Nhân giống vô tính cây saintpaulia bằng phương pháp in - Vitro

u, ý nghĩa khoa học đã đạt được Dịch treo tế bào chuối Cau mẵn được tạo từ mô sẹo có nguồn gốc hoa đực non, trong môi trường lỏng chứa 2,4-D 1mg/l và acid ascorbic 15mg/l. Tế bào dịch treo tăng trưởng nhanh sau 7 ngày nuôi cấy và đạt đỉnh hô hấp ở ngày 14. Sự phối hợp 2,4- D 1mg/l và zeatin 0,5mg/l cải thiện sự tăng trưởng và chất lượng của dịch treo tế bào. Phôi soma hình thành khi tế bào dịch treo được chuyển sang môi trường giảm auxin. Môi trường Ma3 không hormon và mật độ tế bào ban đầu 15µl tế bào lắng/ml dịch treo tế bào thích hợp cho sự sinh phôi soma. Sự tiến hóa phôi soma từ tế bào chuối Cau mẵn qua các giai đoạn đặc trưng của sự tiến hóa phôi đơn tử diệp: phôi hình cầu, hình núi lửa, hình kim tự tháp (ảnh 1 và 2) (Bùi Trang Việt và csv 2004; Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt 2003, 2004). Mối quan hệ di truyền giữa Manihot glaziovii và một số giống trồng Manihot esculenta (Nền co, Cuống trầu, Sắn xanh, Chuối vàng, KM60, KM140, HL23, C9582, C9949, SC205, MPRA183, KM98-1, Rayong5 và KM94) được nghiên cứu nhờ kỹ thuật PCR-RAPD (Phan Ngô Hoang và csv 2004; Phan Ngô Hoang và csv 2005). Ở khoai mì dòng Cuống trầu, chồi ngọn và nụ nách cô lập phát triển tốt trên môi trường MS với BA 0,2mg/l, NAA 0,1mg/l và GA 0,05mg/l (Nguyễn Xuân Dũng và csv 2002). Lá cây in vitro từ các dòng: Cuống trầu, KM98-5, KM98-1, KM140, KM94, và KM108-1 cho phép tạo mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và Trang 30 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 BA 0,5mg/l (Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2004). Mô sẹo phát triển thành dịch treo tế bào trong môi trường MS lỏng có picloram 4mg/l và zeatin 1mg/l (ảnh 3). Sự sinh phôi soma xảy ra khi nuôi cấy mô sẹo từ lá và lóng thân khoai mì dòng Cuống trầu liên tục 21 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có NAA 0,2mg/l, BA 0,15mg/l và GA 0,1mg/l (ảnh 4). 21 Ảnh 2: Sự thành lập phôi sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma3 Ảnh 1:Phôi hình cầu sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma3 3 4 Ảnh 3: Nhóm tế bào dịch treo tế bào khoai mì dòng Cuống trầu sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung picloram 4mg/l và zeatin 1mg/l. Ảnh 4: Phôi hình cầu khoai mì dòng Cuống trầu với hệ thống tiền mạch sau 2 tuần nuôi cấy. Các kết quả trên chuối và khoai mì phù hợp với các kết quả sau đó ở lúa (Bùi Trang Việt và csv. 2004): sự di chuyển hữu cực của auxin (auxin indol acetic) từ mô cấy xuống môi trường nuôi cấy (được giảm hay loại bỏ auxin) có vai trò quan trọng trong sự phát sinh cơ quan phôi. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Từ các nghiên cứu cơ bản, nhóm nghiên cứu đã thực hiện có kết quả sự sinh phôi soma ở một số đối tượng như: Khoai tây, Lúa (Bùi Trang Việt và csv 2004), Huệ trắng (Phan Hoàng Anh và csv. 2005). 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: số đã bảo bảo vệ: 03 đang hướng dẫn: 05 Tiến sĩ: số đã bảo bảo vệ: 0 đang hướng dẫn: 03 Trang 31 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí KH [1]. Bui Trang Viet and Tran Thanh Huong 2004. Growth of cell suspensions of cv. ‘Cau man’. Infomusa 13(1): 2-4. [2]. Bùi Trang Việt, Phan Ngô Hoang, Nguyễn Thị Huệ, Trần Thanh Hương, Trịnh Cẩm Tú, Trần Thị Bích Trinh, Đòan Thị Phương Thùy, Cao Minh Phương 2004. Vai trò của auxin và cytokinin trong quá trình sinh phôi thể hệ ở khoai tây, lúa và chuối. Tạp chí KHKT nông lâm nghiệp số 2/2004: 64-67. [3]. Phan Hoàng Anh, Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2005. Vi nhân giống cây Huệ trắng (Lilium longiflorum Thunb). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ. Vol 8 (8): 43-48. [4]. Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2004. Phân tích biến dị di truyền giữa mì cao su (Manihot glaziovii Muel-Arg) và các giồng trồng khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng kỹ thuật PCR-RAPD. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ. Vol 7 (7): 31-36. [5]. Phan Ngô Hoang, Bùi Trang Việt và Hòang Kim 2004. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở Mì cao su (Manihot glaziovii Muel-Arg) và một số giống trồng khoai mì (Manihot esculenta Crantz). Tạp chí KHKT nông lâm nghiệp số 3/2004; 26-29. 5.2. Các công trình đã hoàn thành và sẽ công bố trong các tạp chí KH [1]. Phan Ngô Hoang, Đỗ Thường Kiệt, Bùi Trang Việt và Hoàng Kim. Khoảng cách di truyền và khả năng quang hợp ở Mì cao su (Manihot glaziovii Muel-Arg.) và một số giống trồng khoai mì (Manihot esculenta Crantz). Bài tham gia Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc trong nghiên cứu cơ bản (Hà Nội tháng 12/2005). 5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2004. Tạo mô sẹo và dịch treo tế bào khoai mì (Manihot esculenta Crantz). Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ ba – Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống (Thái Nguyên tháng 9/2004): 405-408. [2]. Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt 2003. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng của tế bào chuối Cau mẵn (Musa paradisiaca L.) được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc (Huế tháng 12/2003): 766-770. [3]. Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt 2004. Tìm hiểu khả năng sinh phôi của dịch treo tế bào chuối Cau mẵn (Musa paradisiaca L.). Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ ba – Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống (Thái Nguyên tháng 9/2004): 434-437. 