Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOAÙ HOÏC
LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC PHAÂN LAÄP CHUÛNG VI KHUAÅN LACTIC VAØ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN SVTH: LEÂ THÒ HOÀNG VAÂN CBHD: THS. NGUYEÃN VUÕ TUAÂN TP Hoà Chí Minh, 01/2008 TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN Trong coâng ngheä thöïc phaåm vi khuaån lactic ñöôïc söû duïng roäng raõi töø raát laâu ñôøi bôûi öùng duïng phong phuù cuûa noù trong cuoäc soáng. Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy vi khuaån lactic coøn coù khaû naêng sinh toång hôïp caùc bacteriocin, nhöõng peptide hoaït tính kìm haõm ñaëc hieäu hay öùc cheá maïnh meõ söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Ñeå coù nhöõng khaûo saùt saâu hôn tröôùc heát caàn phaûi coù chuûng vi khuaån lactic sinh toång hôïp ñöôïc bacteriocin cao. Vì vaäy chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu nhaèm muïc ñích: - Phaân laäp chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp ñöôïc bacteriocin - Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy leân söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng phaân laäp ñöôïc. Chuûng vi khuaån seõ ñöôïc phaân laäp töø caùc nguoàn töï nhieân nhö söõa töôi töï leân men, caùc loaïi rau quaû muoái chua (caûi muoái chua, caø phaùo muoái chua, döa giaù), kim chi vaø giaù ñoã. Qua quaù trình thí nghieäm, ta coù ñöôïc chuûng vi khuaån lactic phaân laäp töø söõa töôi töï leân men theå hieän vuøng öùc cheá Listeria monocytogenes chöùng toû coù khaû naêng sinh toång hôïp ñöôïc bacteriocin. Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä vaø pH leân söï sinh tröôûng vaø söï sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng nhaèm naâng cao khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Töø keát quaû ñaït ñöôïc thì khi nuoâi caáy chuûng trong moâi tröôøng dòch theå MRS coù pH ban ñaàu 6.0 ôû nhieät ñoä 30oC chuûng seõ sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin toát nhaát. Khi ñoù, ñoä ño quang O.D. 600 nm = 1.417 vaø hoaït tính bacteriocin ñaït 2250 AU/ml. Toùm laïi, nghieân cöùu ñaõ phaân laäp ñöôïc chuûng vi khuaån lactic yeâu caàu töø söõa leân men töï nhieân vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái thích ñeå chuûng sinh tröôûng, sinh toång hôïp bacteriocin cao nhaát laø trong moâi tröôøng dòch theå MRS coù pH ban ñaàu 6.0 ôû 30oC. Vôùi nhöõng yù nghóa cuûa nghieân cöùu, em hy voïng seõ laøm ñöôïc nhöõng khaûo saùt coù yù nghóa vaø goùp phaàn taïo neàn taûng cho nhöõng nghieân cöùu sau naøy, mang laïi nhöõng giaù trò thaät lôùn trong vieäc baûo quaûn thöïc phaåm, ñaûm baûo an toaøn thöïc phaåm vaø naâng cao giaù trò soáng cuûa con ngöôøi. MUÏC LUÏC LÔØI CAÛM ÔN i TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN ii MUÏC LUÏC iv DANH MUÏC HÌNH vi DANH MUÏC BAÛNG vii MÔÛ ÑAÀU 1 Chöông 1: TOÅNG QUAN VI KHUAÅN LACTIC 3 1.1.1 Ñaëc ñieåm chung 3 1.1.2 Caùc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin 8 BACTERIOCIN 12 1.2.1 Sô löôïc veà bacteriocin 12 1.2.2 Bacteriocin töø LAB 13 1.2.3 Bacteriocin töø vi khuaån khaùc 22 1.2.4 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin 23 1.2.5 Ñònh vò vaø tinh saïch bacteriocin 26 1.2.6 ÖÙng duïng cuûa bacteriocin 27 1.2.7 Tình hình nghieân cöùu 30 1.3 PHAÂN LAÄP VI KHUAÅN LACTIC 33 Chöông 2: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 2.1 NGUYEÂN LIEÄU 37 2.1.1 Chuûng vi sinh vaät vaø moâi tröôøng nuoâi caáy, giöõ gioáng 37 2.1.2 Nguoàn nguyeân lieäu phaân laäp 37 2.2 THIEÁT KEÁ THÍ NGHIEÄM 39 2.3 PHÖÔNG PHAÙP 40 2.3.1 Phöông phaùp daøn ñeàu vaø caáy ria 40 2.3.2 Phöông phaùp ñònh danh teá baøo vi khuaån 41 2.3.3 Khaûo saùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy aûnh höôûng leân söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng môùi phaân laäp 43 Chöông 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN 3.1 PHAÂN LAÄP 45 3.2 KHAÛO SAÙT SÖÏ SINH TRÖÔÛNG VAØ SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN CUÛA CHUÛNG MÔÙI PHAÂN LAÄP THEO THÔØI GIAN NUOÂI CAÁY 51 Chöông 4: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 4.1 KEÁT LUAÄN 60 4.2 KIEÁN NGHÒ 60 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 62 PHUÏ LUÏC 68 MÔÛ ÑAÀU Ngaøy nay, nhu caàu aên uoáng cuûa xaõ hoäi ngaøy caøng ñöôïc naâng cao. Cuõng töø ñoù, vieäc an toaøn veä sinh thöïc phaåm ñang ñöôïc chuù troïng vaø ñaåy maïnh. Baûo quaûn thöïc phaåm noùi chung vaø phuï gia thöïc phaåm hay bao bì thöïc phaåm noùi rieâng ñang laø nhöõng vaán ñeà noùng boûng cuûa xaõ hoäi. Neáu nhö nhöõng chaát phuï gia thöïc phaåm coù nguoàn goác hoùa hoïc taùc duïng phoå roäng vôùi nhieàu loaøi sinh vaät vaø gaây aûnh höôûng ñeán söùc khoûe cuûa con ngöôøi thì nhöõng höôùng nghieân cöùu treân nhöõng chaát choáng vi sinh vaät môùi coù nguoàn goác töï nhieân, an toaøn vaø ñaëc hieäu ñoái vôùi töøng loaøi vi sinh vaät gaây haïi ñang ñöôïc quan taâm. [27] Vaø vieäc tìm ra bacteriocin laø moät böôùc ngoaët lôùn trong baûo quaûn thöïc phaåm. Ñaây laø nhöõng chaát coù nguoàn goác sinh hoïc ñaõ ñöôïc cho pheùp söû duïng trong baûo quaûn thöïc phaåm ôû nhieàu nöôùc phaùt trieån. Loaøi coù khaû naêng sinh toång hôïp ra noù cuõng khoâng coù gì xa laï vôùi chuùng ta, ñoù laø caùc vi khuaån lactic, nhöõng vi khuaån maø con ngöôøi söû duïng trong thöïc phaåm haøng ngaøn naêm nay [16]. Bacteriocin töø Lactococcus lactis laø caùc protein nhoû, beàn nhieät, choáng vi sinh vaät. Nisin laø moät bacteriocin ñöôïc söû duïng roäng raõi do coù hoaït tính vôùi phoå roäng khaùng caùc vi khuaån G+, bao goàm Listeria monocytogenes, ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa baøo töû naûy maàm Bacillus vaø Clostridium. [18] Caùc chuûng vi khuaån lactic laø caùc vi sinh vaät quan troïng nhaát trong saûn xuaát caùc thöïc phaåm leân men haèng ngaøy nhö bô, söõa chua, kem, phomai. Chuùng saûn xuaát raát nhieàu caùc hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån, bao goàm bacteriocin. Caùc hôïp chaát naøy xuaát hieän nhö laø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình bieán döôõng. [7] Nhöõng chuûng vi khuaån lactic khaùc nhau seõ coù khaû naêng sinh toång hôïp nhöõng loaïi bacteriocin khaùc nhau, vôùi soá löôïng khaùc nhau [27]. Vì vaäy maø vieäc tìm ra caùc nguoàn töï nhieân ñeå coù theå phaân laäp ra nhöõng chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp haøm löôïng chaát choáng vi sinh vaät cao laø caàn thieát. Töø nhöõng ñieàu thöïc tieãn ñoù, vieäc tìm ra ñöôïc caùc chuûng vi khuaån lactic coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin vaø saûn xuaát ñöôïc caùc loaïi bacteriocin söû duïng trong vieäc baûo quaûn thöïc phaåm an toaøn laø caàn thieát vaø coù yù nghóa quan troïng. Trong baøi nghieân cöùu naøy, chuùng ta seõ xaây döïng nhöõng böôùc khôûi ñaàu cho vieäc khaûo saùt saâu roäng hôn vaø coù giaù trò öùng duïng hôn. Muïc tieâu nghieân cöùu cuûa luaän vaên goàm: - Töø nhöõng nguoàn töï nhieân nhö söõa, kim chi, caùc rau quaû muoái chua, giaù ñoã phaân laäp chuûng vi khuaån lactic coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. - Khaûo saùt söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin chuûng phaân laäp ñöôïc. - Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy nhö pH, nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin ñeå töø ñoù coù theå ruùt ra ñöôïc caùc ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp cho chuûng vi khuaån. Chöông 1: TOÅNG QUAN 1.1 VI KHUAÅN LACTIC 1.1.1 Ñaëc ñieåm chung 1.1.1.1 Hình thaùi vaø dinh döôõng cuûa vi khuaån lactic Vi khuaån lactic (Lactic acid bacteria–LAB) laø caùc vi khuaån G+, chòu acid, khoâng hình thaønh baøo töû, hình que hoaëc hình caàu [2]. Moät soá loaøi hieáu khí vaø coù theå söû duïng oxygen thoâng qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi nhöõng gioáng khaùc kî khí nghieâm ngaët. Vi khuaån lactic phaùt trieån toái öu ôû pH 5.5–5.8 vaø vaø coù nhu caàu dinh döôõng phöùc taïp ñoái vôùi caùc amino acid, peptide, nucleotide base, vitamin, khoaùng, acid beùo vaø carbohydrate. [1, 45] Nhöõng vi khuaån naøy saûn xuaát acid lactic nhö laø saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình leân men carbohydrate. Ñaëc ñieåm naøy ñaõ gaén lieàn LAB vôùi thöïc phaåm leân men ñeå acid hoaù ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa taùc nhaân gaây hö hoûng. Protein bacteriocin ñöôïc saûn xuaát bôûi nhieàu chuûng LAB, cung caáp moät haøng raøo ngaên caûn vi sinh vaät gaây hö hoûng vaø gaây beänh. [11] LAB ñöôïc söû duïng roäng raõi trong saûn xuaát saûn phaåm leân men bôûi vì hoaït tính trao ñoåi chaát ñaëc bieät cuûa noù. Söï acid hoaù, saûn phaåm cuûa acid höõu cô, vaø caùc chaát khaùng khuaån khaùc nhö bacteriocin, goùp phaàn to lôùn trong baûo quaûn thöïc phaåm baèng caùch öùc cheá maàm beänh vaø chaát gaây oâ nhieãm. Söï chuyeån hoaù lactose nhôø nuoâi caáy vi khuaån lactic ñaõ laøm cho thöïc phaåm leân men deã tieâu hoaù hôn. Nhieàu hoaït tính bieán döôõng vaø enzyme cuûa LAB daãn ñeán söï saûn xuaát caùc chaát deã bay hôi hình thaønh muøi thôm vaø höông vò ñaëc tröng cho saûn phaåm leân men. [45] Caùc gioáng cuûa LAB chuû yeáu laø Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weisella…[11, 45].


Hình 1.1: Hình aûnh moät soá vi khuaån lactic: (a) Lactococcus lactis, (b) Streptococcus thermophilus, (c) Lactobacillus helveticus [11] 1.1.1.2 Trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic Vi khuaån lactic ñöôïc chia thaønh ba nhoùm döïa treân moâ hình leân men. - Leân men ñoàng hình: saûn xuaát hôn 85% acid lactic töø glucose - Leân men dò hình: saûn xuaát chæ 50% acid lactic vaø moät löôïng ethanol, acid acetic vaø CO2 - Ñöôïc bieát ñeán nhö laø gioáng leân men dò hình saûn xuaát DL–lactic acid, acid acetic vaø CO2. [45] Döôùi ñieàu kieän dö glucose vaø haïn cheá oxygen, LAB bieán ñoåi moät phaân töû glucose theo con ñöôøng Embden–Meyerhof–Parnas thaønh hai phaân töû pyruvate. Caân baèng oxy hoaù khöû noäi baøo ñöôïc duy trì trong suoát quaù trình oxi hoaù NADH, ñoàng thôøi vôùi söï khöû pyruvate thaønh acid lactic. Quaù trình naøy sinh 2 phaân töû ATP cho moãi glucose ñöôïc tieâu thuï. Ñaïi dieän cho kieåu leân men naøy laø caùc gioáng Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus vaø Lactobacillus nhoùm I. LAB leân men dò hình phaân giaûi glucose theo con ñöôøng pentose phosphate. Moät phaân töû glucose-6-phosphate ban ñaàu bò khöû hydro thaønh 6-phosphogluconate vaø sau ñoù khöû nhoùm carboxyl hình thaønh moät phaân töû CO2. Keát quaû laø pentose–5–phosphate bò chia ra thaønh moät glyceraldehyde phosphate (GAP) vaø moät phaân töû acetyl phosphate. GAP sau ñoù ñöôïc chuyeån hoaù thaønh lactate nhö trong leân men ñoàng hình, vôùi acetyl phosphate bò bieán ñoåi thaønh ethanol qua chaát trung gian laø acetyl–CoA vaø acetaldehyde. Veà maët lyù thuyeát, saûn phaåm cuoái (bao goàm ATP) ñöôïc saûn xuaát coù soá löôïng baèng vôùi töø quaù trình dò hoaù moät phaân töû glucose. Caùc LAB leân men dò hình baét buoäc goàm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, vaø Lactobacillus nhoùm III [45, 47]. Phaân giaûi protein [11] Protein bò caét thaønh nhöõng hôïp chaát nhoû hôn Hoaït tính naøy cuûa Lactobacillus trong heä thoáng ñöôøng ruoät laøm thuyû phaân protein bôûi heä vi sinh vaät tieâu hoaù deã daøng, moät ñaëc tính coù giaù trò cao cho treû em, ngöôøi beänh vaø ngöôøi giaø. Phaân giaûi lipid [11] Phöùc hôïp chaát beùo bò caét thaønh caùc hôïp chaát nhoû hôn Hoaït tính naøy ñöôïc söû duïng trong vieäc thieát keá cheá ñoä dinh döôõng cho treû em, ngöôøi beänh vaø ngöôøi giaø. Baèng chöùng töø thöû nghieäm y khoa vaø laâm saøng cho thaáy Lactobacillus coù theå phaân huûy cholesterol. Bieán döôõng lactose [11] LAB coù enzyme β–galactosidase, glycolase vaø lactic dehydrogenase (LDH) saûn xuaát acid lactic töø lactose. Acid lactic ñöôïc xem laø coù moät soá chöùc naêng sinh lyù nhö: - Laøm taêng söï tieâu hoaù protein söõa baèng caùch keát tuûa chuùng trong söõa ñoâng - Caûi thieän khaû naêng söû duïng calcium, phosphor vaø saét - Kích thích söï baøi tieát dòch töø daï daøy - Laøm gia taêng nhu ñoäng ruoät - Cung caáp nguoàn naêng löôïng cho quaù trình hoâ haáp Vò trí ñoàng phaân quang hoïc cuûa acid lactic ñöôïc saûn xuaát döïa vaøo baûn chaát cuûa moâi tröôøng. Hình daïng caáu truùc cuûa caùc isomer naøy nhö sau:
