy ph¶i ®¶m b¶o: tû lÖ nhiÔm thÊp, tû lÖ sèng cao, tèc ®é sinh tr­ëng nhanh. KÕt qu¶ b­íc nµy phô thuéc rÊt nhiÒu vµo c¸ch lÊy mÉu. Quan träng nhÊt vÉn lµ ®Ønh sinh tr­ëng, chåi n¸ch, sau ®ã lµ hoa, ®o¹n th©n, m¶nh l¸, rÔ… Giai ®o¹n 2: Nh©n nhanh chåi, côm chåi trong ®iÒu kiÖn in vitro Giai ®o¹n nµy kÝch thÝch t¹o c¬ quan phô hoÆc cã cÊu tróc kh¸c mµ tõ ®ã ph¸t sinh c©y hoµn chØnh. Môc tiªu quan träng nhÊt cña giai ®o¹n nµy lµ x¸c ®Þnh ph­¬ng thøc nh©n nhanh nhÊt b»ng m«i tr­êng dinh d­ìng vµ ®iÒu kiÖn khÝ hËu tèi thÝch. Giai ®o¹n 3: T¹o c©y hoµn chØnh §©y lµ giai ®o¹n quan träng, bao gåm viÖc t¹o rÔ, huÊn luyÖn c©y thÝch nghi víi ®iÒu kiÖn thay ®æi cña m«i tr­êng ngo¹i c¶nh nh­: sù thay ®æi nhiÖt ®é, ®é Èm, sù mÊt n­íc, s©u bÖnh vµ chuyÓn tõ tr¹ng th¸i dÞ d­ìng sang tr¹ng th¸i tù d­ìng hoµn toµn. Giai ®o¹n 4: HuÊn luyÖn c©y con, chuyÓn c©y ra trång ë ®iÒu kiÖn tù nhiªn Thêi gian tèi thiÓu cho sù thÝch nghi cña c©y víi ®iÒu kiÖn tù nhiªn lµ 2 - 3 tuÇn. Trong thêi gian nµy, c©y cÇn ®­îc ch¨m sãc vµ b¶o vÖ tèt tr­íc nh÷ng yÕu tè bÊt lîi nh­: MÊt n­íc nhanh lµm c©y bÞ hÐo, nhiÔm vi khuÈn vµ nÊm, bÖnh thèi nân, bÖnh ch¸y l¸ do n¾ng. S¬ ®å quy tr×nh nh©n gièng thùc vËt in vitro Bao phÊn, tói no·n Hoa §Ønh sinh tr­ëng Ph«i Nh©n nhanh chåi M« sÑo VËt liÖu v« trïng RÔ Th©n L¸ MÇm chåi Chåi TÕ bµo ph«i Khö trïng T¸i sinh chåi T¹o m« sÑo C©y hoµn chØnh T¹o rÔ §­a c©y ra ®Êt Côm chåi V­ên ­¬m Côm chåi V­ên ­¬m Ch­¬ng 2. §èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. §èi t­îng nghiªn cøu ThÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh trªn c©y døa Cayen (Ananas comosus L.). Nguån nguyªn liÖu døa ®­îc lÊy tõ c¸c ®Þa ph­¬ng kh¸c nhau: X· La Hiªn - huyÖn Vâ Nhai - tØnh Th¸i Nguyªn. X· Cao Th­îng - huyÖn T©n Yªn - tØnh B¾c Giang. Trong ®ã, nguån nguyªn liÖu chÝnh ®Ó ®­a mÉu lµ c¸c chåi ngän hoÆc chåi n¸ch chøa c¸c m¾t ngñ cña c©y (h×nh 2.1) H×nh 2.1. ¶nh døa Cayen ngoµi tù nhiªn 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.2.1. Thêi gian vµ ®Þa ®iÓm nghiªn cøu C¸c thÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh trong kho¶ng thêi gian tõ th¸ng 9 - 2007 ®Õn th¸ng 5 - 2008 t¹i Phßng thÝ nghiÖm Sinh häc - Khoa Khoa häc Tù nhiªn vµ X· héi - §¹i häc Th¸i Nguyªn. 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p bè trÝ thÝ nghiÖm C¸c thÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh trªn m«i tr­êng nÒn MS (Murashige - Skoog, 1962 ) cã bæ sung ®­êng 2,5%; th¹ch 0,8 - 0,9 %; M-inositol 100 mg/l vµ c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng ë c¸c thang nång ®é kh¸c nhau. ThÝ nghiÖm 1. Nghiªn cøu hiÖu qu¶ khö trïng MÉu dïng cho nu«i cÊy lµ phÇn ngän døa hoÆc chåi n¸ch cã chøa c¸c m¾t ngñ cña c©y. Ngän døa bãc vá, röa s¹ch d­íi vßi n­íc ch¶y, röa tiÕp b»ng n­íc xµ phßng lo·ng, röa s¹ch xµ phßng, sau ®ã ®Ó d­íi vßi n­íc ch¶y m¹nh kho¶ng 5 - 10 phót. Ho¸ chÊt dïng cho viÖc khö trïng mÉu lµ cån 700, javen 50%, thuû ng©n clorua 0,1%. Thêi gian khö trïng thay ®æi tuú tõng lo¹i ho¸ chÊt. Cån 700 khö trïng trong 30 gi©y, javen 50% trong 5 phót, thuû ng©n clorua 0,1% trong 10 - 20 phót. C¸c thao t¸c ®­îc tiÕn hµnh trong buång cÊy v« trïng. ThÝ nghiÖm 2. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi C¸c mÉu sau khi khö trïng t¸ch lÊy c¸c mÇm ngñ vµ ®Ønh sinh tr­ëng cÊy lªn c¸c m«i tr­êng c¶m øng t¹o chåi ban ®Çu. Sau ®ã, lÊy nh÷ng chåi t¹o thµnh cÊy lªn m«i tr­êng nh©n chåi. M«i tr­êng nh©n chåi sö dông m«i tr­êng nÒn MS bæ sung ®­êng 2,5%; th¹ch 0,8% vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l vµ BAP víi nång ®é 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Cô thÓ nh­ sau: KÝ hiÖu m«i tr­êng NAA (mg/l) BAP (mg/l) MT1 0,5 1,0 MT2 0,5 1,5 MT3 0,5 2,0 MT4 1,0 1,0 MT5 1,0 1,5 MT6 1,0 2,0 MT7 1,5 1,0 MT8 1,5 1,5 MT9 1,5 2,0 ThÝ nghiÖm 3. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm Nh÷ng chåi døa Cayen míi t¹o thµnh ë thÝ nghiÖm nh©n chåi sÏ ®­îc cÊy chuyÓn sang m«i tr­êng t¹o protocorm. M«i tr­êng t¹o protocorm lµ m«i tr­êng dÞch thÓ (m«i tr­êng nÒn MS; 2,5% ®­êng vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l; BAP víi nång ®é 1,0; 1,5; 2,0 mg/l). KÝ hiÖu m«i tr­êng NAA (mg/l) BAP (mg/l) ML1 0,5 1,0 ML2 0,5 1,5 ML3 0,5 2,0 ML4 1,0 1,0 ML5 1,0 1,5 ML6 1,0 2,0 ML7 1,5 1,0 ML8 1,5 1,5 ML9 1,5 2,0 ThÝ nghiÖm 4. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng r¾n Sau khi protocorm t¹o thµnh, ®Ó thu ®­îc nh÷ng chåi døa to, khoÎ víi sè l­îng lín th× cÇn chuyÓn nh÷ng protocorm sang m«i tr­êng nh©n chåi. C¸c m«i tr­êng nh©n chåi ®­îc sö dông lµ nh÷ng m«i tr­êng: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8 vµ MT9. ThÝ nghiÖm 5. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng dÞch thÓ §Ó so s¸nh hiÖu qu¶ nh©n chåi tõ protocorm cña c¸c m«i tr­êng dÞch thÓ so víi c¸c m«i tr­êng r¾n chóng t«i sö dông c¸c m«i tr­êng sau: ML5: MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA +1,5 mg/l BAP ML6: MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA +2,0 mg/l BAP ML7: MS + 2,5% ®­êng + 1,5 mg/l NAA +1,0 mg/l BAP ThÝ nghiÖm 6. ¶nh h­ëng cña mËt ®é nu«i cÊy ®Õn sù ph¸t sinh biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi §Ó nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña mËt ®é nu«i cÊy ®Õn sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi, chóng t«i cÊy c¸c chåi døa vµo m«i tr­êng MT6 víi sè l­îng chåi cÊy ban ®Çu: 5, 10, 15, 20 chåi/b×nh. CT1: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 5 chåi/b×nh CT2: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 10 chåi/b×nh CT3: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 15 chåi/b×nh CT4: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 20 chåi/b×nh ThÝ nghiÖm 7. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o c©y hoµn chØnh C¸c chåi døa to, khoÎ ®­îc cÊy vµo m«i tr­êng t¹o rÔ ®Ó t¹o c©y hoµn chØnh. ë thÝ nghiÖm nµy, sö dông m«i tr­êng nÒn MS bæ sung th¹ch 0,8%; ®­êng 2,5%; than ho¹t tÝnh 0,2% vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi nång ®é lµ 0,1; 0,25; 0,5 mg/l vµ BAP víi nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l. KÝ hiÖu m«i tr­êng NAA (mg/l) BAP (mg/l) MR1 0,1 0,5 MR2 0,25 0,5 MR3 0,5 0,5 MR4 0,1 1,0 MR5 0,25 1,0 MR6 0,5 1,0 MR7 0,1 1,5 MR8 0,25 1,5 MR9 0,5 1,5 2.2.3. C¸c chØ tiªu ®¸nh gi¸ §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ khö trïng Tû lÖ mÉu sèng (%) = (Tæng sè mÉu sèng / Tæng sè mÉu cÊy) x100 Tû lÖ mÉu nhiÔm (%) = (Tæng sè mÉu nhiÔm / Tæng sè mÉu cÊy) x100 Tû lÖ mÉu chÕt (%) = (Tæng sè mÉu chÕt / Tæng sè mÉu cÊy) x100 §¸nh gi¸ kÕt qu¶ nh©n chåi HÖ sè nh©n chåi (lÇn) = (Sè chåi t¹o thµnh / Sè chåi ®­a vµo) X¸c ®Þnh sè l¸/chåi (c¸i) = Sè l¸ t¹o thµnh / Sè chåi §o chiÒu cao chåi (cm) §¸nh gi¸ kÕt qu¶ t¹o protocorm tõ chåi HÖ sè t¹o protocorm (lÇn) = Sè protocorm t¹o thµnh / Sè chåi ®­a vµo §¸nh gi¸ kÕt qu¶ nh©n chåi tõ protocorm HÖ sè nh©n chåi (lÇn) = Sè chåi t¹o thµnh / Sè protocorm ®­a vµo §¸nh gi¸ tû lÖ ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi Tû lÖ chåi biÕn dÞ (%) = (Tæng sè chåi biÕn dÞ / Tæng sè chåi) x100 HÖ sè nh©n chåi (lÇn) = Tæng sè chåi t¹o thµnh / Tæng sè chåi ®­a vµo §¸nh gi¸ kÕt qu¶ t¹o c©y hoµn chØnh Sè rÔ (c¸i/chåi) = Tæng sè rÔ t¹o thµnh / Tæng sè chåi ra rÔ X¸c ®Þnh sè l¸/chåi (c¸i) = Sè l¸ t¹o thµnh / Sè chåi §o chiÒu dµi rÔ (cm) §o chiÒu cao chåi (cm) 2.3. Ph­¬ng ph¸p xö lý sè liÖu KÕt qu¶ nghiªn cøu ®­îc chóng t«i xö lý theo ph­¬ng ph¸p thèng kª sinh häc trªn phÇn mÒm tin häc Excel. TÝnh trung b×nh Gi¸ trÞ trung b×nh: §é lÖch chuÈn: S = Sai sè chuÈn: Sai sè tuyÖt ®èi: KÕt qu¶: X = + Trong ®ã Xi: gi¸ trÞ cña tõng sè liÖu n: sè lÇn thÝ nghiÖm t(a,f) tra b¶ng víi (a= 0,05 vµ f = n-1) Ch­¬ng 3. kÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Nghiªn cøu hiÖu qu¶ khö trïng V« trïng mÉu cÊy lµ b­íc ®Çu tiªn cã vai trß quyÕt ®Þnh trong sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro. Nguån mÉu døa Cayen ®­a vµo lµ c¸c chåi ngän hoÆc chåi n¸ch cã c¸c m¾t ngñ cña c©y ®­îc lÊy ngoµi tù nhiªn chøa nhiÒu lo¹i vi sinh vËt. V× vËy, cÇn lùa chän ph­¬ng ph¸p khö trïng vµ lo¹i ho¸ chÊt thÝch hîp ®Ó lo¹i bá hoµn toµn mÇm bÖnh khái mÉu tr­íc khi ®­a vµo m«i tr­êng nu«i cÊy. Do ®ã, chóng t«i ®· sö dông c¸c ho¸ chÊt khö trïng lµ: cån 700, javen 50% vµ thuû ng©n clorua 0,1% (HgCl2) ®Ó khö trïng mÉu trong nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau. Sau 10 ngµy theo dâi chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 3.1. B¶ng 3.1. ¶nh h­ëng cña chÕ ®é khö trïng ®èi víi mÉu døa Cayen ChÕ ®é khö trïng Ho¸ chÊt vµ thêi gian khö trïng Sè mÉu C¸c chØ tiªu ®¸nh gi¸ Cån 700 (gi©y) Javen 50% (phót) HgCl2 0,1% (Phót) Tû lÖ mÉu sèng (%) Tû lÖ mÉu nhiÔm (%) Tû lÖ mÉu chÕt (%) ChÕ ®é 1 30 5 10 25 36 56 8 ChÕ ®é 2 30 5 12 25 48 44 8 ChÕ ®é 3 30 5 15 25 68 20 12 ChÕ ®é 4 30 5 17 25 32 20 48 ChÕ ®é 5 30 5 20 25 27 17 56 H×nh 3.1. ¶nh h­ëng cña chÕ ®é khö trïng ®èi víi mÉu døa Cayen Qua c¸c sè liÖu thu ®­îc ë b¶ng 3.1 vµ h×nh 3.1 ta thÊy: C¸c chÕ ®é khö trïng kh¸c nhau th× cho tØ lÖ sèng, tØ lÖ chÕt, tØ lÖ nhiÔm kh¸c biÖt nhau râ rÖt. Khi khö trïng mÉu cÊy ë chÕ ®é 1 b»ng cån 700 trong 30 gi©y, javen 50% trong 5 phót, HgCl2 0,1% trong thêi gian 10 phót th× tØ lÖ sèng thÊp chØ ®¹t 36%, tØ tÖ chÕt lµ 8% nh­ng tØ lÖ nhiÔm rÊt cao lªn tíi 56%. ChÕ ®é khö trïng 2 (HgCl2 0,1% 12 phót) cho tØ lÖ sèng ®¹t cao h¬n chÕ ®é 1 nh­ng kh«ng ®¸ng kÓ, ®¹t 48%. Cßn tØ lÖ nhiÔm vµ chÕt lÇn l­ît lµ 44% vµ 8%. Khi t¨ng thêi gian khö trïng cña HgCl2 lªn ®Õn 15 phót (chÕ ®é 3) th× hiÖu qu¶ khö trïng ®¹t ®­îc cao h¬n h¼n. ë chÕ ®é khö trïng nµy cho tû lÖ mÉu sèng lµ cao nhÊt, ®¹t 68% vµ tû lÖ mÉu nhiÔm lµ thÊp nhÊt 20%. TiÕp tôc t¨ng thêi gian khö trïng b»ng HgCl2 0,1% lªn 17 phót ë chÕ ®é khö trïng 4 th× tØ lÖ mÉu chÕt t¨ng lªn ®Õn 48% vµ tØ lÖ mÉu sèng chØ ®¹t 32%. NÕu vÉn tiÕp tôc t¨ng thêi gian khö trïng cña HgCl2 0,1% lªn tíi 20 phót (chÕ ®é khö trïng 5) th× tû lÖ mÉu nhiÔm thÊp nhÊt ®¹t 17% nh­ng tû lÖ mÉu chÕt l¹i cao nhÊt ®¹t 56% vµ tû lÖ mÉu sèng ®¹t thÊp nhÊt 27%. Nh­ vËy, ®Ó thu ®­îc c¸c mÉu døa Cayen v« trïng víi tû lÖ sèng cao nªn khö trïng mÉu b»ng cån 700 trong 30 gi©y, javen 50% trong 5 phót, thuû ng©n clorua 0,1% trong 15 phót. KÕt qu¶ nµy t­¬ng ®èi phï hîp víi kÕt qu¶ cña NguyÔn §øc Thµnh vµ cs khi tiÕn hµnh nu«i cÊy døa Cayen. Theo kÕt qu¶ cña NguyÔn §øc Thµnh th× khö trïng mÉu døa Cayen ë chÕ ®é 3 (cån 700 trong 30 gi©y, javen 50% trong 5 phót, thuû ng©n clorua 0,1% trong 15 phót) cho kÕt qu¶ tèt [9]. H×nh 3.2. MÉu døa Cayen khö trïng b»ng thuû ng©n clorua 0,1% trong 15 phót. 3.2. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi C¸c mÉu sau khi khö trïng t¸ch lÊy c¸c mÇm ngñ vµ ®Ønh sinh tr­ëng cÊy lªn c¸c m«i tr­êng c¶m øng t¹o chåi ban ®Çu. Sau ®ã, lÊy nh÷ng chåi t¹o thµnh cÊy lªn m«i tr­êng nh©n chåi. M«i tr­êng nh©n chåi sö dông m«i tr­êng nÒn MS vµ bæ sung ®­êng 2,5%; th¹ch 0,8% vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l vµ BAP víi nång ®é 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Qua theo dâi chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 3.2 B¶ng 3.2. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi KÝ hiÖu m«i tr­êng Sè mÉu ®­a vµo ChØ tiªu sinh tr­ëng sau 6 tuÇn ChØ tiªu sinh tr­ëng sau 10 tuÇn HÖ sè nh©n chåi (lÇn) Sè l¸/ chåi (c¸i) ChiÒu cao chåi (cm) HÖ sè nh©n chåi (lÇn) Sè l¸/ chåi (c¸i) ChiÒu cao chåi (cm) MT1 20 1,300,20 91 3,30,1 3,000,30 142 5,20,1 MT2 20 1,400,20 102 3,50,2 3,150,35 153 5,40,1 MT3 20 1,450,30 101 3,50,2 3,350,35 152 5,50,1 MT4 20 1,550,25 111 4,00,3 3,450,45 162 6,00,2 MT5 20 1,700,20 122 4,50,2 3,700,40 171 6,50,3 MT6 20 1,850,25 132 4,80,2 3,900,40 192 7,00,3 MT7 20 1,600,30 111 4,50,1 3,600,45 161 6,20,1 MT8 20 1,400,30 112 4,00,1 3,000,35 152 6,00,2 MT9 20 1,350,25 101 3,50,1 2,900,35 141 5,30,1 H×nh 3.3. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi Qua kÕt qu¶ cña b¶ng 3.2 vµ h×nh 3.3 chóng t«i nhËn thÊy: sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ë c¸c thang nång ®é kh¸c nhau vµ ë nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau th× hÖ sè nh©n chåi vµ sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi cã sù kh¸c nhau. * ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn hÖ sè nh©n chåi ë m«i tr­êng MT1, MT2, MT3 cã nång ®é NAA ®Òu lµ 0,5 mg/l nh­ng nång ®é BAP lÇn l­ît lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l th× hÖ sè nh©n chåi sau 6 tuÇn ®· cã sù kh¸c nhau. HÖ sè nh©n chåi (lÇn) sau 6 tuÇn ë m«i tr­êng MT1 lµ 1,30; ë m«i tr­êng MT2 t¨ng lªn 1,40 vµ ë m«i tr­êng MT3 tiÕp tôc t¨ng lªn 1,45. HÖ sè nh©n chåi sau 10 tuÇn ë c¸c m«i tr­êng trªn ®· t¨ng lªn râ rÖt so víi hÖ sè nh©n chåi sau 6 tuÇn. HÖ sè nh©n chåi (lÇn) sau 10 tuÇn lÇn l­ît lµ 3,00 ë m«i tr­êng MT1 (t¨ng tõ 1,30 lªn 3,00 ); 3,15 ë m«i tr­êng MT2 (t¨ng tõ 1,40 lªn 3,15) vµ 3,35 ë m«i tr­êng MT3 (t¨ng tõ 1,45 lªn 3,35) . Khi nång ®é NAA vµ nång ®é BAP ®Òu lµ 1,0 mg/l (m«i tr­êng MT4) th× hÖ sè nh©n chåi sau 6 tuÇn vµ sau 10 tuÇn lÇn luît lµ 1,55; 3,45 lÇn cao h¬n m«i tr­êng MT1, MT2, MT3. Gi÷ nguyªn nång ®é NAA lµ 1,0 mg/l vµ chØ t¨ng nång ®é BAP lªn 1,5 mg/l (m«i tr­êng MT5) th× hÖ sè nh©n chåi ®· t¨ng lªn ®¸ng kÓ b»ng 1,70 lÇn sau 6 tuÇn vµ 3,70 lÇn sau 10 tuÇn. TiÕp tôc gi÷ nguyªn nång ®é NAA vµ t¨ng nång ®é BAP lªn 2,0 mg/l ë m«i tr­êng MT6 th× hÖ sè nh©n chåi lµ cao nhÊt, ®¹t tíi 1,85 lÇn sau 6 tuÇn vµ 3,90 lÇn sau 10 tuÇn (t¨ng 2,10 lÇn so víi hÖ sè nh©n chåi sau 6 tuÇn). Ng­îc l¹i, m«i tr­êng MT7 th× t¨ng nång ®é NAA lªn 1,5 mg/l nh­ng gi¶m nång ®é BAP b»ng 1,0 mg/l th× hÖ sè nh©n chåi cã gi¶m so víi m«i tr­êng MT6 nh­ng kh«ng ®¸ng kÓ (®¹t 1,60 lÇn sau 6 tuÇn vµ 3,60 lÇn sau 10 tuÇn). M«i tr­êng MT8 cã nång ®é NAA vµ nång ®é BAP ®Òu b»ng 1,5 mg/l th× cã hÖ sè nh©n chåi gi¶m xuèng râ rÖt. HÖ sè nh©n chåi sau 6 tuÇn ®¹t 1,40 lÇn vµ sau 10 tuÇn ®¹t 3,00 lÇn. Khi gi÷ nguyªn nång ®é NAA 1,5 mg/l t¨ng nång ®é BAP lªn 2,0 mg/l (m«i tr­êng MT9) th× hÖ sè nh©n chåi tiÕp tôc gi¶m xuèng cßn 1,35 lÇn sau 6 tuÇn vµ 2,90 lÇn sau 10 tuÇn. Nh­ vËy, m«i tr­êng MT6 (m«i tr­êng MS + 2,5% ®­êng + 0,8% th¹ch + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng phï hîp ®Ó nh©n chåi. * ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn chiÒu cao vµ sè l¸ cña chåi H×nh 3.4. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn chiÒu cao vµ sè l¸ cña chåi Qua kÕt qu¶ cña b¶ng 3.2 vµ h×nh 3.4 chóng t«i nhËn thÊy: ë c¸c m«i tr­êng kh¸c nhau vµ ë nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau th× c¸c chØ tiªu sinh tr­ëng nh­ chiÒu cao vµ sè l¸ cña chåi døa Cayen cã sù kh¸c biÖt râ rÖt. §èi víi c¸c m«i tr­êng MT1, MT2 vµ MT3 ë nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi cã sù kh¸c nhau. Sau 6 tuÇn, chiÒu cao chåi ë m«i tr­êng MT1 ®¹t 3,30 cm, m«i tr­êng MT2 vµ MT3 ®Òu b»ng 3,50 cm. Sè l¸/chåi ë m«i tr­êng MT1 lµ 9 c¸i, m«i tr­êng MT2 vµ MT3 ®Òu b»ng 10 c¸i. Sau 10 tuÇn, c¶ chiÒu cao chåi vµ sè l¸/chåi ë c¸c m«i tr­êng trªn ®Òu t¨ng lªn, nhÊt lµ ë m«i tr­êng MT3, chiÒu cao chåi ®· t¨ng lªn 5,20 cm vµ sè l¸/chåi còng t¨ng lªn 14 c¸i. Sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi ë c¸c m«i tr­êng MT4, MT5 vµ MT6 ë nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau còng kh¸c nhau vµ ®· cã sù kh¸c biÖt so víi c¸c m«i tr­êng MT1, MT2 vµ MT3. Trong ®ã, m«i tr­êng MT5 vµ MT6 cã sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ. Cô thÓ lµ: sau 6 tuÇn, chiÒu cao chåi ë hai m«i tr­êng trªn t¨ng lªn lÇn l­ît b»ng 4,50 cm ë m«i tr­êng MT5 vµ 4,80 cm ë m«i tr­êng MT6. Sè l¸/chåi còng t¨ng lªn, ®¹t 12 c¸i ë m«i tr­êng MT5 vµ 13 c¸i ë m«i tr­êng MT6. Sau 10 tuÇn, chiÒu cao chåi vµ sè l¸/chåi ë hai m«i tr­êng trªn tiÕp tôc t¨ng lªn so víi sau 6 tuÇn. ChiÒu cao chåi ë m«i tr­êng MT5 b»ng 6,50 cm vµ ë m«i tr­êng MT6 t¨ng cao nhÊt ®¹t 7,00 cm. Sè l¸/chåi ë m«i tr­êng MT5 lµ 17 c¸i vµ ë m«i tr­êng MT6 còng t¨ng cao nhÊt ®¹t 19 c¸i. ë c¸c m«i tr­êng MT7, MT8 vµ MT9 th× sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn chåi gi¶m xuèng so víi m«i tr­êng MT6, ®Æc biÖt lµ ë m«i tr­êng MT9. sau 6 tuÇn, chiÒu cao chåi gi¶m xuèng 3,50 cm (gi¶m 1,30 cm so víi m«i tr­êng MT6), sè l¸/chåi chØ ®¹t 10 c¸i (gi¶m 3 c¸i so víi m«i tr­êng MT6). Sau 10 tuÇn, chiÒu cao chåi lµ 5,30 cm (gi¶m 1,70 cm so víi m«i tr­êng MT6). Sè l¸/chåi gi¶m xuèng chØ cßn 14 c¸i (gi¶m 5 c¸i so víi m«i