Nhân nhanh invitro hoa Lan mokara

quá trình phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Năm 1957, Skoog va Millert đã phát hiện vai trò tỷ lệ nồng độ của các chất auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đinh sinh trrưởng. Cùng năm đó hai ông đã thực hiện vi ghép invitro thành công. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặc cách mạng trong sử dụng kỹ thụât nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh giống địa lan Cymbidium mở đầu thành công trong sự nghiệp vi nhân giống thực vật. Năm 1960, Coking lần đầu tiên sử dụng enzyme phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lượng tế bào trần rất lớn. Năm 1971, Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần từ hai loài thuốc lá Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorfii. Năm 1978, Melchers đã tạo được cây lai soma giữa cà chua và thuốc lá bằng lai xa hai tế bào trần của hai cây này. Năm 1964, Guha và Maheshwari tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà chua Datura. Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm thử sinh khối mô thực vật bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreator dung tích 20.000lít. Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra phổ biến trong nuôi cấy mô và đã đưa ra khái niệm biến dị soma. Năm 1974, Zaenen và cộng sự đã phát hiện plasmid Ti đóng vai trò yếu tố gây khối u ở cây trồng. Năm 1977, Chilt và cộng sự đã chuyển thành công T-DNA vào thực vật. Năm 1979, Marton đã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium.Năm 1982, đã chuyển thành công DNA vào tế bào trần. Năm 1985, Fraley và cộng sự đã thiết kế vertor chuyển gen vào thực vật. Cùng năm ấy Horsch cũng đã chuyển gen vào mảnh lá bằng Agribacterium tumefacienns và tái sinh cây chuyển gen. Năm 1994, thương mại hoá cây cà chua chuyển gen “Flavr-savr”. 1.1.2. Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2.1. Khái niệm chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật [1] Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy đựợc xác định rõ: Việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát. Vi nhân giống là phương pháp nhân nhanh với số lượng lớn và giảm giá thành. 1.1.2.2. Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật [21] Haberlandt 1902, lần đấu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của mỗi cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận vủa phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào khác nhau. Quá trình phân hoá tế bào có biểu thị tuy nhiên khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể về dạng  tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hóa là một quá trình tuyệt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lai bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo chương trình đã được mã hoá cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác tế bào nằm trong khối mô của cơ thể luôn bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoăc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lơị cho sự hoạt hoá các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát triển hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toán của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát triển hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. a/ Auxin trong cây trồng [4] Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra được hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non. Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydase, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với nơi tổng hợp chúng. Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở các mức điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào. * Các chất auxin tổng hợp Gồm các chất sau: - Acid indolybutyrique (AIB) - Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng như: + Acid naphtyloxyacetique (ANOA) + Acid naphtylacetamide (NAD) + Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4D) Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, những chất giống được sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng được nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn được dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả. b/ Cytokinine [4] Cytokinine được khám phá do trung gian của sự nuôi cấy invitro. Người ta đã biết sự thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập được một chất rất hoạt động người ta đặt trên là kinetine, do DNA biến chất. Cytokinine là các chất adenine (IPA). Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp, có hai loại được sử dụng nhiều nhất là: * Tính chất sinh lý của Cytokinine - Tác động hiệu quả rõ len sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhưng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin, Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique. - Có vai trò rất rõ trong việc tạo tế bào cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. - Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động enzime li giải. - Hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi non: các chồi nách được xử lý Cytokinine sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng. - Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy invitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa. * Cytokinine trong cây trồng - Được tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô ( là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn Corymebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây. 1.2. Các yếu tố của môi trường cấy ảnh hưởng đến các giai đoạn trong nuôi cấy invitro Trong giai đoạn nuôi cấy invitro sự tăng trưởng của cây lớn được xác định bởi các thành phần của môi trường nuôi cấy. Thành phần chính của hầu hết môi trường nuôi cấy mô là các thành phần khoáng, đường được xem là nguồn cung cấp carbon và nước. Những thành phần khác có thể được bổ sung bao gồm các chất hữu cơ, các chất điều hòa sinh trưởng, chất làm đặc môi trường. Mặc dù các thành phần khác nhau trong môi trường thay đổi theo các giai đoạn nuôi cấy, môi trưòng MS (Murashige and Skoog) hầu hết được sử dụng phổ biến nhất. 1.2.1. Khoáng đa vi lượng [6,9,23 ] Các khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô đều ở dạng các muối vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các hỗn hợp muối vô cơ. Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh của tế bào, do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Đạm được sử dụng trong nuôi cấy mô thường ở dạng muối (NH4+) và nitrat (NO3-). Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc của màng. Lân thường được sử dụng ở 2 dạng ion là H2PO4- và H2PO22-. Nồng độ khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nữa so với bình thường. Nguyên nhân có lẽ là do nhu cầu về đạm trong giai đoạn này giảm xuống. 1.2.2. Vitamin [6,9] Thực vật cần vitamine để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamine thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamine HCl( vitamine B1); Pyridoxine HCl (vitamine B6); Acid nicotinic; Myo-inositol 1.2.3. Nguồn sắt [7] Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Na2- Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật 1.2.4. Nguồn Carbon [18] Các nguồn carbon (sucrose; glucose) là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao của cây con. Nồng độ sucrose (20g/l và 30g/l) thường được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực nuôi cấy mô Lan. Sucrose thông thường được thêm vào môi trường để dẩy mạnh tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con.Sự vắng mặt của đường làm giảm những vấn đề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng một cách tự dưỡng trong điều kiện invitro khi nồng độ CO2 và mật độ ánh sáng tăng. 1.2.5. Các chất hữu cơ[7] Nước dừa (CW-cocount) được dùng thông dụng trong nuôi cấy mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển như cây chà là, chuối, mầm lúa mì…Nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc. 1.2.6. Than hoạt tính [6,9] Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0,3% than hoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồi. Ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con 1.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô[13] 1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã sớm mở ra  khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống.       Thông qua nuôi cấy mô và tế bào chúng ta đã tiến hành so sánh  đặc tính  của cơ thể và các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể. Thực tế đã chứng minh  là cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh  rồi từ đó là nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo và từ mô sẹo có thể kích thích thành cây hoàn chỉnh.        Bằng phương pháp nuôi cấy mô chúng ta có thể tiến hành tìm hiểu và nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và kí chủ vì vậy mà bệnh lý sẽ được giải quyết  một cách cơ bản. 1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng giống và nhân nhanh giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học. Bằng phương pháp nuôi cấy mô sau một thời gian có thể tạo thành một sinh khối lớn các hoạt chất: alkaloic, glycoside, các steoid các chất dính dùng trong thực phẩm.       Những lợi ích trong nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp: + Kiểm soát được dịch bệnh hại cây trồng, ta có thể loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh. + Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đêm vào sản xuất. + Kiểm soát được từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch. + Tạo sự đồng loạt về giống, cơ giới hoá được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Làm tăng năng suất chất lượng cao giúp tiêu thụ nhanh và đêm lại thu nhập cao. 1.4. Giới thiệu chung về hoa Phong Lan 1.4.1. Một số đặc tính đại cương về họ lan (Orchidaceae) 1.4.1.1. Đặc điểm sinh học [16] Trong số những cây cho hoa có hơn 16000 loài và 700-800 giống thuộc họ Orchidaceae đã được xác định và rất nhiều loài lai giống nhân tạo. Họ lan chiếm vị trí thứ 2 sau họ Cúc (Asteraceae) và họ lớn nhất  trong lớp một lá mầm. Riêng ở Việt Nam lan được biết gồm 750 loài khác nhau.  