D (-) levorotatory lactic acid         L (+) dextrorotatory lactic acid ÔÛ ngöôøi, caû hai isomer ñeàu ñöôïc haáp thuï leân thaønh ruoät. Trong khi L (+) lactic acid ñöôïc chuyeån hoaù hoaøn toaøn nhanh choùng trong toång hôïp glycogen, D (-) lactic acid ñöôïc toång hôïp ít hôn, vaø acid khoâng ñöôïc chuyeån hoaù seõ ñöôïc thaûi ra trong nöôùc tieåu. Khaû naêng chuyeån lactose thaønh acid lactic ñöôïc söû duïng ñieàu trò thaønh coâng beänh khoâng dung hôïp lactose. Nhöõng ngöôøi maéc beänh naøy khoâng theå chuyeån hoaù lactose bôûi vì thieáu heä thoáng enzyme caàn thieát hoaëc chuùng hoaït ñoäng khoâng bình thöôøng. Acid lactic laøm thaáp pH moâi tröôøng ruoät xuoáng khoaûng 4 ñeán 5 ñeå ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät gaây thoái röõa vaø E. coli, vi sinh vaät ñoøi hoûi pH moâi tröôøng toái öu laø 6 ñeán 7. Moät vaøi acid deã bay hôi saûn xuaát trong quaù trình leân men cuõng coù hoaït tính öùc cheá döôùi ñieàu kieän theá oxy hoaù khöû thaáp [45]. 1.1.1.3 Saûn xuaát caùc chaát ñoái khaùng LAB cuõng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät coù haïi gaây thoái röõa thoâng qua caùc saûn phaåm chuyeån hoaù nhö hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl vaø ñaëc bieät laø bacteriocin. Saûn phaåm chuyeån hoaù cuûa LAB söû duïng ñeå choáng laïi caùc vi sinh vaät gaây thoái röõa vaø chöùc naêng sinh hoùa coù theå öùc cheá vi sinh vaät cuûa chuùng ñöôïc toùm taét trong baûng döôùi ñaây. Baûng 1.1: Moät soá saûn phaåm chuyeån hoùa cuûa LAB vaø phöông thöùc hoaït ñoäng cuûa chuùng [44, 45] Saûn phaåm chuyeån hoaù  Phöông thöùc hoaït ñoäng   1.Carbon dioxide  Ngaên caûn söï khöû nhoùm carboxyl, giaûm tính thaám cuûa maøng   2. Diacetyl  Phaûn öùng vôùi protein gaén arginine   3. Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase  Oxy hoaù caùc protein cô baûn   4. Acid lactic  Acid lactic bò phaân ly ñi xuyeân qua maøng, laøm thaáp pH noäi baøo. Noù gaây trôû ngaïi quaù trình chuyeån hoaù nhö oxi hoaù khöû phosphor   5. Bacteriocin  AÛnh höôûng ñeán maøng, toång hôïp protein vaø DNA.   Bacteriocin saûn xuaát bôûi LAB laø chuû ñeà cuûa caùc nghieân cöùu lôùn bôûi vì hoaït tính khaùng khuaån cuûa chuùng choáng laïi söï saûn sinh vi khuaån laøm hö hoûng thöïc phaåm. Chuûng saûn xuaát bacteriocin cuûa LAB raát quan troïng trong vieäc caïnh tranh vôùi caùc vi sinh vaät khaùc trong ñöôøng ruoät. Bacteriocin laø protein coù hoaït tính sinh hoïc, coù khaû naêng ngaên ngöøa söï xaâm nhieãm cuûa vi sinh vaät baèng caùch öùc cheá chuùng vaø lieân keát vôùi receptor ñaëc bieät cuûa teá baøo. Hieän nay, coù nhöõng moái quan taâm veà vieäc öùng duïng bacteriocin trong caû baûo quaûn thöïc phaåm vaø öùc cheá maàm beänh vi khuaån. Haàu heát caùc bacteriocin ñeàu ñöôïc chieát xuaát töø vi khuaån lieân quan trong leân men thöïc phaåm. Söï saûn xuaát bacteriocin vaø tính khaùng ñöôïc xem laø caùc ñaëc tính quan troïng cuûa chuûng, coù theå ñöôïc söû duïng trong thöông maïi nhö laø chaát loaïi boû hoaëc laøm giaûm söï phaùt trieån cuûa chuûng gaây beänh khoâng mong muoán. [34] Hieän nay, caùc nghieân cöùu ñi saâu vaøo vieäc môû roäng hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin, ñaùng chuù yù laø nisin cuøng vôùi nhöõng nhaân toá khaùng khuaån khaùc nhö heä thoáng lactoperoxide hieän dieän trong söõa, caùc taùc nhaân khaùc vaø caùc bacteriocin khaùc [16]. 1.1.2 Caùc chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin 1.1.2.1 Chuûng Lactococcus lactis (a) Giôùi thieäu [11] Chuûng Lactococcus lactis (Lc. lactis) laø caùc vi sinh vaät quan troïng nhaát trong saûn xuaát thöïc phaåm leân men haèng ngaøy nhö bô, söõa chua, kem, fromage. Chuùng saûn xuaát nhieàu hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån, bao goàm bacteriocin. Caùc hôïp chaát naøy xuaát hieän nhö laø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình bieán döôõng. Döïa vaøo ñaëc tính sinh hoùa, Lc. lactis ñöôïc phaân thaønh: Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris vaø Lc. lactis subsp. cremoris. Lc. lactis subsp. lactis coù khaû naêng phaùt trieån ñöôïc ôû nhieät ñoä 40oC, soáng ñöôïc ôû noàng ñoä muoái aên leân ñeán 4.0% vaø saûn xuaát ñöôïc amonia töø arginine trong khi Lc. lactis subsp. cremoris khoâng coù tính chaát naøy. Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis ñöôïc phaân bieät döïa vaøo khaû naêng chuyeån hoùa citrate. Moät trong nhöõng ñaëc ñieåm quan troïng nhaát trong coâng nghieäp cuûa chuûng Lc. lactis laø plasmid ñöôïc maõ hoaù, coù nghóa laø plasmid mang gen coù caùc ñaëc tính nhö bieán döôõng lactose vaø saûn xuaát proteinase cuõng nhö tính khaùng bacteriophage. Caùc plasmid bieán döôõng quan troïng khaùc vaø chöùc naêng cuûa chuùng ôû Lactococcus cuõng ñaõ ñöôïc moâ taû. Do ñoù, hieän nay chuùng ta ñaõ coù nhöõng hieåu bieát veà gen plasmid kieåm soaùt bieán döôõng ñöôøng sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose, söû duïng citrate, tính khaùng phage, bieán döôõng vaø giôùi haïn DNA, söï taäp hôïp teá baøo, saûn xuaát bacteriocin... Theâm vaøo ñoù, Lactococcus chöùa nhieàu plasmid, kích côõ töø 1 ñeán >100 kbp. Plasmid maõ hoaù cho bacteriocin thöôøng lôùn vaø kích thöôùc cuûa chuùng töø 81 ñeán 133 kbp. Chuûng Lc. lactis thöôøng coù töø 2 ñeán 11 plasmid DNA, trong khi soá löôïng phoå bieán thöôøng laø töø 4 ñeán 7. (b) Tính chaát cuûa chuûng Lc. lactis [10, 11] Bieán döôõng protein Gioáng nhö taát caû caùc LAB khaùc, Lactococcus coù nhu caàu dinh döôõng phöùc taïp. Ñeå phaùt trieån, chuùng ñoøi hoûi caùc protein, peptide, caùc amino acid ñaëc bieät, caùc nucleic acid vaø vitamine,... Trong söõa, noàng ñoä isoleucine, leucine, valine, histidine vaø methionine caàn thieát cho Lactococcus laø thaáp hôn 1 mg/l. Noù bao goàm caùc amino acid töï do, coù maët ban ñaàu trong söõa, cung caáp nguoàn nitô cho khoaûng 2% maät ñoä teá baøo cuoái cuøng. Casein, coù khoaûng 80% protein hieän dieän trong söõa, trôû thaønh nguoàn nitô sô caáp sau khi duøng heát nitô töø caùc nguoàn khoâng phaûi protein. Bieán döôõng lactose Bieán döôõng lactose cuûa chuûng Lc. lactis khaùc vôùi bieán döôõng lactose cuûa caùc vi khuaån lactic khaùc. Khaùc bieät laø ôû söï dò hoaù cuøng luùc glucose vaø galactose. Chöùc naêng cuûa con ñöôøng ñoù ñoái vôùi Lactococcus laø ñeå sinh naêng löôïng vaø acid lactic laø saûn phaåm phuï. Bieán döôõng citrate Trong nhoùm Lactococcus thì chæ Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis laø coù khaû naêng bieán döôõng citrate hieän dieän trong söõa. Saûn phaåm cuoái cuøng cuûa bieán döôõng citrate laø diacetyl, acetoin, 2,3 butanediol, acid acetic vaø carbondioxide, chuùng taïo neân höông vò