tr­êng MT6). Qua nh÷ng ®¸nh gi¸ trªn chóng t«i nhËn thÊy: m«i tr­êng MT6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng thÝch hîp nhÊt ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm nh©n chåi. §ång thêi, MT6 còng lµ m«i tr­êng mµ chåi sinh tr­ëng ph¸t triÓn tèt nhÊt. Thêi gian phï hîp ®Ó nh©n chåi lµ kho¶ng 10 tuÇn. Bªn c¹nh ®ã, còng cã thÓ sö dông m«i tr­êng MT5 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) ®Ó nh©n chåi. KÕt qu¶ nµy t­¬ng ®èi phï hîp víi kÕt qu¶ cña Lª §×nh Danh vµ cs (1994); §Æng XuyÕn Nh­ vµ cs (1995). Theo kÕt qu¶ cña c¸c t¸c gi¶ trªn th× bæ sung 1 - 1,5 mg/l NAA vµ 2 mg/l BAP vµo m«i tr­êng lµ thÝch hîp cho viÖc nh©n chåi cña døa Cayen [4], [8]. a b H×nh 3.5. KÕt qu¶ nh©n chåi ë m«i tr­êng MT6 a) Chåi døa Cayen míi t¹o thµnh b) Chåi døa Cayen sau 10 tuÇn 3.3. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm Nh÷ng chåi døa Cayen míi t¹o thµnh sÏ ®­îc cÊy chuyÓn sang m«i tr­êng t¹o protocorm. M«i tr­êng t¹o protocorm lµ m«i tr­êng dÞch thÓ (m«i tr­êng nÒn MS bæ sung 2,5% ®­êng vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l; BAP víi nång ®é 1,0; 1,5; 2,0 mg/l). Sau 4 tuÇn theo dâi chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.3. B¶ng 3.3. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm KÝ hiÖu m«i tr­êng NAA (mg/l) BAP (mg/l) Sè mÉu ®­a vµo HÖ sè t¹o protocorm (lÇn) ML1 0,5 1,0 15 2,130,20 ML2 0,5 1,5 15 2,330,33 ML3 0,5 2,0 15 2,670,33 ML4 1,0 1,0 15 3,200,53 ML5 1,0 1,5 15 3,670,46 ML6 1,0 2,0 15 4,130,33 ML7 1,5 1,0 15 3,600,40 ML8 1,5 1,5 15 3,330,46 ML9 1,5 2,0 15 3,000,46 H×nh 3.6. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o protocorm Qua kÕt qu¶ cña b¶ng 3.3 vµ h×nh 3.6 chóng t«i nhËn thÊy: sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ë c¸c thang nång ®é kh¸c nhau th× hÖ sè t¹o protocorm (lÇn) døa Cayen lµ kh¸c nhau. ë m«i tr­êng ML1, ML2, ML3 cã nång ®é NAA ®Òu lµ 0,5 mg/l nh­ng nång ®é BAP lÇn l­ît lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l th× hÖ sè t¹o protocorm lÇn l­ît lµ 2,13; 2,33; 2,67 lÇn. Khi nång ®é NAA t¨ng lªn 1,0 mg/l vµ nång ®é BAP lÇn l­ît lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l (ML4, ML5, ML6) th× hÖ sè t¹o protocorm ®· t¨ng lªn ®¸ng kÓ lµ 3,20; 3,67; 4,13 lÇn. Nh­ vËy, ë m«i tr­êng ML6 th× hÖ sè protocorm t¹o thµnh ®· t¨ng v­ît tréi so víi c¸c m«i tr­êng tr­íc ®ã. HÖ sè t¹o protocorm cao nhÊt ®¹t 4,13 lÇn t¨ng gÇn 1,30 lÇn so víi m«i tr­êng ML4 vµ 1,12 lÇn so víi m«i tr­êng ML5. NÕu tiÕp tôc t¨ng nång ®é cña NAA lªn 1,5 mg/l nh­ng vÉn gi÷ nguyªn thang nång ®é cña BAP lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l ë c¸c m«i tr­êng ML7, ML8, ML9 th× hÖ sè t¹o protocorm b¾t ®Çu gi¶m xuèng. §Æc biÖt lµ ë m«i tr­êng ML8 vµ ML9 th× hÖ sè t¹o protocorm ®· gi¶m râ rÖt so víi m«i tr­êng ML6. HÖ sè t¹o protocorm chØ ®¹t 3,33 lÇn ë m«i tr­êng ML8 vµ 3,00 lÇn ë m«i tr­êng ML9. Qua nh÷ng ®¸nh gi¸ trªn chóng t«i nhËn thÊy: m«i tr­êng ML6 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng thÝch hîp nhÊt ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm t¹o protocorm. Ngoµi ra, còng cã thÓ sö dông m«i tr­êng ML5 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 1,5 mg/l BAP) ®Ó t¹o protocorm tõ chåi døa. H×nh 3.7. KÕt qu¶ t¹o protocorm ë m«i tr­êng ML6 3.4. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng r¾n Sau khi protocorm t¹o thµnh, ®Ó thu ®­îc nh÷ng chåi døa víi sè l­îng lín th× cÇn chuyÓn nh÷ng protocorm sang m«i tr­êng nh©n chåi. M«i tr­êng nh©n chåi tõ protocorm sö dông m«i tr­êng nÒn MS bæ sung 0,8% th¹ch; 2,5% ®­êng, vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi thang nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l; BAP víi thang nång ®é 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Qua theo dâi chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.4. B¶ng 3.4. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng r¾n KÝ hiÖu m«i tr­êng Sè protocorm ®­a vµo HÖ sè nh©n chåi sau 5 tuÇn (lÇn) HÖ sè nh©n chåi sau 8 tuÇn (lÇn) MT1 20 2,450,20 3,100,30 MT2 20 2,750,30 3,200,35 MT3 20 2,850,35 3,400,35 MT4 20 3,400,25 4,000,45 MT5 20 3,650,40 4,250,40 MT6 20 4,000,35 4,750,40 MT7 20 3,500,45 4,150,45 MT8 20 3,150,30 3,800,35 MT9 20 3,000,30 3,500,35 H×nh 3.8. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng r¾n Qua kÕt qu¶ cña b¶ng 3.4 vµ h×nh 3.8 chóng t«i thÊy: sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ë c¸c thang nång ®é kh¸c nhau th× hÖ sè nh©n chåi (lÇn) døa Cayen tõ nh÷ng protocorm cã sù kh¸c nhau vµ ë nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau th× hÖ sè nh©n chåi còng kh«ng gièng nhau. ë m«i tr­êng MT1, MT2, MT3 cã nång ®é NAA ®Òu lµ 0,5 mg/l nh­ng nång ®é BAP lÇn l­ît lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l th× hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm sau 5 tuÇn lÇn l­ît lµ 2,45; 2,75; 2,85 lÇn vµ sau 8 tuÇn th× hÖ sè nh©n chåi ®· t¨ng lªn so víi sau 5 tuÇn. Cô thÓ lµ: ë m«i tr­êng MT1 t¨ng tõ 2,45 lªn 3,10 lÇn, m«i tr­êng MT2 t¨ng tõ 2,75 lªn 3,20 lÇn vµ m«i tr­êng MT3 t¨ng tõ 2,85 lªn 3,40 lÇn. Khi nång ®é NAA t¨ng lªn 1,0 mg/l vµ nång ®é BAP lÇn l­ît lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l (MT4, MT5, MT6) th× hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm ®· cao h¬n h¼n so víi c¸c m«i tr­êng MT1, MT2, MT3. ë m«i tr­êng MT4 hÖ sè nh©n chåi sau 5 tuÇn ®· t¨ng lªn ®¹t 3,40 lÇn, m«i tr­êng MT5 tiÕp tôc