6. Đánh giá và kiến nghị Trang 32 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 Tiếp tục nghiên cứu về vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh phôi soma ở các đối tượng có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, đồng thời cải tạo và nâng cấp vườn thực nghiệm của Bộ môn để tiếp tục nghiên cứu sự phát triển của các cây ở giai đoạn sau ống nghiệm. ROLE OF PLANT REGULATORS ON ORGANOGENESIS AND SOMATIC EMBRYOGENESIS IN BANANA AND CASSAVA ABSTRACT Micropropagation is the practice of rapidly multiplying stock plant material to produce a large number of healthy homogeneous plants, basing on the two important processes of morphogenesis: plant organogenesis and somatic embryogenesis. The recent development of embryogenic suspension cultures has paved the way to future mass production of plants at low cost. Use of plant growth substances plays a key role in morphogenesis. Therefore, the aim of this work is to explain role of these substances on organogenesis and somatic embryogenesis in two common plants: banana (monocotyledonous plant) and cassava (dicotyledonous plant). Trang 33 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LÁT MỎNG TẾ BÀO ĐỂ NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ Mã số đề tài: 62 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ Cơ quan công tác: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ Q.5 Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 8353193 Email: bvanle@hcmuns.edu.vn 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Để tìm các điều kiện nâng cao tần số tạo chồi trên một số giống cây ăn quả, chúng tôi đã dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào cắt ngang (transverse thin cell layer) và cắt dọc (longgitudinally thin cell layer) thực hiện trên các đối tượng cây ăn quả như: điều, măng cụt, cam chanh và nhãn. Kết quả nghiên cứu cho thấy tần số chồi phát sinh cao từ các lớp mỏng cắt ngang và cắt dọc trên các loài cây điều, măng cụt, cam chanh và nhãn. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt được Đề tài thực hiện trên một số đối tượng cây ăn quả như cây măng cụt, cam chanh, nhãn và điều. Mục đích của đề tài là thực hiện qui trình vi nhân giống với tần số tạo chồi cao trên các loại cây ăn quả sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cắt lát mỏng tế bào. Phương pháp được thực hiện trên các lát mỏng cắt ngang và dọc các phần khác nhau của cây thân gỗ. Kết quả nghiên cứu cho thấy qui trình thích hợp có tần số tạo chồi cao được thực hiện thành công trên các đối tượng như sau: - Lát cắt dọc trên chồi non cây cam (Poncirus trifoliate) một năm tuổi cho số chồi cao nhất là 33 chồi/lát mỏng với các nồng độ BAP (3 mg/l), NAA (0,5 mg/l) và hiệu suất là 90% (Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Sinh Học, Nông Nghiệp, Y Học. Huế, tháng 7/2003). - Trên cây măng cụt (Garcinia mangostana), lát cắt dọc từ hạt và lóng thân cây con cho thấy sự tạo chồi thích hợp ở 1-2 mg/l BAP với 8,4 chồi/lát mỏng cho hạt và 17,3 chồi/lát mỏng cho lóng thân. Các tỉ lệ tạo chồi tương ứng là 91,6% cho hạt và 60% cho lóng thân ( Hội nghị toàn quốc 2004, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Khoa Học Sự Sống. Thái Nguyên tháng 9/2004). - Các kết quả tối ưu khác khi dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào cũng được tìm thấy trên cây nhãn (Euphoria longan) (nồng độ 2,4-D 2 mg/l), cây sung (Ficus carica) (nồng độ BAP 2 mg/l) và cây điều (Anacardium occidentale) (nồng độ BAP 5 mg/l với 17,3 chồi/lát mỏng cắt dọc) (Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Sinh Học, Nông Nghiệp, Y Học. Huế tháng 7/2003). 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Các kết quả này được triển khai trên các đề tài khác như khảo sát quá trình vi ghép in vitro ở cây họ cam chanh và ứng dụng trong biến nạp gen để tạo cây chuyển gen. Qui trình nhân giống cây măng cụt được dùng để chọn lọc và phục tráng cây họ Trang 34 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 măng cụt. Các qui trình khác dùng cho vi nhân giống với số lượng lớn các loại cây ăn quả tương ứng. Phương pháp còn là tiền đề cho các nghiên cứu vi nhân giống các giống cây ăn quả khác. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: Số đã bảo vệ: 03 Số đang hướng dẫn: 00 Tiến sĩ: Số đã bảo vệ: 00 Số đang hướng dẫn: 00 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí khoa học [1]. DT Nhut, J.A. Teixeira da Silva, Bui Van Le and K Tran Thanh Van (2003). Thin Cell layer morphogenesis as a powerful tool in woody plants and fruit crop micropropagation and biotechnology, floral genetics and genetic transformation. In Micropropagation of woody trees and fruits. S. Mohan Jain and Katsuaki Ishii (Eds) Dordrecht: Kluwer Academic Publisher. Pp:785-814. [2]. 5.1.2. DT Nhut, J.A. Teixeira da Silva, Bui Van Le (2005). Thin Cell layer sectioning for inducing somatic embryogenesis in woody plants. In Protocol for somatic embryogenesis in woody plants. S. Mohan Jain and Pramod K.Gupta (Eds). Springer. Pp:785-814. 5.2. Các công trình đã hoàn thành và sẽ công bố trong các tạp chí KH [1]. Bùi Lan Anh, Trần Ngọc Hiếu, Bùi Văn Lệ (2005). Khảo sát qui trình chuyển gen vào lát mỏng tế bào cam ba lá (Poncitrus trifoliata) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hội nghị Khoa Học Toàn Quốc 2005, Công Nghệ Sinh Học Trong Nghiên Cứu Cơ Bản. Hà Nội tháng 12/2005. 5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo khoa học [1]. Bùi Văn Lệ, Trần Nguyên Vũ, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lương Thị Mỹ Ngân (2003). Vi nhân giống một số cây ăn quả dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào. Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Sinh Học, Nông Nghiệp, Y Học. Huế tháng 7/2003: 340-343. [2]. Kiều Phương Nam, Trần Thị Anh Nguyệt, Bùi Văn Lệ, Thái Xuân Du (2004). Khảo sát sự phát sinh cơ quan cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào. Hội nghị toàn quốc 2004, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Khoa Học Sự Sống. Thái Nguyên tháng 9/2004: 533-536. 5.4. Sách chuyên khảo đã xuất bản (tên sách, nhà xuất bản, năm xuất bản) [1]. DT Nhut, Bui Van Le , K Tran Thanh Van and Thorpe TA (2003). Thin cell layerculture system. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher. 6. Đánh giá kiến nghị Đề tài bước đầu đã tìm được một số điều kiện thích hợp cho qui trình vi nhân giống một số giống cây ăn quả, tuy nhiên, còn nhiều hạn chế trên ứng dụng các đối tượng cây ăn quả khác cần phải thực hiện. Đề nghị cấp kinh phí tiếp cho đề tài. Trang 35 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN APPLICATION OF THIN CELL LAYER SYSTEM IN FRUIT CROP IMPROVEMENT ABSTRACT To study a method for high frequency and direct in vitro bud regeneration of fruit crop species, we used the thin cell layer system. A higher percentages of bud regeneration from longitudinally thin cell layer (lTCLs) and transverse thin cell layer (tTCLs) were obtained on citrus (Poncirus trifoliate), mangosteen (Garcinia mangostana), longan (Euphoria longan Steud) and cashew (Anacardium occidentale L.). Trang 36 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP MỚI CHUYỂN GEN VÀO VI NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP NHỜ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Mã số đề tài: 640102 Tên Chủ nhiệm đề tài: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH Cơ quan công tác: Viện Sinh học nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1 Mạc Đĩnh Chi, Q. 1 Điện thoại: 0913 733 410 Email: hoang-quoc-khanh@hcm.vnn.vn Thành viên tham gia: CN Trần Hoàng Ngọc Ai 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Agrobacterium tumefaciens được sử dụng rộng rãi để biến nạp di truyền thực vật. Hiện nay phương pháp này áp dụng cho các đối tượng khác như tế bào động vật, vi nấm, các loại nấm lớn. Biến nạp di truyền nhờ A.tumefaciens có nhiều lợi điểm so với các phương pháp biến nạp khác như tính chọn lọc, đơn giản và hiệu suất cao. Mục tiêu của đề tài là xây dụng phương pháp hoàn chỉnh biến nạp vi nấm nhờ A.tumefaciens. Thử nghiệm biến nạp trên một số loại nấm như Trichoderma, Phytophtora, Volvariella. 2. Kết qủa nghiên cứu của đề tài về mặt khoa học - Hoàn thiện quy trình biến nạp Trichoderma harzianum: biến nạp plasmid pPK2 có mang gen kháng hygromycin vào A.tumefaciens, biến nạp T.harzianum gián tiếp nhờ A.tumefaciens, theo dõi độ ổn định của các dòng biến nạp và kiểm tra sự hiện diện của gen hph (kháng hygromycin) bằng PCR. - Hoàn thiện quy trình biến nạp nấm gây bệnh cây Phytophtora palmivora: quan sát gắn kết của A.tumefaciens lên bề mặt tơ nấm P.palmivora, biến nạp P.palmivora gián tiếp nhờ A.tumefaciens, chọn ngưỡng kháng hygromycin thích hợp và theo dõi độ ổn định của các dòng biến nạp, kiểm tra sự hiện diện của gen hph bằng PCR. - Hoàn thiện quy trình biến nạp nấm ăn Volvariella volvacea: phân lập và khảo sát các điều để nuôi cấy V.volvacea trong điều kiện in vitro, biến nạp V.volvacea gián tiến nhờ A.tumefaciens, chọn ngưỡng kháng hygromycin thích hợp, theo dõi độ ổn định của các dòng biến nạp và kiểm tra sự hiện diện của chỉ thị bằng PCR. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Đây là phương pháp mới, hữu hiệu dùng để chuyển gen vào vi nấm một cách có chọn lọc và hiệu suất cao. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: 0 Tiến sỹ: 0 Trang 37 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Hoàng Quốc Khánh, Trần Hoàng Ngọc Ai. Chuyển gen kháng hygromycin B vào vi nấm Trichoderma harzianum bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens. Hội nghị toàn quốc lần thứ II Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, 25-27/7/2003. [2]. Trần Hoàng Ngọc Ai, Hoàng Quốc Khánh. Biến nạp di truyền gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens vào nấm bệnh cây Phytophtora palmivora. Hội nghị Khoa học lần thứ IV Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM, TP Hồ Chí Minh, 21/10/2004. [3]. Hoang Quoc Khanh, Tran Hoang Ngoc Ai. Agrobacterium tumefaciens- mediated genetic transformation of the phytopathogenic oomycete Phytophtora palmivora. XXII Fungal genetics Conference, Pacific Grove, USA, March 18-23, 2003. [4]. Hoang Quoc Khanh, Tran Hoang Ngoc Ai. Agrobacterium tumefaciens- mediated genetic transformation of the phytopathogenic oomycete Phytophtora palmivora. XIX International Congress of Genetics, Melbourne, Australia, July 6-11, 2003. [5]. Tran Hoang Ngoc Ai and Hoang Quoc Khanh. Agrobacterium tumefaciens-mediated gentic transformation of the edible straw mushroom Vovaviella volvacea. XXIII Fungal genetics Conference, Pacific Grove, USA, March 15-20, 2005. 6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra, mặc dù gặp phải một số khó khăn về điều kiện làm việc. Tiếp tục hỗ trợ kinh phí. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-MEDIATED GENETIC TRANSFORMATION OF FILAMENTOUS FUNGI ABSTRACT Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation is ultilized widely in transformation of plant. Nowadays, the method is applied for different cells such as animal cells, filamentous fungi and mushroom. The goal of this project is setting up a new method for transformation of filamentous fungi by using A.tumefaciens mediation. The method was tested in different kind of filamentous fungi such as Trichoderma, Phytophtora and Volvariella. Trang 38 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CẢI NGỌT CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU Mã số đề tài: 10521 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. NGUYỄN VĂN UYỂN Cơ quan công tác: Viện Sinh học nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1- Mạc Đĩnh Chi, Q. I , Điện thoại: 8978796 E-mail: geneng@hcm.vnn.vn Thành viên tham gia: - TS. Nguyễn Hữu Hổ - KS. Lê Tấn Đức - ThS. Phạm Thị Hạnh - CN. Phan Tường Lộc - CN. Mai Trường 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu - Xây dựng hệ thống tái sinh cây cải ngọt thông qua việc nuôi cấy các cơ quan mô tế bào khác nhau như lá mầm và trụ mầm và nghiên cứu ảnh hưởng của các chất chọn lọc đến khả năng tái sinh của cây tạo tiền đề cho việc chuyển gen. - Xây dựng hệ thống chuyển gen cho cây cải ngọt. - Kiểm tra thể hiện gen bằng các phương pháp: trong môi trường có chất chọn lọc và phản ứng PCR 2. Kết quả nghiên cứu của đề tài về mặt khoa học - Xây dựng hoàn chỉnh hệ thống tái sinh cây cải ngọt từ lá mầm và trụ mầm với kết quả như sau: sự tái sinh từ lá mầm cải ngọt là sự tái sinh thông qua mô sẹo ở cuống lá mầm và sự tái sinh trụ mầm cũng từ mô sẹo. Sự kết hợp giữa môi trường MS với 4 mg/l BA và 2 mg/l NAA kích thích mạnh mẽ sự tái sinh từ lá mầm và trụ mầm đặc biệt lá mầm cho khả năng tái sinh rất cao đạt khoảng 80%. - Hoàn tất việc khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc Phosphinothricin (PPT) đến khả năng tái sinh của lá mầm, trụ mầm và cây cải ngọt đối chứng (không chuyển gen). - Nghiên cứu khả năng chuyển gen từ lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Chúng tôi tiến hành chuyển gen nhiều lần với số lượng lá mầm khá lớn (gần 1500 mẫu). Nhận thấy số lượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc (4mg/l PPT) để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở mức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển và chết ở các lần cấy truyền sau, đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen do chồi ở thể khảm (tế bào chuyển gen và không chuyển gen phát triển Trang 39 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN cùng lúc) và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với 6 mg/l PPT- cho thấy tần số chuyển gen thấp. - Nghiên cứu khả năng chuyển gen cây cải từ trụ mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Sử dụng trụ mầm của cây gieo từ hạt 5-6 ngày tuổi, cấy trụ mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi cho trụ mầm tiếp xúc với dịch vi khuẩn để lây nhiễm, thời gian nuôi chung với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là hai ngày trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 100 µM Acetosyringone và sau khi rửa trụ mầm được cấy trên môi trường tái sinh có chất chọn lọc là 3 mg/l PPT. Sau 3-4 tuần các chồi tái sinh được tiếp tục cấy truyền trên môi trường MS có 6 mg/l PPT để kiểm tra cây chuyển gen. Chúng tôi tiến hành chuyển gen nhiều lần với số lượng trụ mầm khá lớn (hơn 1500 mẫu). Chúng tôi nhận thấy số lượng trụ mầm chống chịu với chất chọn lọc 3mg/l PPT để hình thành mô sẹo khá (khoảng 5%) nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở mức khoảng 0,5% tuy nhiên đa số các chồi đều không phát triển và chết ở các lần cấy truyền sau và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với 6 mg/l PPT- cho thấy tần số chuyển gen không cao. - Sử dụng phương pháp PCR để xác định gen cryIA trong cây cải giả định chuyển gen. Kết quả cho thấy các mẫu ADN của cây giả định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65Kb, chúng là kết của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng. - Đã trồng các cây cải ngọt giả định chuyển gen tại vườn ươm để kiểm tra khả năng kháng sâu Heliothis armigera, kết quả cho thấy khả năng kháng sâu của một dòng khá rõ còn các dòng khác không có sự khác biệt so với đối chứng. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn - Góp phần nâng cao trình độ nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển nạp gen trong công tác tạo giống cây trồng. - Tạo dòng cải ngọt kháng sâu hướng phục vụ cho sản xuất nông nghiệp 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: 0 Tiến sĩ: 0 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt (Brassica integrifolia) và nghiên cứu tạo cây cải chuyển gen. Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Hà Nội, 3/11/2005. trang 1194-1197 [2]. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Kh ảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Hà Nội, 3/11/2005. trang 498-500 Trang 40 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 [3]. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Nghiên cứu tạo cây cải ngọt (Brassica integrifolia) chuyển gen kháng sâu từ trụ mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Bài đã gửi đăng Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản, Hà Nội, 6/12/2005. 6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ dự kiến, hoàn thành các mục tiêu đề ra 1) Xây dựng hoàn chỉnh hệ thống tái sinh in vitro cây cải ngọt đối với hai giống cải và nghiên cứu ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến lá mầm, trụ mầm và cây. 2) Quy trình chuyển gen cho cây cải ngọt với nguồn nguyên liệu là lá mầm và trụ mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3) Kiểm tra cây cải ngọt giả định chuyển gen in vitro bằng chất chọn lọc PPT và kỹ thuật PCR. 4) Thử tính kháng sâu của các dòng cải ngọt giả định chuyển gen tại vườn ươm. 5) Trồng thử nghiệm cây cải ngọt chuyển gen kháng sâu tại vườn ươm để kiểm tra tính ổn định của gen chuyển và kh ả năng di truyền ở thế hệ sau. STUDIES ON THE HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION SYSTEM AND PRODUCTION OF TRANSGENIC BRASSICA INTEGRIFOLIA RESISTANT TO INSECT ABSTRACT - Study on high frequency shoot regeneration system of Brassica integrifolia for genetic transformation. Effect of selective agent on the growth of Brassica integrifolia tissues used in plant transformation. - Development of transgenic Brassica integrifolia plants resistant to insect from hypocotyl via Agrobacterium tumefaciens. - PCR analysis to confirm the presence of cryIA(c) gene in putative transgenic plants Trang 41 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ CÂY THÂN GỖ NHIỆT ĐỚI VÀ CẬN NHIỆT ĐỚI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Mã số đề tài: 62 07 02 Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ QUỲNH Cơ quan công tác: Viện Sinh học nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1 Mạc Đĩnh Chi, Q. 1, Tp. Hồ Chí Minh Điện thoại: 824 4905 / 897 8794 / 824 1401 Email: qtnguyen@hcmc.netnam.vn Thành viên tham gia: - TS. Thái Xuân Du - Th.S. Nguyễn My Uyên - KS. Trịnh Việt Nga 1. Mục đích, nội dung nghiên cứu Nghiên cứu các điều kiện tối ưu của môi trường nuôi cấy in vitro nhằm gia tăng khả năng tự dưỡng của cây thân gỗ trong qúa trình nuôi cấy in vitro, giúp cho việc cung cấp cây giống in vitro có chất lượng cao với giá thành thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy mô truyền thống, tiến đến một công nghệ nhân giống in vitro trên quy mô sản xuất lớn bán vô trùng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy như nồng độ đường và tốc độ trao đổi khí của hộp nuôi cấy Magenta lên sự tăng trưởng của cây lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.) trong giai đoạn nuôi cấy in vitro và thuần hóa ex vitro. - Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ đường, gía thể, cường độ ánh sáng, các kiểu nắp đậy đến sự tăng trưởng của cây hông (Paulownia fortunei) trong giai đoạn in vitro và ex vitro. - Nghiên cứu về ảnh hưởng một số yếu tố vật lý của môi trường nuôi cấy mô như cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến sự tăng trưởng của tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis), bạch đàn (Eucalyptus tereticornis), hông (Paulownia fortunei) trong cả hai giai đoạn in vitro và ex vitro. - Các thí nghiệm đã chứng minh các cây in vitro phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy không có đường và vitamin và độ thoáng khí của bình nuôi cấy cao. Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn giảm đáng kể (2-0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin tỷ lệ nhiễm lên tới 10% trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khẩu ở mặt dưới lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khẩu luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra Trang 42 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 vườn ươm. Tỷ lệ cây sống 95-100 % sau 1 tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không đường, trái lại chỉ từ 70-80% theo phương pháp truyền thống. - Việc kiểm soát các điều kiện vật lý của môi trường nuôi cấy giúp cho cây in vitro gia tăng sử dụng CO2 trong không khí, thay vì phụ thuộc vào nguồn carbon duy nhất là đường và các chất hữu cơ khác như vitamin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy cây in vitro trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng có khả năng phát triển gần giống như cây ngoài tự nhiên. Việc giảm nồng độ hay loại bỏ hẳn đường và các vitamin sẽ góp phần giảm ô nhiễm cho môi trường xung quanh do tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn trong qúa trình nuôi cấy giảm. Đồng thời sử dụng phương pháp nuôi cấy mới này còn góp phần làm giảm lượng CO2 trong không khí nhờ sự gia tăng hoạt động của cơ quan quang hợp của cây in vitro trong quá trình nuôi cấy. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu qủa ứng dụng thực tiễn - Cây in vitro ít bị nhiễm nấm bệnh do môi trường nuôi cấy không đường và vitamin. - Tạo cây cấy mô (lõi thọ, hông, cây tre tầm vông, bạch đàn) có chất lượng cao, tăng trưởng nhanh do đó rút ngắn thời gian nuôi cấy in vitro, đồng thời tỷ lệ cây chết trong giai đoạn vườn ươm thấp dẫn đến việc giảm chi phí chăm sóc khi đưa cây ra vườn ươm. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: 0 Tiến sỹ: đang hướng dẫn: 1 NCS 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trên các tạp chí khoa học 1. PS Sha Valli Khan, T Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, C Kubota, V Dhawan. 2003. Growth and water relations of Paulownia fortunei under photomixotrophic and photoautotrophic conditions. Biologia Plantarum. 46 (2):161-166. 2. PS Sha Valli Khan, T Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, C Kubota, V Dhawan. 2002. Growth and net photosynthetic rates of Eucalyptus tereticornis Smith under photomixotrophic and various photoautotrophic micropropagation conditions. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 71: 141-146. [2]. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Kim Linh, Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du. 2002. Effects of nutrient concentration and ventilation condition of the culture vessel on the growth of Paulownia (Paulownia fortunei) cultured in vitro. Advan. Nat. Sci. Vol.3 (3): 281-287. [3]. Nguyễn Thị Quỳnh, T Kozai. 2002. Environmental control in micropropagation: II. Effects of culture medium environment and biological features on the growth of in vitro plants. Advan. Nat. Sci., Vol.3 (1): 81-90. 5.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị Trang 43 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN [1]. Nguyễn Thị Quỳnh, T Kozai. 2002. Photoautotrphic micropropagation systems for woody plants. pp. 43A. Abtrs. of the 10 th International Association for Plant Tissue Culture & Biotechnology (IAPTC&B), June 23-28, 2002. Orlando, Florida, USA. [2]. PS Sha Valli Khan, T Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, C Kubota, D Vibha. 2002. Photoautotrophic micropropagaiton of potential Energy Crops Paulownia fortunei and Eucalyptus tereticornis. pp. 66A. Abtrs. of the 10 th International Association for Plant Tissue Culture & Biotechnology (IAPTC&B), June 23-28, 2002. Orlando, Florida, USA. [3]. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Thảo, Trần Sỹ Tuệ, Nguyễn Thị Hằng. 2003. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng trong nhân giống in vitro một số cây nhiệt đới: tre tầm vông, lõi thọ, khoai mỡ và khoai lang. Proceedings của Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ 2, tổ chức tại Hà Nội ngày 16-17/12/2003. Nhà XB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 953- 957. [4]. Nguyễn Thị Quỳnh, Phan Vũ Tiên, Trịnh Việt Nga. 2003. Nuôi cấy mô quang tự dưỡng cây lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.). Proceedings của Hội nghị Toàn quốc lần thứ 2 “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” do Bộ Khoa học và Công nghệ, HĐ Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sự sống, tổ chức tại Huế ngày 25-26/7/2003. Nhà Xuất bản Khoa học Kỹ thuât Hà Nội, 394-397. 6. Đánh giá tình hình thực hiện đề tài nghiên cứu Được sự hỗ trợ về kinh phí của Bộ KHCN, đề tài đã chứng minh được khả năng tự dưỡng của cây nuôi cấy in vitro khi nguồn carbon vô cơ (CO2) được dùng thay thế nguồn carbon hữu cơ (đường, vitamin,v.v.) trên khả năng sinh trưởng của một số giống cây trồng. Đề tài được thực hiện theo đúng chương trình đề ra ban đầu. 7. Kiến nghị Hướng nghiên cứu này cần được tiếp tục hỗ trợ mạnh để xây dựng thành hướng công nghệ nuôi cấy mô hiện đại. EFFECT OF ENVIRONMENTAL FACTORS ON THE GROWTH OF TROPICAL AND SUB-TROPICAL WOODY PLANTS CULTURED IN VITRO ABSTRACT Optimal conditions of the micro-environment were studied with the aim to enhance the photosynthetic ability of woody plants during the in vitro stage. Results of this study will be useful for producing in vitro plants at low cost in comparison with that of conventional micropropagation, leading to a micropropagation technology used for large scale production under semi-aseptic condition. Trang 44 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÔNG ĐƯỜNG KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT TĂNG CƯỜNG CO2 VÀ O2 TRONG HỘP NUÔI CẤY LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ CAO TRONG GIAI ĐOẠN IN VITRO VÀ EX VITRO Mã số đề tài: 62 13 05 Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ QUỲNH Cơ quan công tác: Viện Sinh học nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1 Mạc Đĩnh Chi, Q. 1, Tp. Hồ Chí Minh Điện thoại: 824 4905 / 897 8794 / 