Khác với cây trồng cạn, trồng trong môi trường nước các loài phong lan lại có đời sống ký sinh, bì sinh nhờ bộ rễ “ăn nổi” bám vào cây rừng nhiệt đới hoặc hút chất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoai mục. Nhìn chung, họ Lan bao gồm các loài thân thảo, sống lâu năm. Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá…Căn cứ vào cấu trúc thì có 2 nhóm: nhóm đơn thân như giống Vanda, Mokara,…Và nhóm đa thân như giống Cattleya…Ngoài ra cây lan còn mang một số đặc tính: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầu hết không có chất nuôi dưỡng. a/ Rễ - Lan là họ sống phụ (bì sinh) bám, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các dạng thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. - Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bỡi lớp mô hút dày, ẩm bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Với lớp mô xốp đó, rễ có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí. b/ Thân - Lan có 2 loại thân: đa thân và đơn thân - Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nước và các chất dinh dưỡng để nuôi cây invitro - Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giảng điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao. - Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. c/ Lá - Hầu hết các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá. - Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng - Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung  hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. - Màu sắc lá thường xanh bóng, nhưng có trường hợp 2 mặt lá khác nhau. Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ. d/ Hoa -  Hoa đối xứng qua một mặt phẳng. - Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh ngoài cùng là 3 cánh đài, thường có màu sắc và kích thước giống nhau. Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc. Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi. Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. - Ở giữa hoa có một trụ nổi lên, đó là bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống. Trụ gồm nhị và nhuỵ. Sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan. e/ Quả và hạt - Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc. quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chin, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. - Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bỡi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng - Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bỡi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng. 1.4.1.2. Sự phân bố [14] Họ lan phân bố từ cực Bắc như Thủy Điển xuống tận các đảo cực Nam của Ostralia.Tuy nhiên trung tâm phân bố của họ này ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt ở châu Mỹ và Đông Nam Á.Theo nghiên cứu ở vùng nhiệt đới Châu Á có tới 6800 loài. Riêng ở Việt Nam có tới 800 loài .                                                                               Hình 1.1 Một số loài hoa Mokara   Hình 1.3. Lan Cattleya Hình 1.2. Lan Hồ Điệp Hình 1.4. Lan Mokara Hình 1.5. Lan Đendrobium 1.5. Giới thiệu chung về hoa Mokara [12] 1.5.1. Đặc điểm sinh học của lan Mokara 1.5.1.1. Đặc điểm hình thái lan mokara Mokara là nhóm giống hoa được lai tạo từ các giống: Arachnis x Vanda x Ascocentrum. Nhóm giống này có đặc điểm tương tự như nhóm Vanda là loài Lan đơn thân, thân hình trụ dài tiếp tục mọc cao lên mãi, không có giả hành, lá dài hình lòng máng hay hình trụ mọc cách hai bên thân. Phát hoa mọc từ nách lá giữa thân, phát hoa dài mang nhiều hoa thường không phân nhánh. Hoa cỡ trung bình đến lớn, cánh đài của hoa rất lớn. Hoa có nhiều màu sắc phong phú từ trắng, tím, hồng đỏ, cam, vàng nâu, xanh, trên cánh hoa thường có chấm, có đốm hoặc hình carô rất đẹp .    Hình 1.7. Lan Mokara đỏ Hình 1.6. Lan Mokara cam Hình 1.9. Mokara vàng chấm Hình 1.8. Lan Mokara hồng Hình 1.11. Lan Mokara vàng Hình 1.10. Lan Mokara tím Hình1.5. Lan Mokara trắng 1.5.1.2. Sự phân bố Mokara là giống lan có nhiều trong họ Orchidaceae, Mokara phân bố trên các vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nan Á. Nếu như các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp của mình, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Mokara vô cùng phong phú, điều kiện sinh thái cũng rất đa dạng. Hình 1.12. Mokara -Vanda ,Arachanis, Ascocenda 1.5.2. Môi trường và các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng nuôi cấy mô hoa Mokara [13] 1.5.2.1. Nhiệt độ cây Nhiệt độ thích hợp cho Lan Mokara,  phát triển từ 25 - 30 độ C. Nhiệt độ là một trong những yếu tố quyết định sự ra hoa của Mokara. 1.5.2.2. Ẩm độ Rễ của  Mokara là rễ trần (rễ phơi ra ngoài không khí) nên đòi hỏi ẩm độ của vườn rất cao. Cây lan Mokara,  không chịu úng nên phải trồng thật thoáng. Vì đặc điểm của thân cây là lan đơn thân, không có giả hành nên khả năng mất nước rất lớn, từ đó làm cây sinh trưởng kém. Do đó, thường xuyên tưới nước mỗi ngày 2 lần (sáng sớm và chiều mát). 