Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua. Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng. Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua. Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Phi iv TÓM TẮT BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC" Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả chúng tôi có được: Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ enzyme của vi khuẩn tốt nhất. Nhiệt độ 4 - 100C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 370C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm. v ABSTRACT A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase, protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the results had showed: We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis. Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase, protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation. The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7 for 48 hours culture. Enzyme activity conserved better in 4 – 100C than in 30 – 370C. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii TÓM TẮT ................................................................................................................ iv ABSTRACT ............................................................................................................... v MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. x DANH SÁCH SƠ ĐỒ .............................................................................................. xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích đề tài ............................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu đề tài ............................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........ 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 4 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá ................................................................................. 5 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .............. 6 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử ................................................................................ 6 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử ....................................................................... 6 2.1.7. Tính chất đối kháng .............................................................................. 6 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease ..................................... 7 2.3.1. Enzyme amylase ................................................................................... 7 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................ 7 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase .................................................................. 7 2.3.1.3. Đặc tính của amylase ..................................................................... 8 vii 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ............................................ 10 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase ....... 10 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật ..................................................... 11 2.3.2. Enzyme protease ................................................................................. 11 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease ................................................ 11 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ........................... 12 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật ............................... 13 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật ..................................................................................................... 14 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật .................................................... 14 2.3. Giới thiệu về probiotic................................................................................ 15 2.4.1. Định nghĩa ........................................................................................... 15 2.4.2. Chức năng sinh học ............................................................................. 15 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng .............................................. 15 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................................................................... 16 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 18 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ....................................................... 18 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 18 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 18 3.2. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 18 3.2.1. Đối tượng khảo sát .............................................................................. 18 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................... 18 3.2.2.1. Thiết bị ......................................................................................... 18 3.2.2.2. Dụng cụ: ...................................................................................... 18 3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 19 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ..................................................................... 19 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ........................................... 19 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn ....................................... 19 viii 3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 19 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được ............ 20 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 21 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................... 21 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................................. 22 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis. ...................................................... 23 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis ............................................................................................................. 25 3.4.3.1. Quy trình thực hiện ...................................................................... 25 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản .............................. 25 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 26 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 26 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ................ 26 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis .......... 26 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ................................................................ 27 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. .................. 29 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................................... 31 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis .......................................................................................... 33 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất ......... 34 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 36 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 36 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 36 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 40 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................... 21 Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 ................................................................................... 23 Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................... 24 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá ................................................................ 29 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2)............................................. 29 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm ... 31 Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. .............. 32 Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất .................... 33 Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm .................................. 34 x DANH SÁCH HÌNH Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................... 3 Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis ....................................................... 26 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................... 27 xi DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ................................................ 20 Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). .. 21 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có t ính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo con. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh. Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học”. 2 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm. Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005). 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis  Đặc điểm phân loại: Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... 4  Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996). 2.1.3. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000). 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy  Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C  Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.  Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.  Môi trường Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng. Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin. Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. 5 Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều. 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+). Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005). 6 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý. 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000). Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). 2.1.7. Tính chất đối kháng Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh 7 dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976). 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease 2.3.1. Enzyme amylase 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Theo tính chất và phương pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt α-amylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase). 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các giống vi sinh vật sau: Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus. Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova, 1975; Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961). Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác. Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu 8 và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370C. 2.3.1.3. Đặc tính của amylase Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase, amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối. Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.  α-amylase: α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase. α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá). Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose (hoặc glucogen) (nhiều) (ít) α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Ag+, Hg2+. So với α-amylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa. 9 α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005). Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0). Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500C. Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao.  β-amylase β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào. β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy mầm). Vi khuẩn không có β-amylase.  Glucoamylase Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 - glucan trong polysaccharide. Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hòan toàn tinh bột, glucogen, amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose. Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5. Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu etylic, aceton. 10 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân. 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase  Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô. Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác. Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease. 11 Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Coban kích thích tổng hợp amylase. Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase: Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α– amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8. Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase. Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật. 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi. 2.3.2. Enzyme protease 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với protease nội bào. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 12 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: Protease – xerin Protease – tiol Protease – kim loại Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serin. Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid. Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là 13 trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S* + P1 E + P2 Trong đó: E – là enzyme, S – là cơ chất. E – S : là phức chất enzyme – cơ chất E – S* : là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme) P1 : là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới được tạo thành) P2 : là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành). 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau: Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S. Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, 14 hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005). 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng, thành phần môi trường... Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường. Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống vi sinh vật. Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp. 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật  Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh.... Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt, ... 15 có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi.  Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật.  Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm 2.3. Giới thiệu về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột. 2.4.2. Chức năng sinh học Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme. Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng. Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột. 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau như: ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie . 16 VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng. Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN, UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA. 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong nông nghiệp: Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis trong nông nghiệp được tiến hành như sau: Chăn nuôi: Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic. Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae... ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TPHCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp. Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus. 17 Kháng sinh: Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr- (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Đối tƣợng khảo sát Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.2.1. Thiết bị Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, … 3.2.2.2. Dụng cụ Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri, micropipete, giá ống nghiệm, … Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C /15 phút. 19 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1. 3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 37 0C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng. 20 Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 90/00 Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo ủ ở 370C/ 24h Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi. Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định. Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được. Mẫu đất Dd pha loãng mẫu 10-1 Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng 21 Thử phản ứng sinh hóa Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất. Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 Chế độ sục Thời khí gian Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ 48 giờ  Cách làm: Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (1210C/15phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô. Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3%. Cho vòi sục khí vào bình với Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-). Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis 22 thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h. Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả. Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát: Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Tỉ lệ giống 3% pH = 6 Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1. Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme: Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld. 23 Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Rỉ đường + 2% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton TSB + 1% tinh bột 24 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis  Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1. Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần). Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 pH 6,0 7,0 Hoạt độ enzyme Thời gian amylase protease amylase protease 24h 48h  Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất. 25 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis 3.4.3.1. Quy trình thực hiện 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 100C và nhiệt độ phòng. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0. Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 500C Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1 Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn Môi trường sản xuất: cám gạo Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase Thời gian 48h, nhiệt độ 370C Thu hoạch chế phẩm 26 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái. Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng. 27 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.biol.pmf.hr/.../odg-slike/odg451.jpg) 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. 28 Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose 1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 + + + + + 6 +