Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men

NH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................... vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu .................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU....................................................................... 3 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản.............................................................................. 3 2.2 Vi khuẩn lactic ............................................................................................................ 7 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men axit lactic ......................................................... 7 2.2.2 Cơ chế của quá trinh lên men axit lactic ............................................................. 8 2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá .......................................... 8 2.4 Chất kháng khuẩn ....................................................................................................... 9 2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus..................................................................... 12 2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước.................................................................... 13 2.6.1 Những nghiên cứu trong nước ......................................................................... 13 2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước......................................................................... 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 15 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện................................................................................ 15 3.1.1 Địa điểm........................................................................................................... 15 3.1.2 Thời gian thực hiện .......................................................................................... 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 17 3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu .................................................................. 17 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm ....................................................... 18 3.4 Phân tích và xử lý số liệu.......................................................................................... 20 3.4.1 Phân tích VKL ................................................................................................. 20 3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn ..................................................................... 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 21 4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men................................ 21 4.1.1 Thu mẫu ........................................................................................................... 21 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1......................................................................................... 21 4.1.3 Cấy ria trên đĩa pêtri ........................................................................................ 23 7 4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram .......................................................................... 25 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2......................................................................................... 26 4.1.6 Lưu trữ mẫu ..................................................................................................... 26 4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được........................................ 26 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình ........................................................................................ 26 4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được ...................................... 27 CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT............................................................................ 31 5.1 Kết quả ...................................................................................................................... 31 5.2 Đề xuất ...................................................................................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 32 PHỤ LỤC A.................................................................................................................... A PHỤ LỤC B .....................................................................................................................B PHỤ LỤC C.................................................................................................................... C PHỤ LỤC D.................................................................................................................. D1 PHỤ LỤC E .....................................................................................................................E PHỤ LỤC F ...................................................................................................................F1 PHỤ LỤC G.................................................................................................................... G 8 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL ................................................................ 10 Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu...................................................................... 17 Bảng 4.1: Địa điểm và số lượng mẫu thu............................................................. 21 Bảng 4.2: Kết quả tăng sinh lần 1 ........................................................................ 22 Bảng 4.3: Kết quả cấy ria VKL trên đĩa thạch ..................................................... 23 Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuẩn ...................................... 28 Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus........................................... 30 Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth..................................................... A Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar ...................................................... A Bảng D1: Bảng mã mẫu ...................................................................................... D1 Bảng D2: Kết quả thử khả năng sinh CKK của VKL phân lập được ................. D3 Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc................................................................................F1 9 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá..................................................................... 3 Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép ................................................................... 4 Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm.................................................................. 5 Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc ................................................................. 