Những phương thức và kỉ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong phòng thí nghiệm

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP. Họ và tên sinh viên: HOÀNG THỊ DUNG lớp K33C – Sinh, khóa 2007 – 2011. Họ và tên người hướng dẫn khoa học: TS.Lê Xuân Đắc Đơn vị công tác: Viện công nghệ sinh học. Địa điểm thực tập: Viện công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội. Thời gian thực tập: Từ 14/02/2011 đến 24/04/2011. Mục đích – mục tiêu thực tập - Các kỹ thuật cơ bản về nuôi cấy mô và tế bào thực vật. - Kỹ thuật nhân nhanh cây ngưu tất trong ống nghiệm Nội dung và kỹ năng cần đạt được trong đợt thực tập. Nội dung cần thực tập. - Pha hóa chất, làm môi trường nuôi cấy trong ống nghiệm - Tạo đa trồi cây ngưu tất - Tạo cây hoàn chỉnh, trồng cây ngoài vườn ươm. Các kỹ thuật cần đạt được trong thời gian thực tập Các kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực. vật (chuẩn bị làm môi trường, nuôi cấy cây trong ống nghiệm, trồng cây ngoài vườn ươm …). Các công việc đã thực hiện và kết quả thu được. 3.1.Phương pháp pha hóa chất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật 31.1. Mục đích Giúp học sinh nắm vững phương pháp pha một số hóa chất cần thiết sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào tực vật như: MS, các chất kích thích sinh trưởng… 3.1.2. Nguyên lý Hóa chât sau khi pha không kết tủa, không lắng cặn. háo chất đượ pha thành dung dịch “stock” bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho việc pha môi trường nuôi cấy. 3.1.3. Dụng cụ và hóa chất a) Dụng cụ: - Cốc thủy tinh có định mức, ống đong, đũa thủy tinh, phễu,lọ nút nhám - nước cất 2 lần - Giấy lọc, giấy gián nhãn - Máy khuấy từ, bếp đun - Cân điện tử b) Hóa chất: - để pha môi trường cơ bản nuôi cấy đều tan trong nước cất. Cân lần lượt các loại hóa chất - Các loại hóa chất cần thiết để pha môi trường MS - Các chất kích thích sinh trưởng 4. Các bước tiến hành. 4.1. Chuẩn bị - Dụng cụ thủy tinh phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô. Lọ dựng dung dịch phải được dán nhãn ghi tên hóa chất, nồng độ, ngày pha, người pha. - Hóa chất: chuẩn bị theo danh sách, kiểm tra tên hóa chất, hãng sản xuất, hạn sử dụn 4.2. Pha môi trường cơ bản MS. Tất cả hóa chất óa chất cho vào cốc thủy tinh có định mức có định sẵn một lượng nước cất, khuấy tan hóa chất bằng máy khuấy từ, bổ sung nước cất đến thể tích cần thiết. Lọc dung dịch bằng giấy lọc. Đựng vào lọ có dán nhãn đầy đủ và bảo quản trong tủ lạnh Lượng hóa chất cần thiết cho 100ml stock được quy ra từ nồng độ chất đó cần cho một lít môi trường nuôi cấy và phụ thuộc vào cách ta sẽ lấy 1ml hay 5 hoặc 10ml stock cho một lít môi trường nuôi cấy. Ví dụ: lượng CaCl2.2H2O cần thiết cho một lít môi trường nuôi cấy là 44 - Nếu pha stock loại cần 10 ml cho 1 lít môi trường nuôi cấy thì trong 10 ml dung dịch stock sẽ phải có 440 mg CaCl2.2H2O. Trong 100 ml stock sẽ phải có 44000 mg CaCl2.2H2O - Nếu pha loại cần 5 ml cho một lít môi trường nuôi cấy thì trong 5 ml stock sẽ phải có 440 ml CaCl2.2H2O Trong 500 ml dung dịch stock sẽ phải có 44000 mg CaCl2.2H2O 4.3. Pha các chất kích thích sinh trưởng: Thường pha lượng ít (50 đến 100 ml một lần), vì các chất này khi ở dạng dung dịch khó bảo quản. Các chất kích thích sinh trưởng như BAP, NAA, 2,4 D…. ta có thể pha với nồng độ từ 0,2 đến 2 mg/ml. Ví dụ: BAP là chất tan trong dung dịch NaOH 1N Muốn pha 100ml dung dịch BAP nồng độ 1 mg/l ta cân 100 mg BAP, cho gọn vào đáy cốc thủy tinh nhỏ 100 ml, sau đó nhỏ giọt dung dịch NaOH 1N vào, chỉ cho vừa đủ để tan hoàn toàn tinh thể BAP (vì nếu ta cho nhiều NaOH sau này sẽ ảnh hưởng đến độ pH của môi trường nuôi cấy). Lắc cho tinh thể BAP tan hết, dung dịch trong suốt, sau đó định mức nước cất 2 lần đến thể tích 100 ml. Đựng vào lọ thủy tinh nút mài, dán nhãn, bảo quản trong tủ lạnh 40C. Đối với những chất kích thích sinh trưởng hòa tan trong cồn, ta dùng cồn để làm tan hóa chất sau đó mới định mức nước cất đến thể tích cần thiết. II. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy. 1. Mục đích Giúp học viên nắm được phương pháp pha môi trường và khử trùng.s Nguyên lý Tùy theo đối tượng và mục đích nuôi cấy, để pha các loại môi trường đặc hoặc lỏng với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Môi trường sử dụng phổ biến hiện nay là môi trường MS (Murashige – Skoog), có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… tất cả các hóa chất đều phải hòa tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn làm giá đỡ thì không quá rắn, không quá mềm để khi cấy mẫu vật dễ dàng. Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur. Dụng cụ và hóa chất. a) Dụng cụ - Bình tan giác, pipet, ống đong, cốc thủy tinh có định mức… - Bông, giấy làm nút. - Nước cất. b) Hóa chất - Dung dịch MSI, MSII,MSIII, MSIV, MSV - Hoocmon kích thích sinh trưởng (2,4 –D, NAA, BAP….), saccharose, agra…. 4. Các bước tiến hành 1. Xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất cần sử dụng. Ví dụ: MS + 3% saccarose ) + 0,8% agra + 2mg 2,4 –D Dùng ống đong để lấy các dung dịch MS 3. Định mức nước cất đến thể tích cần pha, bổ sung saccharose 4. Đo pH (pH môi trường thường là 5,8) 5.Đun sôi, bổ sung agra, khuấy đều. 6. Bổ sung chất kích thích sinh trưởng 7. Chia đều cho các bình tam giác (mỗi bình khoảng 50 ml) 8. Làm nút bông, nút giấy 9. Khử trùng ở nhiệt độ 119 – 1210C, áp suất 0,8 – 1,2 at. III. Tạo đa chôi cây ngưu tất mục đích - Nắm được cách hức lựa chọn mẫu vật và các thao tác kyx thuật khi tạo chồi và nhân giống vô tính. nguyên lí - Kỹ thuật tạo cụm chồi và nhân giống cây vô tính sử ụng các chất kích thích sinh trưởng (ktst) để thúc đảy hìh thàh các cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Cây tạo thành qua phát triển chồi nách cay tạo đỉnh sinh trưởng mới. - chất kich thich sinh trưởng sử dụng chủ yếu thuộc nhóm cytokinin, tườn là BAP hoặc kinetin. Dụng cụ và hóa chất Dùng để khử trùng bề mặt mẫu vật - Hóa chất và dụng cụ khử trùng bề mặt mẫu b)Môi trường nuôi cấy - Môi trường cấy gây nhân chồi và tạo cụm chồi: MS cơ bản+0,9% agar+3% sucrose+KTST+10% nước dừa. - Môi trường được khử trùng trước khi sử dụng c)Các bước tiến hành Khử trùng bề mặt mẫu vật nuôi cấy - Chọn những bộ phận có chứa chồi( Đỉnh sinh trưởng,chồi nách, mắt) làm nuyên liệu nuôi cấy. - Khử trùng bề mặt mẫu vật 2.Cấy gây - Thấm khô mẫu vật dã khử trùng trên giấy thấm vô trùng. - Nếu mẫu vật thuộc loại có chúa chồi thì cắt thành những 0,5-2 cm tùy loại rồi đặt lên môi trường nhân chồi. Nếu mẫu vât là hạt hoặc phôi thì được đặt luôn lên môi trường nhân chồi. - Môi trường nhân chồi ở giai doạn cấy gây thường có nồng độ KTST tương đối thấp tùy từng đối tượng. - Theo dõi từng ngày, nếu cần thì cấy chuyển để loại bỏ những mẫu vật bị nhiệm - Để đánh giá hiệu quả của phương pháp khử trùng đã sử dụng cần ghi lại tỉ lệ: mẫu vật bị nhiễm/tông lượng mẫu và mẫu vật sống sót/tổng ượng mẫu, kết hợ với quan sát hình thái của mẫu vật để có kết luận chính xác. - Để đánh giá hiệu quả của môi trường cấy gây cần quan sát mỗi tuần những phản ứng về hình thái của mẫu vật gồm: màu sắc mẫu vật, khả năng phát triển của mẫu vật. 2.Nhân nhanh và tạo cum chồi - Sau 4 tuần môi trường cấy gây,các chồi được cắt bỏ những đoạn chết chuyển sang môi trường nhân nhanh.Môi trường nhân nhanh thường có nồng độ BAP hoặc kinetin lớn hơn môi trường cấy gây - Theo dõi sau mỗi tuần. ghi lại các chi số sau: + Độ tăng về chiều dài cua chồi + Màu sắc, hình dạng chồi + Thời gian xuất iện cum chồi đầu tiên. Số lượng chồi/cụm chồi + Cấy chuyển sau 4 tuần 2.Tạo rễ - Các chồi khi dược khoảng 1-2cm tùy loại dược chuyển sang môi trương tạo rễ. Các ụm chồi dược tách thành các chồi riêng lẻ trước khi chuỷen - Theo dõi sau mỗi tuần. Ghi lại các chỉ số sau: + Thời gian xuất hiện rễ đầu tiên + Số lượng trung bình rê/chồi + Chiều dài trung bình rễ - Cấy chuyển sau 4 tuần cho tới khi tạo rễ hoàn chỉnh. - Khi các cây đã tạo rễ và có bộ lá hoàn chỉnh được dưa ra ngoài đất. IV. Phương pháp ra cây. 1.Mục đích Tạo được cây con sau giai đoạn nuôi cấy invitro phatr triển bình thường để trồng được ngoài điều kiện tự nhiên. Tỷ lệ cây sống khi chuyển từ nuôi cấy trong ống nghiệm ra vườn ươm quyết định hiệu quả kinh tế của phương pháp nhân gống invitro. Do đó một quy trình ra cây đạt hiệu quả cao có ý nghĩa rất lớn. 2.Nguyên lý Cây nuôi cấy ong ống nghiệm là cây đang được sống trong một điều kiện nuôi cấy tối ưu về mọi mặt trong môi trường vô trường vô trùng. Khi đưa ra ngoài ống nghiệm,cây phải chịu tác động của nhiều điều kiện bât lợi của môi trường. Trong điều iện in vitro cây rất non yếu, do đó rất dễ bị chết do những điều kiện koong thuận lợi của môi trường tự nhiên như bị vi khuẩn,nấm mốc tấn công gây thối rữa… Do đó để đạt được tỉ lệ cây sống cao khi ra cay ta phai theo nhũng nguyên tắc sau: Trong thời gian dầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận, tránh cho cây khỏi chịu tác động những điều kiện không thuận lợi từ phía ngoại cảnh. Từng bướ co cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài ống nghiệm, cây con sẽ cưng cáp và phát triển được ở ngoài điều kiện tự nhiên. 1)Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ - Khay ra cây, có thể là khay nhựa hoặc hay gỗ,kích thước vừa phải để có thể dễ dàng di chuyển vị trí hoặc che đậy, độ sâu khoảng 10-15 cm. khay nhựa phải có lỗ dưới đáy để thoát nước dễ dàng, khay gỗ chỉ có tính chất là một khung sau đó lót lưới nhựa cho có độ thông thoáng tốt. - Hộp nhựa để đựng dung dịch nuôi cấy nếu ra cây trong môi trương lỏng. - rét khi trời lạnh - Bình phun dể tưới cây. - Panh, kéo, chậu nhưa, rổ nhựa… - Các dung dịch muối khoáng để pha loãng tưới cây - Zinep, kháng sinh để phòng chống nhiễm mốc, nhiễm khuẩn. 1.Chuẩn bị cây 3-4 tuần, được chiếu sáng tốt để phát triển khỏe mạnh, cưng cáp. Khi caayddax co bộ rễ khỏe, lá xanh đẹp, đang thời kì sung sức thì có thể đưa ra môi trường tự nhiên. Nếu có thể thì để các bình cây ra ánh sáng mặt trời vài ba ngày trước khi gắp cây ra khỏi bình. 2.Đưa cây ra - Các bình cây được mở nút, nếu là binh thạch ta phải cho nước vào ngâm 15-20 phút, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời ra khỏi rễ cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bình, cố gắng để cây được nguyên vẹn, không bị - Ngâm cây trong chậu nước sạch sau đó rửa dưới vòi nước chảy cho sạch hoặc lá quá dài, cắt ngắn bớt rễ ở những cây rễ dài quá. - bị giá thê phù hợp. Cây càng có khả năng chịu nước thì tỉ lệ đất trộn vào giá thể càng nhiều, Giá thể được đựng vào khay trồng với bề dày o 1.Trồng cây: Cây con được trồng vào khay với mật độ dày. Sau trồng phun nước nhẹ nhàng cho chặt gốc cây. 2.Chăm sóc cây mạ. - Cây trồng trong dung dịch đỡ tôn công chăm sóc hơn. Những ngày đầu cây được thả trong nước lã, 2-3 ngày sau dùng dung dịch MS pha loãng 1/10 để tạo điều kiện cho cây phát triển tốt hơn. Ta chỉ cần thay dung dịch một tuần 2 lần, để cây nơi có đủ ánh sáng, thoáng đãng nhưng kín gió. Sau 2-3 tuần cây mới ra rễ mới, nhấc miếng xốp len thấy rễ ra trắng xóa là có thể đưa ra vườn ươm - Cây trồng trong khay đất phải chăm sóc mát công hơn. Trong 2-3 ngày đầu tưới nước lã bằng cách phun sương 3h/lần. Trời rét, khô hanh phải che nilon tránh rét và tránh thóa nước nhanh. Nilon che phải đục ra với một số lỗ thủng cho thoáng khí. Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để khay cay nơi đủ ánh sáng, thoáng khí nhưng không gió, tránh nắng, mưa trực tiếp. Tưới nước bằng bình phu 2-3 lần trên ngày. Sau một tuần có thể tưới cây bằng dung dịch MS pha loãng với tỉ lệ 1/10, ngày 1 lần. Sau 3-4 tuần cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra vườn ươm. Đánh giá kết quả Sau khi ra cây 3-4 tuần, cho đến khi cây sống được và ra rễ mới, lá mới là t có thể đánh giá được kết quả ra cây bừng cách tính tỉ lệ số % số cây sống.