Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở đồng bằng Sông Cửu Long

á cá tra nguyên liệu giảm ở mức thấp gây khó khăn cho các hộ nuôi nhưng diện tích ao, hầm nuôi cá tra trên địa bàn tỉnh vẫn duy trì ở mức 334 ha. Sản lượng cá tra trong tháng 8 này ước đạt khoảng 11.030,5 Trang 3 tấn, sản lượng từ đầu năm đến hết tháng 8/2008 khoảng 85.030 tấn (tăng gần 11.000 tấn so với cuối tháng 6/2008). Theo dự báo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, đến hết năm 2008 sản lượng cá tra công nghiệp ước tính đạt khoảng 122.000 tấn (Mỹ Trung, 2008). 2.2 Tình hình bệnh trên cá tra ở ĐBSCL Cá tra, basa cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng. Theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần số xuất hiện bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản là cao nhất với 50,9%. Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang. Trong đó bệnh mủ gan xảy ra với tần suất cao nhất. Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại châu Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish). Còn ở Việt Nam E.ictaluri gây bệnh trên cá tra được gọi bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson và ctv, 2001). Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Cá bị bệnh mủ gan không có dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1 - 3mm và các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận. Bệnh mủ gan có thể xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), tỉ lệ hao hụt ở cá tra giống Trang 4 có thể từ 10 - 90%, nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất là ở giai đoạn cá có trọng lượng từ 300 - 500g (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Đầu năm 2006, bệnh mủ gan đã gây thiệt hại nghiêm trọng với cá tra nuôi thâm canh ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006). Kết quả điều tra của Từ Thanh Dung (2005) cho biết bệnh mủ gan thường bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại. Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất vào thời gian lũ về với tỉ lệ 85,4% số hộ nuôi cá ở An Giang bị nhiễm bệnh (Trần Anh Dũng, 2005). Lê Thị Bé Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy mạnh làm cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh. Ngoài ra, Trương Quốc Phú (2004) còn cho rằng nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26 - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển và gây bệnh. Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila cũng là một loại bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè. Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài là xuất huyết trên gốc các vi và xoang miệng. Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu môn (Phan Văn Ninh và ctv, 1993). Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán. Trường hợp cấp tính có thể gây tử vong cao đến 80 - 90% những trường hợp mãn tính thịt cá có nhiều điểm xuất huyết màu đỏ và sẽ bị loại bỏ hay hạ phẩm cấp trong quá trình chế biến xuất khẩu (Hứa Thị Phượng Liên, 1998). Bệnh vàng da trên cá tra là một bệnh mới xuất hiện gần đây cũng gây thiệt hại lớn cho ngành thủy sản. Tác nhân gây ra bệnh thì chưa được xác định rõ ràng. Phan Thị Hừng (2004) cho biết cá tra vàng da lượng hồng cầu của máu cá chỉ còn 50% so với cá khỏe. Phạm Thanh Hương (2006) cũng có kết luận tương tự khi đưa ra tỷ lệ giảm hồng cầu của cá tra vàng da là 20%. Đồng thời, Lê Thành Cường (2006) cũng nhận xét trên cá tra bị vàng da thì lượng máu cá không có nhiều và máu không có màu đỏ như cá khỏe, quan sát mẫu nhuộm máu thấy hồng cầu bị biến dạng nhiều. Ngoài ra, một tác nhân khác cũng được đề cập đến là kí sinh trùng, đặc biệt là giun tròn với đặc tính thích chui vào ống mật làm viêm nhiễm đường mật, tắc ống mật gây vàng da. Tuy nhiên, tác giả Lê Thành Cường (2006) Trang 5 thì cho rằng kí sinh trùng không phải là tác nhân gây bệnh vàng da ở cá tra tại ĐBSCL. 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính, kháng với O/129 bao gồm A. hydrophila, A.caviae, A.sorbia… (Từ Thanh Dung, 2005). Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh sởi…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005). Trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis and Plumb, 1979). Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn treo râu. Theo thí nghiệm cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra sau khi cảm nhiễm với A. hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận, hậu môn sưng đỏ, các tia vây xuất huyết,…nhưng không gây chết hàng loạt trong thời gian 7 ngày thí nghiệm. Thu mẫu cá chết phân lập chỉ có một loài duy nhất là A. hydrophila. A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java - Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80 - 90% (Angka, 1990). Năm 1982 Saitanu và ctv đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép (Saitanu et al., 1982). Vi khuẩn này còn gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979). Vi khuẩn A. hydrophila còn được tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp) (trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005). Cũng theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005) vào thời gian lũ rút, các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện rất cao, với 85.4% hộ đã ghi nhận. Trang 6 Bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân - hè, nhiệt độ nước khoảng 17 - 22oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Bên cạnh đó, Groberg khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi đã kết luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5oC và 17oC, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, ở 9oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy cá chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson, 1988). Trong báo cáo của Rahman et al., (2000) ông cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có độc lực cao nhất khi to = 17oC (LD50=106.03 CFU/ml) và 25oC (LD50=106.53 CFU/ml) đối với thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus). Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá rô phi bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml đã gây chết 80% cá thí nghiệm. Năm 2001 trong thí nghiệm của mình, Đoàn Nhật Phương tiến hành gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 103 CFU/ml đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có LD50 lần lượt là 3,68x106 CFU/ml (chủng A4); 2,64x106 CFU/ml và 4,52x106 CFU/ml (chủng A11); 1,96x106 CFU/ml và 1,45x107 CFU/ml (chủng A13). Trang 7 PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu - Thu mẫu cá tra từ các ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ. - Phân tích mẫu tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 05 năm 2009. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Ðối tượng nghiên cứu - Cá tra có dấu hiệu xuất huyết được thu mẫu trong ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ. 3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu - Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa. - Pipet, ống nghiệm, ống đong. - Lame, lamella, đĩa petri, giấy nhôm. - Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi. - Chai nấu môi trường, cá từ, bình tam giác, cốc thủy tinh. - Đầu cole, ống hút, găng tay. - Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh. - Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng. - Cân điện tử, lò viba, máy lắc. - Các vật liệu khác … 3.3 Hóa chất 3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn - Cồn 70o, cồn 96o. - Tryptone soya agar (TSA), nutrient agar (NA). Trang 8 3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kít API 20E - Vaseline. - Bộ hóa chất nhuộm Gram. - Dung dịch H2O2. - Que thử oxidase. - Môi trường O/F, glucose, parafin. - Nước cất. - Bộ kít API 20E (bộ test và thuốc thử: TDA, IND, VP). - Các loại hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh hóa truyền thống. 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển - Dự kiến thu khoảng 90 mẫu ở 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe. - Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và còn sống. - Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí và được phân tích ngay. Chỉ sử dụng những mẫu còn sống. 3.4.2 Phân lập vi khuẩn - Mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống. - Trước khi giải phẩu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh. - Cá được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 70o và lau sạch. Sau đó, dùng dao kéo đã tiệt trùng để mổ cá. Khi mổ tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng. - Hơ que cấy vi sinh trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ và để nguội. - Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên trong. - Lấy mẫu vi sinh ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng cấy trên môi trường NA. - Ủ đĩa trong tủ ấm 28oC sau 18 - 24 giờ. Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc, tiến hành tách ròng cho đến khi đạt đĩa cấy thuần. Các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Trang 9 3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn - Trước khi nuôi tăng sinh các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm Gram, tính di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F phải được kiểm tra. - Sau đó chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đã tiệt trùng đặt trên máy lắc (200 vòng/phút) sau 18 - 24 giờ đọc kết quả. 3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Các chỉ tiêu sinh hóa được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993). Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Các chỉ tiêu định danh vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp sinh hóa truyền thống. STT Chỉ tiêu 1 Nhuộm Gram 2 Hình dạng 3 Sinh sắc tố 4 Di động 5 Sinh catalaza 6 Sinh oxidaza 7 Phản ứng lên men yếm khí 8 Phản ứng lên men hiếu khí 9 Arginine 10 Lysine 11 Ornithine 12 Mọc trên môi trường Aeromonas 13 Sinh gas từ glucose 14 Thuỷ phân aesculine 15 Sinh ureaza 16 Sử dụng citrate 17 Sinh amylaza 18 Sinh indole 19 Phản ứng VP 20 Thuỷ phân Tween 80 21 Tạo nitrit từ nitrat 22 Mọc ở 0% NaCl 23 Mọc ở 3% NaCl Trang 10 24 Mọc ở 6% NaCl 25 Mọc ở 7% NaCl 26 Mọc ở 10% NaCl 27 Mọc trên thạch TCBS 28 Kháng với O/129 Sử dụng 29 Arabinose 30 Cellobiose 31 Galactose 32 Glycerol 33 Lactose 34 Mannitol 35 Trehalose 36 Sucrose 37 Glucose 38 Salicin 39 Xylose 3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E - Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux). - Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kít API 20E được trình bày ở bảng 3.2. - Các chỉ tiêu nhuộm Gram, di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F của vi khuẩn được kiểm tra trước khi định danh bằng kít API 20E. Phương pháp thực hiện - Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều. - Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm. - Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. - Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm ở 28oC. Trang 11 Bảng 3.2: Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng bộ kít API 20E. Chỉ tiêu Âm tính Dương tính ONPG Không màu Vàng ADH Vàng Đỏ/ cam LDC Vàng Đỏ/cam ODC