5 Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm ................................................................ 6 Hình 2.6: Pediococcus.......................................................................................... 12 Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm............................................................... 19 Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình............................................................................. 19 Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp .......................................................................... 20 Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL .................................................. 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO3 ............................................. 25 Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính . 25 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của mẫu ................................................................. 27 Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh ra từ VKL ...................................................... 30 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VKL: Vi khuẩn lactic CKK: Chất kháng khuẩn 10 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá và các loài thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu. Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách. (Bùi Quang Tề, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic (VKL). VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hoá chất bột đường và chúng được xếp vào họ Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004). Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và csv., 2009). Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy sản lên men có khả năng kháng khuẩn ” được thực hiện. 11 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nhằm tìm ra một số dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men. 1.3 Nội dung nghiên cứu • Phân lập một số dòng VKL trong các sản phẩm mắm và nước mắm. • Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhóm VKL phân lập được. 12 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản Mắm là sản phẩm đặc trưng của các tỉnh Nam Bộ, tùy vào điều kiện tự nhiên đặc trưng của mỗi vùng mà các sản phẩm mắm cũng đa dạng không kém. Ở các tỉnh đầu nguồn như An Giang, Đồng Tháp nổi tiếng với các sản phẩm mắm cá nước ngọt như mắm cá Lóc, mắm cá Trèn, mắm cá Rô…. Có nhiều cơ sở mắm đã đăng kí bảng quyền thương hiệu và được xuất khẩu như Mắm bà giáo Khỏe, Mắm cô Tư Ấu. Về các tỉnh ven biển Bạc Liêu, Cà Mau cũng vang danh với các loại mắm cá đặc trưng của vùng nước lợ mặn như: mắm cá Phi, mắm cá biển, mắm Ba khía, mắm Tép…. Mắm prohoc một sản phẩm mắm quen thuộc của người dân Khmer hay mắm Tôm chà đặc sản của vùng Gò Công, Tiền Giang. Phần lớn các sản phẩm mắm đều sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống. Quy trình sản xuất của một số sản phẩm mắm Quy trình làm mắm cá có 4 công đoạn: làm cá, muối cá, thính cá, chao mắm. Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Cá làm sạch bỏ ruột, mang, vẩy Vớt cá ra để ráo và rãi thính vào lưng, vào bụng Ướp muối vào bụng, vào lưng (1 kg muối cho 5 kg cá) Chao mắm với cơm rượu trộn chung với đường chảy nấu lỏng Cho vào mái đầm đậy kín (1 tháng) Cho vào mái đầm đậy kín (2 tháng) Mắm thành phẩm Cho vào mái đầm đậy kín (2 tháng) 13 Quy trình làm mắm tép Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Tép sống làm sạch, rửa nước muối Trộn đều với rượu (khoảng 30 phút) Ướp gia vị: tỏi, riềng, ớt, đường, nước mắn Cho vào lọ thủy tinh, đậy lá ổi,lá chùm ruột để lên trên và gài chặc lại Tép dậy nước là dùng được Phơi nắng 2 ngày 14 Quy trình làm mắm tôm Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Các công đoạn làm mắm ruốc Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Ruốc tươi đem xào sơ với một ít muối hạt Phơi nắng Để vài giờ cho ngấm muối Cho vào cối quết thật nhuyễn với muối trắng mịn theo công thức 3 ruốc: 1 muối Khoảng 1 giờ Mắm lên men chua, chuyển sang màu đỏ tươi và dậy mùi thơm là dùng được Tép tươi sống đem say hoặc chà nát Cho vào dụng cụ chứa, phơi nắng, khuấy đều Trộn muối vừa đủ sao cho enzyme trong ruột tép hoạt động được Mắm tôm có màu và hương vị đặc trưng 6 – 12 tháng 15 Trong các sản phẩm lên men thủy sản, nước mắm là loại sản phẩm được nhắc đến nhiều nhất. Nước mắm được sản xuất hầu hết các nước Châu Á tuy nhiên mỗi quốc gia có phương pháp lên men truyền thống khác nhau, tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau. Về cơ bản, nước mắm là dung dịch đạm (chủ yếu là các axit amin) được tạo thành do quá trình thủy phân protein nhờ các hệ enzyme protase có trong cá. Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Cá Lựa chọn Xử lý Trộn muối Lên men Làm nguội Chiết rút Nước mắm thành phẩm Bã Phụ gia 16 2.2 Vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình thu nhận năng lượng nhờ VKL, bao gồm sự biến đổi một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra (Lương Đức Phẩm và csv, 2009): C6H12O6 = 2CH3CHONCOOH + 0,075x106J . VKL được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Các sản phẩm lên men axit lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau hoa quả, lên men thịt, lên men cá. Nhưng mãi đến năm 1878, Lister mới phân lập được VKL, ông gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus lactic). Từ đó đến nay, nhiều loại VKL được phát hiện và ứng dụng có ích của chúng ngày càng đựợc mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và thực phẩm chức năng. Công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có thể nói được hình thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997). Những loài vi khuẩn lactic khác nhau có sự thích nghi để phát triển rộng rãi trong điều kiện môi trường khác nhau, và chúng được phổ biến rộng rãi trong tự nhiên. Vi khuẩn lactic thường được tìm thấy ở đường tiêu hóa (dạ dày và ruột non) của các loài động vật khác nhau (chuột, lợn, gia cầm và con người) (Tannock, 1988 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997). Trong sữa và các sản phẩm từ sữa (Sharp, 1981 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997), các sản phẩm thủy sản (Mauguin và Novel, 1994 được trích dẫn bởi Einar Ringo et al., 1997), và trên một số bề mặt hệ thực vật (Keddie, 1959 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997). Chúng thường được dùng trong sản xuất và bảo tồn các sản phẩm thực phẩm như pho mát, thịt, sữa chua (McKay và Baldwin, 1990 được trích dẫn bởi Einar Ringo et al., 1997). Một vài VKL được tìm thấy trong các sản phẩm thủy sản lên men của Hàn Quốc (Lee, 1993 được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho và Hyung Ki Do, 2006). Ngoài đặc tính lên men axit lactic, VKL còn giúp chuyển hoá thức ăn trong cơ thể, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh (tạo ra axit formic, axit bezoic, H2O2, chất kháng khuẩn...), giúp phòng một số bệnh (cao huyết áp) (Lê Văn Nhương và csv, 2009). 