1.5.2.3. Ánh sáng Nhóm lan Mokara, thuộc nhóm ưa ánh sáng trung bình. Cường độ ánh sáng khoảng 50 - 60% nên cần thiết kế giàn che cho thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển. 1.5.2.4. Độ thông thoáng và giá thể Nhóm lan  Mokara rất cần độ thông thoáng nhiều, nhất là trường hợp trồng cây trong chậu vì hệ rễ của cây rất phát triển mà chất trồng (giá thể)  lại bí. Nên sử dụng chậu đất có nhiều lỗ thoát, bỏ một ít (rất nhỏ) chất trồng vào chậu. Hoặc không cần giá thể cây vẫn sinh trưởng tốt nhưng phải cung cấp thường xuyên dinh dưỡng cho cây. 1.5.2.5. Nhu cầu dinh dưỡng Mokara, cần dinh dưỡng khá cao và thường xuyên. Nên kết hợp sử dụng phân chuồng hoặc phân cá và phân hỗn hợp NPK 30 - 10 - 10 hoặc 20 - 20 - 20, tuỳ theo tuổi cây và tình hình sinh trưởng. Do đặc điểm cấu tạo của Mokara, là có hệ rễ trần nên khi sử dụng phân bón nên sử dụng với liều lượng thấp và nồng độ loãng. Lưu ý vấn đề vàng và tuột lá chân ở Mokara là do thiếu nước và thiếu dinh dưỡng, nhất là đạm  1.5.3. Gíá trị kinh tế và giá trị sử dụng hoa Mokara [15] Lan Mokara là một loài hoa đẹp có giá trị kinh tế .Mokara có hoa nhiều màu sắc phong phú, đa dạng được rất nhiều người ưa thích, là loại hoa có lượng lưu thông lớn trên thị trường thế giới, sản lượng đứng thứ ba thứ tư của hoa cắt cành. Hoa tươi là một sản phẩm hàng hoá đặc biệt của ngành nông nghiệp. Hiện nay trồng hoa đã trở thanh trở thành một ngành sản xuất khắp thế giới. Trong đó hoa Mokara góp một phần không nhỏ. Với ưa thế rất phong phú về hình dạng và màu sắc Hoa Mokara có gía trị kinh tế rất cao trong sản xuất mặt hàng tinh thần. Bên cạnh giá trị phong phú về tinh thần thì hoa Mokara được sử dụng để tách chiết và tinh chế dầu thơm phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm, bánh kẹo. Đối với y học, loài này cũng có giá trị nhất định Với giá trị như vậy hoa Mokara hứa hẹn mang lại một nguồn doanh thu lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này. Hiện nay trên thị trường Việt Nam, các loại hoa Mokara đang được bán phổ biến từ 10.000 đến 15.000 đồng/cành (theo điều tra của thời báo kinh tế). Như vậy đầu tư vốn vào phát triển kinh doanh mặt hàng này sẽ đem lại cho sản xuất lợi nhuận rất cao. 1.5.4. Các loại sâu hại chủ yếu trên hoa Mokara [15] Các bệnh gây hại phổ biến trên nhóm lan Mokara chủ yếu như sau:      - Bệnh đốm lá    + Do nấm Cercospora sp. gây nên. Sử dụng các loại thuốc trừ nấm  như Zineb 3/2000, Benlat 1/2000.      - Bệnh đốm vòng cánh hoa  + Do nấm Alternaria sp. gây ra. Có thể sử dụng thuốc trừ nấm phổ rộng như Daconil 500 SC . 1.5.5. Vật liệu chứa môi trường nuôi cấy hoa Mokara Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu về chuyển gen cây trồng, nhân giống các giống cây có giá trị, sản xuất nguyên liệu cho quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp, các nghiên cứu về sinh lý thực vật…Ngoài những thiết bị sử dụng trong chuẩn bị, khử trùng môi trường, hóa chất đặc trưng trong nuôi cấy mô, bình nuôi cấy là một dụng cụ không kém phần quan trọng. Nhiều nhà khoa học đã có những công trình nghiên cứu, đánh giá ảnh hưởng của bình nuôi cấy lên sự phát triển của mẫu cấy. Bình nuôi cấy có thể được làm từ nhiều vật liệu khác nhau như nhựa, thủy tinh, film nylon… Trong các phòng nuôi cấy mô trên thế giới việc sử dụng bình nuôi cấy bằng nhựa hay film nylon đã rất phổ biến, thay thế dần các bình nuôi cấy bằng thủy tinh. Hiện nay tại nước ta, việc nuôi cấy mô thực vật thực hiện chủ yếu trong các bình nuôi cấy bằng thủy tinh như bình tam giác, chai nước biển, vỏ chai rượu…Việc sử dụng những bình thủy tinh này có ưu điểm là tương đối rẻ tiền, dễ mua nhưng rất dễ vỡ, do không được thiết kế chuyên biệt cho việc nuôi cấy mô nên có nhiều chi tiết không thuận tiện, chiếm nhiều diện tích. Một số đơn vị hiện nay đã sử dụng các hộp nhựa tròn dùng được thực phẩm để làm bình nuôi cấy tuy nhiên do những hợp nhựa này được làm từ loại nhựa polypropylen nên hơi đục, không được trong suốt và dễ lão hóa chỉ qua 3 – 4 lần hấp khử trùng bằng autoclave Hiện tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM đã hoàn tất việc thử nghiệm nguyên liệu nhựa phù hợp và sản xuất thành công hộp nhựa vuông thích hợp cho nuôi cấy mô thực vật. Hộp nhựa với kích thước 65x65x95 mm làm từ nguyên liệu nhựa polycarbonate có độ bền cao, có thể hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong thời gian là 20 phút. Ngoài ra hộp nhựa vẫn trong suốt sau nhiều lần hấp khử trùng (ít nhất 30 lần hấp khử trùng), mức độ truyền sáng tốt cung cấp đủ ánh sáng cho mẫu cấy phát triển. Có thể ứng dụng hộp nhựa trong công tác giữ giống, giai đoạn vô mẫu, nhân nhanh cụm chồi, vươn thân, nuôi cấy hạt …Bên cạnh đó, hộp nhựa còn có thể xếp chồng lên nhau, tiết kiệm được không gian phòng nuôi cấy.   Hình 1.13. Hoa Mokara nuôi trong hộp nhựa vuông 1.5.6. Thiết bị và các nhân tố đảm bảo trong nuôi cấy mô 1.5.6.1. Thiết bị a/ Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước 1 lần - Máy cất nước 2 lần b/ Phòng hấp – sấy - Autoclave - Tủ sấy 60 – 200oC c/ Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g) - Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g) - pH kế - Máy khuấy từ - Tủ lạnh - Lò vi sóng (microwave) d/ Phòng thao tác nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng (laminar) - Quạt thông gió - Đèn tử ngoại treo tường e/ Phòng nuôi cấy - Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang - Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang - Tủ ấm f/ Phòng thí nghiệm (phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền) - Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần) - Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần) - Microtome - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu - Quang phổ kế … 1.5.6.2. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô thực vật Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách - Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. a/ Ý nghĩa vô trùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. b/ Nguồn tạp nhiễm Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: - Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối - Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn - Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường c/ Kỹ thuật vô trùng Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường + Dụng cụ thuỷ tinh Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng. Bảng 1.1. Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử trùng Nhiệt độ (0c)Thời gian khử trùng (phút)16045170181807,51901,5+ Nút đậy. Do bông không thấm nước có các nhược điểm sau: - Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài - Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn - Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ Nên hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng. + Môi trường Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại. Bảng 1.2. Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi hấp (autoclave) ở 121oC tại 103,4 kPa Thể tích môi trường (mL)Thời gian hấp khử trùng (phút)50157520250-50025100025Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá chất nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng trưởng, và các chất kháng sinh. Các chất như vậy thường phải được khử trùng bằng cách lọc vô trùng. Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hoặc sợI cellulose. Các lỗ trên màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ lại các vi sinh vật gây nhiễm. + Lọc vô trùng Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore. Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc. d/ Khử trùng mô thực vật Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Để có khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin dẫn tài liệu nghiên cứu của Street (1974) ở bảng sau: Bảng 1.3 Hiệu quả của các tác nhân vô trùng Tác nhân vô trùngNồng độ (%)Thời gian xử lý (phút)Hiệu quảCalci hypochlorit9-105-30Rất tốtNatri hypochlorit25-30Rất tốtHydro peroxid10-125-15TốtNước Brom12-10Rất tốtHgCl20,1-12-10Trung bìnhChất kháng sinh4-50 mg/l30-60Khá tốt Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải được cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết quả. Có thể dùng kháng sinh để kiểm soát hoặc loại bỏ sự nhiễm nấm trên mô cấy. Hầu hết các kháng sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô trùng. Chúng hoà tan được trong nước hoặc dung môi thích hợp khác, lọc vô trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này đã được làm nguội còn 45-500C Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và Neomycin thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một phạm vi pH nhất định. Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật sau khi bị xử lý trong một thời gian dài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc cho thực vật (và người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy mô thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh khác), các polymicin và vancomycin. *Rifampicin Khả năng hoạt động Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên các ribosome 30S hoặc 50S Gây trở ngại cho quá trình sao chép DNA bằng cách ức chế enzym DNA gyrase Ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Ức chế sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên ribosome 30S Ức chế sự sinh tổng hợptetrahydrofolate Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên Rbx 50S Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên Rbx 50S Tác động lên sự sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn. Gắn lên màng tế bào làm thay đổi dòng ion dẫn đến sự phá vỡ tế bào Tác động lên RNA bằng cách gắn vào RNA polymerase e/ Kỹ thuật cấy vô trùng Để tránh bị nhiễm trong suốt thao tác cấy mô thực vật, các nhà khoa học làm việc trong tủ cấy vô trùng (laminar). Đó là các tủ cấy có thiết bị thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Tủ cấy vô trùng loại trừ một cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm từ bên ngoài và tạo điều kiện thoải mái cho người cấy. Không khí từ bên ngoài được quạt hút vào qua một màng lọc thô. 99% bụi trong không khí được giữ lại ở màng lọc thô. Sau đó không khí được thổi qua màng lọc tinh và phân phối đều ra khắp bề mặt của tủ cấy, không tạo những xoáy không khí đưa bụi vào chỗ cấy. Màng lọc tinh ngăn cản các phần tử lớn hơn 0.3micron với hiệu quả 99,99%. f/ Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Trước khi đưa vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h. Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90%. Tia UV cũng có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và tủ cấy nhưng nó ít hiệu quả hơn và nguy hiểm hơn là sử dụng cồn. Tia UV chỉ tiêu diệt được các mầm vi sinh nằm trực tiếp ngay trên các bề mặt mà tia này chiếu vào. Các dụng cụ mang vào phòng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mủ vải, khẩu trang của người cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90. Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn có thể được khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa đèn cồn. 1.5.7. Phương pháp nhân giống hoa mokara 1.5.7.1. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ( in vitro) Từ một cây mẹ ban đầu có thể nhân ra hàng ngàn cây có kích thứơc và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. Nếu chọn lựa cây mẹ ban đầu tốt, như có đặc tính ra hoa liên tục. * Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoa Mokara *Tạo cây sạch virus [22,24] Một trong những điều kiện cần thiết cho việc nhân giống là cây con phải sạch virus. Nhiều nghiên cứu cho rằng cứ cấy đỉnh sinh trưởng là thu được cây con sạch bệnh nhưng thực tế thì không hoàn toàn như vậy. Các nghiên cứu cho thấy chỉ khi nuôi cấy một đỉnh sinh trưởng 1mm với 2 tiền phát khởi lá mới thu được cây con sạch virus. Một số nguyên nhân giúp mô phân sinh ngọn không bị nhiễm virus là:       + Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn mà hệ thống này không có ở mô phân sinh ngọn          + Trong sự phân chia các tế bào mô phân sinh ngọn không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus          + Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng  mô phân sinh ngọn mạnh hơn các vùng khác trong cây.          Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép của virus. + Virus thường thấy nhất trên hoa lan là một chủng đặc biệt của virus khảm thuốc lá, được biết trước hết là virus đốm vòng Odontoglossum. Nhiều cây bị xâm nhiễm bởi virus có triệu chứng kém phát triển, bị thối, xoăn lá, có sọc trên lá hoặc hoa, năng suất giảm và sau đó là cây chết. Ngoài ra bệnh virus còn là nguy cơ truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau. Mặt khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng, tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống. Do đó cách duy nhất là loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh. * Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng [5,17,19,20] Theo Champagnat (1997) và Fast (1980) Các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới nhú lá thường được dùng làm nguyên liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Khi cấy đỉnh sinh trưởng chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và cuối cùng tạo thành protocorm. Còn đối với Cattleya khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường bị hóa nâu. Vì lý do đó mà đỉnh sinh trưởng thường được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và được nuôi trong môi trường không có agar, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào môi trường. Sự thành lập protocorm ở Mokara mất nhiều thời gian và luôn tạo ra ở phần gốc mẫu cấy. Các protocorm tạo thành được tách ra và cấy chuyền vào môi trường mới để thành lập các protocorm bất định từ các protocorm ban đầu, nếu không được cấy chuyền chúng sẽ phát triển thành chồi và ra rễ. Hình 1.14. Sơ đồ cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan Mokara Môi trường nuôi cấy thường môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơn giản.Môi trường khoáng MS có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng BA 1mg/l và NAA 0.1 mg/l. Ngoài ra các chất chiết từ trái cây cũng được sử dụng như nước dừa 10%, khoai tây.Sau 10-12 tuần nuôi cấy, các đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn nhỏ gọi PLB (protocorm like body). Để có được số lượng lớn PLB làm nguồn mẫu để phục vụ sản xuất. Các PLB này được tách ra thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường kích thích nhân nhanh PLB, tuy nhiên chúng cũng dễ dàng tái sinh chồi ngay trên chính môi trường nhân nhanh. Để có cây con hoàn chỉnh cần tách các chồi riêng lẻ rồi cấy lên môi trường kích thích ra rễ, cây con có thể xuất vườn sau 4-5 tháng nuôi cấy.   1.5.7.2. Phương pháp nhân giống từ hom [12] Đây là phương pháp nhân giống đơn giản bằng cách cây con được cắt thẳng từ đoạn trên cùng đọt của cây mẹ. Thông thường tùy theo yêu cầu quy cách hom giống tối thiểu phải bao gồm từ 2- 3 rễ đâm ra từ thân cây mẹ. Kích cỡ thường để trồng là tối thiểu 25 – 30 cm, có thể tới 50 – 60 cm. Hom càng dài thì khả năng cây càng khỏe do có nhiều rễ, sau khi cắt trồng sang vườn mới thì khả năng phục hồi nhanh, mau ra hoa trở lại. Tùy theo đặc tính giống, sau 3 tháng cây con cắt từ đọt đã có thể cho hoa nhưng thông thường để dưỡng cây người ta cắt bỏ các phát hoa ở giai đọan này. Nhược điểm của phương pháp này là giống đợt đầu nhân ra với số lượng hạn chế, cứ một cây mẹ thì cắt được một đọt - tức 1 cây con. Tuy nhiên sau khi cắt đọt, cây mẹ nếu chăm