t¨ng lªn tíi 3,65 lÇn vµ ®Æc biÖt lµ ë m«i tr­êng MT6 th× hÖ sè nh©n chåi ®· t¨ng cao nhÊt ®¹t 4,00 lÇn. Sau 8 tuÇn, hÖ sè nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng trªn tiÕp tôc t¨ng ®¹t 4,00 lÇn ë m«i tr­êng MT4; 4,25 lÇn ë m«i tr­êng MT5 vµ 4,75 lÇn ë m«i tr­êng MT6. Nh­ vËy, sau 8 tuÇn th× hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm ®· t¨ng kho¶ng 1,17 lÇn so víi hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm sau 5 tuÇn. TiÕp tôc t¨ng nång ®é cña NAA lªn 1,5 mg/l nh­ng vÉn gi÷ nguyªn thang nång ®é cña BAP lµ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l ë c¸c m«i tr­êng MT7, MT8, MT9 th× hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm ®· b¾t ®Çu gi¶m xuèng so víi m«i tr­êng MT6. Cô thÓ lµ: sau 5 tuÇn th× hÖ sè nh©n chåi ë m«i tr­êng MT7 ®· gi¶m xuèng cßn 3,50 lÇn, ë m«i tr­êng ML8, ML9 hÖ sè nh©n chåi vÉn tiÕp tôc gi¶m nhiÒu so víi m«i tr­êng MT6 vµ hÖ sè nh©n chåi chØ ®¹t 3,15 lÇn ë m«i tr­êng MT8; 3,00 lÇn ë m«i tr­êng MT9. Sau 8 tuÇn th× hÖ sè nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng MT7, MT8, MT9 t¨ng lªn so víi hÖ sè nh©n chåi sau 5 tuÇn nh­ng l¹i gi¶m xuèng so víi hÖ sè nh©n chåi sau 8 tuÇn ë m«i tr­êng MT6. HÖ sè nh©n chåi lÇn l­ît lµ: 4,15 lÇn ë m«i tr­êng MT7; 3,80 lÇn ë m«i tr­êng MT8 vµ 3,50 lÇn ë m«i tr­êng MT9. Qua nh÷ng ®¸nh gi¸ trªn, chóng t«i ®­a ra kÕt luËn nh­ sau: m«i tr­êng phï hîp nhÊt ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm nh©n chåi tõ protocorm lµ m«i tr­êng MT6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP). Thêi gian thÝch hîp ®Ó nh©n nhanh chåi tõ protocorm lµ kho¶ng 8 tuÇn. a b H×nh 3.9. KÕt qu¶ nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng MT6 a) Chåi døa Cayen sau 5 tuÇn. b) Chåi døa Cayen sau 8 tuÇn 3.5. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi ë m«i tr­êng dÞch thÓ §Ó so s¸nh hiÖu qu¶ nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng dÞch thÓ so víi c¸c m«i tr­êng r¾n chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu kh¶ n¨ng nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng dÞch thÓ. Dùa trªn nh÷ng kÕt qu¶ thu ®­îc ë nh÷ng thÝ nghiÖm tr­íc chóng t«i lùa chän c¸c m«i tr­êng ML5, ML6 vµ ML7 (m«i tr­êng MS bæ sung 2,5% ®­êng, vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi thang nång ®é 1,0; 1,5 mg/l vµ BAP víi thang nång ®é 1,0; 1,5; 2,0 mg/l). HiÖu qu¶ nh©n chåi døa Cayen ë c¸c m«i tr­êng dÞch thÓ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.5. B¶ng 3.5. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng dÞch thÓ KÝ hiÖu m«i tr­êng NAA (mg/l) BAP (mg/l) Sè chåi ®­a vµo HÖ sè nh©n chåi sau 5 tuÇn (lÇn) HÖ sè nh©n chåi sau 8 tuÇn (lÇn) ML5 1,0 1,5 20 4,400,50 5,000,75 ML6 1,0 2,0 20 4,700,75 5,501,00 ML7 1,5 1,0 20 4,250,60 4,750,50 H×nh 3.10. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm ë m«i tr­êng dÞch thÓ Qua kÕt qu¶ cña b¶ng 3.5 vµ h×nh 3.10 chóng t«i ®­a ra nhËn xÐt: ë c¸c m«i tr­êng dÞch thÓ kh¸c nhau vµ ë nh÷ng kho¶ng thêi gian kh¸c nhau th× cã hÖ sè nh©n chåi (lÇn) kh«ng gièng nhau. HÖ sè nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng dÞch thÓ cao h¬n h¼n so víi hÖ sè nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng r¾n. Khi nång ®é NAA lµ 1,0 mg/l vµ nång ®é BAP lµ 1,5 mg/l (m«i tr­êng ML5) th× hÖ sè nh©n chåi sau 5 tuÇn vµ sau 8 tuÇn lÇn luît lµ 4,40; 5,00 lÇn cao h¬n h¼n so víi m«i tr­êng MT5 (hÖ sè nh©n chåi sau 5 tuÇn t¨ng tõ 3,65 ®Õn 4,40 lÇn vµ sau 8 tuÇn t¨ng tõ 4,25 ®Õn 5,00 lÇn). Gi÷ nguyªn nång ®é NAA lµ 1,0 mg/l vµ chØ t¨ng nång ®é BAP lªn 2,0 mg/l (m«i tr­êng ML6) th× hÖ sè nh©n chåi cao nhÊt b»ng 4,70 lÇn sau 5 tuÇn vµ 5,50 lÇn sau 8 tuÇn. Cã thÓ nhËn thÊy, hÖ sè nh©n chåi ë m«i tr­êng dÞch thÓ ML6 sau 5 tuÇn ®· t¨ng 2,54 lÇn vµ sau 10 tuÇn ®· t¨ng 1,41 lÇn so víi m«i tr­êng r¾n MT6. NÕu t¨ng nång ®é NAA lªn 1,5 mg/l vµ gi¶m nång ®é BAP xuèng 1,0 mg/l ë m«i tr­êng ML7 th× hÖ sè nh©n chåi gi¶m xuèng cßn 4,25 lÇn sau 5 tuÇn vµ sau 8 tuÇn lµ 4,75 lÇn. MÆc dï, hÖ sè nh©n chåi ë m«i tr­êng ML7 ®· gi¶m xuèng so víi m«i tr­êng ML6 nh­ng so víi m«i tr­êng r¾n MT7 th× sau 5 tuÇn vÉn cao h¬n 1,21 lÇn, vµ sau 8 tuÇn cao h¬n 1,14 lÇn. Qua nh÷ng nhËn xÐt trªn chóng t«i rót ra kÕt luËn: Sù nh©n chåi ë m«i tr­êng dÞch thÓ cao h¬n h¼n so víi c¸c m«i tr­êng r¾n vµ thêi gian phï hîp ®Ó nh©n chåi ë m«i tr­êng dÞch thÓ còng lµ 8 tuÇn gièng nh­ m«i tr­êng r¾n. Trong ®ã, m«i tr­êng ML6 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 (mg/l) NAA + 2,0 (mg/l) BAP) lµ m«i tr­êng thÝch hîp nhÊt ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm nh©n chåi. a b H×nh 3.11. KÕt qu¶ nh©n chåi døa Cayen tõ protocorm ë m«i tr­êng ML6 a) Chåi døa Cayen sau 5 tuÇn. b) Chåi døa Cayen sau 8 tuÇn 3.6. ¶nh h­ëng cña mËt ®é nu«i cÊy ®Õn sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi §Ó nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña mËt ®é nu«i cÊy ®Õn sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi, chóng t«i cÊy c¸c chåi døa vµo m«i tr­êng MT6 víi sè l­îng chåi cÊy ban ®Çu: 5, 10, 15, 20 chåi/b×nh. Sau 8 tuÇn nu«i cÊy chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.6. B¶ng 3.6. ¶nh h­ëng cña mËt ®é nu«i cÊy ®Õn sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi KÝ hiÖu m«i tr­êng MËt ®é cÊy (chåi/b×nh) Tû lÖ chåi biÕn dÞ (%) HÖ sè nh©n chåi (lÇn) CT1 5 3,960,37 3,330,30 CT2 10 5,180,37 2,560,15 CT3 15 6,000,75 1,840,10 CT4 20 7,680,37 