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men lactic Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại cảnh khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có một số đặc điểm sau: chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều không chuyển động, chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các polyphyrine, chúng không có chứa xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi 17 có mặt oxy, là loại cơ thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm khí (Lê Văn Nhương và csv , 2009). Theo hình dáng tế bào và cách sắp xếp tế bào trong môi trường người ta thường chia VKL thành 4 giống (4 chi): Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconotoc. Các chủng thuộc 4 chi này có thể lên men đồng hình hay dị hình. Các chủng lên men đồng hình thường được sử dụng để bảo quản thực phẩm, ướp chua cá thịt, trong sản xuất axit lactic (Lương Đức Phẩm, 2004). 2.2.2 Cơ chế của quá trình lên men lactic Trong quá trình lên men axit lactic, cơ chất đầu tiên tham gia vào quá trình lên men là đường glucose hoặc fructose. Khi sử dụng nguồn nguyên liệu là các đường đôi hay các chất chứa gốc đường thì trước khi tham gia vào quá trình lên men chúng phải được thủy phân thành glucose hay fructose nhờ các enzyme tương ứng. Lên men axit lactic là quá trình chuyển hoá yếm khí đường thành axit lactic (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Có 2 kiểu len men lactic. Trong lên men lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit lactic, etanol, axit acetic và CO2. Chỉ có lên men lactic đồng hình là có ý nghĩa về mặc công nghiệp (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997). 2.3 Mối quan hệ giữa axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá VKL không được coi là thuộc về môi trường thủy sản, nhưng có một số loài vi khuẩn như: Carnobacterium, Vagococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus đã được tìm thấy trong các loài cá nước ngọt và môi trường nước nuôi (Austin, 1992 được trích dẫn bởi Ringø et al., 2000). Carnobacteria, Carnobacteria piscicola chiếm phần lớn và thấp nhất là Carnobacteria divergens, đã có những ghi nhận về các giống vi khuẩn này như một phần của hệ vi sinh đường ruột của nhiều loài cá. Mặt khác, Carnobacteria piscicola (Baya et al., 1991 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997) và Lactobacillus sp. có mối quan hệ với cá bệnh (Cone, 1982 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997). Tuy nhiên, sự quan trọng của Carnobacteria như là một tác nhân gây bệnh cá nhưng không thể đánh giá chính xác (Schillinger và Holzapfel, 1995 được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002). Một vài nghiên cứu liên quan đến sản phẩm cá được đóng gói và hút chân đã được thực hiện tập trung vào ảnh hưởng của chế biến và trên các vi sinh vật chất lượng. Sau khi kết thúc quá trình giữ lạnh ở nhiệt độ khác nhau, VKL qua quá trình kiểm tra có từ 106 – 108 CFU/g (Schulze, 1985 được trích dẫn bởi Zorn et al., 1993). Trong nghiên cứu của Zorn et al. (1993) mật số vi khuẩn 18 Carnobacteria vượt trội trong sản phẩm cá Hồi đóng gói hút chân không được bảo quản ở nhiệt độ 8 oC và 20 oC. Một số nghiên cứu trước kia trên sản phẩm cá được hút chân không giữ lạnh. Sau khi kết thúc giai đoạn giữ lạnh sự biến đổi của hệ sinh vật tỷ lệ với vi khuẩn lactic, Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn khác đã được quan sát thấy trong sản phẩm được lưu trữ ở nhiệt độ ướp lạnh. Mật số VKL từ 106 – 108 CFU/g (Joffraud et al., 2001 được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002). Trong một vài trường hợp, số lượng vi khuẩn lactic 106 – 107 CFU/g cùng với mật số vi khuẩn Gram âm từ 105 – 107 CFU/g (Paludan-Müller et al., 1998 được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002). Theo Leroi et al., (2001) (được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002) phân biệt tại thời điểm hỏng cho cùng một loại sản phẩm cá có ba loại vi khuẩn khác nhau: lactobacilli, một hỗn hợp của lactobacilli và Enterobacteriaceae hoặc một hỗn hợp của VKL và Brochothrix thermospacta. VKL trong sản phẩm giữ lạnh hút chân không bị hư hỏng được tìm thấy các giống vi khuẩn Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus và Carnobacterium. Theo Magnusson và Traustadottir (1982) cho rằng chỉ có vi khuẩn Lactobacilli homofermentative trong chân không đóng gói lạnh cá trích hun khói (được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002). 2.4 Chất kháng khuẩn (CKK) Trong các sản phẩm chuyển hoá có khả năng ức chế vi sinh vật của VKL thì chất kháng khuẩn được các nhà khoa học và nhà công nghiệp thực phẩm đặc biệt chú ý. CKK của VKL bắt đầu được nghiên cứu từ những năm 1940. Từ đó đến nay đã có rất nhiều CKK khác nhau được phát hiện (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Nisin là CKK được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất, được sử dụng trên 40 nước khác nhau (Delves – Brought,J,1990 được trích dẫn bởi Adisorn Swetwiwathora et al., 2009). Theo tài liệu gần đây nhất thì CKK được định nghĩa như sau: “CKK là các polypeptit có tính kháng khuẩn, được sản sinh trên các riboxom hoặc các protein có khả năng kháng khuẩn chống lại một phổ hẹp các loài vi khuẩn họ hàng gần gũi” (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Người ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại VKL sản sinh ra CKK (Cleveland et al., 2001; O’Sullivan et al., 2002 được trích dẫn bởi Pongtep Wilaipun et al., 2002) 19 Hiện nay, CKK được chia thành 4 nhóm Nhóm I: là nhóm lantibiotic, là loại polypeptit có khối lượng phân tử nhỏ (< 5 KDa), chứa amino acid lanthionine, β – methyllanthionine. Nhóm II: gồm các CKK không phải là lantibiotic, khối lượng phân tử nhỏ (< 10 KDa). Cấu trúc gấp nếp β, bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ khoảng 100 – 121 oC. Nhóm III: các CKK có khối lượng phân tử lớn (>30 KDa), khả năng bền nhiệt cao. Nhóm IV: Đây là nhóm CKK phức tạp. Trong cấu trúc phân tử ngoài protein, chúng còn chứa các thành phần khác là lipid, carbohydrat. Tiêu biểu của nhóm này là: plataricin S, leconocin S, lactocin 27 và pediocin SJ – 1. Trong đó, nhóm I và II được nghiên cứu nhiều nhất và chúng cũng đa dạng nhất. Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL Chất kháng khuẩn Tên vi khuẩn sản xuất Phổ ức chế pH hoạt động Khối lượng phân tử (Da) Enzyme bất hoạt 1. Lantibiotic Nisin A Lactococcus lactic subsp lactic ATCC 11454 Vi khuẩn Gram (+) 2 – 7 3353 α chymotr ypsin, nisinase Nisin Z Lactococcus lactic subsp lactic NIZO 22186 Vi khuẩn Gram (+) Lacticin 481 Lactococcus lactic subsp lactic CNRZ 481 LAB,Clostridiu m tyrobutyricum 2 – 8 2901 α chymotr ypsin, ficin, proteina se K Lactocein S Lactobacillus sake 145 Staphycoccus carnosus Carnobacteria, lactobacilli Pediococcus, lactococci <5,5 3778 Trysin, protease loại XIV 20 2. Nhóm II Lactococcin A Lactococcus lactic subsp cremoris LMG 2130 Lactococci 5778 Trypsin, endo – proteina se, glu – C Lactacin Lactobacillus acidophilus N2 lactobacilli 5 6500 Proteina se K Lactacin F Lactobacillus acidophilus 11088 Lactobacilli, Enterococeus, Faecalis 6300 Trypsin, ficin, proteina se K Diplococci Lactococcus lactic subsp cremoris 346 Lactococci 5 – 11 5300 proteina se K, α chymotr ypsin, trypsin Sakacin A Lactobacillus sake LD 706 Lactobacilli, Carnobacteria, Enterococci 2 – 9 6000 Trypsin, pepsin, proteina se K, α chymotr ypsin Curvacin A Lactobacillus curvatus LTH 1174 Lactobacilli, Carnobacteria 5000 proteina se K, trypsin 3.Nhóm III Helveticin J Lactobacillus Helveticus 481 Lactobacilli 37511 Trypsin, pepsin, pronase, proteina se K Caseicin 80 Lactobacillus 109 Lactobacillusca sei 109 3 – 9 4000 α chymotr ypsin, trypsin, pepsin, proteinas e (Nguồn: De Vuyst và Vandamme, 1993) 21 Cơ chế tác dụng của CKK của VKL CKK của VKL dù thuộc nhóm này hay nhóm khác nhưng chúng đều có một cơ chế tác dụng chung. Đó là chúng tấn công màng tế bào nhạy cảm, gây tổn thương màng không thể khắc phục được, tế này sẽ chết do nội chất thoát ra ngoài. Sỡ dĩ CKK có thể tấn công vì chúng có dạng hoà tan, dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm mất lực đẩy proton (PMF), làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào, từ đó tế bào không thể tổng hợp được màng tế bào và tế bào bị chết (Lê Văn Nhương và csv , 2009). 