Vàng Đỏ/cam CIT Vàng Xanh/xanh lá H2S Không màu Đen URE Vàng Đỏ/cam TDA Vàng Nâu sậm IND Vàng Đỏ (2 phút) VP Không màu Hồng/đỏ (10 phút) GEL Không màu (còn kết tủa đen) Đen GLU Xanh/xanh lá Vàng MAN Xanh/xanh lá Vàng INO Xanh/xanh lá Vàng SOR Xanh/xanh lá Vàng RHA Xanh/xanh lá Vàng SAC Xanh/xanh lá Vàng MEL Xanh/xanh lá Vàng AMY Xanh/xanh lá Vàng Ghi chú: - ONPG: ortho - nitrophenyl galactosidase - GEL: gelatin - ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose - LDC: lysine decarboxylase - MAN: mannitol - ODC: ornithine decarboxylase - INO: inositol - CIT: citrate - SOR: sorbitol - H2S: sinh H2S - RHA: rhamnose - URE: urea - SAC: sucrose - TDA: tryptophane deaminase - MEL: melibiose - IND: indole - AMY: amygdaline - VP: phản ứng Voges - Proskauer - ARA: arabinnose Đọc kết quả: sau 18 - 24h. - Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết quả dựa vào bảng bên trên. - Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử. Trang 12 9 TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện thì kết quả phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính (-). 9 IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+), màu vàng là phản ứng âm tính (-). 9 VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1,VP2. Đợi ít nhất 10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+). Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 - 12 phút là phản ứng âm tính (-). Trang 13 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả 4.1.1 Tình hình bệnh xuất huyết ở các ao nuôi cá tra Qua kết quả thu mẫu và phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đề tài đã thu mẫu được tổng số 17 ao ở 3 tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ. Trong tổng số 17 ao thu được có 5 ao cá bị bệnh xuất huyết (chiếm 29,41%). Số ao thu được ở Đồng Tháp là 10 ao trong đó có 1 ao bị bệnh xuất huyết (chiếm 10%). Số ao thu ở Vĩnh Long là 4 ao trong đó có 1 ao bệnh xuất huyết (chiếm 25%) và ở Cần Thơ thì cả 3 ao cá đều bị bệnh xuất huyết. (Bảng 4.1 và phụ lục 2). Bảng 4.1 Bảng kết quả thu mẫu. STT Địa điểm Tổng số ao thu Số ao bệnh xuất huyết Số chủng Aeromonas 1 Đồng Tháp 10 1 4 2 Vĩnh Long 4 1 4 3 Cần Thơ 3 3 20 Tổng cộng 17 5 28 Cá bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu thường gặp nhất là xuất huyết ở gốc các vi, da, nắp mang, miệng hay xuất huyết quanh mắt và phù mắt. Cá bệnh nặng có thể có nhiều vết loét trên cơ thể. Bên trong cá có thể bị xuất huyết ở thành bụng, nội quan, mở và cơ (Hình 4.1). Xoang bụng thỉnh thoảng chứa nhiều chất dịch có mùi hôi. Kết quả phân tích vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã phân lập được tổng số 28 chủng vi khuẩn Aeromonas (Đồng Tháp: 4 chủng; Vĩnh Long: 4 chủng; Cần Thơ: 20 chủng). Dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá lúc phân tích và hình thái khuẩn lạc đã chọn ra 8 chủng vi khuẩn đại diện (Đồng Tháp: 2 chủng; Vĩnh Long: 2 chủng; Cần Thơ: 4 chủng) (Bảng phụ lục 3) để tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Kết quả định danh bằng 2 phương pháp cả 8 chủng vi khuẩn đều là A. hydrophila (Bảng 4.2 và Bảng 4.3). Trang 14 Hình 4.1 Cá bị xuất huyết 4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Trong số 28 chủng vi khuẩn phân lập được dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh và một số thông tin lúc thu mẫu cũng như trong quá trình phân lập chọn ra 8 chủng vi khuẩn, trong đó có 2 chủng ở Đồng Tháp (SĐ2.1T, SĐ2.2T), 2 chủng ở Vĩnh Long (CA1.2T, CA1.3TT) và 4 chủng ở Cần Thơ (TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G, CS2.3T) để tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa. Kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993). Mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn kiểm tra được trình bày ở Bảng 4.2. Theo bảng kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa (Bảng 4.2) thì toàn bộ 8 chủng vi khuẩn được định danh đều là vi khuẩn gram âm, hình que (Hình 4.2), có khả năng di động nhưng không sinh sắc tố. Khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và màu trắng đục trên môi trường TSA (Hình 4.3), còn trên môi trường Aeromonas agar thì khuẩn lạc của vi khuẩn cũng có dạng tròn, lồi, nhẵn, nhưng có màu vàng (Hình 4.4). Trang 15 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập Chỉ tiêu kiểm tra A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 Nhuộm Gram - - - - - - - - - Hình dạng q q q q q q q q q Sinh sắc tố - - - - - - - - - Di động + + + + + + + + + Sinh catalaza + + + + + + + + + Sinh oxidaza + + + + + + + + + Lên men yếm khí + + + + + + + + + Lên men hiếu khí + + + + + + + + + Arginine + + + + + + + + + Lysine + + + + + + + + + Ornithine - - - - - - - - - Mọc trên môi trường Aeromonas + + + + + + + + + Sinh gas từ glucose + + + + + + + + + Thuỷ phân aesculine + - + + + + - + + Sinh ureaza - - - - - - - - - Sử dụng citrate + + + + + + + + + Sinh amylaza + + + + + + + + + Sinh indole + - - - + - + - + Phản ứng VP + - - - - - - - - Thuỷ phân Tween 80 + - - - - - - - - Tạo nitrit từ nitrat + + + + + + + + + Mọc ở 0% NaCl + + + + + + + + + Mọc ở 3% NaCl + + + + + + + + + Mọc ở 6% NaCl + - - - - - - - - Mọc ở 7% NaCl - - - - - - - - - Mọc ở 10% NaCl - - - - - - - - - Mọc trên thạch TCBS - - - - - - - - - Kháng với O/129 - - - - - - - - - Sử dụng Arabinose + - - - - - - - - Cellobiose - - - - - - - - - Galactose + + + + + + + + + Glycerol + + + + + + + + + Lactose - + + + + + + + + Mannitol + + + + + + + + + Trehalose + + + + + + + + + Sucrose + + + + + + + + + Glucose + + + + + + + + + Salicin + + + + + + + + + Xylose - - - - - - - - - (+): phản ứng dương tính ( - ): phản ứng âm tính; (q) que;A0: chủng chẩn A. hydrophila ATCC 7966; A1: TN1.1T; A2: TN2.1G; A3:TN2.4TT; A4: SĐ2.2T; A5: SĐ2.1T; A6: CS2.3T; A7: CA1.2T; A8: CA1.3TT Trang 16 Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 100X Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường TSA Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar Trang 17 Các vi khuẩn phân lập được đều cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí. Tất cả đều cho phản ứng decarboxylase dương tính với arginine, lysine và âm tính với ornithine (Hình 4.5). Chúng phát triển tốt trên môi trường Aeromonas agar và có khả năng phát triển ở nồng độ muối thấp (0% và 3%) nhưng không có khả năng phát triển ở những nồng độ muối cao hơn (6%, 7% và 10%). Hình 4.5 Kết quả phản ứng decarboxylase Hình 4.6 Kết quả phản ứng citrate Trang 18 Tuy nhiên, cả 8 chủng vi khuẩn phân lập được đều không thể mọc trên môi trường TCBS và đều kháng với O/129 (150µg). Các vi khuẩn này đều có khả năng sinh gas từ glucose, sử dụng citrate (Hình 4.6), tạo nitrit từ nitrat và dịch hóa amylase nhưng không thủy phân được Tween 80, âm tính với phản ứng VP và phản ứng sinh indole (ngoại trừ 3 chủng SĐ22T, CS23T, CA13TT là có thể sinh indole). Bên cạnh đó cũng chỉ có 2 chủng TN11T và CS23T là không thủy phân được esculine, còn tất cả các chủng còn lại đều thủy phân được esculine. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn này còn có khả năng lên men nhiều loại đường như galactose, glucose, sucrose, mannitol, salicin…(Bảng 4.1) nhưng lại cho kết quả âm tính với đường arabinose, cellobiose và xylose (Hình 4.7). So với chủng chuẩn A. hydrophila của Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) thì các chủng vi khuẩn nghiên cứu của đề tài này có sai khác ở chỉ tiêu VP (-), thủy phân Tween 80 (-), sử dụng đường arabinose (-) và đường lactose (+). Tuy nhiên, kết quả sử dụng đường lactose (+) thì phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Hà Giang (2008). Bên cạnh đó, kết quả phản ứng sinh indole cũng có sự sai khác ở các chủng TN1.1T, TN2.1G, TN2.4TT, SĐ2.1T, CA1.2T và kết quả phản ứng thủy phân esculine có sự khác biệt ở 2 chủng TN11T và CS23T. Còn tất cả các chỉ tiêu còn lại đều giống với dòng chuẩn trong nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2006). Hình 4.7 Các phản ứng sử dụng đường Trang 19 4.1.3 Định danh vi khuẩn phân lập bằng bộ kít API 20E Cùng với việc kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp truyền thống việc sử dụng bộ kít API 20E để kiểm tra cũng được thực hiện, để kết quả được thuyết phục hơn và đồng thời so sánh kết quả giữa 2 phương pháp. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu bằng bộ kít được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.7. Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kít API 20E. STT Chỉ tiêu A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 1 ONPG + + + + + + + + 2 ADH + + + + + + + + 3 LDC + + + + + + + + 4 ODC - - - - - - - - 5 CIT + + + + + + + + 6 H2S - - - - - - - - 7 URE - - - - - - - - 8 TDA - - - - - - - - 9 IND + + + + + + + + 10 VP - - - - - - - - 11 GEL + + + + + + + + 12 GLU + + + + + + + + 13 MAN + + + + + + + + 14 INO - - - - - - - - 15 SOR - - - - - - - - 16 RHA - - - - - - - - 17 SAC + + + + + + + + 18 MEL - - - - - - - - 19 AMY + + + + + - + + 20 ARA - - - - - - - - Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính ( - ): Phản ứng âm tính - A1: TN1.1T - A2: TN2.1G - A3: TN2.4TT - A4: SĐ2.2T - A5: SĐ2.1T - A6: CS2.3T - A7: CA1.2T - A8: CA1.3TT - ONPG: ortho - nitrophenyl galactosidase - GEL: gelatin - ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose - LDC: lysine decarboxylase - MAN: mannitol - ODC: ornithine decarboxylase - INO: inositol - CIT: citrate - SOR: sorbitol - H2S: sinh H2S - RHA: rhamnose - URE: urea - SAC: sucrose - TDA: tryptophane deaminase - MEL: melibiose - IND: indole - AMY: amygdaline - VP: phản ứng Voges - Proskauer - ARA: arabinnose Trang 20 Qua kết quả định danh bằng bộ kít API 20E được trình bày ở bảng 4.3 thì tất cả 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có khả năng thủy phân gelatin và tạo men β- galactosidase (ONPG). Chúng cho phản ứng dương tính với citrate nhưng âm tính với VP. Ngoài ra, chúng cũng có khả năng sinh indole nhưng lại không sinh H2S, urea và cho phản ứng âm tính với tryptophane (TDA). Bên cạnh đó, các chỉ tiêu decarboxylase đều đồng nhất với phương pháp sinh hóa truyền thống là dương tính với arginine và lysine, nhưng âm tính với ornithine. Ngoại trừ chỉ tiêu đường amygdaline âm tính ở chủng CS2.3T là sai khác so với các chủng còn lại (Hình 4.8). Còn tất cả các chỉ tiêu còn lại đều giống nhau ở 8 chủng nghiên cứu và đều được định danh chính xác là A. hydrophila. So với kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống (Bảng 4.1) thì kết quả kiểm tra bằng bộ kít không có gì sai khác. Ngoại trừ, chỉ tiêu indole có sự dao động ở một số chủng (SĐ2.1T, CS2.3T, CA1.3TT) trong phương pháp sinh hóa truyền thống. Hình 4.8 Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính 1: ortho - nitrophenyl galactosidase (+) 11: gelatin (+) 2: arginine dihydrolase (+) 12: glucose (+) 3: lysine decarboxylase (+) 13: mannitol (+) 4: ornithine decarboxylase (-) 14: inositol (-) 5:citrate (+) 15: sorbitol (-) 6: sinh H2S (-) 16: rhamnose (-) 7: urea (-) 17: sucrose (+) 8: tryptophane deaminase (-) 18: melibiose (-) 9: indole (+) 19: amygdaline {a: (+); b: (-)} 10: phản ứng Voges - Proskauer (-) 20: arabinnose (-) Trang 21 4.2 Thảo luận Theo kết quả thu mẫu và phân tích mẫu