1,510,07 H×nh 3.12. ¶nh h­ëng cña mËt ®é nu«i cÊy ®Õn sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi Qua kÕt qu¶ ë b¶ng 3.6 vµ h×nh 3.12 chóng t«i nhËn thÊy: ë c¸c mËt ®é nu«i cÊy kh¸c nhau th× sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi cã sù kh¸c nhau. Gi÷a sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi cã sù t­¬ng quan chÆt chÏ. NÕu mËt ®é nu«i cÊy cµng cao th× sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ cµng lín vµ hÖ sè nh©n chåi cµng nhá. Ng­îc l¹i, nÕu mËt ®é nu«i cÊy cµng thÊp th× sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ cµng nhá vµ hÖ sè nh©n chåi cµng lín. ë c«ng thøc CT1 víi mËt ®é nu«i cÊy 5 chåi/b×nh, tû lÖ chåi biÕn dÞ ®¹t 3,96%, hÖ sè nh©n chåi ®¹t 3,33 lÇn. Khi t¨ng mËt ®é nu«i cÊy lªn 10 chåi/b×nh (c«ng thøc CT2) th× tû lÖ chåi biÕn dÞ t¨ng lªn so víi c«ng thøc CT1 ®¹t 5,18%. HÖ sè nh©n chåi gi¶m xuèng cßn 2,56 lÇn. TiÕp tôc t¨ng mËt ®é nu«i cÊy lªn 15 chåi/b×nh (c«ng thøc 3) th× tû lÖ chåi biÕn dÞ ®· lªn tíi 6,00% (t¨ng 1,51 lÇn so víi c«ng thøc CT1), hÖ sè nh©n chåi gi¶m t­¬ng øng xuèng cßn 1,84 lÇn (gi¶m 1,79 lÇn so víi c«ng thøc CT1). NÕu t¨ng mËt ®é nu«i cÊy lªn 20 chåi/b×nh (c«ng thøc CT4) th× tû lÖ chåi biÕn dÞ cao nhÊt ®¹t 7,68% (t¨ng gÊp 1,93 lÇn so víi c«ng thøc CT1), hÖ sè nh©n chåi gi¶m xuèng chØ cßn 1,51 (lÇn) (gi¶m 2,20 lÇn so víi c«ng thøc CT1). Tõ nh÷ng ®¸nh gi¸ trªn cho thÊy mËt ®é cÊy ban ®Çu tèt nhÊt lµ 5 chåi/b×nh (c«ng thøc CT1). Trong ®iÒu kiÖn nµy, võa ®¶m b¶o hÖ sè nh©n chåi võa h¹n chÕ møc thÊp nhÊt sù ph¸t sinh c¸c chåi biÕn dÞ. KÕt qu¶ nµy hoµn toµn phï hîp víi kÕt qu¶ cña Hoµng ThÞ Kim Hoa vµ cs (Trung t©m Sinh häc thùc nghiÖm - ViÖn nghiªn cøu øng dông c«ng nghÖ); Vò V¨n Vô vµ cs ( Khoa Sinh häc - Tr­êng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn - §HQG Hµ Néi) khi nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña mét sè yÕu tè m«i tr­êng nu«i cÊy lªn tû lÖ biÕn dÞ cña c©y døa Cayen trong qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro, n¨m 2003. Theo c¸c t¸c gi¶ nµy th× mËt ®é cÊy phï hîp lµ 5 - 10 chåi/b×nh [30]. CT1 CT4 H×nh 3.13. KÕt qu¶ vÒ sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ vµ hÖ sè nh©n chåi ë c«ng thøc CT1 vµ c«ng thøc CT4 3.7. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o c©y hoµn chØnh §Ó t¹o ra c©y døa Cayen hoµn chØnh chóng t«i tiÕn hµnh cÊy c¸c chåi døa to, khoÎ vµo m«i tr­êng t¹o rÔ. M«i tr­êng t¹o rÔ sö dông m«i tr­êng nÒn MS, bæ sung ®­êng 2,5%, th¹ch 0,8%, than ho¹t tÝnh 0,2% vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng lµ NAA víi nång ®é lµ 0,1; 0,25; 0,5 mg/l vµ BAP víi nång ®é 0,5; 1,0; 1,5 mg/l. Sau 8 tuÇn nu«i cÊy chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.7. B¶ng 3.7. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o c©y hoµn chØnh KÝ hiÖu m«i truêng Sè rÔ/chåi (c¸i) ChiÒu dµi rÔ (cm) HÖ sè nh©n chåi (lÇn) ChiÒu cao chåi (cm) Sè l¸/chåi (c¸i) MR1 15,001,00 8,331,52 1,550,38 11,001,73 13,001,73 MR2 16,661,15 8,661,52 1,660,33 11,662,51 13,330,57 MR3 19,001,00 9,660,57 1,770,25 12,661,15 13,660,57 MR4 19,002,64 10,331,52 1,880,19 13,331,15 14,001,00 MR5 20,001,00 12,001,00 2,110,19 13,331,52 14,330,57 MR6 22,001,00 13,660,57 2,110,38 15,661,15 15,330,15 MR7 21,001,00 11,661,00 2,300,33 14,001,00 14,661,15 MR8 17,660,34 11,001,00 2,660,33 13,331,52 13,001,00 MR9 14,331,52 10,660,57 2,760,33 12,661,25 12,660,57 H×nh 3.14. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ hÖ sè nh©n chåi * ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ hÖ sè nh©n chåi Qua b¶ng 3.7 vµ h×nh 3.14 cã thÓ thÊy sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ë c¸c thang nång ®é kh¸c nhau ¶nh h­ëng kh¸c nhau ®Õn kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ hÖ sè nh©n chåi trong qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh. M«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3 cã nång ®é BAP lµ 0,5 mg/l, nång ®é NAA thay ®æi lÇn l­ît lµ 0,1; 0,25; 0,5 mg/l th× sè rÔ/chåi t­¬ng øng lµ 15,00 c¸i víi chiÒu dµi rÔ 8,33 cm ë m«i tr­êng MR1; 16,66 c¸i víi chiÒu dµi rÔ 8,66 cm ë m«i tr­êng MR2 vµ 19 c¸i víi chiÒu dµi rÔ 9,66 cm ë m«i tr­êng MR3. HÖ sè nh©n chåi ë c¸c m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3 lÇn l­ît lµ 1,55; 1,66 vµ 1,77 lÇn. M«i tr­êng MR4, MR5 vµ MR6 cã nång ®é BAP t¨ng lªn 1,0 mg/l, thang nång ®é NAA vÉn gi÷ nguyªn lÇn l­ît lµ 0,1; 0,25; 0,5 mg/l th× sè l­îng rÔ vµ chiÒu dµi rÔ ®· t¨ng lªn so víi c¸c m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3. §Æc biÖt lµ ë m«i tr­êng MR5 vµ MR6 sè l­îng rÔ/chåi ®· t¨ng lªn v­ît tréi ®¹t 20,00 vµ 22,00 c¸i. ChiÒu dµi rÔ còng t¨ng cao ®¹t 12,00 cm ë m«i tr­êng MR5 vµ 13,66 cm ë m«i tr­êng MR6. HÖ sè nh©n chåi cña nhãm m«i tr­êng nµy còng t¨ng lªn so víi nhãm m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3. Trong ®ã, m«i tr­êng MR5 vµ MR6 t¨ng cao vµ ®Òu b»ng 2,11 lÇn. NÕu tiÕp tôc t¨ng nång ®é BAP lªn 1,5 mg/l, gi÷ nguyªn thang nång ®é cña NAA lµ 0,1; 0,25 vµ 0,5 mg/l nh­ m«i tr­êng MR7, MR8 vµ MR9 th× sè rÔ/chåi vµ chiÒu dµi rÔ ®· gi¶m xuèng so víi m«i tr­êng MR6. ë m«i tr­êng MR7, tuy sè l­îng rÔ/chåi ®¹t 21,00 c¸i (gi¶m kh«ng ®¸ng kÓ so víi m«i tr­êng MR6) nh­ng chiÒu dµi rÔ ë m«i tr­êng MR7 chØ cßn 11,66 cm gi¶m nhiÒu so víi m«i tr­êng MR6. ë m«i tr­êng MR8, sè rÔ/chåi lµ 17,66 c¸i gi¶m 4,34 c¸i so víi m«i tr­êng MR6 vµ chiÒu dµi rÔ lµ 11,00 cm gi¶m 2 cm so víi m«i tr­êng MR6. ë m«i