2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus Phân loại Pediococcus (Claussen 1903) Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Pediococcus Loài: Pediococcus pentosakeus Nhóm Pediococcus dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, kết đôi hay kết chuỗi hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn. Hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của tế bào cũng có thể thay đổi phụ thuộc vào thành phần của môi trường, điều kiện ngoại cảnh khi nuôi cấy tế bào (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Hình 2.6: Pediococcus Pediococcus có hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình. Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí. Chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường. Vì chúng 22 không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể. Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu axit và chịu NaCl. 2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước 2.6.1 Những nghiên cứu trong nước Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về CKK do VKL sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ứng dụng của CKK còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan. Một số nghiên cứu tiêu biểu về VKL và CKK • Tuyển chọn định hướng VKL sinh CKK từ một số thực phẩm giàu protein lên men lactic ở Việt Nam (Mai Thị Hằng và csv, 2000). • Phân lập và tuyển chọn một số chủng VKL sinh chất diệt khuẩn sinh học CKK (Nguyễn Thị Hương Trà và csv, 2001). • Tối ưu hoá quá trình lên men Entecocin của chủng vi khuẩn enterococus sp. Tn43 phân lập từ nem chua. Phần I-Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng sinh bacteriocin của chủng VKL Enterococus sp. Tn43. 34 (Lê Thanh Mai và csv, 2001). • Nghiên cứu công nghệ sản xuất CKK từ chủng VKL ST20 (Nguyễn Thị Hương Trà và csv, 2002). • Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của loài Lactobacillus plantarum L24. (Nguyễn Thị Hoài Hà và csv, 2005). Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. • Một số đặc tính của CKK sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Lê Thị Hồng Tuyết và Hoàng Quốc Khánh. Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của VKL vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan, có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu việt VKL còn có khả năng sinh tổng hợp CKK, một chất bảo quản thực phẩm. 23 2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng CKK do VKL sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. CKK là một chất có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của VKL được đa dạng và phong phú hơn. CKK đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ rất lâu và đạt nhiều thành tựu. • Theo Kekessy et al., (1970) đã nghiên cứu một phương pháp mới trong việc phát hiện CKK. Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5 mm bằng cách đục bỏ agar trên đĩa. Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp CKK vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng. • Năm 1976 tại Minnesota, Tagg et al., đã nghiên cứu về những loại CKK của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu đã cho biết được tính đối kháng của CKK, cách đặt tên và phân loại CKK, chiết tách và tinh sạch CKK, phân tích hoạt tính CKK, các loại hoạt động của CKK và ứng dụng của CKK. • Năm 1992 tại Laramie, Yang et al., đã nghiên cứu một phương pháp mới để chiết tách một lượng lớn CKK từ VKL. Phương pháp này dùng môi trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 làm tăng hiệu quả chiết tách và thu được một lượng CKK nhiều hơn quá trình phân lập. • Năm 1999 tại Bỉ, Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu việc sinh tổng hợp CKK của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp thu nhận CKK bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen. • Năm 1999 tại Pakistan, Khalid et al., đã nghiên cứu tìm ra một loại CKK mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn lactobacillus có trong một mẫu bệnh. • Năm 2002 Soore và ctv đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng đặc biệt của VKL gọi là CKK. CKK được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác. CKK có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người. 24 • Năm 2002 tại Thái Lan, Pongtep Wilaipun et al. đã tìm thấy khă năng sinh CKK của Enterococcus faecium được phân lập từ các sản phẩm thủy sản lên men của Thái. • Năm 2004, Todorov, S.D., Van Reenen, C.A. và Dicks K.M. (Nam Phi) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley. • Năm 2006, 50 chủng VKL được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp CKK. • Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát triển. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. • Tháng 3/2007, Todorov, S.D. và Leon M.T. Dicks K.M. (Nam Phi) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza. • Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài CKK và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh trên gà và lợn. • Bộ gen cho phân tử CKK sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra CKK. Lợi ích chính của việc sử dụng CKK là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh. 25 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm Phòng thí nghiệm – Khoa Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Tây Đô. 3.1.2 Thời gian thực hiện Từ tháng 3 năm 2011 đến tháng 5 năm 2011. 3.2 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ thí nghiệm cố định
Tủ cấy vi sinh CEMACO.
Tủ ấm vi sinh Memmert.
Tủ lạnh SanYo.
Tủ sấy Memmert.
Nồi Autolave STURDY – SA 300 VF.
Máy khuấy từ Yellowline.
Cân 2 số lẻ Sartorius.
Tủ hút. Dụng cụ thí nghiệm không cố định
Máy Vortex.
Ống nghiệm có nắp, giá để ống nghiệm.
Đĩa petri, cốc 100 ml.
Micropipet BIOHIT 20 – 200 µl , 100 – 1.000 µl , 1.000 – 5.000 µl;
Đầu típ 200 µl, 1.000 µl, 5.000 µl.
Đèn cồn, hột quẹt.
Đũa tán thủy tinh đầu tam giác, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu tròn.
Cây nhíp, dao mổ nhỏ, kéo.
Bao hấp, giấy bạc gói, thun, parafilm, bọc, băng keo giấy, bông gòn, giấy thấm.
Khay nhựa, hộp nhựa nhỏ, thao nhựa, bình tia.
Ống falcon 2 ml, ống effendoft 1,5 ml.
Chai thủy tinh nấu môi trường 500 ml, cá từ.
Găng tay, khẩu trang. 26 Môi trường nuôi cấy
Môi trường MRS_broth (Lactobacillus MRS Broth, MERCH – Đức).
Môi trường MRS_agar (Lactobacillus MRS Agar, MERCH – Đức). Các loại hoá chất
Calcium carbonate (CaCO3), Sodium chloride (NaCl)
Glycerol 30%
Nước cất, nước muối sinh lý 9‰.
Cồn 70% và cồn 96%.
Hoá chất nhuộm Gram.
Hoá chất thử catalase. Nguồn mẫu chỉ thị Pediococcus pentosakeus từ Khoa Nông Nghiệp – Trường Đại học Kyushu, Nhật Bản. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu Mẫu mắm được thu ngẫu nhiên tại các chợ Châu Đốc, Trung tâm thương mại Tp. Cần Thơ (đặc trưng vùng nước ngọt), chợ Bạc Liêu, chợ Sóc Trăng (đặc trưng vùng nước lợ mặn). Mẫu được giữ riêng biệt từng loại trong hộp nhựa nhỏ đặt tại phòng thí nghiệm với nhiệt độ phòng. Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu STT Tên mẫu Điểm thu 1 Mắm linh Châu Đốc 2 Mắm sặc 3 Mắm lóc 4 Mắm chốt 5 Mắm rô 6 Mắm trèn 7 Mắm rô lớn 8 Mè vinh 9 Mắm rô phi 10 Mắm ruốc Bà 2 Tiền Giang 11 Mắm linh Cần Thơ 12 Mắm sặc 13 Nước mắm Quốc Hải 27 14 Nước mắm Hồng Đài 15 Nước mắm Kabin 16 Nước mắm Nam Ngư 17 Nước mắm Thanh Liêm 18 Nước mắm Nam Ngư chua ngọt 19 Mắm ruốc Trí Hải 20 Mắm ruốc Huế 21 Mắm tép 22 Mắm tôm 23 Mắm lóc Bạc Liêu 24 Mắm trèn 25 Mắm sặc A 26 Mắm sặc B 27 Mắm ruốc 28 Mắm ba khía 29 Mắm cá cơm 30 Mắm cá biển A 31 Mắm cá biển B 32 Mắm rô 33 Mắm cá đối, cá cơm 34 Mắm prohoc A nhiễn Sóc Trăng 35 Mắm prohoc B to 36 Mắm sặc 37 Mắm nêm pha sẵn 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm Theo De Man et al., (1960) (được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006) VKL được phân lập trên môi trường MRS_agar sau đó được ủ ở 30 oC trong 48 – 72h để khuẩn lạc phát triển. Khuẩn lạc được chọn một cách ngẫu nhiên và được làm thuần bằng phương pháp cấy truyền (Leisner et al., 1997 được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006). Những dòng thuần của VKL được tăng sinh trong môi trường MRS_broth (pH 6,5) và được ủ ở 30 oC trong 24h. Tất cả các dòng thuần này được trữ trong môi trường MRS_broth có chứa glycerol 20% và ủ lạnh ở âm 70 oC (Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006). Quy trình phân lập mẫu mắm được thực hiện tương tự theo Penson Jumriangrit (2004). 28 Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm Để kiểm tra thời gian tăng sinh mẫu cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất với Pediococcus pentosakeus phù hợp với điều kiện thực nghiệm, VKL đã phân lập được tối ưu hóa theo sơ đồ Hình 3.2. Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình Mẫu mắm Nuôi tăng sinh trong môi trường MRS_broth, nước cất, muối sinh lý Cấy lên đĩa thạch MRS_agar ủ 24h to 30 oC VKL đã phân lập 4 ml thử các phương pháp kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ mẫu đã phân lập Lấy 1 khuẩn lạc riêng lẽ nuôi tăng sinh trong ống nghiệm MRS_broth 5 ml Trữ 1 ml mẫu trong ống fancol, giữ lạnh ủ 24h to 30 oC ủ 24h to 30 oC VKL tăng sinh 24h 36h 48h 72h Tán đĩa MRS agar ủ 30 oC 24h 36h 48h 72h Thử dòng chỉ thị và quan sát (24h, 36h, 48h, 72h) Tán đĩa MRS agar 24h 29 Sau khi tối ưu, chọn thời gian tăng sinh tốt nhất để tiến hành thử khả năng sinh CKK của các dòng phân lập được với dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus bằng phương pháp trực tiếp (Coventry et al., 1997 được trích dẫn bởi Penson Jumriangrit, 2004) theo sơ đồ Hình 3.3. Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 3.4 Phân tích và xử lý số liệu 3.4.1 Phân tích VKL • Quan sát hình dạng khuẩn lạc • Đo kích thước khuẩn lạc • Quan sát sự phân giải CaCO3 3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn • Đo kích thước vòng kháng khuẩn • Quan sát hình dạng vòng kháng khuẩn Số liệu được tổng hợp và phân tích trên phần mềm Microsoft Excel. Đổ ống MRS_agar chứa Pediococcus pentosakeus lên đĩa đã ủ VKL đã tăng sinh cấy 1 điểm lên đĩa MRS_agar Xuất hiện khuẩn lạc của VKL Ủ 24h 30 oC Ủ 24h 30 oC Quan sát vòng kháng khuẩn 30 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men 4.1.1 Thu mẫu Mẫu được thu ngẫu nhiên tại các chợ và trung tâm thương mại. Kết quả được thể hiện qua Bảng 4.1. Có tổng số 37 mẫu được thu tại các vùng nước ngọt và lợ mặn. Cụ thể như vùng nước ngọt Châu Đốc (An Giang), Cần Thơ, Tiền Giang và vùng nước lợ mặn Sóc Trăng, Bạc Liêu. Bảng 4.1:Địa điểm và số lượng mẫu thu Vùng thu Tên tỉnh Số lượng mẫu Châu Đốc (An Giang) 9 Tiền Giang 1 Nước ngọt Cần Thơ 12 Bạc Liêu 11 Nước lợ mặn Sóc Trăng 4 Qua Bảng 4.1 cho thấy, có 22 mẫu mắm và nước mắm được thu tại các vùng nước ngọt và 15 mẫu được thu tại những vùng nước lợ mặn. 