sóc tốt từ các nách lá, tập trung phần trên gần chỗ cắt sẽ ra tiếp tục các mầm cây con. Thông thường từ cây mẹ sẽ ra được 2 - 3 chồi, tối đa có thể 4 chồi, sau khoảng 6 tháng cây con sẽ phát triển hoàn chỉnh và có thề tách ra để trồng. Giá thành cây giống cũng cao giống như cây mẹ. 1.5.7.3. Phương pháp nhân giống từ hom có cải tiến [12] Biện pháp cắt hom lấy phần ngọn làm cây giống, còn phần gốc sẽ phát triển các chồi con thành cây thành phẩm để trồng đang được nhà vườn trồng lan cắt cành Mokara áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên, một điểm hạn chế của phương pháp này là hệ số nhân chồi không cao. Từ một cây mẹ ban đầu, sau khi cắt hom, lấy phần ngọn ta được 01 cây thành phẩm thì số lượng chồi con sinh ra không nhiều, từ 2 – 3 chồi, tối đa có thể 4 chồi. Để cải thiện hệ số này, bằng cách áp dụng các biện pháp kỹ thuật để tác động vào để nâng cao khả năng ra chồi của các giống Mokara. Các lọai phân bón lá có hàm lượng đạm cao như 31-11-11 kết hợp lọai có chứa axit amin, rong biển được phun liên tục vào thời điểm trước khi cắt đọt 1 tháng và sau khi cắt 6 tháng.   Hình 1.15. Cây lan Mokara được xử lý ra chồi sau khi cắt đọt 3 tháng   Kết quả thu được cho thấy: đối với cả 2 giống thí nghiệm, tất cả các công thức có xử lý phân bón lá 31-11-11 kết hợp với rong biển, phân Terra Sorb ( có chứa acid amin ) đã cho số lượng chồi thu được cao hơn hẳn so với đối chứng từ 64 – 114%. Cũng như cao hơn so với công thức chỉ xử lý phun phân bón lá lọai 31-11-11. Số lượng chồi đạt tiêu chuẩn sau 6 tháng cắt đọt trong công thức này cũng cao hơn so với công thức đối chứng và công thức phun 31-11-11. Trong công thức có xử lý rong biển là lọai phân bón lá có chứa chất kích thích sinh trưởng Cytokinin. Đây là loại chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi. Nếu tỷ lệ Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích ra rễ, còn tỷ lệ Cytokinin cao hơn Auxin thì kích thích sự phát triển của chồi nách, giải phóng cây khỏi sự kìm hãm của chồi ngọn. Ngòai ra, lọai phân bón có chứa acid amin cũng góp phần cho sự phát triển về chiều cao của các chồi nách sau khi đọt cây mẹ bị cắt. PHẦN 2 KẾT QUẢ 2.1. Sơ đồ quy trình Chuẩn bị môi trường Nguyên vật liệu Khử trùng mẫu Khởi tạo PLB từ mô lá Sự tái sinh chồi từ mô lá Sự ra rễ Chuyển cây ra vườn ươm 2.2. Thuyết minh quy trình Có nhiều phương pháp để nhân nhanh invitro hoa Mokara. Tuy nhiên tôi xin chọn một trong các cách sau để nhân nhanh đó là sử dụng đỉnh sinh trưởng từ hoa Mokara. 2.2.1. Chuẩn bị môi trường Môi trường MS(Murashige&Skoog),gồm các thành phần sau * Nguyên tố đa lượng - NH4NO3 1650 mg/l - KNO3 1900 mg/l - MgSO4.7H2O 370 mg/l - Ca(NO3).4H2O 400 mg/l - KH2PO4 170 mg/l * Nguyên tố vi lượng - H3BO4 6,3 mg/l - ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l - MnSO4.4H2O 22,3 mg/l - KI 0,83 mg/l - Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l - CuSO4.5H2O 0,025 mg/l - CoCl2.6H2O 0,025 mg/l * Vitamine - Pyridoxine(B6) 1mg/l - Thiamine (B1) 1mg/l - Nicotinic acid 1mg/l - m-Inositol 100 mg/l - Biotine 0,01mg/l - D-Pantothnic acid 1mg/l * Fe EDTA - FeSO4.7H2O 27,8 mg/l - Na2EDTA.2H2O 37,3 mg/l 2.2.2. Nguyên vật liệu -Chọn đỉnh sinh trưởng từ hoa Mokara - Điều kiên nuôi cấy Môi trường Murashige và Skoog (M+S). Môi trường Knudson C. * Ph: 5,8. * Ánh sáng 5.O00 lm/m2 *Quang kỳ 14 giờ * Nhiệt độ 110 0C 2.2.3. Khử trùng mẫu *Rửa sạch chồi Mokara dưới vòi nước chảy.Dùng dao mổ lột sạch các lá non bao quanh chồi cho đến khi để lộ chồi ngọn * Dùng gòn lau nhẹ lên thân chồi, ngâm chồi trong xà bông loãng trong 10 phút,  rửa cho sạch xà phòng dưới vòi nước chảy. * Trong tủ cấy, ngâm chồi vào cồn 70 độ trong 1 phút, sau đó cho chồi vào becher có chứa dung dịch javel có nồng độ (1 thể tích javel: 4 thể tích nước cất vô trùng) trong 10 phút, lắc đều tay. * Dùng kẹp vô trùng cho chồi vừa được khử trùng vào becher  vô trùng, rửa các chồi này bằng nước cất vô trùng cho sạch javel (rửa 3 lần). * Cắt bỏ các mô chết phần gốc chồi, tách bỏ các lá bên bằng kim mũi nhọn để có được một đỉnh chồi mang 4 – 5 tiền phát khởi lá, cấy từng chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường. Dùng viết aceton ghi rõ tên giống , ngày cấy, tên môi trường nuôi cấy. * Đặt tất cả vào phòng nuôi và quan sát. Hình 2.1. Sự hình thành chồi từ hoa Mokara 2.2.4. Khởi tạo PLB từ mô lá Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng được cắt theo kích thước 5 x 5 mm. Các mẫu lá được đặt nuôi trên môi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l   Sau 10 tuần nuôi cấy: Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. Lá và thân mặc dù có những nét giống nhau về hình thái giải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mô. Lá có sinh trưởng tận cùng hữu hạn. Do đó, để có sự phát sinh hình thái mới, đỉnh lá cũng cần phải có sự phân hoá của các tế bào nhu mô để trở về trạng thái mô phân sinh. Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi có vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi. Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hoàn toàn độc lập với hệ thống mạch của mô mẹ. 2.2.5. Sự tái sinh chồi từ PLB Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ PLB chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. Tanaka và Sakanishi (1985) và Tanaka (1987) đã sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, môi trường Hyponex cải tiến, còn Haas-von Schmude (1983,1985) sử dụng môi trường MS  trong việc tái sinh cây con từ PLB. Griesbach (1983) sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việc tái sinh cây con từ PLB, trong khi Lin (1986) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến có bổ sung BA (1 mg/l) để chuyển PLB thành cây con 2.2.6. Sự ra rễ Thông thường các chồi tái sinh từ PLB sẽ ra rễ và phát triển mạnh trên môi trường có bổ sung nước dừa, chuối, khoai tây… mà không cần bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào hết. Tuy nhiên, việc này còn tùy thuộc vào giống. Có một ít giống rất dễ đẻ chồi nách làm chồi chính phân nhánh không phát triển rễ được, lá nhỏ, thân chồi kéo dài, vì vậy, chồi thường tồn tại ở dạng cụm chồi. Để khắc phục điều này, cấy từng chồi riêng lẻ lên môi trường có hormone tăng trưởng IBA với nồng độ 0.5-1 mg/l, chồi sẽ ra rễ dài, lá to. Sau 3-4 tháng nuôi cấy có thể đem cây con ra trồng ngoài ườn ươm. 2.2.7. Chuyển cây ra vườn ươm Khi cây con cao khoảng 5-7 cm và có từ 3-4 lá thì lúc này ta có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.  Như vậy, từ một mô hoa Mokara được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá ta chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.  Như vậy toàn bộ qúa trình nhân giống trên ta được cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, việc cấy mô cần thực hiện theo đúng quy trình đã chọn ra tức là phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt. Có như vậy ta mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm. PHẦN 3 KẾT LUẬN Sau khi trình bày một số phương pháp nhân nhanh hoa Mokara sạch bệnh bằng phương pháp in vitro, tôi thấy phương pháp sử dụng đỉnh sinh trưởng là phương pháp cho hiệu quả cao hơn so với những phương pháp khác. Phương pháp này có ưu điểm là tạo ra cây con sạch bệnh, khả năng nhân giống nhanh.Với đặc điểm là hoa cắt cành lại là hoa có hệ số nhân cao nên khi áp dụng nuôi cấy mô hoa Mokara chiếm ưu thế rất lớn cho quá trình sản xuất đáp ứng nhu cầu cho người Việt Nam và thế giới trong tương lai không xa. Bên cạnh đó, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vào nhân nhanh invitro là tiến bộ kỹ thuật đặc biệt sẽ góp phần giải quyết vấn đề nguồn giống cho nước ta, tiết kiệm chi phí mua giống và nâng cao quy mô sản xuất hoa phong Lan từ quy mô nhỏ lẻ, hộ gia đình lên quy mô công nghiệp. Thành công của kỹ thuật nhân nhanh hoa Mokara in vitro còn tạo ý nghĩa thực tiễn to lớn cho xã hội. Trong thời gian thực hiện đồ án chuyên môn này, tôi đã tiếp thu được một số kiến thức về ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhân giống cây trồng nói chung và hoa Mokara nói riêng. Tuy nhiên để hoàn thành được đồ án này tôi đã được sự tận tình giúp đỡ của cô Phạm Thị Kim Cúc, cô đã giúp tôi từng bước trong việc thu thập, tổng hợp tài liệu. Với sự chỉ dẫn nhiệt tình của cô tôi đã hoàn thành được đề tài: “ nhân nhanh invitro hoa Mokara” Cuối cùng tôi xin cảm ơn nhà trường và khoa công nghệ lương thực thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đồ án này. Trong quá trình thực hiện đề tài sẽ không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế về mặt kiến thức.Vì vậy, tôi mong các bạn cùng thầy cô sữa chữa, đóng góp ý kiến để tôi tiến bộ hơn trong những đề tài sau. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn .Chúc bạn đọc sức khỏe! TÀI LIỆU THAM KHẢO -TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Trần Văn Bảo ,1999.Kỹ thuật nuôi trồng phong lan,nhà xuất bản trẻ.Trang 5-74 [2] Nguyễn Văn Hiền, nghiên cứu thuốc trừ nấm cho loài hoa phong lan [3] Trần Hợp ,1998,2000.Phong lam Việt Nam.Nhà xuất bản nông nghiêp TP HCM [4] Dương Công Kiên ,2003, Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học quốc gia TP. HCM [5] Bùi Văn Lệ - chủ biên, 2001, Thực tập Công nghệ sinh học thực vật, Trường ĐH Khoa học tự nhiên TP. HCM. [6,9]Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thùy Tiên, 2002 [7] Trần Văn Minh ,1999, giáo trình công nghệ sinh học thực vật.Viện sinh học nhiệt đới [8] CN-Huỳnh Thái Phụng, giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh.Trung tâm kỹ thuật và công nghệ sinh học Tiền Giang [10] Nguyễn Bảo Toàn ,2004.giao trình nuôi cây mô và tế bào thực vật.Khoa nông nghiệp ,Trường đại học Cần Thơ, trang 7-51 [11] Anh Nguyễn Văn Trớ,Gia Lộc-Trảng Bàng –Tây Ninh. [12] Dương Hoa Xô, GĐ Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM [13] http:/www.vnn.vn/nong thon. [14] http:/www.hoaphonglan.org. [15] http:/www.rauhoaquavietnam.vn -TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI [16] Begum,2000 [17,19] Champagnat (1997) và Fast (1980) [18] Debergh.PC.1991.Control of vitro plant propagation [20] Edwin F. George (1993), Plant Propagation by Tissue Culture, part 1, Exegetics [21] Haberlandt 1902 [22] Morel, 1960 [23] Moxolov,1987 [24]Quack 1997