tr­êng MR9, sè rÔ/chåi tiÕp tôc gi¶m ®¸ng kÓ xuèng chØ cßn 14,33 c¸i gi¶m 7,67 c¸i so víi m«i tr­êng MR6 vµ chiÒu dµi rÔ lµ 10,66 cm gi¶m 3 cm so víi m«i tr­êng MR6. Tuy nhiªn, hÖ sè nh©n chåi ë nhãm m«i tr­êng nµy vÉn t¨ng lªn so víi m«i tr­êng MR6. §Æc biÖt lµ ë m«i tr­êng MR9, hÖ sè nh©n chåi t¨ng cao nhÊt ®¹t 2,76 lÇn. Nh­ vËy, trong qu¸ tr×nh t¹o rÔ, nÕu cµng t¨ng nång ®é cña BAP lªn cao h¬n 1,0 mg/l th× cµng t¨ng hÖ sè nh©n chåi vµ cµng øc chÕ kh¶ n¨ng t¹o rÔ. * ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi H×nh 3.15. ¶nh h­ëng cña sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ®Õn sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi Qua b¶ng 3.7 vµ h×nh 3.15 cã thÓ thÊy sù kÕt hîp gi÷a NAA vµ BAP ë c¸c thang nång ®é kh¸c nhau ¶nh h­ëng kh«ng gièng nhau ®Õn sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi trong qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh. ë m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3 cã nång ®é BAP lµ 0,5 mg/l, nång ®é NAA thay ®æi lÇn l­ît lµ 0,1; 0,25; 0,5 mg/l th× sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn chåi døa Cayen ®· b¾t ®Çu cã sù kh¸c nhau. ChiÒu cao chåi ë c¸c m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3 t¨ng lªn lÇn l­ît lµ 11,00; 11,66 vµ 12,66 cm. Sè l¸/chåi ë c¸c m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3 t¨ng lªn lÇn l­ît lµ 13,00; 13,33 vµ 13,66 c¸i. M«i tr­êng MR4, MR5 vµ MR6 cã nång ®é BAP t¨ng lªn 1,0 mg/l, thang nång ®é NAA vÉn gi÷ nguyªn lÇn l­ît lµ 0,1; 0,25; 0,5 mg/l th× chiÒu cao chåi vµ sè l¸/chåi ®· t¨ng lªn so víi c¸c m«i tr­êng MR1, MR2 vµ MR3. Cô thÓ, ë m«i tr­êng MR4 vµ MR5 chiÒu cao chåi t¨ng lªn b»ng 13,33 cm, sè l¸/chåi t¨ng lªn lÇn l­ît lµ 14,00; 14,33 c¸i vµ ë m«i tr­êng MR6 chiÒu cao chåi ®· t¨ng cao nhÊt ®¹t 15,66 cm, sè l¸/chåi còng t¨ng cao nhÊt ®¹t 15,33 c¸i. NÕu tiÕp tôc t¨ng nång ®é BAP lªn 1,5 mg/l, gi÷ nguyªn thang nång ®é cña NAA lµ 0,1; 0,25 vµ 0,5 mg/l nh­ m«i tr­êng MR7, MR8 vµ MR9 th× chiÒu cao chåi vµ sè l¸/chåi ®· gi¶m xuèng so víi m«i tr­êng MR6. ë m«i tr­êng MR7, chiÒu cao chåi gi¶m xuèng cßn 14,00 cm (gi¶m 1,66 cm so víi m«i tr­êng MR6), sè l¸/chåi ®¹t 14,66 c¸i (gi¶m 0,67 c¸i so víi m«i tr­êng MR6). ë m«i tr­êng MR8 vµ MR9, chiÒu cao chåi vµ sè l¸/chåi ®· gi¶m nhiÒu so víi m«i tr­êng MR6. ChiÒu cao chåi ë m«i tr­êng MR8 vµ MR9 lÇn l­ît lµ 13,33 vµ 12,66 cm (lÇn l­ît gi¶m 2,33 vµ 3,00 cm so víi m«i tr­êng MR6). Sè l¸/chåi ë m«i tr­êng MR8 vµ MR9 lÇn l­ît lµ 13,00 vµ 12,66 c¸i (lÇn l­ît gi¶m 2,33 vµ 2,67 c¸i so víi m«i tr­êng MR6). Qua nh÷ng ®¸nh gi¸ trªn chóng t«i nhËn thÊy: sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña chåi m¹nh nhÊt ë m«i tr­êng MR6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 0,2% than ho¹t tÝnh + 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP). Tãm l¹i, sù h×nh thµnh rÔ vµ sù sinh tr­ëng ph¸t triÓn cña chåi døa Cayen lµ m¹nh nhÊt khi sö dông nång ®é cña NAA lµ 0,5 mg/l kÕt hîp víi nång ®é cña BAP lµ 1,0 mg/l (m«i tr­êng MR6). ë ®iÒu kiÖn nµy, tuy hÖ sè nh©n chåi kh«ng cao nhÊt nh­ng sè rÔ/chåi vµ chiÒu dµi rÔ lµ cao nhÊt. MÆt kh¸c, sè l¸/chåi vµ chiÒu cao chåi còng ®¹t cao nhÊt, ®¶m b¶o c¸c tiªu chuÈn ®Ó ®­a c©y ra v­ên ­¬m. H×nh 3.16. KÕt qu¶ t¹o c©y hoµn chØnh ë m«i tr­êng MR6 KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ KÕt luËn Cã thÓ khö trïng c¸c mÉu døa Cayen b»ng cån 700 trong 30 gi©y, javen 50% trong 5 phót vµ thuû ng©n clorua 0,1% trong 15 phót th× sÏ thu ®­îc c¸c mÉu døa Cayen v« trïng víi tû lÖ sèng cao, ®¹t 68%. M«i tr­êng cã hÖ sè nh©n chåi cao nhÊt lµ m«i tr­êng MT6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP). Sau 10 tuÇn, hÖ sè nh©n chåi cao ®¹t 3,90 lÇn. M«i tr­êng t¹o protocorm tèt nhÊt lµ m«i tr­êng ML6 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP). HÖ sè t¹o protocorm ë m«i tr­êng nµy lµ 4,13 lÇn. M«i tr­êng r¾n MT6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng cã hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm cao nhÊt, ®¹t 4,75 lÇn sau 10 tuÇn. M«i tr­êng dÞch thÓ ML6 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng cã hÖ sè nh©n chåi rÊt cao, ®¹t 5,50 lÇn sau 10 tuÇn. Cao h¬n so víi m«i tr­êng r¾n. MËt ®é nu«i cÊy 5 chåi/b×nh (c«ng thøc CT1) lµ phï hîp nhÊt. Trong ®iÒu kiÖn nµy th× sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ lµ thÊp nhÊt, ®¹t 3,96% vµ hÖ sè nh©n chåi l¹i lµ cao nhÊt ®¹t 3,33 lÇn. M«i tr­êng t¹o c©y hoµn chØnh tèt nhÊt lµ m«i tr­êng MR6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 0,2% than ho¹t tÝnh + 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP). KiÕn nghÞ Trªn ®©y lµ mét sè kÕt qu¶ mµ chóng t«i thu ®­îc khi nghiªn cøu nh©n gièng in vitro døa Cayen (Ananas Comosus L.). Do thêi gian tiÕn hµnh ®Ò tµi cã h¹n nªn chóng t«i mong r»ng sÏ cã nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo vÒ qu¸ tr×nh ®­a c©y ra v­ên ­¬m ®Ó hoµn thiÖn quy tr×nh nh©n gièng in vitro lo¹i døa Cayen nµy. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu tiÕng viÖt: NguyÔn ThÞ Song An, Kinh tÕ n«ng s¶n nhiÖt ®íi, Khoa Kinh tÕ N«ng s¶n - §¹i häc Kinh tÕ Thµnh phè Hå ChÝ Minh, 1991. T¹ Nh­ Thôc Anh, Nghiªn cøu c«ng nghÖ nh©n nhanh in vitro c©y Trinh n÷ hoµng cung, LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi, 2002. Cocody vµ m. a Titxo., C©y døa, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp, 1978. Lª §×nh Danh, Vâ ThÞ TuyÕt, Nh©n gièng døa Cayen b»ng mét sè biÖn ph¸p kü thuËt, KÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc cña ViÖn Rau qu¶, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp, 1994. Jacop a., von Uex kull h., VÊn ®Ò ph©n bãn cho døa, c©y ¨n qu¶ nhiÖt ®íi, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp, 1972. Lª ThÞ Kh¸nh, Vâ Hïng, “¶nh h­ëng cña c¸c giai ®o¹n xö lý GA3 ®Õn sinh tr­ëng, ph¸t triÓn vµ n¨ng suÊt ít trªn ®Êt phï sa nghÌo dinh d­ìng Thõa Thiªn HuÕ”, T¹p chÝ N«ng nghiÖp, C«ng nghÖ Thùc phÈm vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n, 1996, sè 1, trang 2. NguyÔn V¨n Nghi, Chuyªn ®Ò sinh lý vµ c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi, 1998. §Æng XuyÕn Nh­, Hoµng ThÞ Kim Hoa, Nghiªn cøu nh©n nhanh mét sè gièng c©y trång b»ng kü thuËt nu«i cÊy m«, B¸o c¸o ®Ò tµi cÊp Bé, 1995. NguyÔn §øc Thµnh, Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt - Nghiªn cøu vµ øng dông, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp Hµ Néi, 2000. Phan Gia T©n, C©y døa vµ kü thuËt trång døa ë miÒn Nam, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp, 1984. Lª V¨n Th­îng, Nghiªn cøu mét sè biÖn ph¸p t¨ng nhanh n¨ng suÊt trång døa trªn ®Êt ®åi vµ ®Êt phÌn, Tãm t¾t luËn ¸n Phã TiÕn sÜ Khoa häc N«ng nghiÖp, Tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp H¤X£ MACTI, 1982. TrÇn ThÕ Tôc, Vò M¹nh H¶i, Chu V¨n Chu«ng, So s¸nh tuyÓn chän gièng døa Cayen phôc vô chÕ biÕn ®å hép ë miÒn B¾c ViÖt Nam, Nhµ xuÊt b¶n Gi¸o dôc , 1996. Vò V¨n Vô, ABT, “Mét sè chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng míi ®ang ®­îc sö dông réng r·i ë Trung Quèc vµ c¸c n­íc trong vïng Ch©u ¸ - Th¸i B×nh D­¬ng”, B¸o N«ng nghiÖp, 1998. Vò V¨n Vô, Sinh lý thùc vËt vµ øng dông, Nhµ xuÊt b¶n Gi¸o dôc, 2004. Vò V¨n Vô, NguyÔn Méng Hïng, C«ng nghÖ sinh häc tËp 2, Nhµ xuÊt b¶n Gi¸o Dôc, 2006. Vò V¨n Vô, Vò Thanh T©m, Hoµng Minh TÊn, Sinh lý häc thùc vËt, Nhµ xuÊt b¶n Gi¸o Dôc, 2007. NguyÔn V¨n UyÓn, Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt phôc vô c«ng t¸c gièng c©y trång, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp, 1993. NguyÔn V¨n UyÓn (1995), Ph©n bãn l¸ vµ c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp, 1995. §ç N¨ng VÞnh, C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt vµ øng dông, Nhµ xuÊt b¶n N«ng nghiÖp Hµ Néi, 2005. Tµi liÖu tiÕng Anh: Bhojwani S.S. and Razdam M.K., Plant Tissue Culture Theory and Practice, Elsevier Science Pulishers - Amsterdam, 1993. Dodd J.H., Roberts L.W., Experiments in Plant Tissue Culture - Cambridge University Press, United Kingdom, 1999. Narayanaswamy S., Plants Cell and Tissue Culture, Tata Mc Graw Hill Publishing Company Limited, New Delhi, 1999. Pierik R.L.M., In vitro culture of higher plants, Kluwer Academic Publisers, The Netherlands, 1997, PP. 45 - 94. T. Katchenco, “Une method rapid de mutipli cation de d’ananas. Fruits”, 1997, 2, 371 - 373. Wetzstein, Hazel. Wand Hary. E. Somer, Leaf and anatomy of tissue cultured, Liquid Styraciflua Hamamelidaceae, 1982. Ziv. M., In vitro Hardening and acclimatization of Tissue Culture Plants, in: Plant Tissue Culture and is Agricultural applications, Edited by Lyndsey.A.Wishness, P.G Alderson London, 1986. Mét sè trang web: http:// en. Wikipedia.org/wiki/Pineapple www.cesti.gov.vn/left/stinfo/tddt/de_tai_theo_nam/nam2006/111-duaCayen www.cesti.gov.vn/left/stinfo/tddt/de_tai_theo_nhom_nganh/nong_lam_ngu_nghiep/nam2007/047-duaCayen www.sinhhäcvietnam.com/vn/modules.php?name=Pages1&go=page&pid=34–43k xttm.agroviet.gov.vn/loadasp/hang/rauqua-spec detail.asp?tn=tn&id=1594143 Môc lôc Lêi c¶m ¬n C¸c tõ viÕt t¾t trong luËn v¨n Danh môc c¸c b¶ng trong luËn v¨n Danh môc c¸c h×nh trong luËn v¨n TãM T¾T KÕT QU¶ NGHI£N CøU Tµi liÖu tham kh¶o Phô lôc Tãm t¾t kÕt qu¶ nghiªn cøu 1. Tªn ®Ò tµi Nh©n gièng in vitro døa Cayen (Ananas comosus L.) 2. §èi t­îng ThÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh trªn c©y døa Cayen (Ananas comosus L.) 3. Môc tiªu Nh»m t¹o ®­îc nguån c©y gièng ®ång ®Òu, s¹ch bÖnh, gi÷ ®­îc c¸c ®Æc tÝnh quý cña nguyªn liÖu ban ®Çu víi hÖ sè nh©n gièng cao gÊp nhiÒu lÇn so víi sö dông ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh truyÒn thèng. 4. KÕt qu¶ chÝnh §Ó thu ®­îc c¸c mÉu døa Cayen v« trïng cã thÓ khö trïng c¸c mÉu b»ng cån 700 trong 30 gi©y, javen 50% trong 5 phót vµ thuû ng©n clorua 0,1% trong 15 phót. ë ®iÒu kiÖn nµy cho tû lÖ mÉu sèng cao nhÊt ®¹t 68%. M«i tr­êng cã hÖ sè nh©n chåi cao nhÊt lµ m«i tr­êng MT6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP). Sau 10 tuÇn, hÖ sè nh©n chåi ®¹t 3,90 lÇn. M«i tr­êng t¹o protocorm tèt nhÊt lµ m«i tr­êng dÞch thÓ ML6 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP). HÖ sè t¹o protocorm lµ 4,13 lÇn. M«i tr­êng r¾n MT6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng cã hÖ sè nh©n chåi tõ protocorm cao nhÊt ®¹t 4,75 lÇn sau 10 tuÇn. M«i tr­êng dÞch thÓ ML6 (m«i tr­êng nÒn MS + 2,5% ®­êng + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) lµ m«i tr­êng cã hÖ sè nh©n chåi rÊt cao ®¹t 5,50 lÇn sau 10 tuÇn. Cao h¬n so víi m«i tr­êng r¾n. MËt ®é nu«i cÊy 5 chåi/b×nh (c«ng thøc CT1) lµ phï hîp nhÊt. Trong ®iÒu kiÖn nµy, sù ph¸t sinh chåi biÕn dÞ lµ thÊp nhÊt vµ hÖ sè nh©n chåi l¹i lµ cao nhÊt. M«i tr­êng t¹o c©y hoµn chØnh tèt nhÊt lµ m«i tr­êng MR6 (m«i tr­êng nÒn MS + 0,8% th¹ch + 2,5% ®­êng + 0,2% than ho¹t tÝnh + 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP).