Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α - Amylase và ứng dụng trong sản xuất dextri

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng Nguyễn Thanh Thủy Nguyễn Nhƣ Nhứt Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã luôn trăn trở, lo lắng và động viên để tôi có đƣợc ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn đến tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến chị Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng và anh Nguyễn Nhƣ Nhứt đã tận tình hƣớng dẫn, động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Cảm ơn các anh và các bạn tại phòng sinh hóa ứng dụng của trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Cảm ơn Hồng Vy và Phƣơng Uyên, hai ngƣời bạn thân nhất của tôi đã chia xẻ và giúp đỡ tôi trong 4 năm học tại trƣờng. iv TÓM TẮT Nguyễn Thanh Thủy, Đại học Nông Lâm TP. HCM Đề tài nghiên cứu “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”, thực hiện tại phòng sinh hóa và ứng dụng của trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM từ 19/03/2007 – 19/07/2007. GVHD: ThS. Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng ThS. Nguyễn Nhƣ Nhứt Đối tƣợng nghiên cứu là α-amylase của Bacillus subtilis Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hoà tan trong nƣớc, phƣơng pháp Heinkel xác định hoạt độ α-amylase để khảo sát thời gian nuôi cấy, tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% và (NH4)2SO4, khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis thích hợp để thu α-amylase là 48 giờ. - Tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% tốt nhất là 1 thể tích dịch chiết enzyme và 3 thể tích cồn. Thời gian tủa là 15 phút. - pH và nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân của chế phẩm α-amylase là 6,0 và 55oC. - Lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất từ sự thủy phân bột năng 10%. v ABSTRACT NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state fermentation and dextrin production application”. This thesis was carried out at biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from 03/2007 to 09/2007. We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, α- amylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate. After recovering α-amylase from fermented medium we examined starch hydrolysis ability and dextrin production of α-amylase product. Result experiments showed that: - α-amylase activity was hightest at 48h incubation. - Precipiating α-amylase by 96% ethanol was better than solid ammonium sulfate and suitable volume ratio of extracted enzyme and ethanol for precipitation was 1:3. - Optimum temperature and pH for hydrolysis of purified α-amylase were respective 55 degree C and 6,0. - α-amylase had the most effective hydrolysis in 10% cassava starch fluid. vi MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Abstract ....................................................................................................................... v Mục lục ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ...................................................................................................... x Danh sách các bảng .................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ .................................................................................................. xii Danh sách các đồ thị ................................................................................................. xii Danh sách các biểu đồ ............................................................................................... xii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH...................................................................................................... 2 1.3. YÊU CẦU ........................................................................................................ 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. BACILLUS SUBTILI ....................................................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn .................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại ................................................................................................... 6 2.1.3. Bộ gen ....................................................................................................... 6 2.1.4. Ứng dụng .................................................................................................. 7 2.2. ALPHA-AMYLASE ....................................................................................... 8 2.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 8 2.2.2. Phân loại, danh pháp ................................................................................ 8 2.2.3. Cấu trúc phân tử ....................................................................................... 8 2.2.4. Tính chất ................................................................................................... 9 2.2.5. Cơ chế xúc tác ........................................................................................ 10 2.2.6. Ứng dụng ................................................................................................ 11 2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT ..................................... 12 vii 2.3.1. Nuôi cấy bề mặt ...................................................................................... 12 2.3.2. Nuôi cấy chìm ........................................................................................ 12 2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME .............................................................. 13 2.5. DEXTRIN ...................................................................................................... 13 2.5.1. Phân loại ................................................................................................. 14 2.5.2. Tính chất ................................................................................................. 14 2.5.2.1. Độ nhớt ........................................................................................ 15 2.5.2.2. Độ pH .......................................................................................... 16 2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin .......................................................... 16 2.5.2.4. Độ hòa tan .................................................................................... 16 2.5.2.5. Màu sắc ........................................................................................ 16 2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin ...................................................................... 17 2.5.4. Ứng dụng ................................................................................................ 18 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ......................................................................... 19 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 19 3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ................................................................... 20 3.3.1. Xác định mật độ tế bào ........................................................................... 20 3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy thích hợp .................................................... 20 3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% .............................................. 20 3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 ................................................................. 21 3.3.5. Khảo sát thời gian tủa enzyme bằng cồn 96% ....................................... 21 3.3.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân của α-amylase .......................................................................................................... 22 3.3.6.1. Nhiệt độ ...................................................................................... 22 3.3.6.2. pH ............................................................................................... 22 3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin ................................................ 22 3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân của chế phẩm α-amylase với các nguồn tinh bột. ..................................................................................................... 22 3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột ................. 22 3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp. ......................................... 23 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .............................................................. 23 viii Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 24 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY ....................................... 24 4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4 ............................................................................................................ 25 4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% ................................................ 24 4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 ............................................ 27 4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% .. 28 4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE.......................................................... 29 4.4.1. Nhiệt độ .................................................................................................. 29 4.4.2. pH ........................................................................................................... 30 4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN ......... 31 4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT .................................................. 32 4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE ................. 32 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. subtilis Bacillus subtilis GH Glycosidic Hydrolase EC Enzyme Commission DAP Diamoni Phosphate MW Molecular Weight Da Dalton DE Dextrose equivalent CT Canh trƣờng dOD Delta optical density DCE Dịch chiết enzyme CPE Chế phẩm enzyme (đã sấy khô) CP tƣơi Chế phẩm enzyme tƣơi UI Unit International x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái Bacillus subtilis ........................................................................... 3 Hình 2.2. Bacillus subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử ........................................ 4 Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa ............................................................. 4 Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase ........................................................... 9 Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột ........................................... 11 Hình 2.5. Dextrin ....................................................................................................... 14 Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy .................................................... 25 Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ .............................................................. 25 Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30 Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase ................................................................................. 36 Hình 4.5. Chế phẩm dextrin ...................................................................................... 36 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis .................................................. 5 Bảng 2.2. phân loại của Bacillus subtilis ................................................................... 6 Bảng 2.3. Một số tính chất của dextrin ..................................................................... 15 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ....................... 24 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................. 26 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase ................................... 27 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ................ 28 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase ................................. 29 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ......................................... 30 Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96% ........................................... 31 Bảng 4.8. Dextrin tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10% ......................... 32 Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin ................................................................................. 33 Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10% ................................ 33 Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15% ................................ 34 Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20% ................................ 35 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột .......................................... 17 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase ...................... 25 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase ............................ 26 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase ................................. 27 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase .............. 28 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase ............................... 29 Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase ....................................... 31 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96% ...................................... 31 Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10% .............. 32 Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10% ............. 34 Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15% ............. 34 Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20% ............. 35 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose… Trƣớc đây, ngƣời ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lƣợng lớn α-amylase là rất cần thiết. Dextrin là sản phẩm do sự thủy phân tinh bột của α-amylase. Ngoài giá trị dinh dƣỡng, dextrin còn là một trong những yếu tố cải thiện tính chất, cảm quan của thực phẩm. Vì vậy, dextrin ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm và công nghiệp bánh kẹo. Sản xuất dextrin từ tinh bột có thể dùng acid hay enzyme. Tuy nhiên, sản xuất dextrin bằng acid có rất nhiều hạn chế là khó định hƣớng sản phẩm do tác dụng không đặc hiệu của acid lên nguyên liệu, độc hại nên đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền, lƣợng acid dƣ gây hƣ hỏng thiết bị và làm ô nhiễm môi trƣờng. Mặc khác, dextrin thành phẩm có màu và vị đắng. Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất dextrin sẽ khắc phục đƣợc những hạn chế trên. 2 Dextrin thu đƣợc nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung tính, ít ngọt, sạch khuẩn, khoáng và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp và trong y dƣợc. Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”. 1.2. MỤC ĐÍCH Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân của α- amylase và tinh bột để thu nhận dextrin. 1.3. YÊU CẦU - Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng bán rắn ở điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trƣớc. - Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy B.subtilis. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. BACILLUS SUBTILIS 2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất. Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dƣỡng có dạng hình que, kích thƣớc chiều rộng từ 0,7 – 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 μm. Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang. Hình 2.1. Bacillus subtilis (URL: Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thƣớc chiều rộng 0,6 – 0,9 μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào, phần lớn đƣợc tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (Trần Đỗ Quyên, 2004). 4 Hình 2.2. B. subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử. Cấu trúc hình oval ở trung tâm là bào tử (URL: ec.europa.eu/research/success/images/0291b.jpg). Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đƣờng kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cƣa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005). Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa Trong môi trƣờng lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử chiu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hƣ hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị khó chịu. Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhƣng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium). Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trƣờng lỏng chứa nitrate. Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine nhanh chóng. 5 Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính Catalase + Sinh Indol – MR + VP + Sử dụng Citrate + Khử Nitrate + Tan chảy gelatin + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Manitol + Glucose + Lactose – Maltose + (Theo Holt, 1992) Nhiệt độ tối thích của B. subtilis vào khoảng 36 - 50oC. Nhiều loài vẫn phát triển đƣợc ở 60oC. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển là 10 – 15% (Lƣơng Đức Phẩm, 2000). Ngƣời ta đã chứng minh B. subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism). Chúng dùng cách này nhƣ một phƣơng pháp đơn giản để thoát khỏi những trƣờng hợp điều kiện sống giới hạn. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau nhƣ: subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin…(theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Quỳnh Nam, 2006). 6 Phân bố trong đất và các chất hữu cơ bị phân hủy và là một đối tƣợng dùng trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm (Trần Đỗ Quyên, 2004). B. subtilis không đƣợc xem là mầm bệnh gây bệnh cho ngƣời. Chúng thƣờng có trong thực phẩm nhƣng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm. 2.1.2. Phân loại Bảng 2.2. Bảng phân loại của Bacillus subtilis 2.1.3. Bộ gen Năm 1997, ngƣời ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B. subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn. Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4100 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu đƣợc, 79 gen đƣợc dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào. Phân loại khoa học Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: subtilis Tên kép Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835 Cohn 1872) 7 2.1.4. Ứng dụng của Bacillus subtilis Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lƣợng khá lớn (15-20%) từ tinh bột. Trong y dƣợc, Bacillus subtilis đƣợc đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dƣờng ruột do lị trực trùng, đắp các vết thƣơng lở loét ngoài da (Trần Đỗ Quyên, 2004). Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây bệnh nhƣ nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,... Ngƣời ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium). Khả năng này đƣợc ứng dụng trong kiểm soát sinh học. Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trƣởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lƣợng nƣớc ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi. Hệ enzyme của B. subtilis đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa. Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nƣớc. Một chủng Bacillus subtilis đƣợc biết trƣớc đây là Bacillus natto đƣợc dùng trong sản xuất thực phẩm thƣơng mại của Nhật tƣơng tự nhƣ thực phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc. B. subtilis tái tổ hợp đƣợc sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải nhƣ là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm. 8 2.2. ALPHA-AMYLASE 2.2.1. Khái niệm α-amylase là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside nằm bên trong phân tử tinh bột và glycogen. Là một enzyme kim loại. Nếu không có sự hiện diện của ion Canxi trong phân tử enzyme sẽ không hoạt động đƣợc. α-amylase phân cắt cacbonhydrate chuỗi dài tạo maltotriose và maltose từ amylose hay tạo maltose, glucose và dextrin từ amylopectin. Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase. Ở động vật, α-amylase là enzyme tiêu hóa chính. 2.2.2. Phân loại, danh pháp α-amylase α-amylase: (1,4-α-D-glucan glucanhydrolase) thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), họ 13 (GH 13), mã số EC 3.2.1.1. Xúc tác phản ứng nội thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucosidic trong chuỗi đƣờng đa có chứa 3 hoặc nhiều hơn những đơn vị D-glucose liên kết với nhau ở vị trí α-1,4. Tên khác: glycogenase; endoamylase; Taka-amylase A. Tên hệ thống: 1,4-α-D-glucan glucanhydrolase. 2.2.3. Cấu trúc phân tử Gồm 3 tiểu đơn vị A, B, C. A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trƣng helix (α/β)8 – barrel, đƣợc nối với tiểu đơn vị C (C-terminal) có cấu trúc 8 đoạn β–sheet song song. Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β–sheet đƣợc lồng vào giữa đoạn β–sheet thứ ba và đoạn β–helix thứ hai của tiểu đơn vị A. Tiểu đơn vị B quyết định độ bền và liên kết enzyme và cơ chất. Một ion Canxi nối giữa hai tiểu đơn vị A và B. Tùy thuộc vào dạng enzyme mà có thể có một số tiểu đơn vị khác đƣợc gắn vào đầu C- hay đầu N- của phân tử protein. Trung tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhóm –COOH và -NH2 (Trần Đỗ Quyên, 2004). 9 Khối lƣợng phân tử α-amylase khác nhau ở các loài Bacillus. α-amylase vi khuẩn công nghiệp chủ yếu đƣợc sản xuất từ B. subtilis var. amyloliquefaciens và var. amylosacchariticus có trọng lƣợng phân tử (MW) là 49.000 dalton (Da) (theo Fisher và Stein, 1960) và 60.000 Da (Geranum, 1979). Khi có mặt Zn, enzyme sẽ liên kết tạo dạng dimer có MW 100.000 Da. α-amylase không chứa co-enzyme, tuy nhiên nó cũng cần 1 nguyên tử gam Ca 2+ cho 1 mol enzyme để ổn định cấu trúc và ngăn không cho protease phân hủy enzyme (Nguyễn Tiến Thắng, 2005). Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase. (URL: plaza.snu.ac.kr/~sewonsuh/home/structures.html) 2.2.4. Tính chất α-amylase Tính chấy đặc trƣng của α-amylase là khả năng dextrin hóa cao nên làm cho phản ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Kết quả tác động của α- amylase thƣờng làm giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột do đó ngƣời ta gọi α- amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. α-amylase dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối, dung dịch đệm và rƣợu loãng. α-amylase hoạt động không cần chất hoạt hóa và cần Ca với vai trò là một đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột. Canxi có tác dụng ổn định tốt α- amylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng độ bền của α-amylase 10 trƣớc các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy của protease (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). pH tối ƣu của α-amylase vi khuẩn trong khoảng 6,0 – 7,0. α-amylase bị bất hoạt nhanh ở pH thấp 4,5 – 4,7 và khi có mặt các tác nhân tạo phức với Canxi nhƣ EDTA, polyphosphate, oxalate, chlorine tự do và các chất oxy hóa (Nguyễn Tiến Thắng, 2005). α-amylase của vi khuẩn thƣờng bền nhiệt hơn α-amylase từ các loài vi sinh vật khác và cây trồng, chúng vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ mà α-amylase của nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt . Nhiệt độ tối ƣu của α-amylase trong khoảng 54 - 63 o C (Hopek, 2006). Đối với α-amylase của Bacillus subtilis nhiệt độ tối ƣu có thể đạt đến 70 - 80oC. α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần các amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase đƣợc cấu tạo từ một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. Tuy nhiên, hàm lƣợng tryptophan, tyrosine thƣờng chiếm ƣu thế. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lƣợng amino acid cấu thành phân tử enzyme (Trần Đỗ Quyên, 2004). 2.2.5. Cơ chế xúc tác Phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase thƣờng xảy ra qua hai giai đoạn  Giai đoạn đầu là giai đoạn dịch hóa: chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.  Giai đoạn tiếp theo là sự thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose và các dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thƣờng α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp, không cho màu với Iod và một ít maltose (Trần Đỗ Quyên, 2004). Tinh bột α-Dextrin + Maltose + Glucose α- amylase H2O 11 Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột 2.2.6. Ứng dụng của α-amylase Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay do ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực nhƣ thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghiệp dệt, chăn nuôi…  Trong công nghiệp thực phẩm: - Sản xuất rƣợu, bia, nƣớc trái cây. - Sản xuất bánh, bánh mì: trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ cốc nhƣng hàm lƣợng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải thiện tính chất của bánh nhƣ làm tăng độ nở xốp và mùi vị của bánh. - Chế biến tinh bột, sản xuất đƣờng maltose, syro glucose, syro fructose. Dịch giàu glucose đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, công nghiệp lên men, sản xuất nƣớc trái cây, làm mứt. Glucose tinh thể đƣợc sử dụng trong y tế, trong khẩu phần dinh dƣỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền. Syro fructose đƣợc dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lƣợng, bánh kẹo, nƣớc quả và sản phẩm sữa…  Làm mềm vải trong công nghiệp dệt: Trong sản xuất vải có giai đoạn hồ hóa làm vải chắc hơn, ngƣời ta hồ hóa bằng tinh bột. Sau khi dệt ngƣời ta phải loại bỏ chất tham gia hồ hóa bằng cách xử lý với α-amylase.  Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa: Bổ sung hỗn hợp α-amylase, cellulase, β-glucanase… vào sinh khối cỏ ủ chua nhằm tăng năng suất tiêu hóa của vật nuôi. 12 Bổ sung α-amylase, protease vào khẩu phần thức ăn cho heo con dƣới 5 tuần tuổi nhằm gia tăng tốc độ phát triển của heo con, ngăn phát sinh bệnh tiêu chảy phổ biến ở heo con (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).  Trong y học: chẩn đoán bệnh lâm sàng các bệnh thông thƣờng và các bệnh thiếu enzyme. 2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT SẢN XUẤT ENZYME Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phƣơng pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng rắn (bề mặt) có một số ƣu việt hơn so với phƣơng pháp chìm. Do lƣợng nƣớc trong cơ chất thấp nên enzyme và những sản phẩm khác ở trạng thái cô đặc vì vậy dễ tinh sạch. Nuôi cấy bề mặt dễ sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme. Không cần trang thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). 2.3.1. Nuôi cấy bề mặt Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo môi trƣờng cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng lỏng hoặc sử dụng môi trƣờng đặc (môi trƣờng bán rắn). Ở môi trƣờng lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trƣờng tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng từ dung dịch môi trƣờng, oxy không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.3.2. Nuôi cấy chìm Phƣơng pháp này ngƣời ta sử dụng môi trƣờng lỏng và đƣợc thực hiện trong những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH. Phƣơng pháp nuôi cấy chìm có ƣu điểm chiếm ít diện tích nhƣng có nhƣợc điểm là dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao. 13 2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nƣớc nên có thể tách chiết enzyme từ canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm. Để tinh sạch enzyme ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự, 2000). Phƣơng pháp tinh sạch enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phƣơng pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton). Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự, 2005). Thông thƣờng ngƣời ta thêm 3 – 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nƣớc chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải đƣợc làm lạnh xuống 3 – 5oC. Phƣơng pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung môi bằng chƣng cất. Phƣơng pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để kết tủa. Muối trung tính thƣờng dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 – 60 % so với dịch chiết enzyme (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). 2.5. DEXTRIN (theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Xuân Thủy, 2001) Dextrin là sản phẩm đƣợc tạo thành do sự thủy phân tinh bột mà giá trị tƣơng đƣơng dextrose (DE) đạt đƣợc nhỏ hơn 20. Dextrin có công thức tổng quát giống với cacbonhydrate nhƣng chiều dài chuỗi ngắn hơn và mức độ phức tạp cũng thấp hơn. 14 Hình 2.5. Dextrin ( 2.5.1. Phân loại Dextrin có thể ở dạng polymer mạch thẳng, phân nhánh hay polymer mạch vòng (cyclodextrin). Dựa vào phƣơng pháp xử lý ngƣời ta chia dextrin thành 4 nhóm chính: Dextrin thu nhận dƣới tác động của enzyme. Các dextrin vòng Sardinger thu nhận dƣới tác động của vi khuẩn Bacillus macerans lên tinh bột. Các dextrin thu đƣợc bằng cách dùng acid để thủy phân tinh bột trong môi trƣờng nƣớc. Các pirodextrin gồm các sản phẩm thu nhận đƣợc bằng xử lý nhiệt (có hay không có acid) lên tinh bột. Dựa vào tính tan, ngƣời ta phân loại dextrin nhƣ sau (Lê Hồng Phú, 2000): Amylosedextrin: tan trong rƣợu 25%, không tan trong rƣợu 40% Erythrodextrin: tan trong rƣợu 70%, không tan trong cồn tuyệt đối. Achrodextrin: tan trong cồn tuyệt đối. 2.5.2. Tính chất Đặc tính của dextrin tùy thuộc vào chỉ số DE đạt đƣợc, thƣờng có độ nhớt cao vì chứa một lƣợng lớn các polysaccharide trọng lƣợng lớn. Dextrin có bản chất keo, nhƣng mức phức tạp về phân tử thì lại thấp hơn. 15 Dextrin đƣợc xử lý enzyme tạo maltose, thủy giải bằng acid tạo glucose. Cho nhiều màu sắc khác nhau với dung dịch Iod. Dextrin có mức độ phức tạp cao cho màu xanh hoặc đỏ tía. Các dextrin có mức độ phân tử trung bình cho màu đỏ và các dextrin có mức độ phân tử thấp hơn sẽ không tạo màu với Iod. Dextrin tan trong nƣớc tạo dung dịch trong nhƣ nƣớc trái cây, nhƣng khi có glycogen dung dịch dextrin sẽ có màu trắng đục. Bảng 2.2. Một số tính chất của dextrin DE pH Tính chất 4 - 7 4,0 - 5,0 Độ nhớt cao, rất ít hút ẩm, ít ngọt, hòa tan tới 15% chất khô, bột mịn. Glucose 0,3% chất khô, maltose 0,9% chất khô 9 -12 4,0 - 4,7 Rất ít hút ẩm, ít ngọt, ít hóa màu nâu, hòa tan tới 30% chất khô Glucose 0,8% chất khô Maltose 2,9% chất khô 13 - 19,5 4,0 - 5,1 Ít hút ẩm, ít biến màu nâu, ngọt nhẹ, hòa tan tới 60 - 70% chất khô Glucose 1,3 - 1,6% chất khô, maltose 4,8 - 5,8% chất khô. 2.5.2.1. Độ nhớt Độ nhớt là một trong những yếu tố quan trọng trong ứng dụng của dextrin, lợi dụng độ nhớt này mà ngƣời ta sản xuất huyết tƣơng trong y học. Độ nhớt dextrin đƣợc đo bằng Sangtipuaz bởi các pipet chuyên dụng hoặc các công cụ chuẩn khác. Độ nhớt phụ thuộc vào nguồn tinh bột, nhiệt độ, nồng độ acid, độ pH và tuổi của dung dịch. 16 2.6.2.2. Độ pH pH ảnh hƣởng đến dextrin thành phẩm, độ keo tụ và kết dính. Trong quá trình thủy giải, độ acid làm biến đổi tinh bột hay dextrin phân tử lƣợng lớn tạo dung dịch loãng. Dù đƣợc trung hòa trở lại bằng Na2CO3 hoặc NH3 trƣớc khi đóng gói, nhƣng acid với một lƣợng dƣ vẫn ảnh hƣởng tính keo trong quá trình tích lũy. 2.6.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin Sự gia tăng độ nhớt gây ra do sự đông lại hoặc do sự thoái biến của dung dịch dextrin, đặc biệt là những dextrin ít hòa tan. Khi thêm vào dung dịch dextrin chất làm đông đặc (Tetraborate Natri 5 - 20%) thì độ nhớt của dextrin gia tăng, thêm các chất nhƣ urea, dicyandiamide, salisilic acid, formaldehyde, các muối guanadin sẽ làm giảm độ nhớt. Thêm urea có thể thích hợp để dung dịch dextrin ở trạng thái lỏng. 2.6.2.4. Độ hòa tan Giai đoạn đầu của sự dextrin hóa, không có biến đổi lớn về độ tan của dextrin trong nƣớc lạnh. Ở nhiệt độ 130 - 140oC, khi có acid thì độ hòa tan nhanh chóng đạt 100% nhƣng hồ nóng từ sản phẩm này không bền và lúc làm lạnh thì không tạo nên các gel đặc. 2.6.2.5. Màu sắc Màu của dextrin phụ thuộc độ acid và nhiệt độ dextrin hóa. Các sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ thấp thƣờng cho màu trắng, còn những sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ cao có thể màu nâu. Độ acid cao ở một nhiệt độ nhất định thƣờng làm sẫm màu sản phẩm do quá trình caramel hóa. Có thể tẩy trắng dextrin với các peroxide hydrogen và bisulfite natri trong hệ thống acid hay peborat natri trong dung dịch kiềm. 17 2.5.3. Qui trình sản xuất dextrin (Nguyễn Xuân Thủy, 2001) Dung dịch tinh bột pH thích hợp Hồ hóa t o = 90 – 100oC t = 2 - 3 phút + enzyme Dịch hóa t o thích hợp t = 30 – 150 phút Bất hoạt enzyme Gia nhiệt Hạ pH Ly tâm Dung dịch dextrin có lẫn các loại đƣờng Tủa dextrin bằng cồn 96o Ly tâm loại nƣớc và đƣờng hòa tan Dextrin sấy khô Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột 18 2.5.4. Ứng dụng Dextrin là sản phẩm trung gian giữa tinh bột và đƣờng đơn hay đƣờng đôi. Bản chất là đƣờng nên chúng tƣơng đối đƣợc cơ thể dễ hấp thu hơn tinh bột. Dextrin đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vì chúng không có độc tố và giá thành thấp. Đƣợc sử dụng nhƣ dịch keo có thể hòa tan trong nƣớc nhƣ hồ dán, dùng làm tác nhân hóa dày trong chế biến thực phẩm và tác nhân kết dính trong dƣợc phẩm. Đƣờng malto-dextrin chủ yếu dùng làm thức ăn cho trẻ em, thực phẩm ăn kiêng với lƣợng nhỏ calo pha loãng (Janusz vaf Anna, 2004), làm chất thơm hay màu thực phẩm, dùng trong công nghiệp dƣợc phẩm. Một số dextrin đƣợc sử dụng thay thế cho chất béo trong các sản phẩm nhƣ bơ và mỡ gầy. Trong công nghiệp rƣợu bia, dextrin đƣợc đƣa vào để ổn định lƣợng dextrin trong sản phẩm, vừa là cơ chất cho quá trình lên men vừa tăng chất lƣợng, tạo cảm quan tốt cho sản phẩm. Trong y học, dextrin đƣợc pha chế với glucose 5%, NaCl 9‰ hay sorbitol 5% tạo dung dịch huyết tƣơng, dung dịch này dùng để chữa trị cho bệnh nhân mất máu nhiều (Lê Hồng Phú, 2000). 19 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Khóa luận đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 19/03/2007 đến 19/07/2007. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU  Nguồn gốc vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis do công ty TNHH Gia Tƣờng cung cấp.  Nguyên liệu - Cám bắp, bã đậu nành, bột năng Vĩnh Thuận, bột nếp Vĩnh Thuận, bột gạo Vĩnh Thuận, bột bắp Tài Ký.  Thiết bị và dụng cụ - Cân điện tử - Pipet - Tủ lạnh - Micropipet - Bể điều nhiệt - Bercher - Nồi hấp - Erlen - Tủ sấy - Bình định mức - Máy ly tâm - Ống đong - Máy đo mật độ quang - Khay nhựa…  Hóa chất - Cồn 96% - Iod - NaCl - HCl - NaOH - Na2HPO4 - (NH4)2SO4 - NaH2PO4 … 20  Các loại môi trƣờng Môi trƣờng giữ giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar). Môi trƣờng nhân giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton). Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn. Thành phần và tỷ lệ các loại môi trƣờng đƣợc trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Xác định mật độ tế bào Bacillus subtilis trong dịch tăng sinh Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng cấy chuyển 1 vòng vi khuẩn B. subtilis từ ống giống vào erlen chứa 20 ml môi trƣờng tăng sinh đã khử trùng, lắc đều và đặt trên máy lắc (120 - 180 vòng/phút). Sau 24 giờ kiểm tra số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc (đƣợc trình bày ở mục 2.1 và 2.2 của phần phụ lục). 3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ƣu Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn (35 g/erlen) đƣợc khử trùng ở 1atm trong 45 phút và để nguội khoảng 40 - 50oC. Cấy 5% dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi trƣờng nuôi cấy. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 – 32oC), trong thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Canh trƣờng sau khi nuôi cấy đƣợc sấy khô ở 50oC. Cân 1 g canh trƣờng đã sấy khô hòa trong 100 ml nƣớc cất, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme pha loãng 100 lần. Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính α- amylase theo phƣơng pháp Heinkel (xem mục 2.5 phần phụ lục). 3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% Trong thí nghiệm này dùng phƣơng pháp tủa enzyme bằng cồn 96% lạnh (xem mục 2.3 phần phụ lục). Cân 5 g canh trƣờng đã sấy khô và nghiền nhỏ hòa trong 80 ml nƣớc cất, lắc đều trong 15 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch chiết enzyme. 21 Hoạt độ α-amylase sau tủa Lƣợng protein sau tủa Lấy 10 ml dịch chiết enzyme trên đem tủa với cồn 96% đã để lạnh khoảng 4 o C theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5, lắc đều, để lạnh trong 15 phút rồi lấy ra đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cồn, thu cặn lắng và hòa trong 5 ml đệm acetate pH = 5,0. Định mức với nƣớc cất thành 100 ml. Hút 1 ml dịch enzyme này đem định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry (xem mục 2.6 phần phụ lục) và xác định hoạt tính theo phƣơng pháp Heinkel. Hiệu suất thu hồi hoạt độ amylase từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức: H (%) = x 100 Hiệu suất thu hồi protein từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức: H (%) = x 100 3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 Tƣơng tự, chuẩn bị dịch chiết enzyme từ canh trƣờng giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%. Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 (xem mục 2.6 phần phụ lục). Cho từ từ vào các erlen chứa 10 ml dịch enzyme đã để lạnh, lắc đều trong 10 phút. Sau đó đem để lạnh. Sau 10 phút, đem ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. Các bƣớc kế tiếp tiến hành giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%. 3.3.5. Khảo sát thời gian tủa cồn 96% Các bƣớc tiến hành giống nhƣ phần khảo sát tỷ lệ cồn, nhƣng thể tích cồn ở thí nghiệm này không thay đổi. Tỷ lệ cồn 96% và enzyme là tỷ lệ thích hợp đã xác định đƣợc ở mục 3.3.3. Kiểm tra hoạt tính α-amylase và định lƣợng protein với thời gian tủa là 15, 30, 45, 60 và 75 phút. Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa Lƣợng protein sau tủa 22 3.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase 3.3.6.1. Nhiệt độ phản ứng Cân 0,03 g chế phẩm α-amylase tinh sạch sơ bộ bằng cồn 96% đã sấy khô hòa trong 50 ml nƣớc cất, pha loãng thêm 100 lần. Đo hoạt tính α-amylase theo phƣơng pháp Heinkel ở các giá trị nhiệt độ: 30, 40, 45, 50, 55, 60 và 65oC. 3.3.6.2. pH Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của các giá trị pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 và 6,6 lên hoạt độ α-amylase ở nhiệt độ thích hợp. Kiểm tra hoạt tính α-amylase ở mỗi giá trị pH theo phƣơng pháp Heinkel. 3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn 96% thích hợp để thu dextrin Tinh bột sau khi hồ hóa đƣợc để nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho chế phẩm enzyme (CPE) đã pha loãng vào (xem mục 2.7 phần phụ lục). Sau 30 phút đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tinh bột thừa. Dịch ly tâm đƣợc cho vào các erlen có chứa cồn theo các tỷ lệ 1:2, 1:3 và 1:4, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch cồn và cân lƣợng dextrin thu đƣợc. 3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase 3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột Thực hiện phản ứng thủy phân với các nguồn tinh bột khác nhau: bột gạo, bột năng, bột nếp, bột bắp ở nồng độ 10%. Tiến hành: 2 g tinh bột đƣợc hồ hóa trong 18 ml dung dịch đệm ở giá trị pH tối ƣu; làm nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho vào 0,5 ml chế phẩm α-amylase đã pha loãng 200, 400, 600 lần, khuấy đều, liên tục. Sau 10 phút, cho 5 ml HCl 5% để dừng phản ứng. Ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, dịch ly tâm đƣợc tủa cồn để thu dextrin. Cân lƣợng dextrin tạo thành và so sánh khối lƣợng dextrin có đƣợc giữa các nguồn tinh bột. 23 Dextrin thu đƣợc (g) Tinh bột ban đầu (g) Hiệu suất thu dextrin tính theo công thức: H (%) = x 100 3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp Sau khi chọn đƣợc nguồn tinh bột thích hợp, tiến hành khảo sát lƣợng dextrin tạo thành ở các nồng độ tinh bột là 10%, 15% và 20%. Cho thể tích và độ pha loãng CPE thích hợp vào 20 g hồ tinh bột với nồng độ tinh bột 10% và 15% và 20%. Thời gian khảo sát là 10, 20, 30 và 40 phút. 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu đƣợc xử lý sai số và vẽ đồ thị, biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel 2003. 24 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY B. SUBTILIS Tiến hành thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.2, canh trƣờng nuôi cấy sau các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72 giờ đƣợc kiểm tra hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel. Thời gian nuôi cấy 48 giờ α-amylase có hoạt độ cao nhất là 468865 UI/g canh trƣờng (CT). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1. Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase Thời gian (giờ) Độ pha loãng ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) 24 10000 0,296 ± 0,0006 5,227 ± 0,011 52272 ± 105 36 80000 0,261 ± 0,0018 4,585 ± 0,032 366817 ± 3802 48 100000 0,267 ± 0,0012 4,689 ± 0,021 468865 ± 2108 60 100000 0,252 ± 0,0017 4,427 ± 0,030 442700 ± 3042 72 100000 0,231 ± 0,0009 4,044 ± 0,016 404365 ± 1610 Trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 24 - 36 giờ hoạt độ của amylase tăng nhanh là do Bacillus subtilis trong giai đoạn phát triển và phân chia tối đa. Tại thời điểm 48 giờ, mật độ B. subtilis ổn định và lƣợng α-amylase sinh ra đạt cực đại nên hoạt độ α-amylase lúc này cao nhất. Từ 48 giờ trở đi, vi khuẩn chết dần do cạn dinh dƣỡng và hầu nhƣ không sinh α-amylase nữa; trong khi đó, lƣợng nƣớc có trong canh trƣờng trong thời gian dài làm hoạt độ α-amylase giảm dần. 25 52272 468865 404365 442700 366817 0 100000 200000 300000 400000 500000 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ ( UI /g C T) Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase 4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH SƠ BỘ α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4 4.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa là 50205,64 (UI/10ml dịch chiết enzyme), hàm lƣợng protein có trong 10 ml dịch chiết enzyme trƣớc tủa là 97,032 mg/10ml. Sau khi tủa, ly tâm loại bỏ cồn và đo hoạt tính bằmg phƣơng pháp Heinkel kết hợp định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry theo phần 3 mục 3.3.3; chúng tôi ghi nhận ở tỷ lệ cồn 96% và enzyme là 3:1, α-amylase có hoạt độ cao nhất là 45607,75 Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy 26 4367 43219 44284 45608 44056 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 1 2 3 4 5 Vcồn/Venzyme H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) UI/100ml chế phẩm α-amylase tƣơi). Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 4.2 và đồ thị 4.2. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Enzyme/cồn Protein (mg/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn còn thấp chỉ kết tủa đƣợc một lƣợng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt độ α-amylase thấp. Nhƣng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lƣợng protein thu đƣợc cao hơn, song hoạt độ α-amylase lại thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt độ α-amylase giảm. 27 31835 36916 37575 37281 3693 10000 20000 30000 40000 50000 50 55 60 65 70 (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) 4.2.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa α-amylase bằng (NH4)2SO4 Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phần 3 mục 3.3.4. Kết quả ghi nhận ở bảng 4.3 và đồ thị 4.3. Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Hàm lƣợng protein (mg/100 ml CPtƣơi ) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt độ (UI/100 ml CP tƣơi ) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,293 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72,29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α-amylase có hoạt độ cao nhất. Ở 70%, hoạt độ α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein. Theo bảng 4.2 và 4.3, tủa bằng cồn 96% hoạt độ của α-amylase và lƣợng protein thu hồi đƣợc cao hơn khi tủa bằng (NH4)2SO4. Vì vậy, chúng tôi chọn cồn 96% là tác nhân thích hợp dùng để tủa α-amylase. 28 50369 48742 45942 45729 44497 30000 40000 50000 60000 15 30 45 60 75 Thời gian (phút) H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) 4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA CỒN 96% Tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian tủa theo phần 3 mục 3.3.5. Theo kết quả ghi nhận ở bảng 4.4, thời gian tủa tốt nhất đối với α-amylase là 15 phút. Thời gian tủa càng dài lƣợng protein thu đƣợc càng nhiều nhƣng hoạt độ của α-amylase không tăng do lƣợng α-amylase bị biến tính tăng theo thời gian tiếp xúc với cồn 96%. Bảng