Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (penaeus monodon) tại Sóc Trăng

hóm đối chứng (không sử dụng probiotic) 26% (Rengpipat et al., 1998). Bên cạnh đó tác giả còn cho rằng Bacillus S11 có thể thay thế cả Vibrio spp., một số loài vi khuẩn khác trong ruột tôm và trong môi trường nước. Theo Hasting and Nealson (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng khuẩn hoặc một vài sản phẩm chưa được biết có thể tiêu diệt V. harveyi D331. Theo Moriarty (1998), mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. đã được xem là một trong những nguyên nhân làm tôm chết hàng loạt. Tuy nhiên, các ly trích tế bào tự do Bacillus subtilis BT23 cho thấy có hiệu quả cao trong việc chống lại sự tăng trưởng của Vibrio harveyi phân lập từ tôm sú bệnh đen mang, tỉ lệ chết của tôm giảm 90% (Vaseeharan and Ramasamy, 2002). Nghiên cứu này cho thấy mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài thực tế. Theo một nghiên cứu khác của Vaseeharan et al. (2004), probiotic giúp kháng được vi khuẩn Listonella anguillarum xuất hiện trong nước, bùn đáy ao nuôi và trong các cơ quan của tôm sú. Tác giả cho biết trên mang, cơ, dạ dày và gan tụy của tôm sú trong ao nuôi có sử dụng probiotic, số lượng vi khuẩn Listonella anguillarum thấp hơn so với ao đối chứng. Kết quả này chứng minh các sản phẩm bài tiết của Bacillus trong thức ăn và ruột tôm ức chế sự phát triển của L. anguillarum trong cơ thể tôm đồng thời giúp tăng cường sự tăng trưởng, nâng cao tỉ lệ sống của tôm sú (Vaseeharan et al., 2004). Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu của Moriarty (1998), sau khi sử dụng probiotic (chứa chủng Bacillus spp.) tỉ lệ sống của tôm sú tăng, hạn chế được mầm bệnh vi khuẩn phát sáng Vibrio spp. trong nước và bùn đáy ao. 2.3.2 Cơ chế tác dụng của Probiotic Nhóm vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh như một số loài thuộc nhóm Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium,…) làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (protease, amylase, xenlulase, kitinase, lipase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học ( Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 8 Các loài thuộc giống Bacillus, Pseudomonas, Clostridium (B. mesentericus, B. mycoides, B. subtilis, P. flourescenc, C. sporogenes,…) tham gia vào quá trình amôn hóa protein, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển nitơ từ dạng khó hấp thu sang dạng muối amôn dễ được thực vật thủy sinh hấp thu và giúp làm sạch các thủy vực (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2006). Nhóm vi sinh vật Enterococcus faecium, Streptomyces cinnamoensis, B. subtilis, Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Pediococcus acidilatici,...đặc biệt là nhóm vi khuẩn lên men acid lactic, có vai trò kiểm soát các sinh vật gây bệnh cho tôm, cá trong môi trường nhờ khả năng sinh các chất ức chế như acid lactic, bacterioxin. Bên cạnh đó chúng cũng được dùng làm thức ăn cho tôm, cá, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của các vi sinh vật có hại và tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột. Đồng thời còn có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, hấp thu thức ăn, giúp vật nuôi khỏe mạnh và phát triển nhanh ( Theo Olmos (2005), trong thức ăn nuôi tôm, probiotic có thể giúp phân hủy tất cả các thành phần protein vì các enzyme được tạo ra bởi vi khuẩn có thể bổ sung các hoạt tính của protease giúp tăng khả năng tiêu hóa thức ăn cho tôm. Hơn nữa, enzyme từ probiotic chịu được khoảng pH rộng hơn enzyme của tôm, do đó quá trình tiêu hóa có thể diễn ra trong thời gian dài giúp tôm hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn. 2.4 Đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 2.4.1 Vị trí phân loại Giới Bacteria Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Bacillates