tại Khoa Thủy Sản - Đại Học Cần Thơ thì tần số xuất hiện bệnh xuất huyết (5/17 ao) ít hơn so với bệnh mủ gan (12/17 ao). Kết quả này cũng giống với kết quả khảo sát của Trần Anh Dũng (2005) thì bệnh mủ gan luôn xuất hiện nhiều hơn bệnh xuất huyết trong tất cả các mô hình nuôi từ nuôi ao, nuôi bè đến nuôi đăng quầng. Cũng theo kết quả của cuộc khảo sát này thì hai bệnh này thường phát triển mạnh vào thời điểm giao mùa từ mùa khô sang mùa mưa và thời gian lũ rút. Trong 10 ao thu ở Đồng Tháp thì chỉ có 1 ao cá bị bệnh xuất huyết do A. hydrophila, còn ở Vĩnh Long thu 4 ao thì có 1 ao và cả 3 ao thu được ở Cần Thơ đều bị bệnh xuất huyết do A. hydrophila. Kết quả này cũng tương đồng với cuộc khảo sát của Huỳnh Văn Quang (2008) rằng bệnh xuất huyết thường xuất hiện và gây thiệt hại nhiều cho người nuôi cá tra ở dọc tuyến sông Hậu cao hơn người nuôi ở dọc tuyến sông Tiền. Về kết quả định danh vi khuẩn thì tất cả 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có những đặc tính của giống vi khuẩn Aeromonas là gram âm, hình que, di động, phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men glucose trong cả hai điều kiện yếm khí và hiếu khí, tạo được nitrit từ nitrat, đặc biệt là kháng với hợp chất O/129. Đây là một đặc tính quan trọng để phân biệt vi khuẩn thuộc giống Vibrio với Aeromonas (West và et al., 1986 và Popoff, 1984). Ngoài ra, chúng đều phát triển tốt ở nồng độ muối 3%, không phát triển trong môi trường có 6% muối trở lên. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Cao Tuấn Anh (2005) là A. hydrophila chỉ khả năng phát triển ở nồng độ muối nhỏ hơn 4%. Nhưng nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) và Đoàn Nhật Phương (2001) thì vi khuẩn này phát triển tốt ở môi trường có tới 6% NaCl. Điều này có thể là do nguồn gốc của vi khuẩn khác nhau sẽ dẫn đến sự khác biệt giữa các nghiên cứu trước với các nghiên cứu sau. Cũng có thể là do sự biến đổi các đặc tính của vi khuẩn theo thời gian. Ngoại trừ chỉ tiêu VP là âm tính ở cả hai phương pháp, còn các chỉ tiêu còn lại như arginine, lysine, sinh gas từ glucose, esculine (trừ TN1.1T, CS2.3T) đều cho kết quả dương tính. Đây là những chỉ tiêu điển hình giúp phân biệt vi khuẩn A. hydrophila với vi khuẩn A. sorbia và A. caviae (Huy et al., 1997; Abbott et al., 2003). Thêm vào đó, chúng còn có khả năng sử dụng citrate và cho kết quả âm tính với đường cellobiose là hai đặc tính quan trọng giúp ích cho việc phân biệt A. hydrophila với A. salmonicida và A. bestiarum (Abbott et al., 2003). Còn Cao Trang 22 Tuấn Anh (2005) cho rằng phản ứng citrate dương tính sẽ giúp phân biệt A. hydrophila với A. sorbia. Nhìn chung, các chủng vi khuẩn A .hydrophila phân lập được trong nghiên cứu này ngoại trừ chỉ tiêu VP và thủy phân Tween 80 là âm tính, là khác với các nghiên cứu trước đây và có sự dao động ở phản ứng indole trong hai phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E thì tất cả các chỉ tiêu còn lại đều phù hợp với các nghiên cứu của nhiều tác giả trước đây như Đặng Thị Hoàng Oanh (2006), Buller (2004), Đoàn Nhật Phương (2001), Cao Tuấn Anh (2005) và Nguyễn Hà Giang (2008). Việc có sự dao động về kết quả giữa hai phương pháp có thể được giải thích là do áp dụng các phương pháp khác nhau hoặc có thể là do sai sót thao tác trong quá trình định danh. Còn việc vi khuẩn A. hydrophila phân lập được của đề tài này có sự sai khác với các nghiên cứu trước có thể là do nguồn gốc vi khuẩn khác nhau dẫn đến sự sai khác các đặc điểm sinh hóa giữa các nghiên cứu. Trang 23 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Sưu tập được 8 chủng vi khuẩn A. hydrophila (SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G và CS2.3T). - Không có sự khác biệt lớn giữa kết quả kiểm tra của hai phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E. 5.2 Đề xuất - Nên tiến hành thu mẫu định kỳ trong thời gian dài hơn, để kết quả khảo sát tình hình bệnh xuất huyết do A. hydrophila có tính thuyết phục hơn. - Cần khẳng định kết quả định danh vi khuẩn bằng phản ứng PCR. Trang 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abbott, S.L., K.W.C Wendy and J. Michel Janda, 2003. The Genus Aeromonas: Biochemical Charateristics, Atypical Reaction, and Phenotypic Indentification Schemes. J. of Clin. Micro., p. 2348 - 2357 Vol. 41, No. 6. 2. Angka, S.L., 1990.The Pathology of the Walking catfish Clarias batrachus (L), infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila Asian Fish Sei. 3: 343 - 351.In Asian Fish Health Bibliography and Abtracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992. 3. Azad A.K., D.R. Stanford, S. Sarkar, A.K. Hopper, 2001. Role of the nuclear pools of aminoacyl - tRNA synthetases in tRNA nuclear export. Mol Biol Cell 12: 1381–1392. 4. Barrow and Felltham, 1993. Manual for the Indentification of Medica Bacteria, 262pages. 5. Bộ Tài Nguyên Môi Trường Việt Nam, 2006. 6. Bộ thủy sản, 2007. 7. Buller, N. B. .2004.Bacteria from fish and other aquatic animal: A practical indentification manual.CABI publishing. 353 pp. 8. Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản.Đai Học Thủy Sản Nha Trang. 9. Cao Tuấn Anh, 2005.Thành phần giống loài vi khuẩn và ký sinh trùng trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) huyện Tân Châu tỉnh An Giang.LVTN. Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 10. Chu Thạch, 2007. Giải pháp nào để cá không phá môi trường. 11. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2006. Đặc điểm sinh hóa và kiểu ARN ribosom của vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ bệnh phẩm thủy sản nuôi ở ĐBSCL. Tạp chí nghiên cứu khoa học 2006:5. Trang 85 - 94. 