cho caùc loaïi thöïc phaåm bô söõa leân men. Citrate ñöôïc vaän chuyeån vaøo teá baøo maø khoâng caàn coù söï bieán ñoåi. ÔÛ Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, phaûn öùng naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi citrate permease. Sinh toång hôïp bacteriocin Caùc chuûng thuoäc loaøi Lc. lactis coù khaû naêng sinh toång hôïp raát nhieàu caùc hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån bao goàm caû bacteriocin. Caùc hôïp chaát naøy xuaát hieän nhö laø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình bieán döôõng. Bacteriocin töø Lactococcus laø caùc protein nhoû, beàn nhieät, choáng laïi caùc vi khuaån laân caän. Nisin laø bacteriocin ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát, coù 34 amino acid, khoái löôïng phaân töû 3354 kDa, thuoäc nhoùm lantibiotic, ñöôïc öùng duïng nhieàu trong baûo quaûn thöïc phaåm. Nisin gaây caûn trôû vieäc cung caáp naêng löôïng cuûa teá baøo baèng caùch taïo neân baøo töû treân maøng vaø laøm maát ñieän theá maøng. Nisin coù hoaït tính vôùi phoå roäng khaùng caùc vi khuaån G+, bao goàm caû L. monocytogenes, ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa baøo töû naûy maàm Bacillus vaø Clostridium vaø thoâng qua vieäc theâm calcium, noù seõ coù hoaït tính khaùng laïi moät soá vi khuaån G+. Moät hôïp chaát khaùc, lacticin 3147 ñöôïc xaùc ñònh laø töø Lactococcus thu nhaän töø chuûng Irish Kefir söû duïng trong saûn xuaát bô. Bacteriocin naøy ngaên caûn caùc maàm beänh töø vi khuaån G+ nhö Staphylococcus, Clostridium, Listeria spp., Streptococcus. [10] Ngaøy nay, nisin laø bacteriocin töø LAB duy nhaát ñöôïc cho pheùp laøm chaát phuï gia thöïc phaåm. Hai saûn phaåm khaùc laø ALTA 2431 vaø Microgard ñaõ ñöôïc phaùt trieån laøm chaát keùo daøi tuoåi thoï thöïc phaåm döïa treân saûn phaåm leân men thoâ cuûa LAB. 1.1.2.2 Caùc chuûng vi khuaån lactic khaùc coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin Moät soá chuûng vi khuaån lactic khaùc coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin ñöôïc toång hôïp trong baûng 1.2. Baûng 1.2: Moät soá bacteriocin, chuûng saûn xuaát vaø ñaëc tính tieâu bieåu Bacteriocin  Vi sinh vaät  MW (Da)  Ñaëc tính   Laticin 3714  Lc. lactis  2847  Beàn nhieät ôû 1000C trong 10 phuùt ôû pH 5 hay 900C ôû pH baèng 7 trong 10 phuùt. Nhaïy caûm vôùi trypsin, α–chymotrypsin, proteinase K, vaø pronase E, khaùng pepsin [37].   Plantaricin C  Lactobacillus plantarum  3500-4000  OÅn ñònh ôû nhieät ñoä phoøng vaø nhieät ñoä thaáp, beàn nhieät ôû 1000C trong 60 phuùt hay 1210C trong 10 phuùt. Haàu heát oån ñònh ôû pH acid hay trung tính. Nhaïy caûm vôùi pronase, trypsin, vaø α–chymotrypsin, khaùng laïi pepsin, proteinase K, α–amylase, vaø lipase [21].   Bavaricin A  Lactobacilus bavaricus  3500-4000  Beàn nhieät ôû 1000C trong 60 phuùt. OÅn ñònh ôû pH baèng 2.0 ñeán 9.7, nhaïy caûm vôùi pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K vaø chymotrypsin A, khaùng laïi vôùi catalase [30].   Piscicolin 126  Carnobacterium piscicola JG126  4416  OÅn ñònh ôû pH baèng 2 sau khi löu tröõ 2 thaùng taïi 40C. Beàn nhieät taïi 1000C trong 120 phuùt taïi pH 2–3, trôû neân ít oån ñònh hôn khi pH taêng. Nhaïy caûm vôùi α–chymotrypsin, β–chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII, vaø trypsin, khaùng catalase, lipase vaø lyzozyme [25].   Variacin  Micrpcoccus varians  2658  OÅn ñònh ôû pH töø 2 ñeán 10, beàn nhieät 1150C trong 20 phuùt, nhaïy caûm vôùi pronase E, proteinase K, ficin, khaùng catalase [14].   1.2 BACTERIOCIN 1.2.1 Sô löôïc veà bacteriocin Bacteriocin laø teân chung cuûa caùc peptide do vi khuaån toång hôïp coù hoaït tính kìm haõm ñaëc hieäu hay öùc cheá maïnh meõ söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa moät soá vi khuaån khaùc. Ñieåm ñaëc bieät cuûa caùc bacteriocin laø chuùng khoâng coù hoaït tính khaùng sinh ñieån hình, nghóa laø chuùng chæ kìm haõm nhöng khoâng tröïc tieáp laøm cheát vi sinh vaät. Chính vì lyù do naøy neân thôøi kyø ñaàu ngöôøi ta chæ taäp trung vaøo phaùt trieån caùc chaát khaùng sinh, coøn caùc cheá phaåm bacteriocin bò xem nheï vaø khoâng ñöôïc quan taâm ñuùng möùc. Theo thôøi gian söû duïng chaát khaùng sinh hieän töôïng khaùng thuoác xuaát hieän vaø ngaøy caøng trôû neân traàm troïng ñaõ giaùn tieáp xaùc nhaän ñaëc tính quyù giaù cuûa caùc bacteriocin laø nguy cô gaây ra hieäu öùng treân cuûa chuùng raát thaáp. Nhôø vaäy maø vieäc nghieân cöùu, saûn xuaát vaø söû duïng caùc bacteriocin ñaõ ñöôïc phuïc hoài vaø phaùt trieån. Caùc cheá phaåm bacteriocin ñieån hình laø nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (töø Lactococcus), pediocin A, pediocin PA–1, pediocin AcH (töø Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (töø Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (töø Leuconostoc), propionicin PLG–1, jensenin G (töø Propionicbacterium). [28] Bacteriocin ñöôïc tìm thaáy laàn ñaàu tieân bôûi Gratia vaøo naêm 1925, ñöôïc saûn xuaát bôûi moät chuûng E. coli ñeå choáng laïi caùc chuûng khaùc trong dòch nuoâi caáy. Thuaät ngöõ “colicine” ñöôïc ñaët teân bôûi Gratia vaø Fredericq (1946), coøn “bacteriocin” ñöôïc söû duïng bôûi Jacob et al. (1953) nhö laø thuaät ngöõ chung cho caùc protein coù ñaëc tính khaùng khuaån cao. Thuaät ngöõ colicine ngaøy nay laø ñeå chæ caùc protein coù tính khaùng khuaån ñöôïc saûn xuaát bôûi nhieàu loaøi E. coli vaø caùc loaøi thuoäc hoï Enterobacteriaceae. [28] 1.2.2 Bacteriocin töø LAB Haàu heát caùc nghieân cöùu veà bacteriocin taäp trung chuû yeáu ôû nhoùm vi khuaån lactic vì töø xa xöa ngöôøi ta ñaõ bieát söû duïng vi khuaån lactic trong baûo quaûn thöïc phaåm vaø ngaên ngöøa söï nhieãm caùc vi khuaån gaây beänh. Bôûi vì LAB vaø chaát chuyeån hoaù cuûa chuùng ñaõ ñöôïc tieâu thuï vôùi soá löôïng cao qua nhieàu theá heä ngöôøi tieâu thuï caùc thöïc phaåm truyeàn thoáng maø khoâng coù aûnh höôûng coù haïi naøo, LAB tieáp tuïc nhö laø nguoàn saûn xuaát bacteriocin söû duïng trong thöïc phaåm, keå caû daïng hôïp chaát tinh khieát hay dòch chieát töø moâi tröôøng phaùt trieån. Coù theå thu ñöôïc bacteriocin thoâ baèng caùch nuoâi chuûng LAB saûn xuaát bacteriocin treân moät phöùc hôïp cô chaát. Dòch leân men thoâ coù chöùa caùc chaát khaùc beân caïnh bacteriocin. LAB laø vi khuaån nuoâi caáy ñöôïc söû duïng ñaàu tieân trong ngaønh saûn xuaát