Nhân nhanh IN Vitro Lan Kim Điệp (dendrobium chrysotoxum) – một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng

127 TẠP CHÍ KHOA HỌC, ðại học Huế, Số 64, 2011 NHÂN NHANH IN VITRO LAN KIM ðIỆP (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM) – MỘT LỒI LAN RỪNG CĨ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG Nguyễn Văn Song Viện Tài nguyên, Mơi trường và Cơng nghệ sinh học, ðại học Huế Phan Hùng Vĩnh, Sở Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn Quảng Nam Trương Thị Bích Phượng, Trường ðại học Khoa học, ðại học Huế TĨM TẮT Chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Kim điệp. Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả lan 3 tháng tuổi. Mơi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản cĩ 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP. Mơi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ bản cĩ 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP. Mơi trường MS cơ bản cĩ 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro. Mơi trường MS cơ bản cĩ 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA là thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro. Từ khĩa: Dendrobium chrysotoxum, hạt lan, lan quý hiếm, nhân nhanh, protocorm. 1. Mở đầu Lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) là lồi lan rừng Việt Nam phân bố chủ yếu ở vùng Tây Nguyên, cĩ hoa lớn màu vàng tươi. Cánh mơi cĩ đốm vàng cam đậm ở giữa, mép cĩ lơng mịn. Hoa nở vào dịp tết từ tháng 1 đến tháng 2 [2]. Lồi lan này đang đứng trước nguy cơ sẽ bị tuyệt chủng ngồi thiên nhiên trong một tương lai gần [1]. ðối với nhiều lồi lan hiếm, bị đe dọa hay nguy cấp trong tự nhiên thường được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm bằng hạt [13]. Các lồi lan sống biểu sinh thường được nhân giống từ hạt, sử dụng việc nuơi cấy khơng cộng sinh [5]. Hạt lan phát triển rất kém ngay cả khi đã chín, chúng phụ thuộc vào sự nhiễm nấm để nảy mầm và phát triển trong tự nhiên. Phương pháp nuơi cấy khơng cộng sinh được phát triển sau nghiên cứu của Knudson (1922) [8], hạt lan cĩ thể nảy mầm trên mơi trường muối khống đơn giản cĩ chứa đường. Phương pháp này đã trở thành kỹ thuật chuẩn cho nảy mầm hạt lan [9]. Ở Ecuador, phương thức nảy mầm hạt lan in vitro cũng là một phần quan trọng của chương trình bảo tồn và nhân giống các lồi lan hiếm, cung cấp cây con cho chương trình phục hồi rừng tái sinh [15]. Với cơng nghệ nhân giống in vitro hiện nay hệ số nhân giống từ một quả lan là rất lớn, từ vài ngàn đến một triệu cây con [4]. 128 Trong thời gian qua, đã cĩ một số tác giả trong và ngồi nước nghiên cứu nhân giống bằng hạt ở các lồi lan khác nhau. Luan và đồng tác giả (2006), đã nuơi cấy hạt một số lồi Dendrobium sp. Dactylorhiza fuchsia. Một lồi lan cĩ trong sách đỏ của vùng Baltic cũng được nuơi cấy thành cơng từ hạt của quả cịn xanh [11], Geodorum densiflorum đã được nhân giống in vitro [7], Calanthe sieboldii cũng được cho nảy mầm từ quả 80 ngày tuổi [17], Cypripedium macranthos được nhân giống bằng hạt [19], Epidendrum ibaguense được cho nảy mầm khơng cộng sinh [10]. Kim điệp là một lồi lan đẹp, thuộc nhĩm nguy cấp, tuy nhiên đến nay theo tài liệu chúng tơi cĩ được thì chỉ cĩ Roy và cs (2007) nghiên cứu sự hình thành protocorm thơng qua tạo callus từ đỉnh chồi. Trong bài báo này, chúng tơi trình bày kết quả nghiên cứu nhân nhanh lan Kim điệp bằng nuơi cấy hạt nhằm mục đích bảo tồn lồi lan cĩ nguy cơ tuyệt chủng này đồng thời tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho sản xuất hoa lan. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên cứu là quả lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) 3 tháng tuổi thu hái từ cây ngồi tự nhiên. 