Phân lập và định danh một số loài Aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh - Thành phố Cần Thơ

.........12 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Hình thái học nấm mốc..................................................................................... 10 Hình 2. Mẫu hạt ñậu phộng có nấm mốc phát triển trên môi trường nuôi cấy PGA sau 3 - 5 ngày, nhiệt ñộ 27 - 320C........................................................................................ 21 Hình 3. Aspergillus flavus với những giọt tiết có màu trắng ñục xung quanh rìa khuẩn lạc sau 4 –5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek....................................................... 23 Hình 4. Aspergillus flavus có bông hình cột với những chuỗi bào tử rất dài................... 23 Hình 5. Cấu tạo hiển vi một bông với thể bình hai tầng ................................................. 23 Hình 6. Cấu tạo một bọng có hình gần cầu. ................................................................... 23 Hình 7. Các bào tử kết lại thành chuỗi rất dài ................................................................ 23 Hình 8. Bào tử của A. flavus ......................................................................................... 24 Hình 9. Cấu tạo một thể bình hai tầng với cuống ñính thể bình có hình trụ và thể bình có hình chai................................................................................................................... 24 Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek, nhiệt ñộ 27 - 320C. ........................................................................................................ 26 Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản có bông hình cầu toả tia... 26 Hình 12. Bông với thể bình hai tầng và bọng hình cầu. ................................................. 26 Hình 13. Cấu tạo hiển vi một thể bình hai tầng với lớp thể bình thứ nhất dài gấp ñôi thể bình thứ hai. Lớp thứ nhất có hình trụ, lớp thứ hai có hình chai ............................... 26 Hình 14. Aspergillus oryzae có màu vàng lục khi non và chuyển sang màu vàng lục nâu khi già .................................................................................................................... 28 Hình 15. Aspergillus oryzae có bông hình cầu khi non và xé rách tạo hình trụ hay những chuỗi tua rua khi già. .......................................................................................... 28 Hình 16. Cấu tạo bông lớn với thể bình hai tầng và bọng có hình cầu ........................... 28 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng vi Hình 17. Cấu tạo bông nhỏ với thể bình một tầng.......................................................... 28 Hình 18. Aspergillus ficuum có màu nâu trên môi trường Czapek sau 7 ngày tuổi…..... .28 Hình 19. Aspergillus ficuum có bông hình cầu tỏa tia rất ñều và ñặc biệt cuống khá dài..... ............................................................................................................................ 30 Hình 20. Khi già, bông xé rách tạo dạng cột. ................................................................. 30 Hình 21. Cấu tạo hiển vi một bông có bọng hình cầu và quan sát thấy rõ thể bình một lớp................................................................................................................................. 30 Hình 22. Bông ñược ñính trên cuống rất dài .................................................................. 30 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng vii TÓM TẮT ðậu phộng là một trong những loại hạt có giá trị dinh dưỡng cao và nó là mặt hàng xuất khẩu quan trọng ở nước ta, ñem lại nguồn thu ngoại tệ khá lớn. Tuy nhiên do nước ta có ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm nên rất thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển và gây hại. ðặc biệt trên ñậu phộng thường có loài Aspergillus xâm nhập và gây hư hỏng, chẳng những thế chúng còn tiết ra ñộc tố gây ung thư cho người khi ăn phải. Sự có mặt của các loài này phụ thuộc vào vùng ñịa lý cũng như loại thực phẩm thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng. Phần luận văn này ñược tiến hành với mục ñích “Phân lập và ñịnh danh một số Aspergillus trên hạt ñậu phộng ở chợ Xuân Khánh - thành phố Cần Thơ”. Kết quả sau khi phân lập và tiến hành ñịnh danh ñược bốn loài Aspergillus sau: Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum. ðiều này cho thấy các loài trên phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và xuất hiện trên ñậu phộng với tần số rất cao. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 1 CHƯƠNG I: ðẶT VẤN ðỀ 1.1. ðẶT VẤN ðỀ ðậu phộng là loại cây công nghiệp phổ biến trên thế giới và ở nước ta, nó ñược xem là một trong những cây mũi nhọn về chiến lược kinh tế trong việc sản xuất và khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt ñới. Hạt ñậu phộng có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều protein và lipid với hàm lượng khá cao, nó cũng là nguồn cung cấp vitamin E, K, B rất quan trọng và cả nguồn thiamine và niacine là những vitamin có rất ít trong các loại ngũ cốc khác. Từ ñậu phộng, người ta có thể chế biến thành các sản phẩm thực phẩm như bánh, mứt, kẹo,...(chiếm khoảng 12% sản lượng ñậu phộng), ngoài ra còn có khoảng 6% sử dụng cho chăn nuôi, 1% cho xuất khẩu và khoảng 80% số ñậu phộng sản xuất ra ñược dùng ñể sản xuất dầu ăn. Ở nước ta, sản lượng ñậu phộng sản xuất ra hàng năm chủ yếu dùng cho xuất khẩu (70 - 80%) cho nên nó là cây ñem lại nguồn thu ngoại tệ rất quan trọng. Tuy nhiên, ở nước ta do ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm cộng với ñiều kiện bảo quản không ñảm bảo nên hạt ñậu phộng rất dễ bị nấm mốc tấn công, gây hư hỏng và không thể sử dụng ñược nữa. Phần lớn nấm mốc trên ñậu phộng thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Fusarium và trong số chúng lại sản sinh ra ñộc tố. Theo nghiên cứu, người ta kết luận có 4 ñộc tố hiện diện trên hạt ñậu phộng là: Aflatoxin, Citrinin, Ochratoxin A và Zearalenone trong ñó Aflatoxin ñược ñặc biệt chú ý vì tính ñộc của nó. Sự hiện diện của nấm mốc nhất là Aspergillus sản sinh ñộc tố gây ra những vụ ngộ ñộc, gây chết người và gia súc,... ðặc biệt, chúng còn dẫn ñến gây ung thư gan. Việc biết ñược sự có mặt của các loài Aspergillus trong ñậu phộng có ý nghĩa rất quan trọng, ñể từ ñó có hướng ứng dụng thực tế (vài loài ñược sử dụng ñể sản xuất enzyme, sản phẩm lên men,...), biết ñược sự phân bố của giống ña dạng, ñồng thời phòng chống sự xâm nhập của chúng vào hạt ñậu phộng nói riêng và các loại thực phẩm khô nói chung. Bám sát mục tiêu trên, tôi tiến hành thực hiện ñề tài “Phân lập và ñịnh danh một số loài Aspergillus trên hạt ñậu phộng ở chợ Xuân Khánh - thành phố Cần Thơ”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Phân lập và làm thuần chủng các loài Aspergillus hiện diện trên ñậu phộng trong quá trình tồn trữ và sự xâm nhiễm trong quá trình vận chuyển hạt. - Xác ñịnh tên gọi từng loài dựa trên các ñặc ñiểm về hình thái và các ñặc ñiểm loài của chúng. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. HẠT ðẬU PHỘNG 2.1.1. Cấu tạo hạt ñậu phộng - Về hình dạng: hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, ... - Về màu sắc: hạt có màu trắng, hồng, ñỏ sậm,... - Cấu tạo: hạt có 3 bộ phận chính là vỏ lụa, nội nhũ và phôi. + Vỏ lụa: rất mỏng, ở ngoài bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Màu sắc của lớp vỏ lụa thay ñổi tùy thuộc vào giống. + Nội nhũ (tử diệp): gồm hai phiến có màu trắng sữa hoặc trắng ngà, hình phẳng lồi, hai mặt phẳng úp vào nhau. + Phôi gồm có ba lá phôi: mầm, phôi lá, phôi rễ. 2.1.2. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng hạt ñậu phộng Hạt ñậu phộng có chứa một hàm lượng lớn lipid, protein, ngoài ra trong ñậu phộng còn có các vitamin, chất khoáng, nước,...Thành phần hóa học hạt ñậu phộng thay ñổi tùy thuộc vào giống và ñiều kiện sinh trưởng. Trong protein ñậu phộng có rất nhiều các acid amin, ñặc biệt là các acid amin cần thiết hiện diện trong ñậu phộng với một tỷ lệ rất cao. Hạt ñậu phộng là nguồn chứa hàm lượng lipid rất cao bao gồm cả các acid béo no và chưa no Bảng 1: Thành phần hóa học hạt ñậu phộng. Thành phần gr/100grams Nước 6,50 Protein 25,80 Lipid 49,24 Tro 2,33 Carbohydrate 16,13 ðường 3,97 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 3 *Lipid Trong dầu ñậu phộng có khoảng 80% các acid béo chưa no và 20% các acid béo no.Thành phần chính xác các acid béo thay ñổi tùy theo giống và ñiều kiện canh tác.Trong ñó acid oleic và acid linoleic chiếm trên 80% hàm lượng acid béo và trong các acid béo no, acid palmitic chiếm 10%; 10% còn lại là các acid béo tương ñối quan trọng ñã ñược phát hiện gần ñây. Bảng 2: Thành phần các acid béo trong dầu ñậu phộng. Thành phần gr/100grams Tổng lượng acid béo bão hòa 6,834 Acid myristic, 14:0 0.025 Acid palmitic, 16:0 5.154 Acid steric, 18:0 1.100 Tổng lượng acid béo chưa bão hòa 24.429 Acid palmitoleic, 16:1 0.009 Acid oleic, 18:1 23.756 Acid linoleic, 18:3 0.003 Acid α-linoleic, 18:2 15.555 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Dầu ñậu phộng chứa ít phospholipid, trung bình 0,3% (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006 ). Các phospholipid của dầu ñậu phộng là một trong những trụ cột của ngành công nghiệp dầu do khả năng tạo nhũ tương và ñặc tính chống oxy hóa của chúng. Dầu ñậu phộng tương ñối ổn ñịnh so với nhiều dầu thực vật khác do trong dầu ñậu phộng có tocopherol là chất chống oxy hóa chủ yếu. *Protein ðậu phộng có chứa khoảng 26% protein trong ñó globulin là cao nhất, khoảng 97% hàm lượng protein. Ngoài ra còn có hàm lượng không ñáng kể các albumin, prolamin, glutein. Hệ số tiêu hóa của protein ñậu phộng khoảng 89%. Trong protein ñậu phộng có chứa các acid amin cần thiết cho dinh dưỡng người. Tuy nhiên, dựa trên kết quả phân tích và trên nhiều thí nghiệm người ta nhận thấy rằng cac protein của ñậu phộng bị hạn chế trước hết bởi methionin rồi tới lysine và threonin. Ngoài ra còn có ít nhất 16 acid amin ñược tìm thấy ở dạng tự do, những acid amin này có liên quan ñến phản ứng hóa nâu trong quá trình chế biến. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 4 Bảng 3: Thành phần các acid amin trong protein ñậu phộng. Amino acids gr/100grams Tryptophan 0,250 Threonin 0,883 Isoleucine 0,907 Leucine 1,672 Lysine 0,926 Methionine 0,317 Cystine 0,331 Phenylalanine 1,337 Tyrosine 1,049 Valine 1,082 Arginine 3,085 Histidine 0,652 Alanine 1,025 Aspartic acid 3,146 Glutamic acid 5,390 Glycine 1,554 Proline 1,138 Serine 1,271 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. * Vitamin - Vitamin tan trong dầu: ðậu phộng có lượng rất ít các vitamin A, D và caroten. Trong khi ñó các vitamin E chiếm số lượng ñáng kể tồn tại ở dạng tocopherol và là tác nhân chống oxy hóa chủ yếu trong dầu ñậu phộng. - Vitamin tan trong nước: ðậu phộng là nguồn khá dồi dào về các vitamin tan trong nước. + ðậu phộng không chứa vitamin C. + Vitamin B1 (thiamine) ñược thấy trong ñậu phộng ít nhất ở ba dạng thiamine, thiamine monophosphate và thiamine pyrophosphate với tỷ lệ 33:10:1 (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006). Ngoài ra, còn có riboflavin, niacine,... Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 5 Bảng 4: Thành phần các vitamin trong hạt ñậu phộng. Vitamin mg/100grams Vitamin C 0,000 Thiamine 0,640 Riboflavin 0,135 Niacine 12,006 B6 0,348 E (tocopherol) 8,330 Folate, tổng số (mcg/100gr) 240 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. * Chất khoáng Hạt ñậu phộng là nguồn cung cấp các chất khoáng như Ca, P, Mg, Na, Fe,... Trong hạt các cây lấy dầu trong ñó có ñậu phộng, hàm lượng các nguyên tố khoáng thường lớn hơn 1,8 - 2,2 lần so với hạt các loại cây khác. Bánh dầu ñậu phộng (hạt ñậu phộng sau khi lấy dầu) chứa rất nhiều các khoáng vi lượng và protein. Bảng 5: Thành phần các chất khoáng trong hạt ñậu phộng. Chất khoáng mg/100grams Ca 92 Fe 4,58 Mg 168 P 376 K 705 Na 18 Zn 3,27 Cu 1,144 Mn 1,934 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 6 Ta thấy rằng, ñậu phộng là một loại hạt có nhiều lipid và protein. Sau thu hoạch nhất là trong ñiều kiệu khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm như ở nước ta hạt ñậu phộng có nhiều diễn biến hóa sinh làm thay ñổi thành phần hạt ñậu phộng. Do ñó, trong quá trình bảo quản hạt nếu không ñảm bảo các yếu tố về tình trạng hạt, ñiều kiện phương tiện bảo quản (nhiệt ñộ và ñộ ẩm kho bảo quản) sẽ dẫn ñến hư hỏng hạt mà quan trọng hơn cả là sự tấn công của nấm vào khối hạt. Về các loài nấm hại quả ñậu phộng, người ta chia làm hai nhóm. - Nhóm nấm ngoài ñồng: + Hệ vi sinh vật ở ñất trồng ñậu phộng trong suốt mùa sinh trưởng. Chủ yếu là Fusarium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp., Rhizoctonia spp., Macrophoma phascoli. + Hệ vi sinh vật ở quả và hạt trước khi chín và thu hoạch: chiếm ưu thế là Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. và Rhizopus spp. + Hệ vi sinh vật ở quả và hạt khi phơi (hoặc sấy khô) chiếm ưu thế là Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. - Nấm trong khi cất giữ: Người ta phát hiện ñến 150 loài nấm ở quả và hạt ñậu phộng cất giữ trong kho. Phổ biến là các loài nấm Aspergillus (nhóm Aspergillus flavus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger), Penicillium spp. (P. rubram, P. funicularum, P. citrum), Fusarium spp., Rhizopus spp.,...ðóng vai trò quan trọng là các giống Aspergillus mà trong số chúng tạo ra ñộc tố aflatoxin gây nguy hại ñến sức khỏe con người (Chu Thị Thơm và et al., 2006) 2.2. NẤM MỐC ASPERGILLUS HIỆN DIỆN TRÊN ðẬU PHỘNG 2.2.1. ðặc tính chung của nấm mốc Aspergillus Họ nấm Aspergillus có thể lên ñến 200 loài, trong ñó có khoảng 20 loài gây hại cho con người. Aspergillus thuộc nhóm vi nấm, không có chất diệp lục do vậy chúng không thể tổng hợp ñược các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường ñể sinh trưởng và phát triển. Khuẩn ty có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trở nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất ñịnh của khuẩn lạc. Aspergillus hoàn toàn hiếu khí, chúng phát triển mạnh trong ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới và cận nhiệt ñới. Tương tự như các loài nấm mốc nói chung, Aspergillus chịu ñược ñiều kiện nhiệt ñộ, ñộ acid và aw thấp hơn các loài vi sinh vật khác. Về sinh sản, Aspergillus sinh sản bằng hình thức vô tính ñó là cách sinh sản bằng mẩu sợi - một ñoạn sợi nấm rơi vào cơ chất gặp ñiều kiện thuận lợi Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 7 sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới. Ngoài sinh sản bằng mẩu sợi, nấm mốc còn sinh sản bằng bào tử ñính (conidia), ñây là hình thức sinh sản phổ biến ở nấm mốc; khi ñó các sợi khuẩn ty khí sinh hình thành một dạng tế bào ñặc biệt hình chai và ñầu các tế bào này sinh ra các bào tử còn gọi là bào tử ñính hay bào tử trần, màu sắc của bào tử ñặc trưng cho nấm mốc ở tuổi trưởng thành. Các giống Aspergillus phân bố rất rộng rãi. Chúng có thể ñược phân lập từ ñất, ñậu phộng, thóc, gạo, ngô, giày da, sơn, giấy, phim ảnh, dược liệu,... Một số giống Aspergillus ñược sử dụng trong công nghệ lên men, sản xuất enzyme (amylase, protease, pectinase,...), các acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic,...). Một số loài lại tạo thành mycotoxin có khả năng gây ung thư (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus versicolor,...). 2.2.2. Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm Sợi nấm là một ống hình trụ dài, có vách ngăn ngang. Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài vừa phân nhánh và vừa tạo thành các vánh ngăn. Các nhánh lại tiếp tục phân nhánh liên tiếp. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một tế bào nấm mốc trên môi trường nuôi cấy hoặc trong một số cơ chất tự nhiên gọi là hệ sợi nấm, hệ sợi nấm phát triển thành khối có hình dạng nhất ñịnh thường là tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc (Bùi Xuân ðồng, 2004). Về nguyên tắc cấu tạo tế bào nấm mốc không khác tế bào vi khuẩn và nấm men, trong tế bào chất thường tạo thành một số không bào chứa ñầy dịch bào. Các chuỗi tế bào ñược ngăn cách và nối tiếp nhau tạo thành khuẩn ty. Hệ sợi nấm mốc có một số sợi ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Từ khuẩn ty khí sinh sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản ñặc biệt mang bào tử và màu sắc của bào tử sẽ ñặc trưng cho màu sắc của nấm mốc khi già. 2.2.3. Hình thái nấm mốc Giống Aspergillus sinh sản bằng bào tử ñính (conidia), ñây là hình thức sinh sản vô tính và bào tử nấm mốc là cơ quan sinh sản chứ không phải là dạng tồn tại bảo vệ như ở các vi khuẩn. Bào tử ñính phát triển từ thành tế bào rất dày bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào chân ñế. Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là bọng (túi). Xung quanh bọng là một hoặc hai bộ cuống ñể ñính bào tử gọi là cuống ñính bào tử hay thể bình. Từ bộ cuống ñính bào tử ngoài cùng, bào tử ñược sinh ra gọi là bào tử ñính. Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử ñính tương tự ( Nguyễn ðức Lượng et al., 2003). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 8 Nguồn: 2.2.4. Một số loài Aspergillus thường gặp • Aspergillus flavus Khi phát triển trên môi trường thạch Czapek, thạch malt và PDA bề mặt khuẩn lạc có màu vàng lục, do bào tử ñính màu này ñược tạo ra rất nhiều. Hệ bào tử ñính thường có sợi cuống với vỏ cuống xù xì, có hai bộ cuống ñính bào tử và tạo bào tử ñính có gai. Loài này có thể tạo aflatoxin và có khả năng gây bệnh. Foot cell Tế bào chân ñế Conidiophore stipe Cuống conidi Vesiele Bọng Metulac Phialides Thể bình (cuống thể bình) Thể bình Conidia Bào tử Columnar Hình cột Radiate Hình tia Hulle cells Tế bào Hulle (tế bào vỏ dầy) Hình 1: Hình thái học nấm mốc Chú thích hình: Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 9 • Aspergillus parasiticus Loài này tương tự như loài Aspergillus flavus, chỉ có hai ñiểm khác là chúng chỉ có một bộ cuống ñính bào tử và bề mặt cuống nhẵn hoặc xù xì. Chúng cũng có thể tạo aflatoxin và gây bệnh. • Aspergillus niger Nhóm này gồm có trên dưới 10 loài. Chúng có màu ñen khi quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử ñính màu ñen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có ñộ phóng ñại thấp. Chúng có hai bộ cuống ñính bào tử và tạo bào tử ñính màu nâu hơi ñen và có gai. Bọng và sợi cuống thường có màu nâu bóng. Một số loài của nhóm này có khả năng gây bệnh. • Aspergillus fumigatus Loài này có hệ bào tử ñính chỉ có một bộ cuống ñính bào tử. Cuống ñính bào tử, túi và sợi cuống có màu lục hơi xanh. Bào tử ñính có gai. Khuẩn lạc có màu nâu hơi xanh. ðây là loài có khả năng gây bệnh cho người và ñộng vật, thường lây nhiễm qua con ñường hô hấp. Chúng phát triển mạnh ở vùng có khí hậu nhiệt ñới và cận nhiệt ñới (Nguyễn ðức Lượng et al., 2003). 2.2.5. Aflatoxin và tác ñộng của nó ñối với sức khỏe con người Hiện nay có khoảng 300 aflatoxin với trên 100 loài nấm mốc tương ứng ñã ñược phát hiện, trong ñó chiếm số ñông là Penicillium sau ñó ñến Aspergillus. Bảng 6: Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành. Loài nấm Mycotoxin Aspergillus flavus Aflatoxin, acid koji, acid nitro-propionic, acid Aspergillic, aspertoxin,... Asp. parasiticus Aflatoxin Asp. niger Aflatoxin Asp. fumigatus Aflatoxin, fumigacillin, gliotoxin Asp. oryzae Oryzacilli, acid koji Asp. versicolor Versicolorin A, B, C; aversin, sterogmatocystin Nguồn: Bùi Xuân ðồng, 2004. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 10 Trong thực tế hiện nay chỉ có những mycotoxin gây ung thư gan mới ñược con người thực sự quan tâm. Trong số ñó ñược chú ý ñặc biệt là các aflatoxin B1, B2, G1, G2 do: - ðộc tính và ñược tạo thành với lượng nhiều. ðộc tố rất bền nhiệt. - Khả năng phân bố phổ biến Aspergillus flavus. - Tỷ lệ cao các chủng tạo ra aflatoxin ở các loài nấm này. Ở Việt Nam, Aspergillus flavus và aflatoxin ñược phát hiện trên nhiều loại lương thực và thực phẩm với tần suất khác nhau trên các sản phẩm và vùng ñịa lý khác nhau. * ðộc tính aflatoxin Với lượng nhỏ ăn nhiều ngày aflatoxin có khả năng ung thư gan cho người, nếu hấp thu tổng lượng 2,5mg trong 89 ngày có thể dẫn ñến ung thư gan hơn một năm sau. Với số lượng aflatoxin lớn, gây bệnh cấp tính với các triệu chứng chủ yếu ở gan (gan bị hoại tử, chảy máu gan,...). Liều lượng ñộc tố gây chết người khoảng 10mg (www.vnn.vn). Theo WHO, qui ñịnh trong thức ăn, thức uống cho người không ñược có quá 30µg trên 1kg sản phẩm ăn uống và không ñược có quá 0,3ppm aflatoxin trong thức ăn bổ sung cho trẻ em ở các vùng dân cư thiếu dinh dưỡng protein. 2.2.6. Sự nhiễm ñộc aflatoxin trên ñậu phộng và biện pháp phòng tránh ðậu phộng có thể bị nhiễm ñộc khi có một số nấm phát triển trên nó, sự sinh sản và sinh nhiễn ñộc tố này có thể xảy ra trong 3 thời kỳ: - Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh ñộc tố trước khi thu hoạch: Do gặp ñiều kiện thời tiết xấu, vỏ hạt bị tổn thương nứt vỡ tạo ñiều kiện thuận lợi cho nấm xâm nhập vào trong quả. - Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh ñộc tố sau khi thu hoạch: Aspergillus flavus phát triển mạnh khi hạt ñậu ñã chín quá mức mới thu hoạch. ðậu phộng sau khi thu hoạch nếu không ñược phơi khô mà ñem ñi bảo quản ngay cũng tạo ñiều kiện tốt cho việc sản sinh ñộc tố. - Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh ñộc tố trong kho bảo quản: ðộ ẩm tương ñối trong không khí ở kho và nền kho là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng ñến sự sản sinh ñộc tố. Nếu trong kho quá ẩm, nguy cơ ñậu phộng nhiễm ñộc rất cao mặc dù ñược thu họach ñúng kỹ thuật và phơi ñúng cách. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 11 * Các nhân tố tạo ñiều kiện xuất hiện chất ñộc trên ñậu phộng Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh ñộc tố phần lớn ảnh hưởng bởi ba yếu tố: - Nhiệt ñộ: • Aspergillus flavus tồn tại và phát triển ñược ở khoảng nhiệt ñộ 6 - 450C. • Tốc ñộ tăng trưởng tối ưu ở khoảng 30 - 350C. • Sinh ñộc tố ở khoảng 13 - 400C, ñặc biệt nhiều ở 250C. - ðộ ẩm: • Aflatoxin sinh ra nhiều khi ñộ ẩm không khí là 85% ở 300 C trong 21 ngày. - Tình trạng vỏ hạt: • Vỏ hạt bị thương tổn là ñiều kiện ñể xúc tiến nhiễm ñộc cao, tạo ñiều kiện nấm xâm nhập và gây hư hỏng. * Những biện pháp sau ñây cho phép thu hoạch ñậu phộng không có hoặc có rất ít aflatoxin: - Chọn những giống lạc có vỏ dai, cứng, không bị nứt vỏ, quả ít bị tổn thương trong quá trình canh tác và thu hoạch. - Thu hoạch kịp thời ngay khi chín, không ñể lâu. - Phơi giữ cho ñậu phộng thật khô. - Cần phải bảo quản ñậu phộng tránh tiếp xúc với không khí bên ngoài. - Dùng phương pháp lý hóa ñể ức chế hoặc giải ñộc aflatoxin. 2.3. Sơ lược về hệ thống phân loại nấm mốc và phương pháp ñịnh danh. 2.3.1. Sơ lược về hệ thống phân loại nấm mốc. ðơn vị nhỏ nhất là loài. Mỗi loài ñược gọi bằng một tên khoa học gồm hai phần: tên giống và tên loài (danh pháp kép). Tên giống viết hoa, tên loài viết thường và ñược in nghiêng. Giống là một nhóm có chứa một hoặc nhiều loài, trong khi bậc kế tiếp là họ có thể có một hoặc nhiều giống. Do vậy, hệ thống phân loại theo bậc ñược xếp từ trên xuống gồm có 7 bậc như sau: Giới (Kingdom). Ngành ( Phylum). Lớp (Class). Bộ (Order). Họ (Family). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 12 Giống (Genus). Loài (Species). 