Nhân nhanh invitro hoa Dendrobium

MỤC LỤC MỞ ĐẦU Từ xưa tới nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan ở Việt Nam đẹp vẻ đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa.Cùng với sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ làm đẹp hơn hình ảnh của Việt Nam trong con mắt du khách đến với đất nước xứ sở nhiệt đới này mà còn mang lại hiệu quả kinh tế cao. Một số giống hoa có thể trồng được trong điều kiện khí khí hậu nhiệt đới cận của nước ta như Dendrobium, Mokara, Cattleya,…Trong đó lan Dendrobium được trồng nhiều và có giá trị kinh tế cao.Bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium mang lại thì Dendrobium còn được sử dụng để tách chiết phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm. Ngoài ra, đối với y học loài hoa này cũng có nhiều giá trị nhất định.Với giá trị như vậy hoa Dendrobium hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này. Tuy nhiên để đáp ứng nhu cầu giống của thị trường trong nước, hàng năm chúng ta phải nhập một số lượng lớn các giống hoa Lan (kể cả giống và cành hoa) từ Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc. Do đó giá thành của các cây giống còn rất cao. Nếu đầu tư một vườn Lan với diện tích tối thiểu khoảng 1000m2 nhà lưới thì số lượng cây giống đầu tư trung bình là 4000 cây, giá trị cây giống lên tới 160 – 200 triệu đồng chưa kể giá thành nhà lưới và vật tư cần thiết khác từ 60 - 80 triệu đồng/1000m2 nhà lưới. Chi phí ban đầu cho cây giống hoa Lan Dendrobium là rất cao. Do đó việc giảm giá thành cây giống để cung cấp cho người sản xuất, mở rộng diện tích đang là vấn đề nóng hiện nay.[8] Để giải quyết vấn đề này người ta áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, đây là kỹ thuật có thể nhân nhanh được hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như bố mẹ chọn lọc. Từ một cây mẹ ban đầu ta có thể nhân ra hàng ngàn cây con có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. Mặt khác, cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời giảm tác hại cho cây giống và đem lại hiệu quả thiết thực trong việc nâng cao chất lượng cây giống và giảm giá thành. Chính vì vậy nên tôi chọn đề tài: “Nhân nhanh invitro hoa Dendrobium ” nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về quy trình, phương pháp tiến hành của quy trình nhân nhanh giống hoa lan Dendrobium bằng phương pháp invitro. PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm sinh học của lan Dendrobium [1],[2] 1.1.1. Sự phân bố của Lan Dendrobium Dendrobium là giống Lan gồm hơn 1600 loài thuộc họ Orchdaceae, phân bố trên các vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu. Nếu như các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp của mình, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Dendrobium vô cùng phong phú. Điều kiện sinh thái cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào. Hình1.1. Dendrobium vàng tím 1.1.2. Đặc điểm hình thái + Rễ Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống như: - Khi sống ở đất thì rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn, mập hay mảnh mai đều giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng hấp thu chất dinh dưỡng trên vỏ cây gỗ, chúng được bao bởi một lớp mô hút ẩm dày, bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Ngoài ra, nó còn làm nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi gió cuốn đi. Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phù thuộc chung vào cơ thể. - Ở loài sống hoại sinh thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hút chất dinh dưỡng từ xác thực vật. Nhiều loài lại có hệ rễ đan thẳng thành một búi chằng chịt, nó là nơi thu gom mùn vỏ cây để làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng. + Thân Dendrobium thuộc nhóm đa thân ( sympodial), chúng vừa có thân thật vừa có giả hành. Gỉa hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Hình1.2. Dendrobium hồng đỏ + Lá Phong lan đều là cây tự dưỡng do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá, có rất nhiều lá dài và lá hình trụ. Về màu sắc, phiến lá thường có màu xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau, mặt trên lại khảm thêm nhiều màu sặc sở. + Hoa Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa cô độc. Các chồi hoa không những mọc trên các giả hành mới mà có thể mọc trên giả hành cũ. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa, mang phần đực ở phía trên và phần cái ở mặt trước. Cột này thường dài, thẳng hay cong về phía trước. Nhị gồm hai phần, bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy. Còn hốc phấn thì lõm lại, mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng do có tinh bột, sáp hay chất sừng. Vì thế giống Dendrobium là những loài hoa rất lâu tàn, trung bình từ 1-2 tháng. Hình1.3. Dendrobium Sonia + Qủa Qủa phong lan thuộc loại quả nang nở ra theo 3-6 đường nứt dọc. Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi vỏ này mục nát. Hình1.4. Dendrobium gibsonii + Hạt Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ bé, trọng lượng toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười đến một phần ngàn mg. 1.2. Môi trường và các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến cây Dendrobium 1.2.1. Nhiệt độ [7] Nhiệt độ ảnh hưởng rất nhiều đến sự tăng trưởng của Lan Dendrobium. Vào mùa hè Nhiệt độ cao cây phát triển nhanh hơn cho nên cần nhiều độ ẩm và nước. Phần lớn các cây này thích hợp với nhiệt độ ban đêm vào khoảng 10-16°C và ban ngày vào khoảng 21-32OC. Nếu nhiệt độ ở ngoài trời cao hơn chúng ta nên tưới cây thường xuyên hơn, cây sẽ không bị tình trạng căng thẳng (stress) hay nóng cháy.Vì đa dạng về chủng loại nên mỗi loài Dendrobium cần một nhiệt độ nhất định. + Đối với nhóm Dendrobium ưa lạnh, chúng sẽ sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ lý tưởng là 15OC, những giống này được lấy từ các vùng cao nguyên của Việt Nam và Myanmar trên độ cao 1000m như các loài Vảy Cá (Dendrobium Linlleyi), Thủy Tiên Tím (Dendrobium amabile), Long Nhãn Kim Điệp (Dendrobium fimbriatum). Các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25OC, thì cây vẫn sống, nhưng phát triển yếu hơn và hiếm bao giờ ra hoa. + Đối với nhóm Dendrobium ưa nóng, gồm đa số các giống Dendrobium rừng của Châu Úc, Indonexia, Malaixia và các loài của giống Dendrobium lai hiện được trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam, nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25OC. Tuy nhiên các giống Dendrobium lai chịu được một nhiệt độ cao hơn nhiều. + Đối với nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng lạnh và vùng nóng. Ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn. Ví dụ các loài Dendrobium Primulinum, Dendrobium fanmeri, Dendrobium chrysotoxum, nhiệt độ lý tưởng của các loài này là 20OC. Hình1.5. Dendrobium Caesar 1.2.2. Độ ẩm [7] Độ ẩm thích hợp giúp cho cây được phát triển nhanh hơn, hoa cũng tươi tốt và lâu tàn. Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều kiện không khí ẩm và thoáng, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40-60%, vào ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn. Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobium vì có thể toàn bộ rễ bị thối và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân.Với độ ẩm cao, lá cây và rễ cây sẽ có thể hút hơi nước trong không khí khi cần thiết. 1.2.3. Tưới nước [7] Nước rất quan trọng cho cây để tăng trưởng. Vào mùa hè cây cần nước nhiều hơn là mùa đông. Nếu thiếu nước cây sẽ không phát triển và có thể bị chết khô. Nhìn thấy thân cây hoặc lá cây bị nhăn nheo, chúng ta biết là cây bị thiếu nước. Vào mùa hè chúng ta có thể tưới 2 lần một tuần, nếu trồng trong chậu nhựa, còn mùa đông chỉ tưới mỗi tuần một lần là đủ. Tưới quá nhiều nước, cây sẽ bị úng thủy, thối rễ và tạo cho cây dễ bị nhiễm trùng hoặc nhiễm nấm rồi chết. Riêng đối với những giống Dendrobium được trồng ở TPHCM thì chu kỳ tưới nước lại khác hơn: từ tháng 5 đến tháng 11 tưới nước 2 lần/ngày, từ tháng 12 đến tháng 2 tưới nước 3 lần/ngày và từ đầu tháng 3 đến cuối tháng 4 tưới nước 1 lần/ngày. Sự thay đổi các điều kiện sinh thái trong mùa nắng và mùa mưa là nguyên nhân chính quyết định sự ra hoa của loài Dendrobium. 1.2.4. Ánh sáng [9] Dendrobiun là giống ưa sáng nên có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay khuếch tán ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%, vì thế giàn che với độ che sáng 30% dưới đấtt và 40% ở trên cao với cường độ ánh sáng từ 15.000-30.000 lm/m2 rất thích hợp cho sự phát triển của Dendrobium. Các chậu Dendrobium được treo trong giàn không nên quá gần nhau, mà phải có khoảng cách 25cm cho các loài có dạng lớn và 15cm cho các loài có dạng nhỏ, nhằm mục đích tạo cho cây có đầy đủ ánh sáng và độ thoáng. Nếu có đầy đủ giống, ta nên trồng một loài Dendrobium đồng nhất trong giàn, hoặc nếu một giàn trồng nhiều giống khác nhau nên chọn những cây cùng kích thước (để sự phân bố ánh sáng được điều hòa) và những cây cùng tuổi (để việc sử dụng phân bón dễ dàng hơn). Dendrobiun có thể trồng dưới ánh sáng trực tiếp cây vẫn phát triển tốt, tuy nhiên để ngăn ngừa trường hợp cây bị bỏng lá, ta phải tập cho các cây thích nghi từ từ và các chậu khi trồng phải treo hởi khít vào nhau. Đối với các loài thuộc giống Dendrobium, phải nên nhớ, thà rằng cây bị bỏng lá vì thừa ánh sáng hơn là thiếu. Thiếu ánh sáng đối với các loài thuộc giống này sẽ gây ra sự thoái hóa rõ rệt, số lượng hoa cũng rất ít, cây èo ọt. Trái lại, thừa ánh sáng đối với các loài thuộc giống Dendrobim, chỉ làm cho cây xấu đi vì lá quá vàng hoặc các giả hành trơ trụi, nhưng cây sẽ thích nghi dần và vẫn đảm bảo cây ra hoa nhiều và đẹp. Dù sao điều kiện ánh sáng lý tưởng vẫn cho kết quả tối nhất. Hình1.6. Giàn che của vườn trồng lan Dendrobium 1.2.5. Nhu cầu phân bón [9] Dendrobim thân đứng là loài lan đòi hỏi dinh dưỡng cao, vì thế chúng cần rất nhiều phân bón và có thể dùng rất nhiều dạng phân bón khác nhau.Còn các loại Dendrobium thân thòng ăn phân yếu phải dùng nồng độ thật loãng. Phân heo có thể dùng rất tốt bằng dạng tưới pha thật loãng hay phân khô vò chặt thành từng viên dài đặt phía trên bề mặt giá thể. Phân bánh dầu khô cũng được dùng hữu hiệu bằng cách ngâm nước rồi pha thật loãng để tưới hay dùng thắng từ viên bánh dầu khô: dùng đầu ngón tay đặt cách xa giả hành khoảng 5cm. Rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới bước. Một số các loại phân hữu cơ khác cũng được dùng như phân tôm cá, phân trâu bò khô… Các loại phân vô cơ được dùng, thường có công thức N-P-K 30-10-10 dùng 3 lần/1 tuần với nồng dộ 1 muỗng cà phê/lít. Trong suốt mùa tăng trưởng (từ đầu tháng 5 đến cuối tháng 1) một tháng trước khi bước vào mùa nghỉ (trong suốt tháng 2) ta bón phân N-P-K 10-20-30 làm 2 lần/1 tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân N-P-K 30-10-10 bằng phân N-P-K 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn. Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kỳ tăng trưởng hằng năm của nó. Thường Dendrobium hoàn tất thời kỳ tăng trưởng vào tháng 9 đến tháng 10 khi mà những lá cuối cùng của nó thấy được trên đỉnh giả hành và thân. Thời kỳ tăng trưởng hoàn tất, cần giảm nước tưới và thức ăn từ từ cho đến khi không còn gì nữa trong một thời gian chừng 4 tuần, vào lúc này cây cần càng nhiều ánh nắng càng tốt- phối hợp với điều kiện khí hậu tháng 12 ngày ngắn và nhiệt độ mát nên những giống thay lá hằng năm chuẩn bị rụng lá để hình thành phát hoa. Các giống không thay lá ít biểu lộ hơn và thường chỉ rụng một đến hai lá ở các giả hành và thân già ít khi các nhà vườn trồng lan, dùng các loại phân riêng rẽ, thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp gồm vô cơ, và đôi khi những chất phụ gia là các loại sinh tố và các nguyên tố vi lượng. 1.2.6. Cấu tạo giá thể [9] Mặc dù rất dễ chịu về điều kiện ánh sáng nhưng Dendrobium rất nhạy cảm khi cấu tạo giá thể không thích hợp. Chậu trồng Dendrobium phải là những chậu có những lỗ nhỏ để tạo độ thoáng và giúp cho cây không bị úng. Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc giống Dendrobium có thể dùng giá thể hơi ẩm nhưng không làm thối căn hành. Dễ chịu hơn lan Hồ Điệp, giá thể dành cho Dendrobium là loại dễ kiếm, rẻ tiền: xơ dừa (phải được ngâm thuốc chống mốc trước khi sử dụng). Và không nên tưới nước nhiều, như thế sẽ làm cây bị thối vì quá ẩm. Tuy nhiên cũng có người dùng nguyên trái dừa như một cái chậu làm giá thể cho cây, khoét một lỗ dưới đáy trái dừa để tạo độ thoáng cho cây. Nhưng giá thể tốt nhất dành cho Dendrobium là than. Hình1.7. Gía thể trồng lan Dendrobium 1.2.7. Thay chậu [9] Dendrobium là một giống lan rất nhạy cảm khi cấu tạo giả thể không thích hợp cho việc phát triển của nó và biểu hiện là một số cây con mọc trên ngọn thân của các giả hành. Khi có điều này xảy ra phải tiến hành thay chậu , vì chắc chắn các giá thể trong chậu đã bị hư. Hiện tượng này là do cấu tạo một giá thể quá ẩm như xơ dừa. Chỉ một thời gian ngắn thay giá thể, xơ dừa bị mục và lắng xuống đáy chậu tạo thành một lớp mùn úng nước. Chính vì thế các rễ hoàn toàn trong điều kiện úng nước sẽ bị thối toàn bộ. Ngoài ra dính lớp mùn là điều kiện sinh sống thuận lợi của các côn trùng các loài này tác động cùng với sự bất lợi vì thừa nước, cắn phá toàn bộ rễ của cây lan. Do bản năng sinh tồn cây lan sẽ phản ứng bằng cách mọc ra một số cây con trên ngọn để duy trì nòi giống. Quan sát hiện tượng các cây con mọc trên chồi ngọn cũng sẽ giúp các nhà vườn kiểm tra xem cách trồng như thế đã hợp lý chưa? Nhất là về điều kiện nước tưới và bón phân. Ngoài ra với chu kỳ 2 năm một lần, ta nên thay chậu vì trong quá trình sinh trưởng, ít nhiều chậu bị đóng rêu, giá thể bị hư hao, cây mất cân đối. 1.3. Một số sâu bệnh và cách phòng trị [9] + Gián và cuốn chiếu Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng. Đây là 2 nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại cho các loài dán và con tiêu cắn phá rễ trong giá thể. + Một loại rệp màu vàng Chúng thường xuất hiện trên bề mặt lá cây, có kích thước rất nhỏ như đầu cây tăm, chúng có tác hại sẽ hút nhựa cây làm cho cây thiếu sự sống. Đối với những loài côn trùng như thế ta chỉ cần dùng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500 là có thể tiêu diệt chúng. b) a) Hình1.8. Một số hình ảnh về rẹp vàng phá hại hoa lan Dendrobium + Nấm và virut Khi cây không được vệ sinh kỹ lưỡng ta sẽ thấy xuất hiện nấm trên thân cây. Hoặc khi thấy cây bị khô thân ở gần gốc và giả hành làm cho giả hành khô và chết thì lúc đó cây đã bị virut tấn công. Để ngừa bệnh ta nên dùng những loại thuốc trị nấm như Topsil, Zineb, Bencmyl với nồng độ 1/400, chu kỳ phun là ½ tháng phun 1 lần. + Bệnh thối giả hành Cây Dendrobium cũng thường bị bệnh này do quá ẩm, bị nấm mốc làm giả hành bị thối mềm nhũn, thường ở rễ gốc rồi cả giả hành. Nên cắt bỏ những giả hành bị thối, bôi thuốc trừ nấm Zineb, Alliette hoặc ViCarben vào chổ vết cắt và xịt thuốc cho cả giàn lan, để tránh lây lan sang cây khác. + Bệnh virut Đối với Dendrobium thì ít có, nhưng khi bị bệnh thì lá có nhiều đốm. Cần để riêng chúng ra để tránh lây lan qua cây kế cận, cắt bỏ hết chỗ bị bệnh rồi xịt thuốc kháng sinh như Streptomicine, pénéciline. Nếu không khỏi, tốt nhất là nên đốt bỏ (vì chưa có thuốc đặc trị). Nên phòng bệnh hơn trị bệnh, cho nên nhất thiết phải vệ sinh môi trường, không nên mua cây lan bi bệnh về trồng chung, dễ bi lây bệnh. 1.4. Gía trị kinh tế, tình hình sản xuất lan Dendrobium ở Việt Nam và trên thế giới 1.4.1. Tình hình sản xuất lan Dendrobium ở Việt Nam [7] Ở Việt Nam, lan là một loại thực vật đa dạng trải dài từ Bắc vào Nam nên từ lâu đã được trồng làm cảnh trong nhà. Gần đây, một số nhà vườn đã trồng và cung cấp lan Dendrobium cắt cành cho thị trường trong nước. Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm 5 – 6 %. Mặt khác, hiện nay trong nước chưa có hệ thống sản xuất và cung cấp quy mô lớn mà chỉ nhân giống theo phương thức cổ truyền từ hạt, mầm, củ và lai. Tuy giá thành rẻ và dễ làm nhưng chất lượng giống không cao, dễ nhiễm bệnh, cây phát triển không đồng đều về chất lượng nên không thể cạnh tranh với các nhà vườn Thái Lan, Singapore. Hơn nữa, TS Trần Viết Mỹ - Giám đốc trung tâm nghiên cứu KHKT nông nghiệp và khuyến nông TP. Hồ Chí Minh cho biết: do nguồn lan cắt cành trong nước không đủ nhu cầu nên mỗi tuần Thành Phố phải nhập hơn 20.000 cành từ Thái Lan. Với giá 4000đ/cành thì mỗi năm, Thành Phố phải chi khoảng 4 tỷ đồng nhập lan cắt cành. Giống hoa lan đang là khoảng trống lớn, giá giống lan hiện nay khá cao (45.000 – 50.000đồng/cây). Các doanh nghiệp, công ty giống, viện nghiên cứu vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước. Chỉ riêng nhập từ Thái Lan khoảng 40.000cây/tháng thì ta đã tốn bạc tỷ để nhập giống lan. Đây là một thực tế chưa có hướng giải quyết. TS Dương Hoa Xô – Giám đốc trung tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh trăn trở, việc phụ thuộc nguồn giống từ Thái Lan, Đài Loan là một bất cập trong khi tiềm năng nhân giống, cấy mô hiện nay của thành phố còn bỏ ngõ. Nhân giống phục vụ thị trường nội địa, tham gia vào chương trình phát triển hoa lan đang là yêu cầu cấp bách. Hiện TP Hồ Chí Minh có 50 ha trồng hoa lan, trừ các địa phương còn khó khăn trong vấn đề nước ngọt, còn lại đều thuận lợi phát triển hoa lan. Lan cắt cành thuộc nhóm Dendrobium và Mokara hiện được trồng nhiều do lợi nhuận từ hai loài này khá cao, có thể đạt thu nhập trên 1 tỷ dồng/ha. Chương trình phát triển hoa, cây kiểng, TP Hồ Chí Minh giai đoạn 2004 – 2010 đã được Sở Nông nghiệp – phát triển nông thôn TP Hồ Chí Minh thông qua với mục tiêu TP Hồ Chí Minh phấn đấu đạt kim ngạch sản xuất hoa kiểng 15 triệu USD vào năm 2010. Để phấn đấu đạt mục tiêu trên, TP Hồ Chí Minh đã đề ra các giải pháp: Xây dựng, quy hoach tổng thể các làng, phố hoa, kiểng, các chợ đầu mối giao dịch về hoa kiểng, và tạo điều kiện mở rộng hoạt động nghiên cứu khoa học kĩ thuật về ngành này. Áp dụng công nghệ sinh học lai tạo giống mới, chất lượng cao và các phương pháp kỹ thuật canh tác cải tiến. Trại giống Đồng Tiến ở quận 12, có diện tích 28 ha sẽ là siêu thị nông nghiệp và trung tâm nghiên cứu công nghệ sinh học. Hiện nay đã có nhiều nhà vườn lớn và công ty liên doanh ứng dụng các kĩ thuật hiện dại nhằm hỗ trợ cho việc sản xuất giống như kĩ thuật nuôi cấy mô phân sinh và kĩ thuật gieo hạt vô trùng. Ngoài ra, các kĩ thuật hỗ trợ cũng được quan tâm: * Kỹ thuật ươm trồng lan: là một kĩ thuật khó trong quy trình công nghệ, bao gồm việc sản xuất cung ứng vật tư ươm trồng lan và kĩ thuật ươm trồng tiến. * Kĩ thuật nâng cao phẩm chất của hoa. * Kĩ thuật sử dụng nhà ấm. * Kĩ thuật làm compost và phân bón là một lợi thế do Việt Nam có nguồn phế thải thực vật như xơ dừa, bã mía… sẽ được xử lý làm giá để ươm trồng giống lan. 1.4.2. Tình hình sản xuất lan Dendrobium trên thế giới [14] Nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng ngày càng tăng, tỷ lệ hàng năm của ngành sản xuất hoa thế giới 10% dạt khoảng 49tỷ USD. Một số nước như Thái Lan, Singapore, Hawaii xem lan là một trong những mặt hàng đem lại nguồn kim ngạch xuất khẩu lớn. Trong đó Dendrobium được chọn làm giống chủ đạo trong ngành sản xuất lan cắt cành có những ưu điểm sau: - Siêng bông, cho nhiều cành hoa, số lượng hoa trênh một cành nhiều (tối thiểu 10 hoa/cành). - Số lượng loài rất lớn nên chủng loại sản phẩm đa dạng, dể thay đổi theo thị hiếu của thị trường nên dạng hoa cắt cành này rất được ưa chuộng trên thị trường Châu Á. Ngoài ra, Dendrobium còn được dùng vào các mục đích sau: - Thân cây dùng để làm rỗ ở Phillippines, Indonesia và New Guinea giả hành của Dendrobium tokai đã được sử dụng như thuốc tránh thai. - Một bộ tộc ở Indonesia dùng lá Dendrobium sallacense nấu với cơm như người Việt Nam ở đồng bằng song Cửu Long dùng lá dứa. Lá, giả hành còn được dùng làm trà hay lấy sợi trong thân làm thành kiềng đeo tay… Hình1.9. Hình ảnh pha trà của lan Dendrobium 1.5. Phương pháp nhân giống lan Dendrobium 1.5.1. Phương pháp cắt đoạn thân Dendrobium [9] a/ Các cây con mọc trên ngọn thân thì phương pháp nhân giống đơn giản.Tách rời cây con khỏi thân cây mẹ bằng một vết cắt chỗ tiếp giáp. Với cách cắt như trên cây sẽ không đảm bảo tỷ lệ sống, nên vội vàng cắt thêm một đoạn thân cây mẹ. Thật ra không có sự khác biệt nhiều về sự tăng trưởng giữa cây cắt ngay chỗ tiếp giáp và cây cắt với một đoạn thân cây mẹ. Do đó một việc làm như vậy là lãng phí, vì trên đoạn thân cây mẹ này có thể cho thêm vài cây con nữa trong tương lai. Thực tế chứng minh rằng với 1 giả hành Dendrobium, nhiều khi có thể cho đến 15 cây con. Điều quan trọng là nên cắt cây con vào thời điểm nào? Đối với các loài Dendrobium mạnh như Dendrobium Caesar Alba, Dendrobium Caesar Latil, Dendrobium Popadour có thể cắt cây con, khi giả hành cây con trưởng thành, mọi sự cắt quá non đều cho những kết quả không tốt. Đối với các loài yếu hơn như Dendrobium Jacqueline Thomas, Dendrobium Theodore Takiguchi… ta có thể đợi cây con mọc thêm một giả hành mới, thì việc nhân giống bảo đảm hơn. Vì vậy ta nên có sự chọn lựa thật kỹ càng: nếu để cây con, thì cây mẹ sẽ yếu sức và ngược lại việc lấy cây con quá non sẽ có tỷ lệ tử vong cao. Ngoài ra Dendrobium là giống giả hành có thân, vì thế hư các mắt ngủ của căn hành không gây sự chết tuyệt đối ở cây như giống Cattleya và chính nhờ hiểu biết này, ta có thể nhân giống các giống Dendrobium quí một giả hành duy nhất vẫn đảm bảo cây sống. b/ Cực đoan hơn, Dendrobium có thể nhân giống bằng cách cắt từng đoạn thân mang khoảng 2 mắt một, nhúng 2 đầu đoạn cắt, vào parafm hoặc bôi son, vôi… Đặt các đoạn nằm ngang, trên mặt cát ẩm, che lại bởi một lồng kính, ba lần/ngày phun một lần dung dịch urê, 1 muỗng cà phê / 4 lít nước, cộng thêm cả sinh tố B1, với một nồng độ 10 phần triệu (10 ppm) trong thời gian 2 tuần liên tục. Sau đó chỉ phun mỗi dung dịch nửa muỗng cà phê trong 4 lít + sinh tố B1 cho đến khi cây mọc các cây con. Phun hàng tuần trong các tuần kế tiếp. Hình1.10. Nhân giống Dendrobium bằng cắt đoạn thân 1.5.2. Phưong pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng [3],[4],[5],[12] 1.5.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu Để thuận tiện cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ta chọn các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới nhú lá . 1.5.2.2. Phương pháp khử trùng Rửa sạch chồi Dendrobium dưới vòi nước chảy. Dùng dao mổ lột sạch các lá non bao xung quanh chồi cho đến khi để lộ chồi ngọn. Dùng gòn lau nhẹ lên thân chồi, ngâm chồi trong xà bông loãng trong 10 phút, rửa cho sạch xà phòng dưới vòi nước. Trong tủ cấy, ngâm chồi vào cồn 70 độ trong 1 phút, sau đó cho chồi vào becher có chứa dung dịch javel có nồng độ (1 thể tích javel: 4 thể tích nước cất vô trùng) trong 10 phút, lắc đều tay. Dùng kẹp vô trùng cho chồi vừa được khử trùng vào becher vô trùng, rửa các chồi này bằng nước cất vô trùng cho sạch javel (rửa 3 lần). Cắt bỏ các mô chết phần gốc chồi, tách bỏ các lá bên bằng kim mũi nhọn để có được một đỉnh chồi mang 4 – 5 tiền phát khởi lá, cấy từng chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường. Dùng viết aceton ghi rõ tên giống, ngày cấy, tên môi trường nuôi cấy. Đặt tất cả vào phòng nuôi và qua sát. Hình1.11. Sơ đồ cắt dọc đỉnh sinh trưởng Dendrobium 1.5.2.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Môi trường nuôi cấy: thường môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơn giản + Môi trường khoáng MS (1962) có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng BA 1mg/l và NAA 0.1 mg/l. + Các chất chiết từ trái cây như nước dừa 10%, khoai tây. - Kết quả Sau 10-12 tuần nuôi cấy, các đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn nhỏ gọi PLB (protocorm like body). Để có được số lượng lớn PLB làm nguồn mẫu để phục vụ sản xuất. Các PLB này được tách ra thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường kích thích nhân nhanh PLB, tuy nhiên chúng cũng dễ dàng tái sinh chồi ngay trên chính môi trường nhân nhanh. Vì vậy để có cây con hoàn chỉnh cần tách các chồi riêng lẻ rồi cấy lên môi trường kích thích ra rễ, cây con có thể xuất vườn sau 4-5 tháng nuôi cấy. 1.5.3. Phương pháp nuôi cấy mô phát sinh hoa tự Dendrobium [6],[11],13],[15] Tóm tắt: Sự ra hoa của Dendrobium sp. liên quan đến sự chuyển tiếp mô phân sinh dinh dưỡng tạo lá và thân sang mô phân sinh sinh dục tạo hoa. Mô phân sinh hoa tự là vị trí phát sinh cơ quan liên tục với một vùng nhỏ các tế bào gốc đa năng. Đời sống và hoạt động của mô phân sinh hoa tự liên quan đến số nụ hoa trên phát hoa được quan sát bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường Ma có bổ sung zeatin 1mg/l, AIA 0,5mg/l và GA3 1mg/l. Với BA 5mg/l, mô phân sinh hoa tự của phát hoa tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vì tiếp tục tạo phát hoa. Mục đích nuôi cấy mô phân sinh hoa tự: là tìm hiểu khả năng duy trì hoạt động (kéo dài đời sống ) của mô phân sinh hoa tự và qua đó làm gia tăng số nụ hoa trên phát hoa. 1.5.3.1 Vật liệu Phát hoa Dendrobium sp. ở các giai đoạn phát triển: - Giai đoạn 1: phát hoa thành lập sau 3-5 ngày (chiều dài 1-3 cm) - Giai đoạn 2: phát hoa thành lập sau 11-13 ngày (chiều dài 10-13 cm) - Giai đoạn 3: phát hoa thành lập sau 30-32 ngày (chiều dài 28-32 cm) 1.5.3.2 Phương pháp a/ Nuôi cấy khúc cắt phát hoa trên môi trường đặc Các khúc cắt (khoảng 2cm) ở các vị trí đốt 1-4 (tính từ gốc phát hoa) được đặt trên môitrường Ma (Chatelet 1992) có bổ sung AIA 0,1: 0,5mg/l, zeatin 0,5: 1 mg/l, GA3 0,5:1mg/l Science & Technology Development, Vol 9, No.9- 2006 hoặc BA 5mg/l. b/ Nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường đặc Mô phân sinh hoa tự ở vị trí số 8, kích thước 200-300μm được cô lập từ phát hoa ở 3 giai đoạn phát triển của phát hoa và được đặt trên môi trường Ma có bổ sung IAA 0,5 mg/l, zeatin 0 : 0,5: 1 và 2 mg/l (riêng rẽ hoặc kết hợp). Tỉ lệ khúc cắt không bị hóa nâu (còn sống và hoạt động) được quan sát. c/ Nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trong môi trường lỏng Mô phân sinh hoa tự ở vị trí số 8, kích thước 200-300μm được cô lập từ phát hoa ở giai đoạn 2 và được đặt vào Erlen 50ml chứa 5ml môi trường Ma lỏng với zeatin 1mg/l kết hợp AIA 0,1; 05 mg/l hay với GA3 1mg/l(lắc liên tục với tốc độ 80 vòng/phút). Sự nuôi cấy in vitro được thực hiện ở các điều kiện chiếu sáng 2500lux±500lux, 12 giờ/ngày, nhiệt độ 280C ± 20C, ẩm độ 55% ± 5%. Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 mẫu. 1.5.3.3. Kết quả a/ Hoạt động của mô phân sinh hoa tự trong sự phát triển của phát hoa. Ở giai đoạn 1 của phát hoa, mô phân sinh hoa tự gần giống mô phân sinh dinh dưỡng với đỉnh nhọn và các phác thể lá bắc.Trể hơn trong giai đoạn , ở nách lá bắc đầu tiên đã xuất hiện các mô phân sinh hoá. Giai đoạn 1 kéo dài khoảng hơn10 ngày. Ở giai đoạn 2 của phát hoa, mô phân sinh hoa tự hoạt động mạnh, phát hoa kéo dài số nụ tăng. Cuối giai đoạn này phát hoa đã có khoảng 5 nụ hoa, các mô phân sinh hoa mới nhất (gần bên dưới mô phân sinh hoa tự) xuất hiện từ vùng ngoại vi của mô phân sinh hoa tự. Giai đoạn 2 kéo dài khoảng 15 ngày. Ở giai đoạn 3, phát hoa thường đã có khoảng 5 nụ hoa hoàn chỉnh và 2 sơ khởi hoa đang phân hoá. Đỉnh nhọn gồm mô phân sinh hoa tự, đã hướng ngang theo cách đặc sắc và thường không tiếp tục phát triển. Sau sự hướng ngang này, mô phân sinh hoa tự và các nụ hoa non nhất héo và chết, trong khi trục phát hoa tiếp tục kéo dài các nụ hoa xuất hiện trước tiếp tục phân hoá và tăng trưởng. Giai đoạn 3 kéo dài khoảng 8 ngày. b/ Sự tạo mới phát hoa thứ cấp từ khúc cắt phát hoa Sau 2 tuần nuôi cấy, khúc cắt phát hoa (ở vị trí 1- 4) hoàn toàn không tạo mô phân sinh hoa tự trên các môi trường có IAA 0,5mg/l, zeatin 0,5-1mg/l hoặc GA3 0,5-1mg/l. Tuy nhiên, trên môi trường có BA 5mg/l, mô phân sinh hoa tự được cảm ứng (ở tuần thứ 2) và tiếp tục phát triển thành phát hoa ở tỷ lệ khúc cắt tạo mới phát hoa là 55% sau 4 tuần. Các phát hoa được tạo mới này cho những nụ hoa đầu tiên sau 8 tuần. c/ Nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường đặc Sau 2 tuần nuôi cấy, mô phân sinh hoa tự ở giai đoạn 3 hoá nâu và không tiếp tục phát triển. Tuy nhiên, mô phân sinh hoa tự ở giai đoạn 1 và giai đoạn 2 vẫn phát triển tốt nếu môi trường có bổ sung IAA 0,5 mg/l và zeatin 2mg/l cho tới sau 4 tuần nuôi cấy. Mô phân sinh hoa tự ở giai đoạn 2 khi được nuôi cấy trên môi trường này tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vì phát hoa. d/ Nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường lỏng Sau 4 tuần nuôi cấy, mô phân sinh hoa tự ở cuối giai đoạn 2 ngừng tăng trưởng trong môi trường Ma không hoocmon trong khi trong môi trường Ma có bổ sung AIA 0,5 mg/l và zeatin 1 mg/l GA3 1 mg/l mô phân sinh hoa tự hoạt động mạnh để kéo dài trục phát hoa và cho nhiều mô phân sinh hoá. Mô phân sinh hoa tự ở cuối giai đoạn 2 được nuôi cấy trong môi trường Auxin và Cytokinin có thể kéo dài đời sống được 8 tuần. PHẦN 2 QUY TRÌNH NHÂN NHANH LAN DENDROBIUM 2.1. Sơ đồ quy trình Khử trùng quả Môi trường thích hợp để gieo hạt Tạo protocorm Nguyên vật liệu(Mẫu quả gieo hạt) Nhân protocorm Ra rể Tạo cây hoàn chỉnh Chuyển cây ra vườn ươm 2.2. Thuyết minh quy trình [3] 2.2.1. Nguyên liệu, điều kiện gieo hạt trong ống nghiệm 2.2.1.1. Mẫu quả gieo hạt - Qủa lan Dendrobium dài từ 4-5 cm lấy từ cây ngoài thiên nhiên. 2.2.1.2. Môi trường nuôi cấy - Môi trường Knudson’C (1946), bổ sung thêm: + Nước dừa 15% + Than hoạt tính 0,5g/l + Đường 30g/l + Agar 8,5g/l + PH: 5,7-6 - Môi trường MS (1962), bổ sung thêm: + Than hoạt tính 15% + Glycin 0,5g/l + Myo-Inốitl 0,1g/l + Đường 30g/l + Agar 8,5g/l + PH: 5,5-5,7 - Sử dụng chai thuỷ tinh 100ml và 500ml để nuôi cấy. - Tất cả môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút. 2.2.1.3. Điều kiện nuôi cấy - Nhiệt độ phòng nuôi: 24-280C. - Cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux - Thời gian chiếu sáng 8h/ngày. - Ẩm độ trung bình: 60-70 %. 2.2.2. Khử trùng quả lan Dendrobium 2.2.2.1. Mục đích - Tìm ra phương pháp khử trùng thích hợp. - Tìm nồng độ Hypochloride calcium (Ca(OCl)2) và thời gian khử trùng thích hợp đối với quả lan. - Theo dõi sự biểu hiện của hạt + Tỷ lệ sống sau khi gieo. + Tình trạng hạt gieo: xanh, trắng … 2.2.2.2 Phương pháp và hoá chất sử dụng - Phương pháp đốt cồn. - Phương pháp hoá chất: dùng Ca(OCl)2. 2.2.2.3. Cách khử trùng - Mẫu lấy từ thiên nhiên sau đó ta đem đi: + Rửa mẫu dưới nước chảy khoảng 10 phút + Rửa mẫu bằng xà phòng pha loãng + Rửa lại nhiều lần bằng nước cất - Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng + Rửa mẫu bằng cồn 700C trong 1-2 phút. + Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng khoảng 2-3 lần. + Ngâm mẫu trong Ca(OCl)2 10% trong 10 phút. + Rửa lại nước cất vô trùng 2-3 lần. + Nhúng vào cồn 90O và hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn. + Nhanh chóng đặt quả lan vào đĩa petri và đậy nắp lại. + Sau đó quả lan sẽ được cắt gọt 2 đầu, và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan, tách làm 2. + Dùng dao giữ phần vỏ quả, dùng kẹp lấy hết hột ra một đĩa petri + Gieo hạt vào môi trường . 2.2.2.4. Kết quả - Những mẫu sống, không bị nhiễm, sau 1 tuần hạt dần chuyển sang màu nâu vàng mật ong. - Những mẫu bị ảnh hưởng bởi Ca(OCl)2, nhiệt độ cao thì hạt chuyển sang màu trắng , nâu đục không phát triển. 2.2.3. Môi trường thích hợp để gieo hạt 2.2.3.1. Mục đích Theo dõi thời gian hạt nảy mầm. 2.2.3.2. Môi trường gieo hạt - Môi trường MS không bổ sung kích thích tố, ký hiệu: MO - Môi trường MS bổ sung 1ppm BA, ký hiệu: M1 - Môi trường Kundson’C không bổ sung kích thích tố, ký hiệu: KO - Môi trường Kundson’C bổ sung 1ppm, ký hiệu: K1. 