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1 Mẫu mắm sau khi thu về tiến hành tăng sinh lần 1 ở 30 oC, thời gian 24h trong 3 loại môi trường khác nhau MRS_broth, nước cất và nước muối sinh lý đã thanh trùng (phụ lục C). Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL Ghi chú: A – mẫu chưa tăng sinh; B – mẫu sau tăng sinh A B 31 Bảng 4.1: Kết quả tăng sinh lần 1 STT Tên mẫu Điểm thu Môi trường nuôi nước cất muối sinh lý MRS broth 1 Mắm linh Châu Đốc + + + 2 Mắm sặc + - + 3 Mắm lóc + - + 4 Mắm chốt + - + 5 Mắm rô + - + 6 Mắm trèn + - + 7 Mắm rô lớn + + + 8 Mè vinh + + + 9 Mắm rô phi + + + 10 Mắm ruốc Bà 2 Tiền Giang + + + 11 Mắm linh Cần Thơ + + + 12 Mắm sặc + + + 13 Nước mắm Quốc Hải + + + 14 Nước mắm Hồng Đài + + - 15 Nước mắm Kabin + + + 16 Nước mắm Nam Ngư + + + 17 Nước mắm Thanh Liêm + + - 18 Nước mắm Nam Ngư chua ngọt - - - 19 Mắm ruốc Trí Hải + - - 20 Mắm ruốc Huế + + - 21 Mắm tép + + + 22 Mắm tôm + + + 23 Mắm lóc Bạc Liêu + + + 24 Mắm trèn + + + 25 Mắm sặc A + + + 26 Mắm sặc B + + + 27 Mắm ruốc + + + 28 Mắm ba khía + + + 29 Mắm cá cơm + + + 30 Mắm cá biển A + + + 31 Mắm cá biển B + + + 32 Mắm rô + + + 33 Mắm cá đối, cá cơm + + + 34 Mắm prohoc A nhiễn Sóc Trăng + + + 35 Mắm prohoc B to + + + 36 Mắm sặc + + + 37 Mắm nêm pha sẵn + + + Ghi chú: + mẫu tăng sinh có lên vi khuẩn; - mẫu tăng sinh không lên vi khuẩn 32 Tăng sinh mẫu lần 1 có 36 dòng phát triển trong môi trường nước cất, 30 dòng phát triển trong môi trường nước muối sinh lý 9‰, 32 dòng phát triển trong môi trường MRS_broth. Sự khác nhau giữa số lượng vi khuẩn có xuất hiện trong các môi trường không cao. Vì VKL có khả năng phát triển trong những điều kiện môi trường khắc nghiệt (Lương Đức Phẩm, 2004). Trong đó, có 27 mẫu có phát triển được trong cả 3 môi trường. Mẫu nước mắm Nam Ngư chua ngọt do có chứa tỏi ớt (đây là chất diệt khuẩn) nên vi khuẩn không phát triển, tăng sinh mẫu không lên. Các mẫu mắm thu ở vùng nước lợ mặn vi khuẩn đều lên tốt trong các môi trường nuôi so với mẫu thu ở vùng nước ngọt. Có thể nguồn mẫu thu từ vùng nước ngọt có hàm lượng dinh dưỡng không cao nên khi cân mẫu cho vào nuôi tăng sinh thì không đủ dinh dưỡng cho sự phát triển của vi khuẩn. 4.1.3 Cấy ria trên đĩa petri Những mẫu mắm tăng sinh lần 1 có vi khuẩn phát triển được mang đi cấy ria tiếp tục lên môi trường MRS_agar có bổ sung CaCO3 0,6%. Đĩa sau khi cấy được quấn giấy parafim xung quanh và cho vào tủ ủ ấm ở 30 oC sau 24h quan sát, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.3. Bảng 4.3: Kết quả cấy ria vi khuẩn trên đĩa thạch Nước cất Nước muối sinh lý MRS_broth Tên mẫu Điểm thu Tăng sinh lần 1 Kết quả cấy ria Tăng sinh lần 1 Kết quả cấy ria Tăng sinh lần 1 Kết quả cấy ria Mắm linh Châu Đốc + + + + + + Mắm sặc + + + + Mắm lóc + + + + Mắm chốt + + + + Mắm rô đồng + - + + Mắm trèn + - + + Mắm rô lớn + + + + + + Mắm mè vinh + - + - + + Mắm rô phi + + + + + + Mắm ruốc Bà 2 Tiền Giang + + + + + + Mắm linh Cần Thơ + + + + + + Mắm sặc + + + + + + Nước mắm Quốc Hải + + + + + + Nước mắm Hồng Đài + + + + Nước mắm Kabin + + + + + + Nước mắm Nam Ngư + + + - + - Nước mắm Thanh Liêm + + + + 33 Mắm ruốc Trí Hải + + Mắm ruốc Huế + + + + Mắm tép + + + + + + Mắm tôm + - + - + - Mắm lóc Bạc Liêu + + + + + + Mắm trèn + - + - + - Mắm sặc A + + + + + + Mắm sặc B + + + + + + Mắm ruốc + + + + + + Mắm ba khía + + + + + + Mắm cá cơm + + + + + - Mắm cá biển A + - + + + + Mắm cá biển B + + + + + + Mắm rô + + + + + + Mắm cá đối, cá cơm + + + + + + Mắm prohoc A nhiễn Sóc Trăng + + + + + - Mắm prohoc B to + + + + + + Sặc + + + - + + Mắm nêm pha sẵn + + + + + + Ghi chú: - không lên khuẩn lạc + có lên khuẩn lạc Kết quả cấy ria có 82 đĩa pêtri xuất hiện sự phát triển của khuẩn lạc. Trong đó, có 15 đĩa mẫu bị nhiễm nấm, 67 đĩa mẫu không nhiễm nấm và được 57 mẫu có khả năng phân giải CaCO3. Qua quá trình quan sát khuẩn lạc nhận thấy đa số khuẩn lạc phân lập được có dạng hình tròn, một số có hình dạng tròn không đều rìa dợn sóng. Bề mặt khuẩn lạc lồi, nhẵn bóng, một số khác bề mặt