12. Đoàn Nhật Phương, 2001. Xác định LD50 và thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio).LVTN.Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 13. Đỗ Thị Hòa và Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh thủy sản. NXB Nha Trang. 14. Esteve, C., E.G. Biosca and C. Amaro, 1993. Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguila reared in fresh water. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 16: 15 - 20. 15. Ferguson H.W., J.F. Turnbull, A. Shinn, K. Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish, 2001. Bacillary nercrosis in farmed Pangasius hypopthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Viet Nam. Journal of Fish Diseases 2001,24,509 - 513. 16. Hawke J.P., 1979. A bacterium associated with diseases of pond cultured channel catfish. Journal of Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508 - 1512. Trang 25 17. Huỳnh Văn Quang. 2008. Khảo sát tình hình nghề nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) trong ao ở tỉnh Vĩnh Long. LVTN. Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 18. Huy Bình, 2008. 19. Huys, G., P. Kampfer, 1997. Aeromonas popoffii sp.nov., a mesophilic bacterium isolated from drinking water production plants and reservoirs. Int. J. of Syst.Bact.47: 1165 - 1171. 20. Hứa Thị Phượng Liên, 1998. Nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá basa, cá tra tại An Giang và biện pháp phòng trị. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, 71 trang. Sở khoa học công nghệ và môi trường An Giang. 21. Lê Phú Khởi, 2006. Đánh giá thông tin liên quan đến quản lý sức khỏe cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở tỉnh An Giang. LVTN, Khoa Thủy Sản - Đại Học Cần Thơ. 22. Lê Thành Cường, 2006. Khảo sát nội ký sinh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh vàng da trong ao nuôi thâm canh. LVTN, Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 23. Lê Thị Bé Năm, 2002. Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá tra (Pangasius hypopthalmus).LVTN.Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 24. Lewis, D.H. and J.A. Plumb, 1979. Bacterial diseases p.15 - 24. In Principal diseases of farm raised catfish. Southern Cooperative Ser. 225 Auburn University. Alabama. 25. Lý Thị Thanh Loan, 2008. Hiện trạng môi trường và bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở ĐBSCL – Giải pháp khắc phục. Báo cáo tham luận tại hội nghị Giải pháp phát triển bền vững nghề nuôi và chế biến cá tra ở ĐBSCL. 26. Mỹ Trung, 2008. Năm 2008: Sản lượng cá tra công nghiệp có khả năng đạt 122.000 tấn. 27. Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung, Ferguson H.W, 2003. Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh trắng gan. Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, chuyên ngành thủy sản, 2004, 120 - 125. 28. Nguyễn Hà Giang. 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila tại Khoa Thủy Sản. LVTN. Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 29. Nguyễn Thanh Phương, T.T.T. Hoa, V.N. Út, H.T. Giang, C.T. Anh, N.T.T.Hằng, P.T.N. Thảo, Đ.T.M. Thy, N.T.T. Thảo, Đ.T.H. Oanh, N.M. Hậu, N.Q. Thịnh, Đ.N. Phương, 2007.Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (tra –Pangasianodon hypopthalmus và Basa – Pangasius bocourti) và tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở tỉnh An Giang. Trang 26 30. Phạm Thanh Hương, 2006. Xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra (Pangasiu hypophthalmus) bệnh vàng da ở tỉnh Cần Thơ. LVTN, Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 31. Phan Thị Hừng, 2004. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra (Pangasiu hypophthalmus) bệnh vàng da. LVTN, Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 32. Phan Văn Ninh, Nguyễn Thị Phi Phượng, Phạm Thị Thu Hồng, Trần Châu Phương Tuấn, 1993. Điều tra vi sinh vật gây bệnh cá nuôi bè, nghiên cứu biện pháp phòng trị. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, 32 trang. Sở Nông Nghiệp An Giang. 33. Popoff, M. 1984. Genus III Aeromonas. In Bergey,s Mannual of Determinative Bacteriology, vol. 1. ed. Krieg, N.R and Holt, J.G. pp 545 - 548. Baltimore. 34. Quang Hải, 2008. 35. Rahman, M.H., S. Suzuki and K. Kawai, 2000. The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish Carassius auratus. 36. Roselynn, M and W. Stevenson, 1988. Vaccination against Aeromonas hydrophila. In Fish Vaccination. 9:112 - 123. 37. Saitanu, K.S., Wongsawang and K. Poonsuk, 1982. Red sore diseases in carp (Cyprinus carpio L) J. Aquat. Animal Dis.3: 79 - 86. (In Thai). In Asian Fish Health Bibliography and Abtracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992. 38. Sở Công Thương Đồng Tháp, 2009. 39. Tanasomwang, V. and K. Saitanu, 1979. Ulcer diseases in striped catfish (Pangasius pangasius) J. Aquat. Animal. Dis. 2: 131 - 133. In Asian Fish Health Bibliography and Abtracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992. 40. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) thâm canh ở tỉnh Ang Giang. LVCH. Khoa Thủy Sản - ĐHCT 41. Trương Quốc Phú, 2004. Bài giảng quản lý môi trường ao nuôi. Khoa Thủy Sản - ĐHCT. 42. Từ Thanh Dung, 2005. Bài giảng bệnh học thủy sản.Khoa Thủy Sản - Đại Học Cần Thơ. 43. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, N.T.N. Ngọc, N.Q. Thịnh và Đ.T.M Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng gan trên cá tra (Pangasius hypopthalmus), Tạp chí Khoa học Đại Học Cần Thơ chuyên ngành Thủy Sản. 44. VASEP, 2008. Xuất khẩu thủy sản chạm ngưỡng 4 tỉ USD. 175068. Trang 27 45. West, P.A., P.R. Brayton, T.N. Bryant & R.R Colwell, 1986. Numerical taxonomy of Vibrios isolated from aquatic enviroments. Int. J. of Syst. Bact. 36 (4): 531 – 534. Trang 28 PHỤ LỤC 1 ™ Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lam. Các bước thực hiện: 1. Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam. Để 1 phút. 2. Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lam (khoảng 2 giây), để khô. 3. Nhỏ dung dịch Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng 1 phút. 3. Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine trên lam. 4. Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu bằng cách nghiêng lam kính rồi nhỏ từ từ dung dịch III cho đến khi giọt nước cuối trên lam không còn màu tím. Rửa và để khô. 5. Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng 2 phút. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát ở vật kính 100X. Đọc kết quả Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh. Vi khuẩn Gram âm (G - ) có màu hồng đỏ. ™ Quan sát tính di động Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt nước treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện như sau: 1. Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. 2. Cho một giọt nước lên lamelle. 3. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hòa vào nước. 4. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn trên lamelle. 5. Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle. 6. Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. ™ Phản ứng Oxidase Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm dung dịch oxidase. Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển sang màu xanh trong vòng 10 giây và ngược lại không chuyển màu thì ( - ). ™ Phản ứng Catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong 100ml nước cất). 1. Nhỏ lên vi khuẩn một giọt 3% H2O2 2.Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lam. Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong Trang 29 dung dịch 3% H2O2 và ngược lại không sủi bọt thì ( - ). ™ Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: 1. Đun và khấy cho tan hoàn toàn môi trường O/F. 2. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C. 3. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm có chứa môi trường O/F. Sau đó phủ 0.5 - 1ml dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. Theo dõi và đọc kết quả sau từ 1 đến 7 ngày. Lên men (F) khi ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng. Oxidation (O) khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng. Không đổi (N) cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ. ™ Phản ứng Decarboxylase (Arginine, Lysine, Ornithine) Các bước thực hiện: 1. Pha môi trường Decarboxylase (công thức trên nhãn) + 0.5% yeast extract. 2. Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có amino acid. 3. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm sau đó phủ lên mỗi ống 0.5ml parafin tiệt trùng, để trong tủ ấm ở 280C. Đọc kết quả từ 1 - 4 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu của ống đối chứng và ngược lại thì phản ứng ( - ). ™ Khả năng sử dụng Citrate 1. Pha môi trường Simmon’s Citrate agar (công thức pha chế trên nhãn). 2. Đun sôi và khuấy cho tan. 3. Cho khoảng 6ml môi trường vào ống nghiệm 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của ống nghiệm. Ủ ở 280C Sau 2 - 7 ngày, vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường Simmon’s Citrate agar cho kết quả (+) và ngược lại thì cho phản ứng ( - ). ™ Khả năng sinh H2S Các bước thực hiện: 1. Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất). 2. Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. Trang 30 3. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội ở 450C. 4. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm. 5. Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở 280C. Đọc kết quả sau 14 - 28 giờ Vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose và Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)). Vi khuẩn chỉ lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)). Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)). Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm. ™ Khả năng sử dụng Urea. Các bước thực hiện: 1. Pha 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4 + 0.0012% Phenol Red + 0.1% Glucose 2. Thêm 2% ure cho phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có urea. 3. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng. ™ Khả năng sinh Indole Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. 3. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. ™ Phản ứng Voges - Proskauer (VP) Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml môi trường MR – VP broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. Thuốc thử: A : Hòa tan 5g alpha naphthol trong 100ml ethyl alcohol. Trang 31 B: Hòa tan 40g KOH trong 100ml nước cất. 3. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ 0.6ml thuốc thử A và 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút. Kết quả: Sự chuyển màu hồng của môi trường cho phản ứng (+) và ngược lại. ™ Khả năng sử dụng các nguồn cacbohydrate Các bước thực hiện: 1. Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế trên nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) 2. Thêm 1% đường (glucose, arabinose, cellobiose…) 3. Chỉnh pH = 6.8 4. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm 5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội 6. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C 7. Đọc kết quả trong vòng 2 - 7 ngày Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại ™ β - galactosidase Cho vi khuẩn vào môi trường NB, thêm vào 0.2ml của 1.5% NaCl. Ủ qua đêm. Sau 48 giờ cho đĩa ONPG vào, giữ 20 phút và đọc kết quả: dương tính cho màu vàng trong vòng 4 giờ, ngược lại là âm tính. ™ Thuỷ phân amylase (Khả năng thủy phân Starch) Môi trường NA (xem công thức pha chế trên nhãn) + 0.5% starch. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội khoảng 45oC, đổ môi trường ra đĩa petri. Thuốc thử Lugol's Iodine: 5g Iodine, 10g KI và 100 ml nước cất. - Cách pha: hòa tan KI và Iodine trong 10ml nước cất rồi thêm tiếp cho đủ 100ml nước cất. Cấy vi khuẩn trên đĩa petri và ủ ở 28oC. Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử Lugol's Iodine trên bề mặt khuẩn lạc. Trong vòng 30 phút, nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển thì cho kết quả (+), ngược lại ( - ). ™ Khả năng sinh gas từ glucose Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế trên nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%). Chuẩn độ pH về 6.8. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội và cho thêm 1% đường glucose vào. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm đã tiệt trùng có chứa sẵn chuông tiệt trùng. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 28oC. Trang 32 Đọc kết quả trong vòng 2 - 7 ngày. Nếu môi trường chuyển sang màu vàng và chuông nổi lên mặt môi trường cho phản ứng (+) và ngược lại thì ( - ). ™ Kháng với hợp chất O/129. Sử dụng môi trường Muller Hinton Agar (MHA), giấy tẩm O/129 và ống nghiệm chứa 5ml 0.9% NaCl tiệt trùng. Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít vi khuẩn ròng cho vào ống nghiệm chứa 5ml 0.9% NaCl tiệt trùng và lắc đều. So sánh màu của dung dịch vi khuẩn với ống Mc Farland 0.5 Dùng pipet tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho lên đĩa MHA. Nghiêng nhẹ để trãi đều dung dịch vi khuẩn khắp bề mặt agar rồi hút bỏ phần dung dịch thừa. Dùng kẹp đặt giấy tẩm O/129 lên mặt đĩa agar. Để đĩa trong tủ ấm ở 28oC. Đọc kết quả sau 24 giờ. Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên một vòng tròn vô trùng ≥ 15mm xung quanh đĩa tẩm O/129. Trang 33 PHỤ LỤC 2 Bảng kết quả thu mẫu và phân tích mẫu Địa điểm Kí hiệu ao Tên hộ nuôi Bệnh Dấu hiệu bệnh lý Tổng số mẫu thu Số mẫu bệnh (con/ao) 1. MX2 Nguyễn Văn Hải Mủ gan Xuất huyết nhẹ da, vây. Gan, thận trước, thận sau, tỳ tạng có đốm trắng li ti. 6 4 2. MX3 Nguyễn Văn Hải Mủ gan Xuất huyết da, vây và hậu môn. Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ. 6 4 3. MX4 Nguyễn Văn Hải Mủ gan Xuất huyết nhẹ da,vây và hậu môn. Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ. Bóng hơi trương to. 6 4 4. MX5 Nguyễn Văn Hải Mủ gan Xuất huyết nhẹ da, vây và nắp mang. Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ. Bóng hơi trương to. 6 4 5. MX13 Nguyễn Văn Hải Mủ gan Bị ăn mòn cơ và vây, lồi xương. Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm mủ trắng nhỏ. Gan có màu nhạt. 6 4 Đồng Tháp 6. TT1 Nguyễn Văn Thuận Mủ gan ên ngoài bình thường. Xoang bụng có dịch vàng, gan màu không đồng nhất. Gan, thận, đều có nhiều đốm mủ trắng. 6 4 Trang 34 7. TT2 Nguyễn Trí Uyên Mủ gan Xuất huyết nắp mang, vây và phù mắt. Gan nhạt màu và có đốm mủ trắng ở thận. 6 4 8. SĐ1 Đặng Minh Quang Mủ gan Dấu hiệu bên ngoài bình thường. Gan tái nhạt, thận trước bị nhũn, tỳ tạng có đốm trắng. Xoang bụng có dịch màu hồng. 6 4 9. SĐ2 Phan Văn Điền Xuất huyết Sưng hầu, phù mắt. Xuất huyết nội quan. Xoang bụng có chứa chất dịch màu hồng. 6 4 10. SĐ3 Nguyễn Văn Huệ Mủ gan Bị ăn mòn đuôi, mang tái nhạt. Gan, thận nhạt màu. 6 4 1. CA1 Huỳnh Văn Khuê Xuất huyết Gan có màu vàng, dịch xoang bụng có mùi hôi. Thành bụng xuất huyết. 6 4 2. CA2 Phạm Minh Tiến Mủ gan Dấu hiệu bên ngoài bình thường. Gan, thận có đốm mủ trắng. Gan màu không đồng nhất. 6 4 3. CA3 Trần Hỷ Ngàn Mủ gan Mang, vây trắng nhạt. Gan màu không đồng nhất. Thận có đốm mủ trắng. 6 4 Vĩnh Long 4. CA4 Phạm Văn Tú Mủ gan Gan có màu vàng có đốm mủ trắng. Bóng hơi trương to. Thận bị nhũn. 6 4 Trang 35 1. CS2 Nguyễn Thị Hoà Xuất huyết Cơ bị loét, vây trắng nhạt và xuất huyết. Xuất huyết mặt trong thành bụng, nội quan. Xoang bụng chứa chất dịch có mùi hôi. 4 4 2. TN1 Lê Thành Nhân Xuất huyết Phù mắt, xuất huyết hầu, xuất huyết vi. Xuất huyết cơ bụng. Gan có màu vàng. 6 4 Cần Thơ 3. TN2 Lê Thành Nhân Xuất huyết Xuất huyết vi, hậu môn, hầu. Xuất huyết thành bụng và nội quan. Xoang bụng chứa chất dịch có màu vàng mùi hôi 6 4 Trang 36 PHỤ LỤC 3 Bảng các chủng vi khuẩn Aeromonas phân lập được từ bệnh phẩm Địa điểm Kí hiệu ao Tên hộ nuôi Bệnh Dấu hiệu bệnh lý Chủng vi khuẩn Đồng Tháp 1. SĐ2 Phan Văn Điền Xuất huyết Sưng hầu, phù mắt. Xuất huyết nội quan. Xoang bụng có chứa chất dịch màu hồng. 1. SĐ2.1G 2. SĐ2.1T 3. SĐ 2.2G 4. SĐ2.2T Vĩnh Long 1. CA1 Huỳnh Văn Khuê Xuất huyết Gan có màu vàng, dịch xoang bụng có mùi hôi. Thành bụng xuất huyết 1. CA1.2G 2. CA1.2T 3. CA1.3G 4. CA1.3TT 1. CS2 Nguyễn Thị Hoà Xuất huyết Cơ bị loét, vây trắng nhạt và xuất huyết. Xuất huyết mặt trong thành bụng, nội quan. Xoang bụng chứa chất dịch có mùi hôi. 1. CS2.1T 2. CS2.1TT 3. CS2.2T 4. CS2.2TT 5. CS2.3G 6. CS2.3T 2. TN1 Lê Thành Nhân Xuất huyết Phù mắt, xuất huyết hầu, xuất huyết vi. Xuất huyết cơ bụng. Gan có màu vàng. 1. TN1.1G 2. TN1.1T 3. TN1.1TT 4. TN1.2T 5. TN1.2G Cần Thơ 3. TN2 Lê Thành Nhân Xuất huyết Xuất huyết vi, hậu môn, hầu. Xuất huyết thành bụng và nội quan. Xoang bụng chứa chất dịch có màu vàng mùi hôi. 1. TN2.1G 2. TN2.1T 3. TN2.1TT 4. TN2.3G 5. TN2.3T 6. TN2.3TT 7. TN2.4G 8. TN2.4T 9. TN2.4TT Trang 37