824 1401 Email: qtnguyen@hcmc.netnam.vn Thành viên tham gia: - Th.S. Nguyễn My Uyên - CN. Huỳnh Hữu Đức - CN. Nguyễn Đình Sỹ - CN. Nguyễn Minh Tuấn 1. Mục đích, nội dung nghiên cứu Nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy mô quang tự dưỡng (môi trường không đường và vitamin) khác nhau, bao gồm hệ thống trao đổi khí tự nhiên và hệ thống bơm khí trực tiếp, lên sự tăng trưởng và ra rễ của một số loài cây trồng như phong lan, tre, nho, dâu tây trong hai giai đoạn in vitro và ex vitro với phương pháp nuôi cấy mô truyền thống, nhằm tiến đến xây dựng một công nghệ vi nhân giống hiện đại trên quy mô sản xuất lớn bán vô trùng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được − Nghiên cứu ảnh hưởng của việc tăng cường CO2 cho hộp nuôi cây, nồng độ đường, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và giá thể đến sự tăng trưởng của cây nho (Vitis vinifera L.) trong giai đoạn in vitro và ex vitro. − Nghiên cứu ảnh hưởng của việc tăng cường CO2 cho hộp nuôi cây, nồng độ đường, và điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng của lan Dendrobium trong giai đoạn in vitro và ex vitro. − Nghiên cứu thiết kế hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp nhằm tăng cường CO2 và O2, sử dụng hộp nuôi cấy lớn chứa 50-100 cây. − So sánh ảnh hưởng của hai hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên và bơm khí trực tiếp lên sự tăng trưởng của cây tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis) trong giai đoạn in vitro và ex vitro. − Các thí nghiệm đã chứng minh cây phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy không có đường, không có vitamin, cùng với sự gia tăng độ thoáng khí của bình nuôi cây. Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn giảm đáng kể (2-0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin (tỷ lệ nhiễm lên tới 10% trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu). Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khẩu ở Trang 45 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN mặt dưới lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khẩu luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra bên ngoài. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu qủa ứng dụng thực tiễn - Tạo cây cấy mô có chất lượng cao, rút ngắn thời gian nuôi cấy, tăng tỷ lệ sống ngoài vườn ươm. - Giảm công lao động trong khâu nuôi cấy in vitro, đồng thời giảm công chăm sóc khi đưa ra vườn ươm. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: đang hướng dẫn: 1 Tiến sỹ: đang hướng dẫn: 1 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trên các tạp chí khoa học [1]. Kozai T, Xiao Y, Nguyễn Thị Quỳnh, Zobayed SMA, Afreen-Zobayed F. 2005. Photoautotrophic (sugar-free medium) micropropagation systems for large-scale commercialization. Prop. of Ornam. Plants, 5(1): 23-34. 5.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị [1]. Nguyễn Thị Quỳnh, Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn My Uyên. 2005. Sự tăng trưởng của lan Dendrobium nuôi cấy quang tự dưỡng trong điều kiện ánh sáng tự nhiên. [2]. Bài này gửi đến Ban tổ chức Hội nghị tòan quốc 2005 “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” do HĐ Khoa học tự nhiên, Ngành KHSS tổ chức tại Hà Nội ngày 3/11/2005 nhưng đã bị làm thất lạc và không được in trong Proceedings, nên sẽ công bố trong tạp chí chuyên ngành. 6. Đánh giá và đề nghị - Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ theo như đề cương đã đề ra trong hai năm 2005-2006. - Đề tài cần được đầu tư nghiên cứu nhiều hơn ở mức quốc gia để xây dựng thành công nghệ vi nhân giống hiện đại. EFFECT OF SUGAR-FREE MEDIUM IN COMBINATION WITH CO2 AND O2 ENRICHMENT IN THE CULTURE BOX ON THE GROWTH OF SOME ECONOMICAL PLANTS DURING IN VITRO AND EX VITRO STAGES ABSTRACT Effect of photoautotrophic (sugar-free) micropropagation, including natural ventilation and forced ventilation systems, on the growth and root formation of Trang 46 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 orchids, bamboo, grapevines, and strawberry during in vitro and ex vitro stages has been studied in comparison with those of conventional micropropagation. The research aims at establishing a modern micropropagation technology for large scale production under semi-aseptic condition. Trang 47 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN BIẾN ĐỘNG HÀM LƯỢNG AZADIRACHTIN VÀ NIMBIN TRONG LÁ NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS) VÀ HIỆU QUẢ XUA ĐUỔI, GÂY CHẾT VÀ BIẾN DẠNG CỦA DỊCH CHIẾT NHÂN HẠT NEEM ĐỐI VỚI RẦY NÂU (Nilaparvata lugens Stal.) Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN TIẾN THẮNG Cơ quan công tác: Viện Sinh học Nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1 Mạc Đỉnh chi, Q1, tp.HCM Thành viên tham gia: - Vũ Văn Độ - Lê Thị Thanh Phượng - Bùi Văn Toàn 1. Đặt vấn đề Cây neem (Azadirachta indica A. Juss) thuộc họ xoan (Meliacea) có nguồn gốc từ Ấn Độ được du nhập vào Việt Nam từ khá lâu. Đến nay, neem đã được trồng tập trung ở Bình Thuận và Ninh Thuận cho thấy khả năng thích nghi cao của nó đối với vùng đất cát, khô hạn. Nhân hạt neem bước đầu đã được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật thử nghiệm. Hoạt chất azadirachtin và nimbin trong hạt và lá neem có tác dụng kháng khuẩn và xua đuổi côn trùng. Nội dung báo cáo liên quan đến khảo sát biến động hàm lượng azadirachtin và nimbin trong lá neem và hiệu quả xua đuổi, gây chết và biến dạng của dịch chiết nhân hạt neem đối với rầy nâu (4,6,8). 