2.2.3.3. Cách tiến hành - Các quả lan đã được khử trùng ở giai đoạn khử trùng ta sẽ đem di gieo vào 4 loại môi trường MO, M1, KO, K1. - Sau 2-4 tuần ta thấy ở các quả lan đã xuất hiện sự nảy mầm. - Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, mỗi lần 15 chai 100ml. 2.2.3.4. Kết quả - 1tuần sau khi gieo vào môi trường, tất cả mẫu hạt đều hoá nâu vàng - Sau 2 tuần, mẫu bắt đầu nảy mầm. - Sau 4 tuần, những hạt có màu hơi vàng, dần chuiyển sang xanh do tiếp xúc với ánh sáng tạo diệp lục tố, nên phình to hơn. 2.2.4. Tạo protocorm 2.2.4.1. Mục đích Trên 2 môi trường khác nhau, cùng bổ sung nồng độ kích thích tố ta so sánh sự thành lập protocorm. 2.2.4.2. Môi trường nuôi cấy - Môi trường MS không bổ sung kích thích tố, ký hiệu: MO. - Môi trường MS bổ sung 2ppm BA, ký hiệu: M2. - Môi trường Knudson’ C không bổ sung kích thích tố, ký hiệu KO. - Môi trường Knudson’ C bổ sung 2ppm BA, ký hiệu K2. 2.2.4.3. Cách tiến hành - Sử dụng những mầm hạt đã phình to ra, có màu xanh, không bị nhiễn từ giai đoạn ở môi trường gieo hạt, ta cho vào môi trường nuôi cấy trên. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 8 chai 100ml. - Sau 2-4 tuần nuôi cấy nhằm tạo protocorm. 2.2.4.4. Kết quả - Sau 2 tuần hạt gieo bắt đầu biến đổi tạo thành 1 đám tế bào có màu xanh. - Số lượng protocorm ngày càng tăng nhanh sau 3-4 tuần, chúng phình to lên. 2.2.5. Nhân nhanh protocorm 2.2.5.1. Mục đích - So sánh sự nhân protocorm trên cùng một loại môi trường với nồng độ kích thích tố thay đổi. - Môi trường nhân nhanh protocorm bật chồi tốt nhất thời gian ngắn nhất cho cây có chiều cao 2-3 cm và có 2-3 lá. 2.2.5.2. Môi trường nuôi cấy - Môi trường Knudson’ C không bổ sung kích thích tố, ký hiệu KO. - Môi trường Knudson’ C bổ sung BA với nồng độ 1ppm:2ppm:3ppm, ký hiệu K1, K2, K3. - Môi trường Knudson’ C bổ sung 200ppm BA và IAA với nồng độ 0,1ppm : 0,5ppm : 1ppm, ký hiệu K4, K5, K6. 2.2.5.3. Cách tiến hành - Sử dụng các protocorm được tạo thành từ giai đoạn tạo protocorm. - Chờ thu nhận kết quả sau 2-4 tuần nuôi cấy. - Lặp lại thí nghiệm 3 lần, mỗi lần 3 chai 500ml. d/ Kết quả - Sau 2 tuần, bắt đầu xuất hiện protocorm mới, có lông hút, số lượng và kích thước thay đổi tuỳ theo môi trường. - Sau 3 tuần, có 1 số protocorm bật chồi mới. - Sau 4 tuần các chồi mới phát triển mạnh. 2.2.6. Ra rể 2.2.6.1 Mục đích - Tìm môi trường thích hợp cho sự ra rể. - Quan sát chiều dài ra rể - Sự tăng trưởng chiều cao của cây. 2.2.6.2. Môi trường - Môi trường Knudson’ C không bổ sung kích thích tố, ký hiệu KO. - Môi trường Knudson’ C bổ sung NAA với nồng độ 0,1ppm : 0,5ppm : 1ppm, ký hiệu là KN1, KN2, KN3. - Môi trường Knudson’ C bổ sung IAA 0,1ppm : 0,5ppm : 1ppm, ký hiệu là KI1, KI1, KI3. 2.2.6.3. Cách tiến hành - Những cây con có chiều cao từ 2-4 cm và 2-3 lá tạo thành từ giai đoạn nhân protocorm. - Lặp lại thí nghiệm 3 lần, mỗi lần 3 chai 500ml. - Sau 3-4 tuần nuôi cấy ta ghi nhận được kết quả ra rễ. 2.2.6.4. Kết quả - 2 tuần sau khi cấy vào môi trường ra rễ, cây bắt đầu tăng chiều cao và ãê xuất hiện. - Sau 4 tuần rễ phát triển mạnh, tuy nhiên sự phat mạnh hay yếu còn tuỳ thuộc vào từng loại môi trường. 2.2.7. Tái sinh cây invitro hoàn chỉnh [10] Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị đưa cây ra vườn ươm. Các thể chồi sẽ được đưa sang môi trường tạo rễ (chứa nhiều auxin). Điều kiện nuôi cấy gần như giống với môi trường bên ngoài, giúp cây có thể thích nghi tốt sau khi chuyển ra vườn ươm. Giai đoạn này mất khoảng 4-5 tháng để từ thể chồi sang cây con. 2.2.8. Chuyển cây con invitro ra vườn ươm [10] Cây cao khoảng 4-5 cm, là và bộ rễ phát triển đầy đủ thì có thể chuyển ra vườn ươm được. Cây con được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và đặt trong chậu có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp…để cây có thể thích nghi từ từ. Sau khoảng 2 tuần cây đã quen với điều kiện bên ngoài lúc đó có thể tăng cường chiếu sáng và hạ độ ẩm. Giai đoạn này cây thường bị chết rất nhiều do sự khác biệt giữa môi trường nhân tạo và tự nhiên. Để hạn chế cần phải giữ ẩm tốt cho cây có thể phun sương nhiều lần hoặc tưới thuốc ra rễ cây mau thích nghi hơn. PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.1. Kết luận Sau khi trình bày một số phương pháp nhân nhanh hoa Dendrobium sạch bệnh bằng phương pháp in vitro, tôi thấy phương pháp sử dụng đỉnh sinh trưởng là phương pháp cho hiệu quả cao hơn so với những phương pháp khác. Phương pháp này có ưu điểm là tạo ra cây con sạch bệnh, khả năng nhân giống nhanh.Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, việc nuôi cấy mô ta cần phải thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quy trình, và phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt.Bên cạnh đó, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vào nhân nhanh invitro là tiến bộ kỹ thuật đặc biệt sẽ góp phần giải quyết vấn đề nguồn giống cho nước ta, tiết kiệm chi phí mua giống và nâng cao quy mô sản xuất hoa phong Lan từ quy mô nhỏ lẻ, hộ gia đình lên quy mô công nghiệp. Thành công của kỹ thuật nhân nhanh hoa Dendrobium invitro còn tạo ý nghĩa thực tiễn to lớn cho xã hội. Tuy nhiên các phương pháp còn lại nếu ta sử dụng môi trường và phương pháp thích hợp ta cũng có kết quả thuận lợi. - Đối với phương pháp nuôi cấy mô phân sinh hoa tự: Các kết quả nghiên cứu trên Dendrobium sp. vừa được trình bày trong tổng quan tài liệu chứng tỏ: + BA 5mg/l có thể cảm ứng sự tạo mới mô phân sinh hoa tự và có thể giúp mô phân sinh hoa tự tạo cụm chồi dinh dưỡng. + Mô phân sinh hoa tự ở cuối giai đoạn 2 có thể kéo dài đời sống tới trên 5 tuần khi được nuôi cấy với môi trường Ma có bổ sung zeatin 1mg/l, IAA 0,5mg/l và GA3 1mg/l. - Đối với phương pháp nhân giống invitro mà tôi chọn trong phần thuyết trình của mình cũng có 1 số kết quả sau: + Môi trường MS có 1ppm BA cho sự nảy mầm của hạt lan Dendrobium tốt hơn so với môi trường Kundson’C. + Sự tạo protocorm trong môi trường Kundson’C có bố sung kích thích BA là tốt nhất + Đối với thí nghiệm nhân protocorm sử dụng môi trường Kundson’C bổ sung 2ppm BA và 0,5 ppm IAA thì sẽ tạo thành nhiều chồi hơn, có chiều cao và kích thích cho sự ra rễ sau đó. + Môi trường tốt nhất cho sự ra rễ Dendrobium là Kundson’C có bổ sung 0,5 ppm NAA. Trong thời gian thực hiện đồ án chuyên môn này, tôi đã tiếp thu được một số kiến thức về ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhân giống cây trồng nói chung và hoa Dendrobium nói riêng. Tuy nhiên để hoàn thành được đồ án này tôi đã được sự tận tình giúp đỡ của thầy Nguyễn Hữu Nhân, thầy đã giúp tôi từng bước trong việc thu thập, tổng hợp tài liệu. Với sự chỉ dẫn nhiệt tình của thầy tôi đã hoàn thành được đề tài: “ nhân nhanh invitro hoaDendrobium”. 3.2. Đề nghị Trong quá trình thực hiện đồ án này tôi đã gặp rất nhiều những tài kiệu liên quan đến việc nhân giống invitro hoa Dendrobium. Tôi hy vọng và mong chờ các nhà khoa học sẽ tiếp tục nghiên cứu để tìm ra môi trường thích hợp cho sự nhân nhanh và sinh trưởng trên các loài khác thuộc giống Dendrobium. Cuối cùng tôi xin cảm ơn nhà trường và khoa công nghệ lương thực thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đồ án này. Trong quá trình thực hiện đề tài sẽ không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế về mặt kiến thức.Vì vậy, tôi mong các bạn cùng thầy cô sữa chữa, đóng góp ý kiến để tôi tiến bộ hơn trong những đề tài sau. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn. PHỤ LỤC Một số môi trường trong nuôi cấy mô invitro a. Môi trường Kundson’C (1946) Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l) (NH4)2SO4 500 Ca(NO3)2.4H2O 1000 MgSO4.7H2O 250 KH2PO4 250 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) MnSO4.4H2O 7,5 FeSO4.7H2O 25 b. Môi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) Hóa chất Nồng độ (mg/l) Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200ml) Lượng bổ sung cho 1l môi trường MS1 KNO3 KH2PO4 NH4NO3 MgSO4.7H2O 1900 170 1650 370 19 (x10) { 1,7 16,5 3,7 { 20ml MS2 CaCl2.2H2O 440 (x20) 8,8 10ml MS3 H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O CoCl2.6H2O KI 6,2 22,3 8,6 0,025 0,25 0,025 0,83 0,124 0,446 0,172 (x20) { 0,5mg 5mg 0,5mg 16,6mg { 10ml MS4 FeSO4.7H2O Na2EDTA 27,8 37,3 (x20) { 0,556 0,746 { 10ml MS5 Myo-inositol Acid nicotinic Pyridoxine.HCl (B6) Thiamine.HCl (B1) Glycine 100 0,5 0,5 0,1 2 2 10mg (x20) { 10mg 2mg 40mg { 10ml Cách pha môi trường MS đầy đủ Gồm: 20ml MS1 + 10ml MS2 + 10ml MS3 + 10ml MS4 + 10ml MS5. PHẦN 4 TÀI LIỆU THAM KHẢO 4.1. Tài liệu Tiếng Việt [1] Trần Hợp (1998, 2000). Phong lan Việt Nam. Nhà xuất bản nông nghiệp TPHCM [2] Nguyễn Công Nghiệp (1998, 2000). Phong lan Việt Nam. Nhà xuất bản nông nghiệp TPHCM [3] Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học quốc gia TP. HCM.Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 9, Số 9-2006 [4] Bùi Văn Lệ - chủ biên (2001), Thực tập Công nghệ sinh học thực vật, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM.Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 9, Số 9-2006 [5] Trần Văn Minh (1999), Giáo trình Công nghệ sinh học Thực vật, Viện sinh học nhiệt đới.Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 9, Số 9-2006 [6] Trịnh Cẩm Tú, Trương Thị Đẹp, Bùi Trang Việt Tìm hiểu vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự ra hoa ở Lan Denđrobium Sp. Tạp chí phát triển khoa học công nghệ. Tạp 5, số 7& 8, 5 – 12, (2002). [7] Dương Hoa Xô, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật.GĐ Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM [8] www.hoaphonglan.com.vn.letham.wordpress.com.Bài đăng ký: 22.5.2008 [9]lantaynguyen.wordpress.com/2009/07/22/ca%CC%81ch-tro%CC%80ng-ca%CC%81c-loa%CC%A3i-gio%CC%81ng-dendrobium [10]www.sinhhocvietnam.com.vn.violet.vn/uploads/resources/49/40388/preview.swfo [11] Carles C.C. and Fletcher J.C.,Shoot appical mersitem maintenance, the art of a dinamic balance, Plant Seience, 8 : 394 – 401, ( 2003 ) [12] Edwin F. George (1993), Plant Propagation by Tissue Culture, part 2, Exegetics Ltd., Edington, Wilts. BA13 4QG, England. [13] Sobry S.,Havelange A., Liners F., Cutsem P.V. Immunoloca lization of homogala cturouans in the apex of the long – day plant Sinapsis alba at floral transitir. Physiohogia plant 123 : 339 – 347, (2005) [14] International Floriculture Trade Statistics 1995 [15] King R.W. and Evans L.T. Gibberellins and flowering of grasses and cereals: prizing open the lid of the “florigen” black box. Annu. Rev. Plant Biol., 54:307- 328., (2003).