2.3.2. Phân loại nấm. Giới nấm (Mycetalia) Ngành Nấm nhày (Myxomycetes). Lớp Acrasiomycetes. Lớp Hydromyxomycetes Lớp Myxomycetes. Lớp Plasmodiophoromycetes. Ngành Nấm (Mycota). Giai ñoạn dinh dưỡng là sợi nấm hoặc ñơn bào, có vách. Chia thành 5 lớp. Lớp Nấm Roi (Mastigomycetes) gồm nấm có bào tử ñộng, sợi nấm không vách ngăn. Lớp Nấm Tiếp Hợp (Zygomycetes). Sợi nấm không vách ngăn, sinh sản hữu tính theo lối ñẳng giao cho ra một bào tử tiếp hợp. Lớp Nấm Nang (Ascomycetes). Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản hữu tính cho ra nang chứa bào tử nang. Lớp Nấm ðảm (Basidiomycetes). Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản hữu tính cho ra ñảm mang bào tử ñảm. Lớp Nấm Bất Toàn (Deuteromycetes). Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng bào tử hay hạch nấm, chưa biết sinh sản hữu tính (kể cả những nấm ñã biết sinh sản hữu tính nhưng trong giai ñoạn vô tính vẫn xếp vào lớp này). 2.3.3. Phân loại ñến giống Aspergillus Giới Nấm: Mycetalia Ngành Nấm: Mycota Lớp Nấm Bất Toàn: Deuteromycetes Bộ Nấm Bông: Moniliales. Họ Nấm Bông: Moniliaceae. Giống: Aspergillus. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 13 * Phương pháp ñịnh loại loài. Qui tắc chính. - Chủng nấm mốc tuyệt ñối thuần chủng (không lẫn nấm mốc hoặc các loài vi sinh vật khác). - Sử dụng các môi trường nuôi cấy, nhiệt ñộ và thời gian nuôi cấy ñúng với qui ñịnh của các chuyên luận phân loại. - Quan sát và ghi chép ñầy ñủ các ñặc ñiểm phân loại của chủng nấm mốc cần ñịnh loại (ñặc ñiểm khuẩn lạc trên môi trường trong ñĩa petri và các ñặc ñiểm vi học). - Dùng các chuyên luận phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ) ñể ñịnh loại ñến giống, sau ñó dùng các chuyên luận phân loại của giống ñã xác ñịnh ñể ñịnh loại ñến loài (và thứ nếu có). - Kiểm tra mẫu nấm mốc ñã ñịnh loại với chủng mẫu của loài có trong bộ sưu tập mẫu (nếu có). - Viết tên các nhóm phân loại ñúng danh pháp quốc tế. Bảng 7. Qui trình ñịnh loại một chủng nấm mốc (ñối với nhiều chi nấm mốc). Tuổi khuẩn lạc (ngày) Quan sát khuẩn lạc Quan sát các ñặc ñiểm vi học Ngày 1 Cấy nấm ở một hoặc 3 ñiểm ở giữa mặt thạch trong ñĩa petri. Thực hiện tiêu bản thạch hoặc tiêu bản phòng ẩm. Ngày 2 - 5 (tùy từng loài) Khảo sát các ñặc ñiểm của khuẩn lạc non. Ghi chép. Khảo sát, ghi chép, vẽ các ñặc ñiểm phát sinh, cách sắp xếp của bộ máy mang bào tử và của bào tử. Ngày 5 - 12 (tùy từng loài) Khảo sát các ñặc ñiểm của khuẩn lạc trưởng thành. Ghi chép. Khảo sát, ghi chép, vẽ các ñặc ñiểm hình thái của bộ máy mang bào tử và của bào tử (ở tiêu bản vi học). Các ñặc ñiểm của khuẩn lạc cần quan sát: - Hình dạng (thường là tròn, gần tròn). - Kích thước (ñường kính, chiều dày). - Dạng mặt (mượt, mịn, len, xốp, dạng hạt, lồi lõm,...) - Màu sắc mặt trên. - Màu sắc mặt dưới. - Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo,..) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 14 - Giọt tiết (nhiều, ít, màu sắc,...) - Sắc tố hòa tan ra môi trường (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc), nếu có. Các ñặc ñiểm vi học cần khảo sát: - Bào tử: typ phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt,... - Bộ máy mang bào tử trần, gồm: Giá bào tử trần (conidiophore): kích thước (ñường kính, chiều dài), bề mặt (nhẵn, có gai,...), màu sắc, có vách ngăn hay không, và các ñặc ñiển khác. Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell): typ tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng sinh bào tử trần ñồng thời hay không ñồng thời, dạng sinh bào tử trần qua lỗ ñể lại sẹo,...), hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí (ở ñỉnh giá, nhánh, dỉnh nhánh,...)... - Sợi nấm: Có hay không có vách ngăn ngang, ñường kính, màu sắc, bề mặt, có hoặc không có các hình thái ñặc biệt như bó sợi, bó giá, hạch nấm,... Tiến hành ñịnh loại. Căn cứ vào kết quả khảo sát ñầy ñủ, chính xác các ñặc ñiểm của khuẩn lạc và các ñặc ñiểm vi học, tiến hành xác ñịnh tên loài của chủng nấm mốc. ðể ñịnh loại tiến hành hai bước: • Bước 1: Tìm nhóm phân loại có trong các chuyên luận phân loại bằng một số ñặc ñiểm qui ñịnh trong các chuyên luận phân loại ñó. Thường chúng ta dùng chuyên luận phân loại bậc cao ñể xác ñịnh chủng nấm mốc lần lượt, cuối cùng thuộc giống nấm mốc nào. Tiếp theo dùng chuyên luận phân loại trong các chuyên luận phân loại của giống ñó ñể xác ñịnh loài. Khi ñã xác ñịnh tạm thời loài của chủng nấm mốc, tiến hành so sánh tất cả các ñặc ñiểm ñã khảo sát của chủng nấm mốc với các ñặc ñiểm tương ứng của loài ñó trong chuyên luận. Trường hợp các ñặc ñiểm phù hợp với chuyên luận, ta xác ñịnh chủng nấm mốc này thuộc loài vừa tiến hành so sánh, nếu không phù hợp ta phải tiến hành làm lại từ ñầu. • Bước 2: Nếu có chủng nấm mốc mẫu của loài hoặc thứ vừa xác ñịnh trong bộ sưu tập các chủng nấm thì ta tiến hành so sánh chủng này với chủng nấm mốc mẫu. Muốn vậy ta xác ñịnh các ñặc ñiểm chính của khuẩn lạc, các ñặc ñiểm vi học chính của chủng nấm mẫu, và tiến hành so sánh với chủng nấm cần ñịnh loại. Nếu các ñặc ñiểm này trùng nhau ta khẳng ñịnh chắc chắn loài của chủng nấm mốc cần ñịnh loại. Thông thường trong trường hợp khi ñịnh loại nấm mốc bằng chuyên luận phân loại cho kết quả không chắc chắn ta mới tiến hành thêm với các chủng nấm mẫu. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 15 Có nhiều chuyên luận phân loại các chủng nấm mốc khác nhau ñược sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm. Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sử dụng chuyên luận phân loại trong “The genus Aspergillus” của K. B. Raper et Ch. Thom, 1965. Baltimore; ñồng thời có tham khảo thêm một số tài liệu phân loại có liên quan. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 16 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1. ðịa ñiểm Quá trình tiến hành thí nghiệm, thu thập các dữ liệu sẽ ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - Trường ðại Học Cần Thơ. 3.1.2. Thời gian nghiên cứu Thí nghiệm sẽ ñược thực hiện trong thời gian là 12 tuần bắt ñầu từ ngày 26/02/07 ñến ngày 18/05/07. 