2 2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Khử trùng mẫu Quả lan được ngâm trong nước xà phịng lỗng và rửa kỹ dưới dịng nước chảy, sau đĩ khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 2 phút, tiếp đến khử trùng bề mặt vỏ quả bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút. Cuối cùng, quả được rửa lại 5 lần bằng nước cất vơ trùng. 2.2.2. Nảy mầm và phát sinh protocorm Hạt lan thu từ quả đã khử trùng được cấy lên mơi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) cĩ 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 15% nước dừa (CW), 0,5-2,5 mg/l benzylamino purine (BAP), và 0,2-1,5 mg/l napththaleneacetic acid (NAA) để thăm dị khả năng nảy mầm và phát sinh protocorm. 2.2.3. Nhân nhanh protocorm Các protocorm sau khi hình thành sẽ được cấy chuyển lên mơi trường MS cơ bản cĩ 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 15% CW, bổ sung BAP, kinetin, NAA riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng độ khác nhau để thăm dị khả năng nảy mầm và nhân protocorm. 2.2.4. Phát triển chồi từ protocorm Các protocorm sau khi nhân nhanh được cấy lên mơi trường MS cơ bản cĩ 8 g/l agar, 30 g/l sucrose, 1 g/l than hoạt tính bổ sung 15% CW và các chất kích thích sinh trưởng (BAP, NAA và kinetin) riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng độ khác nhau để thăm dị khả năng phát triển chồi. 129 2.2.5. Tạo rễ từ chồi in vitro Các chồi thu được từ các thí nghiệm trên được tách riêng rẽ và cấy lên mơi trường cơ bản MS cĩ 8 g/l agar; 30 g/l sacharose bổ sung NAA từ 0,1 - 1,5 mg/l hoặc 1,0 mg/l NAA phối hợp với kinetin (0,3 - 1,5 mg/l) để thăm dị khả năng hình thành và phát triển của rễ từ chồi in vitro sau 6 tuần nuơi cấy. Các thí nghiệm nuơi cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. 2.2.6. Chuyển cây con trồng ngồi điều kiện tự nhiên Các cây con tái sinh hồn chỉnh (cao 3,0 - 4,5 cm, cĩ 2 - 5 rễ) được huấn luyện thích nghi với điều kiện bên ngồi. Sau đĩ cây con được trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ (tỷ lệ 1:2) ở chế độ che sáng 50 % và tưới phun sương. Xác định tỷ lệ sống sĩt của cây con sau 4 tuần chăm sĩc. 2.3. Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần (n ≥ 30) để tính trung bình mẫu và phân tích Duncan (p < 0,05) bằng chương trình SAS. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Sự nẩy mầm và phát sinh protocorm Bảng 1. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nảy mầm và hình thành protocorm của hạt Nồng độ chất kích thích sinh trưởng (mg/l) Khả năng nảy mầm và phát sinh protocorm BAP - + 0,5 ++ 1,0 +++ 1,5 +++ 2,0 ++++ 2,5 ++ NAA 0,2 +++ 0,5 ++ 1,0 ++ 1,5 ++ Chú thích: - : Khơng bổ sung chất kích thích sinh trưởng; ++++ : tốt ; +++ : khá ++ : trung bình; +: kém 130 Các hạt lan ban đầu cĩ màu vàng chanh được nuơi cấy in vitro sau 2 tuần đã chuyển sang màu nâu vàng, rồi bắt đầu trương lên. Sau 3-4 tuần hạt tiếp tục trương to và cĩ hình cầu màu xanh nhạt do lục hĩa. Kết quả sau 6 tuần nuơi cấy được trình bày ở bảng 1. Số liệu ở bảng 1 cho thấy, BAP và NAA cĩ tác dụng rõ rệt đối với sự nảy mầm đồng thời phát sinh protocorm của hạt so với đối chứng (khơng bổ sung chất kích thích sinh trưởng). Mơi trường cĩ BAP (1,0 - 1,5 mg/l) cĩ tác dụng tương đương với mơi trường cĩ bổ sung 0,2 mg/l NAA. Mơi trường cĩ 2,0 mg/l BAP kích thích sự nảy mầm và phát sinh protocorm tốt nhất. Kết quả nghiên cứu trên lan Nghinh xuân (Rhynchostylis gigantea) cũng tương tự, nồng độ NAA thích hợp là 0,1 mg/l [3]. Tuy nhiên, ở một số lồi Dendrobium sp. thì cần NAA ở nồng độ cao hơn lên đến 0,5 mg/l NAA [14]. 