2. Nguyên liệu và phương pháp Nguyên liệu Lá neem tươi thu hái trực tiếp trên cây, cùng thời gian vào ngày 15 hàng tháng trong năm 2004 tại Trại Thạnh Lộc và Thủ Đức TP HCM và tại Ninh Phước, Ninh Thuận được xử lý đồng thời và phân tích ngay trong ngày. Rầy nây do Trung tâm nghiên cứu bảo vệ thực vật phía Nam (Tiền Giang) cung cấp. Lúa Tài Nguyên D14 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cung cấp. Chiết bột nhân hạt neem bằng ethanol, hexane và nước và tiến hành thử nghiệm so sánh với dầu neem. Phương pháp :Định lượng dẫn xuất azadirachtin và nimbin trong lá neem 20 g mẫu lá neem được nghiền thành dạng past, ngâm chiết với 200 ml methanol trong 2 giờ và lọc qua giấy lọc. Lặp lại 5 lần. Gom dịch lọc và loại bỏ chlorophyll bằng than hoạt tính và rửa thôi bằng methanol. Cô dịch thu được ở 50oC còn 10 ml và loại mỡ trong dịch cô bằng n-hexane. Dịch sau loại mỡ được lọc qua lọc 0,45 µm và đem phân tích HPLC trên cột Bondapak C18, 125 A, 10 µm, 3,9 x 300 mm với lượng mẫu bơm vào cột 5 µl, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, sử dụng dung môi thôi cột là acetonitril : H2O2 (55 : 45) với detector DAD ở λ = 220 nm. Trang 48 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 Đánh giá hiệu lực xua đuổi, gây chết và biến thái đối với rầy nâu của dịch chiết nhân hạt neem Đánh giá hiệu lực xua đuổi: thả 10 con rầy nâu cái đã bị bỏ đói 5 giờ vào giữa ống nhựa dài 7 cm, đường kính 12 cm nằm ngang nối 2 chậu lúa xử lý thuốc và không xử lý thuốc. Đếm số lượng rầy nâu bám trên lúa. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 4 loại dịch thử nghiệm ở các nồng độ: 1,0 - 5,0 - 10,0 %. Hệ số xua đuổi tính theo Saxena (9). Đánh giá hiệu lực gây chết và biến dạng: thả 20 rầy nâu (7 ngày tuổi và trưởng thành) vào mỗi lồng có sẵn chậu lúa đã xử lý các dịch thử nghiệm theo dãy nồng độ từ 0,2 -3,0%. Đếm số lượng rầy bị chết. Tiếp tục nuôi số rầy còn sống để ghi nhận sự phát triển và biến dạng của rầy trưởng thành. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 4 loại dịch thử nghiệm ở các nồng độ: 0,2 - 0,5 -1,0 - 2,0 - 3,0 %. Tính tỷ lệ chết của rầy nâu theo từng nghiệm thức, từ đó tính giá trị LD50 của các dịch thử nghiệm bằng phương pháp phân tích Probit thao tác trên phần mềm Excel. Các số liệu được phân tích Anova và xếp hạng các nghiệm thức theo trắc nghiệm Duncan thao tác trên phần mềm Statgraphic 7.0 (1). 3. Kết quả và thào luận Hình 2. Một số kiểu biến dạng rầy nâu do ảnh hưởng của dịch chiết nhân hạt neem Kết quả quan sát cho thấy ở các nghiệm thức xử lý neem, một số rầy trưởng thành bị biến dạng, trong đó nhiều nhất ở nghiệm thức neem- hexane (31,5%) và ít nhất ở nghiệm thức neem- nước (21,6%). Nghiệm thức neem- ethanol và dầu neem Ấn Độ có tỉ lệ rầy biến dạng tương đương nhau (tương ứng là 29,5 và 29,3%). Tác động gây biến dạng của các hoạt chất từ neem đã được báo cáo ở nhiều loài côn trùng như châu chấu Schistocerca gregaria, gián Blattella germanica, muỗi Aedes aegypti…(5,10). 1. Có sự dao động khá lớn hàm lượng dẫn xuất azadirachtin và nim bin trong lá neem trồng tại Việt Nam phụ thuộc mùa và thời gian trong năm, vào mùa khô hạn cao hơn so với vào mùa mưa. Hàm lượng dẫn xuất azadirachtin cao hơn so với hàm lượng nimbin và lá neem ở Ninh Thuận có hàm lượng dẫn xuất azadirachtin cao nhất. 2. Dịch chiết nhân hạt neem có khả năng xua đuổi, gây chết và làm biến dạng rầy nâu trưởng thành. Trong đó hiệu lực xua đuổi của dịch chiết neem - hexane và dầu Trang 49 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN neem là mạnh nhất, kế đến là dịch neem - ethanol với các hệ số xua đuổi tương ứng là 0,0 ; 3,3 và 6,7 % (ở nồng độ 10%) và 16,7; 16,7 và 20,0 % (ở nồng độ 5%). Dịch chiết neem - ethanol có hiệu lực gây chết mạnh nhất (LC50 = 1,21%), dịch chiết neem- nước có hiệu lực gây chết yếu nhất (LC50 = 5,67%). Dịch chiết neem - hexane gây biến dạng nhiều nhất (31,5%), dịch chiết neem - nước gây biến dạng ít nhất (21,6%). INVESTIGATION THE DERIVATIVE AZADIRACHTIN AND NIMBIN IN LEAVES OF NEEM TREE (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS), AND REPELLENT, INSECTICIDAL AND DEFORMING EFFECTS OF NEEM SEED KERNEL EXTRACTS ON BROWN PLANT HOPPER (NILAPARVATA LUGENS STAL.) ABSTRACT Investigation the derivative azadirachtin and nimbin contents in leaves of neem tree (Azadirachta indica A. Juss) planted at Ninh thuan province, Thu Duc District and Thanh Loc ( District 12) acording to the season and time of the year. The results showed that the leaves of the neem tree at Ninh Thuan had highest content of derivative azadirachtin, the lowest one was at Thu Duc district. There were large variety about derivative azadirachtin and nimbin in neem leaves acording to the season and months in the year. The derivative azadirachtin varied from 18.8 ppm to 348.87 ppm at Ninh Thuan, from 5.04 ppm to 50.05 ppm at Thu Duc District, and from 20.87 ppm to 205.03 ppm at Thanh Loc. Neem seed kernel extracts, viz., ethanolic, aqueous, hexane extracts and neem oil were screened as the repellent, insecticidal and deformating agents to Brown Plant Hopper (BPH) (Nilaparvata lugens Stal.). It was showed that at concentration of 10%, the hexane extract, neem oil and ethanolic extract indicated strongest repellent effect on BPH adults, with repellent index respectively 0.0; 3,3 and 6.7 %. The ethanolic extract had the highest toxicity against seven-day old and adult BPH with the LC50 being 1.21 and 4.68 %, respectively. 1% ethanolic extract was found to cause the trongest malformation to BPH with 13.8 % of deformed adults. Trang 50 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ PHÔI SOMA TRONG CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ PHÁT TRIỂN CÂY THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA ZUCC) ĐANG BỊ TUYỆT DIỆT Mã số đề tài: 62-09-05 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH Cơ quan công tác: Viện Sinh học Nhiệt đới. Tp.HCM Địa chỉ liên lạc: 01 Mac Đỉnh Chi, Q.1, TP Hồ Chí Minh Điện thọai: 1. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.1. Mục đích Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi soma trong bảo tồn và phát triển cây thông đỏ 1.2. Nội dung nghiên cứu - Tái sinh cây thông đỏ in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn - Nghiên cứu quá trình phát sinh phôi soma in vitro nhằm mục tiêu phát triển 2. Kết quả nghiên cứu của đề tài Thời gian thực hiện đề tài trong 2 năm (2005-2006). Trong báo cáo này chúng tôi báo cáo nội dung (1) trong toàn tiến trình thực hiện đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tái sinh cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) in vitro 2.1. Vật liệu - Mẫu nuôi cấy: cây thông đỏ đầu dòng được giâm cành trong bầu đất với nhiều độ tuổi khác nhau (Trung tâm Nghiên cứu Lâm sinh ĐàLạt thu thập ở vùng núi Liang Biang, Lâm Đồng). - Điều kiện nuôi cấy: môi trường được vô trùng ở 121oC, 1at, trong 25 phút. Nhiệt độ phòng nuôi cấy 28+1oC. Cường độ chiếu sáng 34,2µmol/m2/s. Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày - Môi trường nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản MS (Murashige-Skoog, 1962), WPM (Lloyd & McCown, 1981), WV3 (Coke, 1996), được bổ sung BA (6-benzylaminopurine), kinetin (6-fufurylaminopurine), IBA (β-indol butyric acid), NAA (α-naphthalen acetic acid). Chất chống hóa nâu: than hoạt tính, PVP, AgNO3. 2.2. Phương pháp Thí nghiệm được bố trí theo RCBD, 4 lần lặp lại, 5 bình tam giác cho một lần lặp lại, mỗi bình cấy 5 mẫu. Số liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê MSTSC. 2.3. Kết quả và thảo luận - Vô trùng mẫu nuôi cấy: mẫu nuôi cấy được lấy từ cây mẹ bầu đất 18 tháng tuổi. Chồi đỉnh và chồi bên được sử dụng làm mẫu nuôi cấy. Chồi non được vô trùng Trang 51 Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN bằng hypochlorite Natri (10%) trong 15 phút. Chồi non vô trùng được đưa vào nuôi cấy in vitro - Ảnh hưởng của môi trường khoáng cơ bản đến nuôi cấy tái sinh chồi thông đỏ in vitro: chồi no được nuôi cấy trên môi trường khoáng cơ bản MS, WPM, WV3 có bổ sung BA (5mg/l). Môi trường MS tỏ ra thích hợp - Ảnh hưởng của chất chống hóa nâu đến nuôi cấy tái sinh chồi thông đỏ in vitro: cây thông đỏ thường tiết ra nhựa đỏ trên vết thương. Sau khi nuôi cấy hồi non 2 ngày thì thấy xuất hiện nhựa đỏ tiết ra vào môi trường làm hạn chế khả năng tái sinh chồi. Trên môi trường MS + BA(5mg/l) có bổ sung than hoạt tính, PVP hay AgNO3. Kết quả nghiên cứu cho thấy than hoạt tính (1000mg/l), PVP (150mg/l) và AgNO3 (150mg/l) đã hạn chế rõ rệt sự tiết nhựa vào môi trường nuôi cấy. Trong đó AgNO3 tỏ ra hiệu quả hơn - Ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuôi cấy đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: sinh lý mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh chồi bên và chồi bất định in vitro. Có nhiều loạ mẫu được đưa vào nuôi cấy: (1) ngọn chính + đốt 1, (2) thân chình + đốt 2, (3) thân chính + đốt 3, (4) ngọn cành + đốt 1, (5) thân cành + đốt 2, (6) thân cành + đốt 3. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả cho thấy mẫu (1) và (2) có số chồi / mẫu cao hơn cả 1,5 và 3 - Ảnh hưởng của tuổi mẫu nuôi cấy đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: tuổi mẫu nuôi cấy có vai trò quan trọng, mẫu phải non, và đủ độ tuổi chín sinh lý, sẽ cho phát sinh chồi cao. Mẫu nuôi cấy có tuổi sinh lý 12-15-18 tháng tuổi, được nuôi cấy trên môi trường MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ chồi tái sinh cao nhất với tuổi mẫu 18 tháng, phát sinh số chồi / mẫu nuôi cấy cao (3,1 chồi) - Ảnh hưởng của BA đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản có bổ sung BA(0,5-2,5-5-10-15mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy BA(5mg/l) thích hợp cho nuôi cấy tái sinh chồi - Ảnh hưởng của BA và Kinetin đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: nhằm nâng cao khả năng nuôi cấy tái sinh chồi, tổ hợp BA(5mg/l) + Kinetin(0,1-0,5-1-2,5-5mg/l) + AgNO3(150mg/l) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS. Kết quả cho thấy, tổ hợp MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) + AgNO3(150mg/l) thích hợp cho nuôi cấy tái sinh chồi, cho số chồi / mẫu nuôi cấy nhiều (3,1 chồi) - Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến tỷ lệ ngã nghiêng chồi thông đỏ in vitro: cây thông đỏ có đặc tính khi giâm cành bên ngoài vườn ươm thường có tỷ lệ cây ngã nghiêng cao. Môi trường nuôi cấy tái sinh chồi: MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) + AgNO3(150mg/l). Mẫu nuôi cấy: (1) đỉnh thẳng đứng (2) thân thẳng đứng (3) đỉnh cành (4) thân cành. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ ngã nghiêng cao khi mẫu nuôi cấy là (3) và (4) so với độ thẳng đứng của trục tung (0o) là >45o, mẩu (1) và (2) có tỷ lệ ngã nghiêng <45o. Mẫu nuôi cấy thích hợp cho tái sinh chồi in vitro là (1) đỉnh thẳng đứng và (2) thân thẳng đứng - Ảnh hưởng của tính bảo lưu cục bộ đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro: trong giâm cành, với mẫu là cành (nhánh) bên, thường cho cây ngã nghiêng. Nghiên cứu tính bảo lưu cục bộ in vitro cho thấy: trên môi trường nuôi cấy MS + BA(5mg/l) + Trang 52 Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005 AgNO3(150mg/l), với mẫu nuôi cấy (1) đỉnh cành (2) thân cành, cho kết quả: góc nghiêng so với trục tung (0o), mẫu nuôi cấy (1) có tỷ lệ ngã nghiêng thấp nhất - Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thông khí và ánh sáng đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro: trên môi trường nuôi cấy MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l), mẫu nuôi cấy là thân chính + đốt 2, bình tam giác được đậy kín bằng nắp giấy và nắp cao su, trong điều kiện chiếu sáng 11,4-22,8-34,2µmol/m2/s. Kết quả cho thấy trong điều kiện chiếu sáng 11,4-22,8µmol/m2/s và đậy bằng nắp giấy cho phát sinh chồi / mẫu cao (2,8 chồi) - Nhân nhanh cây thông đỏ in vitro: chồi non phát sinh trong nuôi cấy được sử dụng làm protocol cho quá trình vi nhân giống. Trên môi trường cơ bản MS có bổ sung BA v à K. Kết quả cho thấy môi trường nhân nhanh hiệu quả là MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) cho phát sinh chồi / cụm cao (3,4 chồi). Cây thông đỏ in vitro có tính ưu thế ngọn mạnh mẽ, nuôi cấy đốt thân cho phát sinh chồi bên, nuôi cấy chồi ngọn chỉ cho vươn thân chồi - Nuôi cấy phát sinh rễ chồi thông đỏ in vitro: cây con thông đỏ phát sinh rễ in vitro trên môi trường nuôi cấy WPM + NAA(3mg/l) + Rhizopon(50mg/l) sau 75 ngày nuôi cấy. 2.4. Kết luận Cây thông đỏ được nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang bị tuyệt diệt 3. Kết quả đã và đang ứng dụng vào thực tiễn - Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng in vitro nhằm bảo tồn số lượng cây thông đỏ còn sót lại trên Lâm Đồng - Cây thông đỏ in vitro là nguồn nguyên liệu cho dòng hóa tế bào phôi soma trong công nghệ vi nhân giống và dòng hóa tế bào trong nuôi cấy chiết xuất taxol 4. Kết quả đào tạo sau đại học Cao học: 01 (bảo vệ 12/2005) Nghiên cứu sinh: 01 (2006-2009) 5. Sản phẩm khoa học - 01 bài báo trong tạp chí KH&KT Nông Lâm nghiệp - 01 bài báo trong tạp chí KH&CN - 02 bài báo trong Hội nghị NCCB 2006 Trang 53