3.1.3. Nguyên liệu Hạt ñậu phộng ñược thu mua tại các sạp hàng khác nhau ở chợ Xuân Khánh - Tp Cần Thơ. 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị ðĩa petri. Tủ ủ. Nồi thanh trùng. Lame, lamellae. Becher. Tủ sấy. Que cấy móc. Kính hiển vi có thước trắc vi. ðèn cồn. Nút bông. 3.1.5. Hóa chất Glucose Agar-Agar Cồn 700 và 960 Nước cất NaOH 1N HCl 1N 3.1.6. Các loại môi trường Môi trường Czapek. Môi trường PGA. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 17 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nuôi cấy mẫu trên môi trường PGA. - Quan sát khuẩn lạc nấm mốc phát triển trên môi trường nuôi cấy, tách ròng loài nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus bằng phương pháp cấy chuyền liên tục. - Tiến hành phân lập trên môi trường Czapek. - Thực hiện tiêu bản nấm mốc quan sát dưới kính hiển vi. 3.3. NỘI DUNG VÀ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 3.3.1. Phân lập nấm mốc Aspergillus Nhằm xác ñịnh các loài Aspergillus hiện diện trên ñậu phộng, tách riêng các loài nấm mốc từ quần thể ban ñầu và ñưa về dạng thuần chủng, tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình quan sát hình thái sợi nấm, nhờ ñó việc ñịnh tên chúng sẽ chính xác hơn. 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm a. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Môi trường PGA và Czapek ñược chuẩn bị, thanh trùng ñổ vào các ñĩa petri ñể ñặc tự nhiên trên mặt phẳng ngang. b. Chuẩn bị mẫu Thí nghiệm ñược thực hiện với hai mẫu hạt khác nhau: - Mẫu 1: Hạt ñậu phộng ñược rửa sạch bằng nước cất vô trùng ñể xác ñịnh những loài nấm mốc có trong bản thân hạt. - Mẫu 2: Hạt ñậu phộng không ñược rửa, dùng xác ñịnh những loài nấm mốc bám lên hạt trong quá trình vận chuyển. c. Phân lập nấm mốc - Cho một vài hạt ñậu phộng còn nguyên vào ñĩa petri chứa sẵn môi trường PGA. - Cho ñĩa vào tủ ủ ở nhiệt ñộ phòng. - Tiến hành quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày. Sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 5-7 ngày, dùng que cấy vít lấy một ít bào tử nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus (dựa trên hình thái và màu sắc bào tử nấm mốc) cấy lên môi trường PGA trong ñĩa petri. - Tiến hành ủ ở nhiệt ñộ phòng, và quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày. - Thao tác cấy truyền ñược thực hiện nhiều lần cho ñến khi mẫu hoàn toàn thuần chủng, không có lẫn sợi nấm lạ. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 18 d. ðịnh danh Tiến hành nhận xét ñại thể và vi thể nấm mốc - ðại thể: quan sát ñặc ñiểm hình thái sợi nấm bằng mắt thường. - Vi thể: thực hiện tiêu bản nấm mốc, quan sát ở vật kính 40X cấu tạo khuẩn ty và bào tử của nó. Dựa trên kết quả thu nhận ñược tra khóa phân loại, xác ñịnh tên loài nấm mốc tương ứng. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 19 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tôi quan sát thấy trên hạt ñậu phộng xuất hiện thường xuyên một số loài nấm mốc (ñược phân biệt chủ yếu dựa trên màu sắc) như sau: - Nấm có hệ sợi bao phủ như mạng lưới, phát triển nhanh, bao trùm lên khắp ñĩa với ñầu là những chấm màu ñen. - Nấm có màu trắng, bề mặt li ti như bụi, không có hệ sợi khí sinh. - Nấm có màu vàng nâu. - Nấm có màu ñen. - Nấm có màu nâu. - Nấm có màu xanh xám, bề mặt li ti như bụi, không có hệ sợi khí sinh. - Nấm có màu vàng tươi, bề mặt li ti như bụi, không có hệ sợi khí sinh. - Nấm có màu xanh lục. - Các loài men dại. Sau quá trình phân lập và ñịnh danh, chúng tôi xác ñịnh ñược bốn loài Aspergillus sau: - Aspergillus flavus - Aspergillus oryzae - Aspergillus niger - Aspergillus ficuum Hình 2. Mẫu hạt ñậu phộng có nấm mốc phát triển trên môi trường nuôi cấy PGA sau 3 - 5 ngày, nhiệt ñộ 27 - 320C . a) b) b) Mẫu hạt có rửa a) Mẫu hạt không rửa Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 20 4.1. Aspergillus flavus TÊN: Aspergillus flavus Xuất xứ: Hạt ñậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ñộ: 27- 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc ñộ mọc: Trung bình Kích thước: 5 - 5.5 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời. Giọt tiết: Xung quanh rìa khuẩn lạc có giọt tiết màu trắng ñục và màu ñen, trong. Chúng ñược tiết ra sau 4 - 5 ngày nuôi cấy, bề trái các giọt tiết có màu ñen. Màu sắc: Mặt phải: Ban ñầu khuẩn lạc có màu vàng nhạt sau chuyển sang màu xanh lục Mặt trái: Không màu Sắc tố ra môi trường: Không Giai ñoạn vô tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và tạo thành các cột với những chuỗi bào tử rất dài khi già. Kích thước: (50 - 200) µm. Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống ráp, có nhiều gai mịn, ñều. Kích thước: (380 - 800) x (12 - 18) µm. Màu sắc: Không màu. Bọng: Hình dạng: Hình cầu ñến gần cầu. Kích thước: (35 - 50) µm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng. Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình hai tầng và một tầng. Có cả hai loại thể bình trên cùng một bông. Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Hình trụ. (10 - 20) x (3,75 - 5) µm. Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình chai. (5 - 7,5) x (3,75 - 5) µm. Hình dạng: Bào tử: Kích thước Hình cầu, bề mặt có vẻ trơn nhẵn. (3 - 5) µm Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 21 Hình 3. Aspergillus flavus với những giọt tiết có màu trắng ñục xung quanh rìa khuẩn lạc sau 4 –5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek. Hình 7. Các bào tử kết lại thành chuỗi rất dài Hình 6. Cấu tạo một bọng có hình gần cầu. Hình 4. Aspergillus flavus có bông hình cột với những chuỗi bào tử rất dài. Hình 5. Cấu tạo hiển vi một bông với thể bình hai tầng Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 22 Nguồn: Hình ảnh ñược chụp ở ñiều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phòng thí nghiệm bộ môn CNTP và bộ môn Bảo Vệ Thực Vật Hình 8. Bào tử của A. flavus Hình 9. Cấu tạo một thể bình hai tầng với cuống ñính thể bình có hình trụ và thể bình có hình chai Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 23 4.2. Aspergillus niger TÊN: Aspergillus niger Xuất xứ: Hạt ñậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ñộ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc ñộ mọc: Trung bình Kích thước: 4,4 - 5,8 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, tâm khuẩn lạc lồi, rìa là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Không Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc có màu ñen như than. Mặt trái: Không màu Sắc tố ra môi trường: Không Giai ñoạn vô tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và xé rách tạo dạng cột khi già. Kích thước: (100 - 200) µm Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn, không màu, có màu nâu gần bọng. Kích thước: (400 - 800) x (15 - 18) µm Màu sắc: Không màu Bọng: Hình dạng: Hình cầu Kích thước: (45 - 72) µm Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình hai tầng với ñặc trưng là lớp thứ nhất dài gấp ñôi lớp thứ hai. Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Hình trụ dài. (17,5 - 25) x (5 - 7,5) µm Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình chai. (5 - 8) x (3 - 3,75) µm Hình dạng: Bào tử: Kích thước Hình cầu, bề mặt có gai xù xì. (3,75 - 5) µm Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 24 Nguồn: Hình ảnh ñược chụp ở ñiều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phòng thí nghiệm bộ môn CNTP và bộ môn Bảo Vệ Thực Vật Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek, nhiệt ñộ 27 - 320C. Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản có bông hình cầu toả tia. Hình 12. Bông với thể bình hai tầng và bọng hình cầu. và bọng có hình cầu. Hình 13. Cấu tạo hiển vi một thể bình hai tầng với lớp thể bình thứ nhất dài gấp ñôi thể bình thứ hai. Lớp thứ nhất có hình trụ, lớp thứ hai có hình chai. a) b) a) sau 3 ngày b) sau 5 ngày Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 25 4.3. Aspergillus oryzae TÊN: Aspergillus oryzae Xuất xứ: Hạt ñậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ñộ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc ñộ mọc: Trung bình Kích thước: 5 - 6 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, khuẩn lạc tâm lồi, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Không Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc ban ñầu có màu vàng lục sau chuyển thành màu vàng lục nâu. Mặt trái: Không màu Sắc tố ra môi trường: Không Giai ñoạn vô tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và xé rách thành những dãy tua rua với những chuỗi bào tử rất dài khi già. Kích thước: (140 - 170) µm. Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống có gai mịn. Kích thước: (400 - 550) x (6,5 - 10) µm. Màu sắc: Không màu. Bọng: Hình dạng: Hình cầu ñến gần cầu. Kích thước: (16,25 - 25) µm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng. Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tầng là chủ yếu. ðặc biệt bông lớn hai thể bình, bông nhỏ một thể bình. ðôi khi có cả hai thể bình trên cùng một bông. Thể bình một tầng Hình dạng: Kích thước: Hình chai. (7 - 8.75) x (3,75 - 5) µm Hình trụ dài. (7,5 - 11) x (3,75 - 7,5) µm Thể bình hai tầng: Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình chai. 12,5 x (7 - 7,5) µm Hình dạng: Bào tử: Kích thước: Hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kích thước lớn, màu vàng nâu. Khi già gai trở nên xù xì, vách dày. (5 - 7) µm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 26 Nguồn: Hình ảnh ñược chụp ở ñiều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phòng thí nghiệm bộ môn CNTP và bộ môn Bảo Vệ Thực Vật Hình 14. Aspergillus oryzae có màu vàng lục khi non và chuyển sang màu vàng lục nâu khi già Hình 15. Aspergillus oryzae có bông hình cầu khi non và xé rách tạo hình trụ hay những chuỗi tua rua khi già. Hình 16. Cấu tạo bông lớn với thể bình hai tầng và bọng có hình cầu Hình 17. Cấu tạo bông nhỏ với thể bình một tầng Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 27 4.4. Aspergillus ficuum TÊN: Aspergillus ficuum. Xuất xứ: Hạt ñậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ñộ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc ñộ mọc: Nhanh. Kích thước: 7 cm. Dạng khuẩn lạc: Dạng mặt răng cưa, khuẩn lạc là những vòng tròn ñồng tâm thấp dần từ trong ra ngoài, rìa là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Không Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc có màu nâu nhạt ñến nâu. Mặt trái: Không màu Sắc tố ra môi trường: Không Giai ñoạn vô tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia rất ñều khi non và xé rách tạo dạng cột khi già. Kích thước: (150 - 200) µm Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn, không màu, có màu nâu gần sát bọng. Cuống có ñặc trưng dài vượt trội so với những loài trên. Kích thước: (1200 - 1950) x (11 - 12,5) µm Màu sắc: Không màu, có màu nâu gần sát bọng. Bọng: Hình dạng: Hình cầu ñến gần cầu, có kích thước lớn. Kích thước: (52 - 62) µm Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tầng với ñặc trưng là kích thước rất ngắn. Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Hình trụ ngắn. (8,75 - 10) x (3,75 - 5) µm Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình dạng: Bào tử: Kích thước: Hình cầu ñến gần cầu, bề mặt có gai mịn. Màu nâu (3,75 - 4,5) µm Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 28 Nguồn: Hình ảnh ñược chụp ở ñiều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phòng thí nghiệm bộ môn CNTP và bộ môn Bảo Vệ Thực Vật Hình 20. Khi già, bông xé rách tạo dạng cột. Hình 18. Aspergillus ficuum có màu nâu trên môi trường Czapek sau 7 ngày tuổi. Hình 19. Aspergillus ficuum có bông hình cầu tỏa tia rất ñều và ñặc biệt cuống khá dài. Hình 21. Cấu tạo hiển vi một bông có bọng hình cầu và quan sát thấy rõ thể bình một lớp. Hình 22. Bông ñược ñính trên cuống rất dài Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 29 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Qua kết quả nghiên cứu và theo dõi quá trình phát triển của nấm mốc ñược phân lập trên hạt ñậu phộng, chúng tôi xin rút ra những kết luận sau: 1. Các loài nấm mốc có mặt trên hạt ñậu phộng ở các sạp hàng khác nhau tương ñối giống nhau. ðiều này cho thấy hệ nấm mốc tồn tại trên hạt ñậu phộng tương ñối ổn ñịnh trong khu vực chợ Xuân Khánh, Tp Cần Thơ. Bước ñầu ñịnh danh ñược những loài sau: 1. Aspergillus flavus. Loài này tiết ra ñộc tố aflatoxin gây ung thư cho người và gây ra những bệnh cấp tính khi ăn phải với số lượng lớn. 2. Aspergillus oryzae. Loài này ñược sử dụng ñể chế biến thực phẩm lên men truyền thống mà ñặc trưng là tương. ðặc biệt, nó còn ñược sử dụng trong chế biến sản phẩm koji của Nhật Bản. 3. Aspergillus niger. Loài này cũng tạo ra ñộc tố mycotoxin, ngoài ra nó còn có mặt trong bánh men thuốc bắc dùng trong sản xuất rượu nếp than 4. Aspergillus ficuum. Bốn loài này xuất hiện trên hạt ñậu phộng với tần số rất cao, trong quá trình phân lập bao giờ cũng bắt gặp sự hiện diện của chúng. 2. Hệ nấm mốc trên hạt ñậu phộng trong quá trình phân lập không thay ñổi nhiều dù có qua quá trình làm sạch bề mặt hay không làm sạch, chứng tỏ hệ nấm mốc xâm nhập vào bên trong hạt trong quá trình canh tác và vận chuyển ñến nơi tiêu thụ là như nhau. 3. Hệ vi sinh vật trên hạt ñậu phộng chủ yếu là nấm mốc và nấm men. 5.2. ðỀ NGHỊ 1. Thực hiện thí nghiệm với việc sát khuẩn hoàn toàn bề mặt mẫu hạt bằng natri hypochloride 3% hoặc với H2O2 4%, rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng ñể loại hóa chất khử trùng. Sau ñó nuôi cấy song song với mẫu hạt không ñược sát khuẩn ñể phát hiện những loài nấm mốc nhiễm vào bên trong hạt trong quá trình canh tác và bám trên bề mặt hạt trong quá trình vận chuyển. 2. Tiếp tục tiến hành phân loại sâu hơn ñể ñịnh danh chính xác các loài nằm trong giống Aspergillus. 3. Mở rộng khu vực thí nghiệm ra các chợ khác ñể khảo sát sự có mặt của các loài Aspergillus khác trên hạt ñậu phộng từ ñó biết ñược sự phân bố ña dạng của các loài Aspergillus trên Tp Cần Thơ. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Xuân ðồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật 2. Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật (2003), Thực hành Vi Sinh Học ñại cương, trường ðại Học Cần Thơ. 3. Chu Thị Thơm et al. (2006), Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây lạc, NXB Lao ðộng. 4. Lâm Văn Mềnh (2004), Phân lập nấm mốc hiện diện trên cam - biện pháp hạn chế sự phát triển của chúng trong quá trình bảo quản, Trường ðHCT. 5. Nguyễn Bảo Vệ và Trần Thị Kim Ba (2005), Cây ñậu phộng kỹ thuật canh tác ở ðồng Bằng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp. 6. Nguyễn ðức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh học- tập 1- Cơ sở vi sinh vật công nghiệp, NXB ðHQG Tp HCM. 7. Nguyễn ðức Lượng et al. (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học- tập 2- Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ðHQG Tp HCM. 8. Nguyễn Thị Hoàng Anh (1997), Nghiên cứu chế biến sữa ñậu phộng, Trường ðHCT. 9. Phạm Văn Kim (2000), Vi sinh học ñại cương, Trường ðHCT. 10. www.vnn.vn 11. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 31 PHỤ LỤC Phụ lục A: ðiều chế môi trường trong nuôi cấy và phân lập nấm mốc. Phụ lục A.1. Môi trường PGA Thành phần: Khoai tây. 200 gr Glucose 20 gr Agar - Agar 15 gr Nước cất 1000 ml pH = 6,5 - 6,8 ðiều chế: Khoai tây làm sạch vỏ, cắt thành từng sợi mỏng, cho vào beaker có chứa nước cất. ðun cách thủy từ 2 - 4h. Lọc lấy nước trích, cho thêm nước cất cho ñủ một lít, cho glucose vào khuấy tan, ño pH môi trường, tiến hành ñiều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N cho ñến khi ñạt pH yêu cầu. Cuối cùng cho agar vào và nấu tan. Môi trường sau khi ñiều chế xong phân phối vào các bình tam giác có dung tích 500ml và tiến hành thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Phụ lục A.2. Môi trường Czapek Thành phần: - NaNO3 3 gr - K2PO4 1 gr - MgSO4 0,5 gr - KCl 0,5 gr - FeSO4.7H2O 0,01 gr - Succrose 30 gr - Agar 15 gr - Nước cất 1000 ml pH = 6,5 - 6,8 ðiều chế: Dùng beaker có chứa 1000ml nước cất, ñun cách thủy. Cho lần lượt các hóa chất theo thứ tự từ trên xuống và khuấy tan. Sau khi các hóa chất ñã tan hết, ño pH môi trường và tiến hành ñiều chỉnh cho ñến khi pH ñạt yêu cầu, cho agar vào và nấu tan. Chuyển môi trường vào các bình tam giác 500ml và thanh trùng ở nhiệt ñộ 1210C trong khoảng thời gian 15 phút. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 32 Phụ lục B: Thực hiện tiêu bản quan sát nấm mốc dưới kính hiển vi. Phụ lục B.1. Tiêu bản nhuộm sống. Cho một giọt cotton blue lên một lame sạch. Sử dụng kim mũi giáo hoặc que cấy móc lấy một ít tơ hoặc một mảnh nhỏ thạch có khuẩn ty nấm mốc. Rửa bớt bào tử nấm mốc bằng cách ñặt tơ nấm trong dung dịch nước xà phòng loãng, khuấy nhẹ. ðặt sinh khối khuẩn ty ñã rửa vào giọt cotton blue trên lame, dùng hai que cấy móc hoặc một que cấy móc với một kim mũi giáo tách rời các sợi khuẩn ty trong dung dịch nhuộm. ðậy lại bằng một lamellae. ðặt tiêu bản lên bàn mang vật của kính hiển vi và tiến hành quan sát ở vật kính 10X và 40X. Phụ lục B.2. Tiêu bản thạch. Cắt một mảnh thạch hình chữ nhật có kích thước bằng ¼ kích thước của lame, ñặt lên một lame sạch. Dùng que cấy nhọn chạm nhẹ lên phần ñầu sợi nấm ñể lấy bào tử, sau ñó cấy nấm ở các cạnh của hình chữ nhật, ñậy phần thạch lại bằng một lamellae sạch, ñặt cả lame vào ñĩa petri và ủ ở nhiệt ñộ phòng. Sau khoảng thời gian 3-5 ngày, lấy lame ra và tiến hành quan sát các ñặc ñiểm vi học sợi nấm ở vật kính 10X.