thöïc phaåm leân men, chuùng hieån nhieân ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát cho söï bieán ñoåi gen ñeå taïo caùc chuûng coâng nghieäp bò thieáu gen ñieàu hoaø sinh toång hôïp neân bacteriocin mong muoán. [27] 1.2.2.1 Phaân loaïi bacteriocin [18, 24, 27, 28] Haàu heát caùc bacteriocin töø LAB ñeàu coù tính cation, kî nöôùc hay phaân töû löôõng cöïc hình thaønh töø khoaûng 20 ñeán 60 goác amino acid. Caùc bacteriocin thöôøng ñöôïc phaân chia thaønh 3 hay 4 nhoùm. Nhoùm I: goàm caùc lantibiotic laø caùc peptide nhoû coù chöùa caùc amino acid khoâng phoå bieán nhö lanthionine (Lan), α–methyllanthionine (MeLAn), dehydrodlanine, vaø dehydrobutyrine. Nhoùm I ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm nhoû tuyø theo caáu truùc hoaù hoïc vaø hoaït tính khaùng khuaån. - Nhoùm Ia: lantibiotic type A laø caùc peptide ñöôïc keùo daøi ra vôùi maïng löôùi tích ñieän döông, hoaït ñoäng thoâng qua vieäc hình thaønh caùc loã treân maøng teá baøo vi khuaån. Moät soá nhoùm nhö pep-5 chöùa 3 noái monosulfite, epidermin chöùa 4 noái monosulfite, nisin A vaø Z, subtilin thì laïi chöùa 5 caàu noái monosulfite. Kích thöôùc phaân töû cuûa lôùp phuï Ia dao ñoäng töø 1959 kDa ôû duramycin ñeán 4635 kDa ôû carnocin U9. - Nhoùm Ib: lantibiotic type B laø caùc phaân töû peptide hình caàu nhoû hôn vaø coù moät ñieän tích aâm hoaëc khoâng tích ñieän, hoaït tính khaùng khuaån lieân quan ñeán söï öùc cheá caùc enzyme ñaëc bieät. Moät soá caùc bacteriocin lôùp phuï Ib nhö mersacidin, actagardin, cinnamycin vaø mutacin A. Trong ñoù mutacin A taïo ra bôûi Streptococcus mutan. Nhoùm II: Caùc peptide nhoû (< 10 kDa), beàn nhieät, khoâng coù caùc amino acid bieán ñoåi sau dòch maõ coù chöùa ít nhaát moät caàu noái disulfur caàn thieát cho hoaït ñoäng cuûa chuùng. Laø nhoùm bacteriocin lôùn nhaát trong heä thoáng phaân lôùp naøy, caùc peptide ñöôïc chia thaønh 3 nhoùm phuï. - Nhoùm IIa bao goàm peptide gioáng pediocin, coù trình töï lieân öùng ñaàu N–Tyr Gly–Asn–Gly–Val–Xaa–Cys. Nhoùm phuï naøy ñöôïc quan taâm nhieàu bôûi vì hoaït tính khaùng Listeria, chuùng laøm maát caân baèng ñieän tích vaø taïo loã thuûng laøm roø ró caùc chaát phaân höõu cô vaø gaây cheát teá baøo ñích. - Nhoùm IIb goàm caùc bacteriocin ñoøi hoûi phaûi coù 2 peptide khaùc nhau ñeå coù hoaït tính nhö lactococcin Gα/ Gβ, lactococcin M/N, plantaricin EF, JK, enteriocin L50A vaø enteriocin L50B. - Nhoùm IIc: bao goàm taát caû caùc bacteriocin nhoùm 2 khoâng phuï thuoäc IIa vaø IIb, peptide coù nhoùm thiol coù hoaït tính, ñoøi hoûi phaûi caét giaûm nhoùm cysteine ñeå coù hoaït tính. Nhoùm III: nhoùm naøy hieän vaãn chöa ñöôïc moâ taû kyõ. Nhoùm naøy coù caùc protein lôùn (>30 kDa), deã bieán ñoåi bôûi nhieät ñoä. Moät soá bacteriocin lôùp naøy laø helveticin J taïo bôûi L. helveticus 481 vaø lactacins A vaø B taïo bôûi L. acidophilus, helveticin V, acidophilicin A. Nhöõng loaïi naøy ít ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc trong lónh vöïc thöïc phaåm quan taâm. Klaenhammer (1999) ñeà nghò theâm nhoùm 4, laø nhoùm chöùa caùc bacteriocin phöùc taïp, ñoøi hoûi carbohydrate hay lipid ñeå coù hoaït tính. Tuy nhieân bacteriocin cuûa nhoùm naøy chöa ñöôïc mieâu taû nhieàu ôû möùc ñoä sinh hoaù ñeå môû roäng ñònh nghóa. Nhoùm naøy bao goàm caû glycoprotein nhö lactocin 27 hoaëc lipoprotein nhö lacstrepcin. [27]
Hình 1.2: Coâng thöùc cuûa Nisin A [24] 1.2.3.2 Cô cheá sinh toång hôïp bacteriocin a. Gene vaø sinh toång hôïp Bacteriocin ñöôïc toång hôïp vôùi ribosome. Gen maõ hoaù cho saûn xuaát vaø mieãn dòch cuûa bacteriocin thöôøng ñöôïc toå chöùc thaønh caùc operon cluster. Nhoùm gene bacteriocin coù theå ñöôïc ñònh vò treân nhieãm saéc theå (subtilin vaø mersacidin), cuõng coù theå ñöôïc ñònh vò treân plasmid (divergicin A vaø sakacin A), hay laø treân transposon (nisin vaø lacticin 481). [18] Operon sinh toång hôïp lantibiotic thöôøng chöùa gen maõ hoaù treân tieàn peptide, enzyme chòu traùch nhieäm cho caùc phaûn öùng bieán ñoåi, quaù trình phaân huûy protein chòu traùch nhieäm taùch rôøi peptide chæ ñaïo, ABC (ATP–binding cassette), hoï protein vaän chuyeån bao goàm protein vaän chuyeån peptide, protein ñieàu hoaø, vaø caùc protein töï baûo veä teá baøo saûn xuaát. Peptide chæ ñaïo coù moät vai troø raát quan troïng. Noù giöõ cho tieàn peptide ôû daïng baát hoaït trong teá baøo, phaùt ra tín hieäu vaän chuyeån lantibiotic ra khoûi teá baøo, chöùa caùc trình töï ñaëc bieät chæ ñöôøng cho enzyme sinh toång hôïp ñi tôùi nôi thích hôïp ñeå thöïc hieän söï bieán ñoåi caùc amino acid vaø oån ñònh hình daïng cuûa domain propeptide. [18, 28] Gene maõ hoaù cho sinh toång hôïp bacteriocin nhoùm II nhö lactococccin A, B, vaø M, pediocin PA–1/AcH, vaø plantaricin A coù nhieàu ñieåm gioáng nhau trong toå chöùc gen, bao goàm moät gen caáu truùc maõ hoaù cho tieàn peptide, theo sau bôûi moät gen mieãn dòch, gen ñeå vaän chuyeån vaø protein phuï theâm. Moät soá tröôøng hôïp ñaõ tìm ra ñöôïc gen ñieàu hoaø. Caùc protein phuï theâm laø raát caàn thieát ñeå caùc bacteriocin nhoùm II ñöôïc xuaát ra. Khoâng coù baûn sao naøo cuûa caùc protein phuï theâm ôû lantibiotic ñöôïc tìm thaáy. [16, 18] Söï taïo caùc bacteriocin vi khuaån G+ thöôøng caàn nhieàu gen ví duï nhö cuïm gen taïo nisin: Nis A: prepeptid Nis B, nis C: enzyme bieán ñoåi amino cacid Nis P: caét caùc peptide leader Nis L, nis FEG: mieãn dòch Nis R, nis K: ñieàu hoaø vaø bieåu hieän [18]. b. Cô cheá Haàu heát caùc bacteriocin ñöôïc toång hôïp nhö laø caùc tieàn peptide ôû daïng baát hoaït mang moät peptide chæ ñaïo coù ñaàu N gaén vôùi tieàn peptide taïi ñaàu C. Ñoái vôùi lantibiotic, goác serine, threonine, vaø cystein trong phaàn tieàn peptide phaûi traûi qua böôùc keùo daøi bieán ñoåi sau dòch maõ ñeå hình thaønh Lan/MeLan. Con ñöôøng sinh toång hôïp cuûa lantibiotic ñi theo moät keá hoaïch chung: hình thaønh tieàn peptide, phaûn öùng bieán ñoåi, phaûn öùng taùch rôøi phaân huûy peptide chæ ñaïo vaø di chuyeån tieàn peptide ñaõ ñöôïc bieán ñoåi hay tieàn peptide tröôûng thaønh xuyeân qua maøng teá baøo chaát. Söï taùch rôøi peptide chæ ñaïo coù theå dieãn ra tröôùc, trong suoát quaù trình hay sau khi xuaát ra khoûi teá baøo. Trong saûn xuaát lantibiotic nhoùm I, nhö trong tröôøng hôïp cuûa nisin, epidermin, subtilin, vaø Pep5, phaûn öùng dehydrate coù leõ ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme LanB. [18]