3.2. Nhân nhanh protocorm Hạt lan nảy mầm cĩ thể sản xuất ra một khối tế bào chưa phân hĩa rõ ràng được gọi là protocorm. Tất cả những protocorm này sẽ tiếp tục phát triển trong nhiều tuần, nhiều tháng hay thậm chí nhiều năm phụ thuộc từng lồi cho đến khi đủ lớn để tạo lá và rễ [15]. Bảng 2. Ảnh hưởng của BAP, kinetin riêng rẽ hoặc kết hợp với NAA lên khả năng nhân nhanh protocorm sau 6 tuần nuơi cấy Chất kích thích sinh trưởng (mg/l) Số Protocorm trung bình/mẫu Kinetin BAP NAA - ðC - 1,80c - 0,5 - 2,50b - 1,0 - 2,75b - 1,5 - 4,25a - 2,0 - 4,33a - 2,5 - 3,67ab LSD0,05 1,26 - - - 1,80d 0,5 - - 2,75c 1,0 - - 3,88a 1,5 - - 3,86a 2,0 - - 3,26b 2,5 - - 2,78c 131 LSD0,05 0,08 - - - 1,80c - 0,5 1,0 2,40bc - 1,0 1,0 3,62a - 1,5 1,0 3,66a - 2,0 1,0 2,75b - 2,5 1,0 1,83c LSD0,05 0,74 - - - - 0,5 - 0,5 2,75b 1,0 - 0,5 3,60a 1,5 - 0,5 3,12ab 2,0 - 0,5 2,15c 2,5 - 0,5 1,88c LSD0,05 0,57 Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05. Các protocorm sau khi hình thành được cấy chuyển lên mơi trường MS cơ bản, bổ sung BAP, kinetin, NAA riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng độ khác nhau để nhân nhanh protocorm. Kết quả thu được sau 6 tuần nuơi cấy trình bày qua bảng 2 cho thấy, BAP cĩ tác dụng tích cực đến sự hình thành protocorm, nồng độ 2,0 mg/l BAP thích hợp nhất để phát sinh protocorm, số protocorm trung bình đạt được cao nhất là 4,33. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Kalimuthu và cs (2006) trên Oncidium sp. và kết quả của Anjum và cs (2006) khi nghiên cứu trên D. Malones. Kinetin cũng cĩ tác dụng trong sự hình thành protocorm. Mơi trường cĩ kinetin ở nồng độ 1,0 mg/l cho số protocorm cao nhất là 3,88. Sự kết hợp giữa NAA với BAP hoặc kinetin cho hiệu quả nhân protocorm tốt. Số protocorm hình thành cao nhất 3,66 protocorm trên mơi trường cĩ 1,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA và 3,60 protocorm trên mơi trường cĩ 1,0 mg/l kinetin + 0,5 mg/l NAA. Nghiên cứu từ mẫu lá D. Malones cũng cho số protocorm cao nhất trên mơi trường cĩ 1,0 mg/l kietin + 0,5 mg/l NAA [6]. 3.3. Phát sinh chồi từ protocorm Kết quả phát sinh chồi từ protocorm sau 12 tuần nuơi cấy được trình bày ở bảng 3 cho thấy, NAA cĩ tác dụng rõ rệt đến sự phát triển chồi từ protocorm so với mơi trường đối chứng. Trên mơi trường cĩ 0,7 mg/l NAA cho số số chồi/protocorm cao nhất 132 là 2,8 chồi/protocorm và sự phát triển chiều cao chồi lớn nhất (4,03 cm) ở mơi trường cĩ 1,0 mg/l NAA. Kinetin cĩ tác dụng tích cực đến sự phát triển chồi từ mẫu cấy, số chồi hình thành cao hơn so với mơi trường cĩ NAA, tuy nhiên, sự phát triển chiều cao chồi lại kém hơn. Trên mơi trường cĩ 1,0 mg/l kinetin số chồi hình thành cao nhất là 3,16 chồi/protocorm, mơi trường cĩ 1,5 mg/l kinetin kích thích sự phát triển chiều cao chồi Kim điệp tương đối tốt (3,68 cm). Sự phối hợp giữa BAP và NAA cĩ tác động khá tốt đến sự hình thành chồi từ protocorm, số chồi thu được cao nhất ở mơi trường cĩ 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, chiều cao chồi lớn nhất ở mơi trường cĩ 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA. Từ kết quả này cũng cho thấy, với tỷ lệ Cytokinin/Auxin (BAP/NAA) = 2 là thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi từ protocorm của lan Kim điệp. Các tỷ lệ khác cho hiệu quả thấp, điều này cũng cĩ thể do hàm lượng auxin nội sinh của mơ đã ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi của protocorm. 