gồ ghề, lõm ở giữa. Khuẩn lạc sau một thời gian phát triển đặc tính nhày. Màu sắc khuẩn lạc thường có màu trắng sữa, trắng trong hoặc màu trắng đục, để một thời gian chuyển sang màu vàng kem. Đặc biệt, khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của axit. Trong quá trình phát triển của VKL đã tạo ra các chất biến dưỡng cùng với các sản phẩm của trao đổi chất, mà cụ thể là axit lactic. Axit lactic này tác dụng với CaCO3 được bổ sung vào môi trường trong quá trình nuôi cấy, lượng CaCO3 xung quanh khuẩn lạc bị chuyển hóa thành muối canxi, CO2 và H2O, nhờ thế mà duy trì được pH ở mức 5.5 – 6 (Lương Đức Phẩm, 2004) trả lại vùng môi trường xung quanh khuẩn lạc trong như ban đầu. Bề dày của vòng trong này biểu thị lượng axit sinh ra nhiều hay ít. 34 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO3 4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram Tiến hành thử catalase và nhuộm Gram cho những đĩa có sự phát triển của khuẩn lạc (phụ lục E). Qua kết quả nhuộm Gram cho thấy các dòng vi khuẩn đều là vi khuẩn Gram dương bắt màu tím sen với thuốc nhuộm và có dạng hình que, sống đơn, đôi hoặc kết thành chuỗi ngắn, một số dòng còn gom thành cụm. Qua phép thử catalase toàn bộ các dòng được phân lập đều âm tính với catalase. Những thông tin này đều phù hợp với mô tả của các nghiên cứu trước đây (Pongtep Wilaipun et al., 2002; Penson Jumriangrit, 2004; Nguyễn Võ Mỹ Ngân, 2010). Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính. Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có đặc tính giống như các nghiên cứu đã được công bố về VKL như: hình que ngắn, không sinh enzyme catalase, gram dương, tạo vòng trong đối với môi trường có bổ sung CaCO3 và một điều quan trọng là môi trường dùng cho công tác phân lập và tách ròng là MRS, môi trường đặc hiệu cho loài Lactobacillus. Như vậy, tất cả những dòng vi khuẩn được phân lập chứng thực là nhóm VKL. 35 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2 Tiến hành tăng sinh lần 2 cho các đĩa chứa mẫu sau khi được xác định là VKL. Tăng sinh mẫu ở 30 oC trong ống nghiệm chứa môi trường MRS_broth có bổ sung NaCl 0,6% (cho những mẫu mắm thu ở vùng nước lợ mặn) (Komkhae Pilasombut et al., 2005). Theo Pongtep Wilaipun et al. (2002), các dòng VKL tăng sinh trong môi trường MRS_broth ở nhiệt độ 30 oC sẽ sinh CKK tốt nhất và khả năng chất kháng khuẩn này sẽ giảm đi khi tăng nhiệt độ. Kết quả tăng sinh lần 2 tất cả 56 đĩa lên khuẩn lạc phát triển tốt trong môi trường MRS_broth. Có 26 mẫu không phát triển được do bị nhiễm nấm trong quá trình thao tác, do phòng thí nghiệm được sử dụng chung cho các hoạt động khác nhau và không phải là khu vực cách ly so với môi trường bên ngoài nên khả năng nhiễm nấm và tạp khuẩn sẽ cao. Tiến hành lập mẫu và trữ các dòng vi khuẩn đã phân lập được. 4.1.6 Lưu trữ mẫu Mẫu được trữ dưới 2 dạng • Lỏng: rút 1 ml mẫu đã tăng sinh cho vào falcon 2 ml chứa 1 ml dung dịch glycerol 30% đã thanh trùng, lắc đều trên máy vortex và quấn kín bằng giấy parafim. Mẫu được trữ lạnh ở âm 80 oC. • Khuẩn lạc: cấy mẫu đã tăng sinh lên mặt phẳng nghiêng của môi trường MRS_agar trong ống effendoft 1,5 ml, mỗi mẫu cấy vào 3 ống, đem ủ ấm ở 30 oC đến khi xuất hiện khuẩn lạc rõ (48h). Mẫu được giữ trong ngăn mát tủ lạnh. 4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình Chọn ngẫu nhiên 3 mẫu 78, 80 và 83 tiến hành tối ưu hóa theo quy trình Hình 3.2, nhằm xác định thời điểm sinh chất kháng khuẩn nhiều nhất trong điều kiện thí nghiệm hiện tại của các dòng vi khuẩn được phân lập, với dòng chỉ thị là Pediococcus pentosakeus. Kết quả tối ưu hoá được thể hiện ở Hình 4.4 cho thấy mẫu nuôi tăng sinh ở 30 oC, thời gian 48h cho kết quả tốt nhất (C) với vòng kháng khuẩn rõ, đường kính vòng 1,3 cm. 36 1,3 cm 1,2 cm 1,05 cm 1,2 cm A B C D Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của mẫu 4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml môi trường MRS agar và các dòng vi khuẩn đã phân lập được nuôi tăng sinh ở 30 oC, thời gian 48h. Tiến hành thử khả năng sinh CKK với dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus bằng phương pháp trực tiếp. Qua Bảng 4.4 cho thấy VKL có khả năng sinh CKK, kết quả này phù hợp với kết quả của Penson Jumriangrit (2004) nghiên