Hình 1.3: Cô cheá sinh toång hôïp Nisin theo 5 böôùc [18] Bacteriocin nhoùm II ñöôïc sinh toång hôïp nhö laø moät tieàn peptide coù chöùa moät trình töï chæ ñaïo ñaàu N baûo toàn vaø moät ñieåm laøm phaân taùch protein, vôùi ngoaïi leä laø bacteriocin nhoùm IIc, ñöôïc saûn xuaát vôùi moät trình töï ñôn ñaàu N ñieån hình daïng sec vaø ñöôïc tieán haønh thoâng qua moät con ñöôøng coøn chöa ñöôïc bieát roõ. Khoâng gioáng nhö lantibiotic, bacteriocin nhoùm II khoâng traûi qua quaù trình bieán ñoåi sau dòch maõ. Sau khi hình thaønh tieàn peptide, tieàn peptide ñöôïc taùch khoûi peptide chæ ñaïo ñoàng thôøi vôùi vieäc ñöôïc xuaát ra khoûi teá baøo. [18] Peptide chæ ñaïo coù moät vuøng nhaän bieát ñieàu khieån tieàn peptide trong suoát quaù trình tröôûng thaønh, vaø protein vaän chuyeån, baûo veä chuûng hoang daïi baèng caùch giöõ lantibiotic ôû traïng thaùi khoâng coù hoaït tính khi noù ôû beân trong sinh vaät saûn xuaát, vaø töông taùc vôùi domain tieàn peptide ñeå chaéc chaén raèng coù moät caáu hình phuø hôïp caàn thieát cho töông taùc enzyme–cô chaát. [16, 18]
Hình 1.4: Cô cheá sinh toång hôïp bacteriocin nhoùm II theo 4 böôùc [18] c. Cô cheá khaùng khuaån cuûa bacteriocin [16, 18] Haàu heát caùc bacteriocin hoaït ñoäng baèng caùch taïo keânh hay loã treân maøng laøm phaù huyû naêng löôïng höõu ích cuûa teá baøo soáng. Caùc bacteriocin cuûa vi khuaån G+ thöôøng khoâng coù receptor ñaëc hieäu ñeå huùt baùm maëc duø vaãn coù nhöõng ngoaïi leä. Hoaït ñoäng khaùc vôùi vi khuaån G- ôû hai ñieåm chính sau: - Vieäc taïo bacteriocin thì khoâng caàn thieát phaûi gaây cheát cho vi sinh vaät saûn xuaát. Söï khaùc bieät naøy laø do cô cheá vaän chuyeån ñeå giaûi phoùng bacteriocin. ÔÛ moät vaøi vi sinh vaät thì phuï thuoäc vaøo heä thoáng tieát. Ngoaøi ra, ôû vi khuaån G+ coù söï ñieàu hoaø ñaëc hieäu bacteriocin neân caùc bacteriocin chæ döïa vaøo heä thoáng ñieàu hoøa cuûa teá baøo chuû. - Haàu heát caùc bacteriocin kích thöôùc nhoû hoaït ñoäng trong phaïm vi pH roäng töø 3 – 9, thaäm chí acidocin B coù theå hoaït ñoäng ôû pH 11, ôû ñieåm ñaúng ñieän cao cho pheùp chuùng töông taùc vôùi beà maët ñieän tích aâm cuûa maøng teá baøo vi khuaån. Ñoái vôùi caùc bacteriocin phoå khaùng khuaån roäng caùc hôïp chaát caàn theå nhaän thì seõ gaén phaàn kî nöôùc vaøo maøng vi khuaån. Sau ñoù söï lieân keát cuûa caùc phaân töû bacteriocin vôùi nhau seõ taïo thaønh nhöõng loã xuyeân maøng laøm maát gradient vaø gaây cheát teá baøo. Lôùp lipid tích ñieän aâm cuûa maøng teá baøo chaát laø receptor ñaàu tieân cho bacteriocin trong vieäc hình thaønh loã. Ví duï nhö nisin: xöû lí teá baøo baèng nisin cho thaáy noù taïo ra khe hôû cho tia UV chieáu ñöôïc vaøo trong noäi baøo; nisin laø moät bacteriocin coù caùc phaàn tích ñieän döông; lieân keát vôùi maøng lipid tích ñieän aâm, hình thaønh loã, beân caïnh ñoù laøm trung hoaø ñieän tích cuûa maøng, laøm maát ñi löïc vaän chuyeån proton. Do coù söï hình thaønh loã khoâng ñaëc hieäu, caùc chaát nhoû nhö ion, ATP thoaùt ra ngoaøi, coøn caùc chaát lôùn nhö protein khoâng thoaùt ra taïo neân ñieän theá maøng, laøm teá baøo cheát töø töø. Moät soá bacteriocin töø vi khuaån G+ coù theå laøm baát hoaït caùc taùc nhaân gaây beänh G- khi söû duïng taùc nhaân coù tính kìm keïp (chelating) nhö EDTA ñeå phaù huûy caùc ñaëc tính cuûa lôùp raøo caûn beân ngoaøi vi khuaån G-. Ngoaøi ra, nisin cho thaáy laø coù taùc duïng gaây ra söï töï phaân cuûa teá baøo, gia taêng aùp suaát noäi baøo laøm caûn trôû chuyeån hoùa naêng löôïng, ngaên caûn söï phuïc hoài vaùch teá baøo.
Hình 1.5 : Cô cheá taïo loã hay keânh ion treân maøng teá baøo cuûa bacteriocin nhoùm II [18] Ngöôøi ta cho raèng caùc bacteriocin nhoùm IIa coù theå töï taïo loã xuyeân qua maøng teá baøo vì chuùng laø nhöõng bacteriocin cöïc nhoû vaø löôõng cöïc. Caùc cystibiotic thuoäc lôùp IIc nhö cerecin 7/8, enterocin B, carnobacteriocin A vaø devergicin A coù ñaëc ñieåm laø coù caáu truùc baäc 2 coù söï hieän dieän caùc vuøng lôùn bao quanh gaàn nhö toaøn boä vuøng kî nöôùc. Trong taát caû caùc tröôøng hôïp phaàn cystein ñaàu tieân tìm thaáy naèm sau lysin tích ñieän döông ôû cuoái phaàn öa nöôùc vaø phaàn thöù hai naèm ôû 3 trình töï cuoái. Lieân keát disulfur caàn cho hoaït tính khaùng khuaån cuoän trong phaàn C cuûa protein taïo thaønh caáu truùc kî nöôùc beàn vöõng, ngoaøi ra trong phaân töû coù chöùa glycerin neân phaân töû raát linh ñoäng. Chính söï linh ñoäng naøy cho pheùp chuyeån töø caáu truùc β thaønh α ñeå thích hôïp vôùi tính kî nöôùc. Chieàu daøi cuûa voøng kî nöôùc ñuû daøi xuyeân qua maøng teá baøo chaát vaø khi coù söï gaén keát moät soá löôïng lôùn caáu truùc voøng seõ gaây cheát [16, 18]. Caùc hieåu bieát thoâng thöôøng veà phoå öùc cheá cuûa bacteriocin töø vi khuaån G+ laø chuùng chæ gieát giôùi haïn moät soá vi khuaån G+ khaùc. Phoå gieát cheát ñoùng vai troø quan troïng töø nhöõng tröôøng hôïp phoå heïp nhö Lactococcin A, B, M chæ gieát ñöôïc Lactococcus ñeán tröôøng hôïp phoå roäng nhö nisin A, mutacin B coù theå gieát ñöôïc nhieàu vi sinh vaät nhö Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococus, Mycrobacterium, Propiobacterium, Streptococcus vaø Staphylococcus. Ngöôïc laïi vôùi nhöõng hieåu bieát treân laø caùc bacteriocin cuõng coù hoaït tính choáng laïi caùc vi khuaån G- gaây beänh nhö : Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter vaø Neisseria [18]. 1.2.3 Bacteriocin töø caùc loaøi vi khuaån khaùc Bacteriocin vi khuaån Gram aâm [30, 34] Vi khuaån G- saûn xuaát nhieàu bacteriocin khaùc nhau, chuùng ñöôïc ñaët teân theo teân gioáng (ví duï nhö klebicin cuûa Klebsiella pneumoniae) hay theo teân loaøi (ví duï nhö colicin cuûa E. coli, marcescin cuûa Serratia marcescens, alveicin cuûa Hafnia alvei vaø cloacin cuûa Enterobacter cloacae) cuûa vi khuaån saûn xuaát. Bacteriocin do Pseudomonas saûn xuaát ñöôïc goïi laø pyocin. Klebicin, alveicin vaø marcescin cuõng coù phaïm vi gieát giôùi haïn ôû caùc loaøi Klebsiella, Hafnia vaø Serratia. Bacteriocin saûn xuaát bôûi Pseudomonas spp. (pyocin) cuõng ñöôïc nghieân cöùu roäng raõi. Gen pyocin ñöôïc maõ hoaù treân nhieãm saéc theå vaø thöôøng gaëp ôû Pseudomonas. Coù 3 daïng pyocin ñaõ ñöôïc moâ taû: daïng F, daïng R, vaø daïng S. Pyocin daïng R vaø daïng F ñöôïc saûn xuaát bôûi 90% vaø daïng S ñöôïc saûn xuaát bôûi 70% caùc chuûng P. aeruginosa ñöôïc nghieân cöùu. Pyocin daïng F vaø R laø bacteriocin daïng ñuoâi phage, khaùng nuclease vaø protease. Pyocin daïng S laø bacteriocin nhaïy caûm vôùi protease töông töï nhö colicin. Nhoùm gen colicin goàm 3 gen lieân keát chaët cheõ vôùi nhau, maõ hoaù cho caùc protein gaây ñoäc, protein mieãn dòch vaø protein phaân giaûi. Colicin gieát teá baøo ñích baèng caùch hình thaønh loã, baèng hoaït tính nuclease hay baèng caùch laøm giaùn ñoaïn vaùch teá baøo. Söï ñònh höôùng cuûa gen colicin vôùi gen mieãn dòch laø khaùc nhau trong tröôøng hôïp nhoùm gen colicin hình thaønh loã hay hoaït tính nuclease. Trong tröôøng hôïp hình thaønh loã, gen mieãn dòch ñöôïc ñònh höôùng ñoái dieän vôùi gen gaây ñoäc, coù theå gieát teá baøo töø beân ngoaøi baèng caùch khoang moät loã leân maøng teá baøo. Bacteriocin töø Archaea: halocin vaø sulfolobicin [34] Cho ñeán nay, caùc archaeocin ñaõ ñöôïc moâ taû ñaëc ñieåm chæ töø hai nhoùm: nhoùm Archaea ñaëc bieät öa maën saûn xuaát halocin, nhoùm Archaea ñaëc bieät öa nhieät saûn xuaát sulfolobicin. Haàu heát Archaea ñeàu saûn xuaát khaùng sinh, ngöôøi ta cho raèng coù haøng traêm halocin khaùc nhau, nhöng chæ coù 7 halocin vaø moät sulfolobicin ñaõ ñöôïc thu nhaän vaø moâ taû ñaëc ñieåm ñaày ñuû. Halocin raát ña daïng veà kích côõ (thay ñoåi töø 3–35 kDa), beàn nhieät, vaø phuï thuoäc muoái. Phoå hoaït tính khaù roäng vôùi hoaït tính gieát cheát caùc haloarchaea khaùc. Hieän nay, chæ coù halocin H6/H7 laø ñöôïc bieát roõ veà cô caáu hoaït ñoäng, noù öùc cheá keânh vaän chuyeån Na+/H+ ôû caû teá baøo haloarchaea vaø ñoäng vaät coù vuù. Halocin coù theå laø peptide (≤10 kDa, goïi laø microhalocin), hay laø protein (>10 kDa), coù hoaït tính khaùng sinh, ñöôïc saûn xuaát bôûi caùc thaønh vieân cuûa hoï Halobacteriaceae. 1.2.4 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï sinh toång hôïp bacteriocin 1.2.4.1 Moâi tröôøng nuoâi caáy Kelstrup vaø Gibbons (2002) ñaõ thaáy raèng gia taêng tính nhôùt cuûa dòch moâi tröôøng baèng caùch theâm agar, dextran, glycerol, hay tinh boät seõ gia taêng naêng suaát saûn sinh bacteriocin cuûa vi khuaån Streptococcus coâ laäp töø khoang mieäng cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät gaëm nhaám. Moät nghieân cöùu khaùc cuûa M.A. Riley (2007) veà staphylococcin 1580 cho thaáy nuoâi trong moâi tröôøng baùn raén seõ cho naêng suaát lôùn hôn 20 laàn so vôùi moâi tröôøng loûng. Caùc chaát rieâng bieät hôïp thaønh moâi tröôøng coù theå quyeát ñònh söï saûn xuaát cuûa bacteriocin. Söï saûn xuaát bacteriocin bôûi caùc chuûng khaùc nhau cuûa S. mutans coù theå laøm gia taêng baèng caùch theâm cao naám men 2% vaøo moâi tröôøng cô baûn Trypticase. Töông töï, söï hình thaønh butyricin 7423 trong moâi tröôøng ñöôïc thaáy laø phuï thuoäc vôùi löôïng casein hydrolysate theâm vaøo cho ñeán toái ña 5%. Söï hình thaønh bacteriocin cuûa caùc chuûng Corynebacteria vaø bôûi Staphylococcus ñöôïc thaáy raèng phuï thuoäc haøm löôïng amino acid trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Ion Mangan (2004) ñöôïc thaáy laø caàn thieát cho nhieàu saûn phaåm saûn sinh trong moâi tröôøng hoaù hoïc xaùc ñònh. Theâm 0.5% mannitol vaøo moâi tröôøng brain heart infusion broth laøm gia taêng naêng suaát cuûa staphylococcin 426 nhöng giaûm löôïng staphylococcin 414. Töông töï, glucose laøm gia taêng söï saûn xuaát streptococcin A–FF22 nhöng laøm giaûm streptococcin B–74628. Nhöõng nghieân cöùu khaùc cho thaáy theâm vaøo caû glucose hay manitol seõ laøm gia taêng söï saûn xuaát chaát öùc cheá bôûi phage type 71 Staphylococcus trong dòch chieát ñaäu naønh. [13] Ñieàu kieän nuoâi caáy Söï khaùc nhau cuûa ñieàu kieän moâi tröôøng nhö nhieät ñoä, thôøi gian, oxy, pH coù aûnh höôûng ñeán naêng suaát cuûa bacteriocin coù hoaït tính. Nhìn chung, söï saûn xuaát bacteriocin toát hôn ôû ñieàu kieän nhieät ñoä toái öu cuûa chuûng saûn xuaát phaùt trieån. Nuoâi ôû nhieät ñoä quaù cao coù theå ngaên caûn söï saûn sinh bacteriocin vaø ñoâi khi daãn ñeán söï thay ñoåi caùc ñaëc tính moät caùch khoâng thuaän nghòch. [40] Vieäc taïo ra caùc bacteriocin ôû vi khuaån G+ thöôøng khi chuyeån töø pha log ñeán pha oån ñònh. Saûn löôïng bacteriocin toái ña trong moâi tröôøng coù theå thaáy ôû nhieàu pha khaùc nhau trong chu kyø taêng tröôûng. Schlegel vaø Slade (2002) nhaän thaáy söï saûn xuaát streptocin STH1 nhieàu nhaát trong suoát pha log vaø giaûm daàn möùc ñoä saûn sinh bacteriocin tröôùc khi böôùc vaøo pha oån ñònh. Traùi laïi, saûn xuaát streptococcin A – FF22 baét ñaàu ôû cuoái pha log vaø hoaït tính giaûm daàn daàn khi nuoâi keùo daøi. Töông töï, saûn xuaát staphylococcin C55 baét ñaàu ôû pha log, ñaït ñeán toái ña giöõa 24 vaø 48 giôø phaùt trieån, vaø sau ñoù suy taøn daàn. Butyricin 7423 thì ñöôïc tieát ra trong suoát cuoái pha log, tuy nhieân, perfringocin 11105 chæ xuaát hieän nhieàu vaøo pha oån ñònh vaø saûn phaåm cuûa noù döôøng nhö laïi tieâu huûy moät phaàn teá baøo saûn xuaát. Meitert (2005) ñaõ baùo caùo moät vaøi chuûng C. diphtheriae giaûi phoùng bacteriocin lieân tuïc nhöng moät vaøi chuûng khaùc laïi saûn xuaát giaùn ñoaïn. Lachowicz (2002) nghieân cöùu khaû naêng saûn xuaát staphylococcin A–1262a treân moâi tröôøng raén. Hoaït tính ñöôïc nhaän thaáy ñaàu tieân sau 8 giôø, ñaït ñeán toái ña khi töø 18 ñeán 24 giôø, vaø sau ñoù giaûm daàn veà 0. Nhöõng nghieân cöùu khaùc cuõng nhaän thaáy hoaït tính bacteriocin bò maát khi nuoâi keùo daøi. Söï aûnh höôûng naøy coù theå lieân quan ñeán söï xuaát hieän cuûa chaát baát hoaït bacteriocin hay enzyme tieâu huûy hoaëc thay ñoåi chuùng [38, 40]. Moät aûnh höôûng thuù vò leân söï phuïc hoài moät soá bacteriocin laø pH. Moät nghieân cöùu veà ñieàu kieän ñeå toái öu saûn xuaát colicin K cho thaáy raèng ñieàu chænh pH moâi tröôøng laø moät yeáu toá then choát. Moät soá nghieân cöùu tìm thaáy raèng saûn xuaát streptococcin A–FF22 treân agar Todd–Hewitt seõ gia taêng khi ñieàu chænh pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng ñeán 6.5. [13] Saûn xuaát chaát öùc cheá bacteriocin vaø chaát laøm baát hoaït Davie vaø Brock (2003) tìm thaáy acid teichoic, thöôøng coù trong lôùp voû teá baøo S. faecalis subsp. zymogenes X14, goùp phaàn vaøo tính mieãn dòch cuûa vi khuaån naøy vôùi bacteriocin cuûa chính noù saûn xuaát ra (hemolysin). Vieäc thaûi ra caùc saûn phaåm öùc cheá trong giai ñoaïn sau chu trình phaùt trieån laø keát quaû cuûa söï bieán maát cuûa bacteriocin trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Töông töï, hoaït tính bacteriocin trong dòch noåi moâi tröôøng chöùa staphylococcin 1580 ñöôïc gia taêng khi thaåm taùch, töø ñoù ñeà nghò raèng caùc cheá phaåm naøy coù theå chöùa moät chaát öùc cheá khoái löôïng phaân töû nhoû cuûa bacteriocin. Taát caû bacteriocin ñöôïc moâ taû ñaëc ñieåm ñeàu coù chöùa moät hôïp chaát protein caàn thieát cho hoaït tính sinh hoïc. Söï baát hoaït khoâng thuaän nghòch cuûa moät soá bacteriocin coù theå laø keát quaû töø söï tieâu huûy bôûi protease neáu nhöõng chaát naøy cuõng saûn xuaát bôûi vi khuaån Bacteriocinogenic. Taùc ñoäng naøy laàn ñaàu tieân ñöôïc chöùng minh bôûi Serratia marcescens, nhöng noù cuõng ñöôïc tin laø ñoùng vai troø trong vieäc laøm baát hoaït bacteriocin cuûa Clostridium botulinum vaø Streptococcus nhoùm A. Ñun cheá phaåm bacteriocin maø oån ñònh nhieät seõ laøm baát hoaït protease, do ñoù baûo veä bacteriocin. [28] 1.2.5 Ñònh vò vaø tinh saïch bacteriocin Nhieàu bacteriocin cuûa vi khuaån G+ döôøng nhö toàn taïi ôû hai daïng laø lieân keát vôùi teá baøo vaø ôû ngoaøi teá baøo. Tyû leä cuûa moãi daïng phuï thuoäc vaøo traïng thaùi sinh lyù cuûa moâi tröôøng. Bacteriocin trong phaân loaïi naøy bao goàm megecin C–216, lactocin LP27, staphylococcin 1580, butyricin 7423, staphylococcin C55 vaø streptococin A–FF22. Nhöõng nhaän xeùt töông töï cuõng ñöôïc baùo caùo nhieàu vôùi colicin. [21] Trong tröôøng hôïp bacteriocin coù nhieàu ôû xung quanh teá baøo, caùc tính chaát hoaù hoïc, cô hoïc, enzyme coù theå aûnh höôûng ñeán vieäc giaûi phoùng chuùng khoûi teá baøo. Viridin A, B, vaø C (bacteriocin cuûa Streptococcus viridans) coù theå thu ñöôïc ôû traïng thaùi teá baøo töï do (cell-free) sau khi ñoàng nhaát dòch teá baøo saûn xuaát bacteriocin. Staphylococcin 414 cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû beà maët teá baøo cuûa chuûng saûn xuaát nhöng coù theå taùch ra baèng caùch phaù vôõ cô hoïc teá baøo. Traùi laïi, staphylococcin 462 khoâng theå bò hoaø tan baèng caùch phaù vôõ teá baøo saûn xuaát. Caùc nghieân cöùu khaùc cuõng chöùng toû raèng staphylococcin 1580 coù theå ñöôïc trích töø vi khuaån vôùi 5% NaCl. Töông töï tinh cheá colicin E2–W3110 vaø E3– W3110 vaø bacteriocin JF246 cuûa S. marcescens ñöôïc hoã trôï baèng caùch trích bacteriocin quanh teá baøo vôùi 1M sodium chloride. Streptococcin A–FF22 ôû daïng lieân keát vôùi teá baøo coù theå ñöôïc trích baèng caùch ñun trong axit loaõng. Streptococcin, nisin vaø diplococcin cuõng coù theå ñöôïc thu baèng caùch trích vôùi axit töø teá baøo saûn xuaát. Trong moät soá nghieân cöùu khaùc phöông phaùp xöû lyù nhieät dòch nuoâi caáy cuûa Lactobacillus ñaõ gia taêng khaû naêng giaûi phoùng lactocin LP27 töø teá baøo. Phöông phaùp trích vôùi axit döôøng nhö coù hieäu quaû trong ví duï naøy. Donoghue khi söû duïng moät phöông phaùp khaùc ñaõ nhaän thaáy raèng megacin C–216 vaø Cx–337 ñöôïc giaûi phoùng töø teá baøo sinh megacinogenic baèng caùch xöû lyù vôùi lysozyme, keát hôïp tieàn xöû lyù vôùi trypsin. Taùc giaû keát luaän raèng megacin ñöôïc ñònh vò treân beà maët ngoaøi teá baøo. [17] Thöôøng dòch thoâ ñaàu tieân ñöôïc coâ ñaëc baèng caùch laéng tuûa phaân ñoaïn vôùi acid, muoái, ethanol, hoaëc caùc hoãn hôïp khaùc nhau. Sau ñoù vieäc tinh cheá coù theå döïa vaøo kích côõ khaùc nhau (saéc kyù loïc gel, loïc qua maùy sieâu loïc, ly taâm) hay thay ñoåi ñieän tích (saéc kyù trao ñoåi ion, ñieän chuyeån). [32] Moät vaán ñeà chung laø söï maát hoaït tính trong quaù trình tinh cheá. Do ñoù vieäc giaùm saùt hoaït tính bacteriocin (ñôn vò bacteriocin/miligram protein) taïi moãi böôùc tinh cheá vaø ñieàu chænh khi coù theå ñeå traùnh vieäc maát nhieàu hoaït tính laø raát quan troïng [28]. 1.2.6 ÖÙng duïng bacteriocin 1.2.6.1 ÖÙng duïng trong baûo veä söùc khoeû con ngöôøi Khi coù söï taêng nhanh caùc vi khuaån gaây beänh caàn phaûi coù phöông phaùp loaïi boû söï nhieãm. Moät trong nhöõng giôùi haïn trong vieäc söû duïng khaùng sinh laø chuùng coù phoå öùc cheá roäng. Ñieàu naøy seõ gieát khoâng ñaëc hieäu baát kyø loaïi vi khuaån naøo khoâng khaùng thuoác. Do ñoù, khaùng sinh tieâu dieät luoân caùc vi khuaån coù lôïi cho söùc khoeû con ngöôøi. Ngöôøi ta söû duïng bacteriocin nhö laø moät giaûi phaùp thay theá. Chuùng coù phoå öùc cheá heïp neân coù theå xem nhö “thuoác ñoäc thieát keá”, noù coù taùc duïng ñaëc hieäu vôùi caùc vi khuaån gaây beänh [41]. 1.2.6.2 ÖÙng duïng trong baûo quaûn thöïc phaåm Hieän nay chæ coù bacteriocin cuûa LAB ñöôïc pheùp söû duïng trong thöïc phaåm leân men vì LAB ñaõ ñöôïc söû duïng haøng theá kyû qua ñeå leân men thöïc phaåm. Naêm 1988, FDA tieán tôùi vieäc söû duïng nisin trong quaù trình khöû truøng Pasteur fromage, taïo thaønh moät söï kieän chính thöùc hôïp phaùp ôû Myõ trong öùng duïng bacteriocin nhö laø chaát phuï gia thöïc phaåm. Khi öôùc löôïng ñeå söû duïng nhö laø chaát phuï gia thöïc phaåm phaûi ñoøi hoûi söï ñaùnh giaù veà tính beàn nhieät khi chuùng ñöôïc söû duïng phoå bieán trong quaù trình cheá bieán thöïc phaåm. [41] Töø raát xa xöa, ngöôøi ta söû duïng phoå bieán nitrate ñeå ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa Clostridium trong thòt nhöng vì söï an toaøn cho coâng nghieäp thöïc phaåm caàn phaûi coù moät phöông phaùp baûo quaûn khaùc. Nisin coù taùc duïng ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa baøo töû C. botulinum trong fromage, ñöôïc thöông maïi vaø söû duïng roäng raõi. Öu ñieåm lôùn cuûa nisin laø haàu nhö khoâng taùc duïng leân caùc loaøi vi khuaån G- neân vieäc söû duïng chuùng khoâng laøm aûnh höôûng ñeán heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät coù lôïi cuûa ngöôøi, chuùng deã daøng bò phaân huûy trong ñöôøng tieâu hoaù vaø hoaøn toaøn an toaøn ôû lieàu söû duïng. Ví duï: lieàu baûo quaûn hieäu quaû trong phomaùt laø 100 – 400 UI/g, trong khi ñoù lieàu LD50 treân meøo vaø chuoät non thaäm chí tôùi 7 g/kg ngaøy. Chính nhôø ñaëc ñieåm treân neân nisin hieän nay ñang ñöôïc trieån khai thöû nghieäm öùng duïng laøm chaát baûo quaûn thöïc phaåm ôû nhieàu quoác gia treân theá giôùi. Trong coâng ngheä cheá bieán söõa, nisin coù theå ñöôïc söû duïng theo moät