3.4. Sự hình thành rễ của chồi in vitro Chồi của lồi Kim điệp thu được từ các thí nghiệm trên được tách riêng rẽ và cấy lên mơi trường tạo rễ để khảo sát khả năng hình thành rễ. Kết quả thí nghiệm sau 6 tuần theo dõi được trình bày ở bảng 4. Kết quả ở bảng 4 cho thấy, sự hình thành rễ của chồi in vitro tốt nhất trên mơi trường cĩ 1,0 mg/l NAA (5,93 rễ/chồi). Chiều dài rễ tương đương nhau trên các mơi trường cĩ 0,1; 0,3; 0,5 mg/l NAA. Chồi Kim điệp hình thành rễ kém trên mơi trường cĩ sự kết hợp giữa kinetin và NAA. Bảng 3. Ảnh hưởng của BAP, kinetin và NAA lên khả năng phát sinh chồi từ protocorm Chất kích thích sinh trưởng (mg/l) Số chồi/protocorm Chiều cao chồi (cm) Kinetin BAP NAA - - - 1,26c 2,23d - - 0,1 1,43c 2,06d - - 0,3 1,50c 2,46d - - 0,5 2,30ab 3,00c - - 0,7 2,80a 3,70b - - 1,0 2,16b 4,03b - - 1,5 1,81bc 4,53a LSD0,05 0,58 0,40 - - - 1,26e 2,23e - 2,0 0,1 1,56e 2,57d - 2,0 0,3 2,09d 2,95c - 2,0 0,5 2,27cd 3,48a 133 - 2,0 0,7 2,65bc 3,25b - 2,0 1,0 3,18a 3,28b - 2,0 1,5 2,77ab 2,85c LSD0,05 0,47 0,12 - - - 1,26c 2,23c 0,5 - - 1,50bc 3,13b 1,0 - - 3,16a 3,20b 1,5 - - 2,03b 3,68a 2,0 - - 1,83bc 3,00b 2,5 - - 1,70bc 2,88b LSD0,05 0,57 0,33 3.5. Chuyển cây con trồng ngồi điều kiện tự nhiên Các bình cây con Kim điệp tái sinh hồn chỉnh (cao 3,0 - 4,5 cm, cĩ 2 - 5 rễ) được chuyển từ phịng nuơi cấy ra ngồi điều kiện tự nhiên, cĩ ánh sáng đầy đủ, ở nhiệt độ phịng trong khoảng 10 ngày để cây thích nghi dần. Sau đĩ, chuyển cây con ra khỏi bình nuơi cấy, rửa sạch mơi trường, cắt ngắn rễ và nhúng vào dung dịch sát khuẩn (VIBEN-C 50BTN 0,25 - 0,3 %) trong thời gian 1 phút. Cây con được trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ (tỷ lệ 1:2) ở chế độ che sáng 50 % và tưới nước phun sương. Sau 2 tuần, cây con bắt đầu hình thành rễ mới và hình thành lá mới sau 3 tuần chuyển ra vườn ươm. Kết quả sau 1 tháng theo dõi, tỷ lệ sống sĩt đạt 90,9 %. Bảng 4. Ảnh hưởng của chất KTST lên khả năng tạo rễ của chồi lan Kim điệp in vitro Chất KTST (mg/l) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) NAA Kinetin - - 2,94e 1,44c 0,1 - 4,54d 2,24a 0,3 - 5,06c 2,23a 0,5 - 5,32b 2,24a 1,0 - 5,93a 1,83b 1,0 0,3 2,06g 0,79e 1,0 0,5 2,17fg 0,80e 1,0 1,0 2,13fg 1,06d 1,0 1,5 2,18f 0,99d LSD0,05 0,1 0,09 134 4. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu chúng tơi sơ bộ rút ra một số kết luận sau: - Mơi trường tốt nhất cho sự nảy mầm đồng thời phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản cĩ 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ sung 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP. - Mơi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất (4,33 protocorm/mẫu) là MS cơ bản cĩ 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ sung 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP. - Mơi trường MS cơ bản cĩ 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, bổ sung 15% nước dừa và kết hợp 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA hoặc 1 mg/l Kinetin là thích hợp nhất cho sự phát sinh chồi từ protocorm và sự sinh trưởng của chồi in vitro. - Mơi trường thích hợp cho tạo rễ là MS cơ bản cĩ 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ sung 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA. A B C D E Hình 1. A: Hạt lan nảy mầm sau 6 tuần trên mơi trường cĩ 2,0 mg/l BAP. B: Protocorm sau 6 tuần nuơi cấy trên mơi trường cĩ 2,0 mg/l BAP. C: Chồi phát sinh từ protocorm trên mơi trường cĩ 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA sau 12 tuần nuơi cấy. D: Chồi in vitro tạo rễ sau 6 tuần trên mơi trường cĩ 1,0 mg/l NAA. E: Cây con trồng trên giá thể ngồi tự nhiên. 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Tiến Bân và các tác giả, Sách đỏ Việt Nam – Phần II – Thực vật, Nxb Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ, Hà Nội, 2007. [2]. Trần Hợp, Phong lan Việt Nam, Nxb Nơng Nghiệp, Tp HCM, 1998. [3]. Nguyễn Hồng Lộc, Mai Văn Phơ, ðiều tra sơ bộ thành phần lồi họ lan ở Thừa Thiên Huế và bước đầu bảo tồn in vitro một số lồi phân bố ở đây, Tạp chí Sinh học 22(3b), (2000), 173-178. [4]. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, Cây Phong lan Dendrobium sp, Trường ðại học Nơng Lâm Tp HCM, 2001. [5]. Alvarez-Pardo VM, Ferreira AG, Nunes VF, Seed disinfestation methods for in vitro cultivation of epiphyte orchids from Southern Brazil, Horticultura Brasileira 24, (2006), 217-220. [6]. Anjum S, Zia M. and Chaudhary MF, Investigations of different strategies for high frequency regeneration of Dendrobium malones ‘Victory’, African Journal of Biotechnology, 5(19), (2006), 1738-1743. [7]. Bhadra SK, Hossain MM, In vitro germination and micropropagation of Geodorum densiflorum (Lam.) Schtr., an endangered orchid species, Plant Tissue Cult. 13(2), (2003), 165-171. [8]. George EF, Hall MA and Jan de Klerk G., Plant propagation by tissue culture, 3rd Edition, Vol 1. The background. Spinger, the Netherlands, 2008. [9]. Goh CJ, Ammirato PV, Evans DR, Sharp WR, Bajaj YPS, Orchids, Monopodials. In: Handbook of Plant Cell Culture, McGraw-Hill, New York. Vol. 5,(1990), 598-633. [10]. Hossain MM, Asymbiotic seed germination and in vitro seedling development of Epidendrum ibaguense Kunth. (Orchidaceae), African Journal of Biotechnology 7(20), (2008), 3614-3619. [11]. Jakobsone G., Morphogenesis of wild orchid Dactylorhiza fuchsii in tissue culture, Acta Universitatis Latviensis, Biology 745, (2008), 17–23. [12]. Kalimuthu K, Senthilkumar R and Vijayakumar S., In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp. (Dancing Dolls), African Journal of Biotechnology 6 (10), (2006), 1171-1174. [13]. Kauth P., In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila lanceolata var. lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master thesis, University of Florida, 2005. 136 [14]. Luan VQ, Thien NQ, Khiem DV and Nhut DT., In vitro germination capacity and plant recover of some native and rare orchids, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, (2006), 175-177. [15]. McKendrick S., In vitro germination of orchids: a manual, Ceiba Foundation for Tropical Conservation, (2000), 1-17. [16]. Murashige T, Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant 15, (1962), 473-497. [17]. Park SY, Murthy HN and Paek KY., In-vitro seed germination of calanthe sieboldii, an endangered orchid species, Joumal of Plant Biology 43(3), (2000), 158-161. [18]. Roy J, Naha S, Majumdar M, Banerjee N., Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl, Plant Cell Tiss Organ Cult, 90, (2007), 31-39. [19]. Taniguchi H, Katsumi M, Yamamoto Y, Tatsumi Y, Sano CM, Choi YE and Sano H., In vitro proliferation and genetic diversity of Cypripedium macranthos var. rebunense, Plant Biotechnology, 25, (2008), 341-346. IN VITRO PROPAGATION OF DENDROBIUM CHRYSOTOXUM - AN ENDANGERED ORCHID SPECIES Nguyen Van Song Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University Phan Hung Vinh Quang Nam Department of Agricultural and Rural Development Truong Thi Bich Phuong College of Sciences, Hue University SUMMARY We have carried out in vitro propagation of Dendrobium chrysotoxum. In this report, the 3-month old seeds were used for propagation. The suitable medium for seed germination accompanied with protocorm induction is basal MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP and for protocorm propagation is basal MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP. The basal MS medium + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l activated charcoal + 15% CW and 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA was the most suitable for multi-shoot micropropagation from protocorm and the growing of in vitro shoots. The suitable medium for rooting is MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 1,0 mg/l NAA. Key words: Dendrobium chrysotoxum, immature seeds, endangered orchid, micropropagation, protocorm.