cứu về khả năng sinh CKK từ các sản phẩm thủy sản lên men của Thái Lan. Khả năng sinh CKK của những dòng VKL là khác nhau, phụ thuộc vào: dòng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy, giai đoạn phát triển, thời gian nuôi cấy. Đa số những dòng vi khuẩn lactic sau 8h bắt đầu sinh CKK, vòng kháng khuẩn khá rõ sau 12 giờ và đạt bề dày lớn nhất sau 18h – 24h, sang 48h vòng kháng khuẩn mờ dần và đến 72h gần như không thấy, kết quả tương tự Mai Đàm Linh và csv (2007). Có 21 mẫu không cho vòng kháng khuẩn ở cả 3 lần thử và 19 mẫu nghi ngờ có vòng kháng khuẩn do vòng mờ, khó đo được độ dày vòng kháng khuẩn. Trong đó, có 8 mẫu đều cho vòng kháng khuẩn tốt qua 3 lần thử, 5 mẫu cho vòng kháng ở 2 lần thử và 3 mẫu chỉ cho vòng kháng khuẩn 1 lần. 37 Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuẩn Kết quả thử STT Mã mẫu lần 1 lần 2 lần 3 1 7 0 0 ? 2 45 0 0 ? 3 11 0 ? ? 4 13 0 ? ? 5 28 ? ? 0 6 36 0 ? ? 7 58 ? ? 0 8 60 ? ? 0 9 3 ? ? ? 10 9 ? ? ? 11 16 ? ? ? 12 21 ? ? ? 13 23 ? ? ? 14 30 ? ? ? 15 31 ? ? ? 16 35 ? ? ? 17 48 ? ? ? 18 81 ? ? ? 19 82 ? ? ? 20 4 ? + ? 21 26 ? + ? 22 57 ? ? + 23 1 ? + + 24 34 ? + + 25 63 + + ? 26 79 + ? + 27 80 + + ? 28 6 + + + 29 10 + + + 30 40 + + + 31 41 + + + 32 43 + + + 33 71 + + + 34 78 + + + 35 83 + + + Ghi chú: 0: không có vòng kháng khuẩn ?: nghi ngờ có vòng kháng khuẩn +: có vòng kháng khuẩn 38 Những mẫu nghi ngờ có khả năng kháng khuẩn và những mẫu cho vòng kháng khuẩn tốt được đem thử tiếp với dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus thời gian nuôi khuẩn lạc của mẫu 48h (gấp đôi lần thử trước). Kết quả cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn rõ và to hơn đối với những mẫu cho vòng kháng khuẩn tốt ở lần thử đầu, còn những mẫu nghi ngờ nhiều cũng cho vòng kháng khuẩn rõ và to như mẫu 16, 81, 82. Mẫu ủ 48h khuẩn lạc phát triển lớn hơn vì thế mà khả năng sinh chất kháng khuẩn cũng nhiều hơn khuẩn lạc nhỏ ủ trong 24h (De Man et al., 1960 được trích dẫn bởi Gyu Sung Cho và Hyung Ky Do, 2006). Kết quả được thể hiện ở Bảng 4.5. A B Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh ra từ VKL Ghi chú: A – mẫu nuôi ở 24h; B – mẫu nuôi ở 48h 39 Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus Khuẩn lạc nuôi 24h (cm) STT Mã mẫu lần 1 lần 2 lần 3 Khuẩn lạc nuôi 48h (cm) Tên mẫu 1 1 ? 0,1 0,1 0,2 Linh MRS CĐ 2 6 0,3 0,2 0,5 0,5 Linh muối CĐ 3 7 ? ? ? 0,15 Mắm ruốc Bà 2 MRS TG 4 10 0,4 0,4 0,4 0,5 Nước mắm Quốc Hải MRS CT 5 11 ? ? ? 0,1 Nước mắm Hồng Đài nước CT 6 16 ? ? ? 0,65 Nước mắm Hồng Đài nước CT 7 34 ? 0,15 0,1 0,85 Sặc A MRS BL 8 36 ? ? ? 0,2 Lóc nước BL 9 40 0,15 0,1 0,1 0,3 Mắm ruốc MRS BL 10 41 0,3 0,3 0,3 0,7 Sặc MRS ST 11 43 0,15 0,1 0,15 0,5 Lóc muối BL 12 63 0,3 0,2 ? 0,7 Lóc MRS BL 13 71 0,1 0,2 0,1 0,35 Biển B muối BL 14 78 0,15 0,1 0,15 0,7 Rô MRS BL 15 79 0,3 ? 0,3 0,4 Cá đối muối BL 16 80 0,25 0,1 ? 0,65 Rô lớn MRS CĐ 17 81 ? ? ? 0,65 Rô nước BL 18 82 ? ? ? 0,7 Cá đối MRS BL 19 83 0,4 0,3 0,4 0,7 Rô muối BL Qua Bảng 4.5 cho thấy mẫu có độ dày nhỏ nhất là 0,1 cm và lớn nhất là 0.85 cm. Trong đó, có 5 dòng cho vòng kháng khuẩn với độ dày 0,1 – 0.3 cm, có 5 dòng cho độ dày vòng trong khoảng lớn hơn 0,3 – 0,6 và có 9 dòng có độ dày vòng kháng khuẩn hơn 0,6 cm. 40 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận • Trong các sản phẩm thủy sản lên men như các loại mắm, nước mắm, mắm ruốc có chứa vi khuẩn lactic. Đã phân lập được 83 dòng vi khuẩn lactic từ 37 mẫu mắm và nước mắm. • Qua quá trình khảo sát đã xác định được 19 dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Trong đó, có 12 dòng VKL được phân lập từ các loại mắm ở vùng nước lợ mặn, 4 dòng VKL được phân lập từ mẫu vùng mắm nước ngọt và 3 dòng từ các sản phẩm nước mắm đóng chai. • Độ dày vòng kháng khuẩn với vi khuẩn Pediococcus pentosakeus từ 0,1 – 0,85 cm. Trong đó có 9 dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn 0,1 cm là nhỏ nhất. 5.2 Đề xuất Để đưa kết quả khảo sát vào thực tiễn, cần tiến hành thêm các khảo sát thử khả năng diệt các mầm bệnh trên động vật thủy sản, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây ra. Cần định danh những dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn mạnh để phục vụ các nghiên cứu sâu hơn về nhóm vi khuẩn này.