Họ Bacillaceae Giống Bacillus Loài Bacillus subtilis ( Năm 1872, Ferdinand Cohn (cùng thời Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là B. subtilis. B. subtilis là trực khuẩn Gram dương, di động, có kích thước 2-3x 0,7-0,8 µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8 µm. Ở điều kiện 100oC, bào tử B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. B. subtilis hình thành bào Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 9 tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng như sống thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi như khan hiếm chất dinh dưỡng ( Tuy nhiên, B. subtilis cũng có thể phản ứng với sự thiếu dinh dưỡng bằng cách di chuyển cơ thể từ các điều kiện nghèo dinh dưỡng đến nơi tốt hơn nhờ vào các lông roi (Mirel et al., 2000). 2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis Khi môi trường bị thay đổi đột ngột hoặc do thiếu thức ăn, các loài thuộc giống Bacillus và Clostridia khác nhau tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động tạm thời gọi là nội bào tử, có thể chống lại các tấn công lớn có thể phá hủy thành tế bào (Driks, 1999). Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nẩy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi. Đó là loại tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về bào tử của B. anthracis có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà khoa học nghiên cứu về bào tử với mục đích khám phá ra như thế nào loại tế bào ngưng hoạt động đặc biệt có thể chịu nhiệt độ và các điều kiện gây sốc khác. Theo Driks (1999), bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử. Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiều lớp bao quanh bào tử được cấu thành bởi hơn 25 loại polypeptid liên kết chéo chặt chẽ với nhau. Tuy nhiên lớp áo bào tử cũng cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trường thích hợp. Bào tử có thể chuyển đổi thành tế bào phát triển thông qua một quá trình gọi là sự nảy mầm. Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh. Nhiều loài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các polymer sinh học (protein, starch, pectin,…), đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh học Nitơ và Carbon ( Quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn cần khoảng 8 giờ để hoàn thành (Driks, 1999). Trong quá trình hình thành bào tử, nhiễm sắc thể nhân đôi thành các bản sao riêng biệt. Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiễm sắc thể nằm trong bào tử, sau đó thành hai tế bào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng thích. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983), phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm và mỗi bào tử chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng. Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kỳ điều kiện nào. Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 10 trong môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên có sự chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh và trong suốt pha tĩnh (Banwart, 2000). 2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis B. subtilis tạo protease kiềm (subtilisin) với lượng lớn, có đặc tính bền vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Subtibilin chủ yếu được sử dụng trong các ngành công nghiệp các chất tẩy rửa và cả trong y dược học. Ngoài ra subtibilin còn sử dụng trong xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc, làm nước mắm cá, làm thức ăn gia xúc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rác thải trong lò mổ gia cầm. Trong những năm gần đây tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là protease được sản suất từ các chủng Bacillus, mà chủ yếu là B. subtilis. Năm 1971, đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở Bacillus. Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản, tính chất lý hóa của protease kiềm từ Bacillus ( Năm 1972, người ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn các protease kiềm ở một vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trường thương mại, vi khuẩn Bacillus trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo quan điểm công nghiệp ( Gần đây người ta đã thành công trong nhân dòng phân tử, giải trình tự nucleotide và biểu hiện gen mã hóa protease kiềm từ nhiều loài Bacillus. Nhiều chủng được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa subtilisin, trong đó chủng Bacillus được sử dụng nhiều nhất vì đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền với toàn bộ genon đã được xác định ( .Ngoài những sản phẩm hóa chất, một số công ty cũng sử dụng B. subtilis như tác nhân sinh học để kiểm soát địch hại. B. subtilis (QST 713) có hiệu quả đáng kể chống nhiều loại vi khuẩn và bệnh nấm. QST 713 hoạt động bằng cách chiếm bề mặt lá cây, cạnh tranh với các mầm bệnh để chiếm không gian và các chất dinh dưỡng, nhờ đó ngăn cản mầm bệnh bằng con đường vật lý. Nó cũng sản sinh ra các chất chuyển hóa lipopeptit có tác động kết hợp để phá hủy các ống và màng của mầm bệnh ( Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 11 Quỹ nghiên cứu trà USPAI tại Valparai, Ấn Độ đã khảo sát tiềm năng của các vi khuẩn chống các mầm bệnh gây rụi lá trà. Nhiều dòng vi khuẩn B. subtilis đã được xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của mầm bệnh. Hiện nay các nhà nghiên cứu đang tiến hành các thí nghiệm để nâng cao hiệu quả thực địa của những dòng vi khuẩn chọn lọc ( B. subtilis là một trong những vi khuẩn có tiềm năng nhất, thuận lợi trong việc cải thiện sức khỏe và kích thích hệ miễn dịch. Theo các nghiên cứu lâm sàng trong báo cáo khoa học về thuốc “Sự kích thích miễn dịch bởi Bacillus subtilis” của nhà vi sinh vật học J. Harmann, các thành phần của thành tế bào vi khuẩn B. subtilis có thể hoạt hóa gần như tất cả các hệ thống phòng thủ miễn dịch của con người, bao gồm sự hoạt hóa ít nhất 3 kháng thể chuyên biệt (IgM, IgG, IgA) chống lại hiệu quả nhiều virus, nấm, mầm bệnh vi khuẩn gây hại thường xâm nhập và gây nhiễm vào cơ thể người ( Theo một nghiên cứu của Gong et al. (2006), chủng B. subtilis PY-1 phân lập từ bó mạch của cây bông có khả năng kháng mạnh nhiều mầm bệnh nấm trên cây trồng đặc biệt là nấm Fusarium oxysporum gây ra thiệt hại kinh tế lớn trong nhiều mùa vụ. Theo tác giả, các chất kháng sinh tạo ra bởi chủng B. subtilis PY-1 ổn định ở các điều kiện pH trung tính và kiềm, không nhạy với nhiệt độ cao. Gần đây các nhà khoa học sử dụng các vi sinh vật này như là một phương pháp bảo vệ sinh học, kiểm soát mầm bệnh và thay thế các thuốc diệt sinh vật (methyl bromide) có nguy cơ gây ra thiệt hại môi trường nghiêm trọng ( 2.5 Các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Tổng các phản ứng xảy ra trong tế bào có liên quan đến quá trình trao đổi chất và các phản ứng hóa học riêng được tạo nên bằng sự xúc tác bởi các phản ứng protein gọi là enzyme. Phần lớn các enzyme trong tế bào có chức năng phân cắt các nguyên liệu thức ăn (sự dị hóa) và tổng hợp thành các thành phần của tế bào (sự đồng hóa). Tuy nhiên vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do thành tế bào cứng. Vì thế chúng bài tiết ra các ngoại enzyme có chức năng bên ngoài tế bào để phân cắt các đại phân tử như: protein, tinh bột,… thành các amino acid, monosaccharide,… Sau đó được vận chuyển vào tế bào. Điển hình của các ngoại enzyme của vi khuẩn là: protease, amylase, lypase,… Mục đích đầu tiên của quá trình trao đổi chất là tạo ra năng lượng cần cho sự tổng hợp sinh học và tăng trưởng của tế bào. Vi khuẩn có thể đạt được các nhu cầu năng lượng bằng hai phương thức trao đổi chất khác nhau đó là quá trình Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 12 hô hấp và quá trình lên men. Trong quá trình hô hấp các phân tử hữu cơ được phân hủy một cách hoàn toàn thành carbondioxide (CO2) và nước. Ngược lại, sự lên men là sự phân cắt các phân tử hữu cơ thành các alcohol, aldehyde, acid và các khí như: CO2, hydrogen. Trong quá trình này các phân tử hữu cơ trong con đường trao đổi chất giữ nhiệm vụ như chất nhận electron cuối cùng và trở thành sản phẩm cuối cùng trong con đường lên men. Nhiều loài vi khuẩn có khả năng phát triển bằng hai quá trình hô hấp và lên men. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men có thể được sử dụng như một chỉ tiêu để định danh vi khuẩn (Brown, 2005). Khi vi khuẩn hiếu khí phát triển bằng quá trình hô hấp, chúng tạo ra hydrogen peroxide (H2O2) như một sản phẩm khử O2 thành nước. H2O2 có tính phản ứng cao sẽ gây tổn hại đến các enzyme, nucleic acid, các phân tử nhỏ trong tế bào. Để tránh thiệt hại này, các sinh vật hiếu khí tạo ra enzyme catalase chuyển H2O2 thành O2 vô hại. 2H2O2 2H2O + O2↑ Các vi khuẩn kỵ khí bặt buộc thiếu enzyme này vì thế chúng không thể xử lý với H2O2 tạo ra trong môi trường hiếu khí. Sự hiện diện của catalase là một cách để phân biệt các vi khuẩn này với vi khuẩn hiếu khí. 2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Thế giới khoa học cần có một hệ thống phân loại dựa trên các dấu hiệu có ở các sinh vật sống. Trong những năm 1980, nhà khoa học Carl Woese đưa ra một đề nghị mới đó là đi thẳng đến trung tâm của nguồn gốc tính đa dạng. Ông đề nghị trình tự deoxyribonucleic acid (ADN) của vài gen thông thường có thể được sử dụng để xác định mối quan hệ của các sinh vật khác nhau. Điển hình Woese nhặt một gen mã hóa 1 phân tử RNA tìm thấy trong ribosome (rRNA). Ribosome (phức hợp protein-RNA) tìm thấy trong tất cả prokaryote và eukaryote. Mặc dù có sự khác nhau về kích cỡ giữa ribosome của prokaryote và eukaryote, nhưng trình tự của phân tử rRNA thì rất giống nhau (đó là vùng có tính bảo tồn cao). Điều này cho phép các trình tự nucleic được đánh dấu và so sánh. Woese chọn 16S rRNA (prokaryote) hoặc 18S rRNA (eukaryote). Phân tử này đủ lớn để chứa đủ các thông tin cho so sánh di truyền và đủ nhỏ cho gen để giải trình tự một cách dễ dàng (trích dẫn bởi Salyers and Whitt, 2001). PCR được Kary Mullis phát minh năm 1985, là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại một đoạn ADN lên đến 106 lần hoặc nhiều hơn (Marlowe et al., 2005) mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. Theo Marlowe et al. (2005), PCR thực chất là một phản ứng catalase Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 13 enzyme đơn giản, sử dụng enzyme ADN-polymerase để sao chép trình tự ADN mong muốn lập lại 25-30 chu kỳ. Trong mỗi chu kỳ trình tự ADN được nhân đôi, kết quả lượng ADN tăng theo hàm số mũ. Theo giả thiết, 25 chu kỳ tạo ra sự khuếch đại là 225, nhưng trong thực tế chỉ đạt được tương đương 106 lần lượng ADN ban đầu. Theo tác giả đây là do hiệu quả của sự khuếch đại không hoàn hảo. Ngày nay PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các bệnh di truyền; nhận dạng, chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng; tách dòng gen; xác định huyết thống. PCR cũng được dùng để phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể. Trong thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn (Vibrio) hoặc virus (WSSV, YHV,…), ký sinh trùng và nấm trên động vật thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Một chu kỳ thông thường của PCR gồm 3 bước (biến tính ADN, gắn mồi, và kéo dài ADN). Phần lớn các phản ứng PCR, giai đoạn biến tính được chuẩn hóa tại nhiệt độ 94oC trong 1,5 phút, vì ở nhiệt độ này đảm bảo sự biến tính hoàn toàn của các phân tử ADN (Marlowe et al., 2005). Giai đoạn gắn mồi xảy ra tại nhiệt độ thấp hơn (thông thường khoảng 50-70oC trong 1 phút), mức nhiệt độ ở giai đoạn này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng. Bước cuối của PCR là kéo dài mạch ADN, giai đoạn kéo dài thường xảy ra trong 1 phút tại 72oC. Thành phần quan trọng của giai đoạn này là enzyme Taq polymerase thu từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus. Enzyme này phù hợp với PCR do nó ổn định với nhiệt độ (có thể trên 98oC) và có thể tái sử dụng cho nhiều chu kỳ (Marlowe et al., 2005). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 14 Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện Địa điểm: Thu mẫu tại các ao nuôi tôm thâm canh ở ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng. Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Khoa Thuỷ Sản, trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian: Từ tháng 3 – tháng 7 năm 2008. 3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị Môi trường nuôi: Tripticase soya agar (TSA), Luria-Bertani (LB), Tripticase Soya Broth (TSB) Môi trường và hóa chất để xác định các đặc tính sinh lý sinh hóa vi khuẩn: Môi trường: MR-broth, Nitrate broth, Trypton, Casein, Gelatin, Starch, Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), Simmon’s citrate agar,… Hóa chất nhuộm: Crystal violet, iodine, cồn 96%, safranin, malachite green 5% Hóa chất pha thuốc thử: alpha naphthol, KOH, sulphanilic acid, acid acetic, alpha naphthylamine, H2O2 , HgCl2, HCl đậm đặc, phenol red, methyl red Hóa chất khác: NaCl, K2HPO4, KH2PO4, các loại đường (glucose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol), urê,… Hóa chất trong phương pháp PCR Hóa chất ly trích ADN : Na3PO4, Tris-HCl (10mM, pH 9), Lysozyme, CH3COONH4, Chloroform, TE (pH 8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM), isopropanol,… Hóa chất trong phản ứng PCR: nước cất 2 lần, MgCl2 (1,5 mM), buffer Hóa chất trong điện di: dung dịch TAE 1X, agarose, ethidium bromide Thiết bị và dụng cụ Nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, vortex, cân phân tích, kính hiển vi, micropipet, đèn cồn, que cấy, que tán, đĩa petri, ống nghiệm,… Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, bộ điện di, bàn đọc UV, máy chụp gel. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu 3.3.1 Thu mẫu Mẫu bùn được thu bằng bộ dụng cụ thu mẫu làm bằng ống nhựa PVC (do viện nghiên cứu sức khỏe động vật thủy sản Thái Lan thiết kế). Thu mẫu tại 4 ao, mỗi ao thu 3 điểm (khoảng 100g bùn/điểm) theo đường chéo của ao. Thu từ trên bề mặt đáy ao xuống khoảng 10cm. Mẫu được cho vào chai có nắp đậy đã tiệt trùng và trữ lạnh ngay ở 4oC. Sau đó vận chuyển về phân tích. Nhịp thu mẫu 2 tuần/lần. 3.3.2 Phân tích mẫu Pha loãng 1g bùn ở mỗi vị trí thu mẫu của 1 ao trong 9ml nước muối sinh lý, trộn đều. Sau đó hút 3ml dung dịch được pha loãng từ mỗi mẫu (3 mẫu/ao) trộn lại thành 9ml dung dịch mẫu bùn pha loãng của ao thu mẫu. Hút 1 ml từ mẫu 9 ml trên cho vào ống 9 ml nước muối sinh lý khác. Tiếp tục pha loãng đến hệ số cần thiết (tùy theo độ đục của mẫu phân tích). Pha loãng mẫu tương tự đối với các ao còn lại. Để nhiệt kế vào một ống nghiệm khác có chứa nước (không cần tiệt trùng). Sau đó xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng và ống nghiệm có nhiệt kế vào cùng một giá, để vào nước nóng ở 80ºC. Khi nhiệt kế đạt 80ºC tính thời gian đến 10 phút rồi lấy các ống nghiệm ra. Sau đó hút 100µl từ mỗi nồng độ pha loãng của mẫu bùn trong mỗi ao cho vào các đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl), dùng que thủy tinh trãi đều. Mỗi nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần. Ủ ở 30oC trong 24 – 28 giờ. 3.4 Phân lập vi khuẩn Chọn các khuẩn lạc đặc trưng mọc trên các đĩa môi trường sau khi ủ, cấy sang đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl) ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Tiếp tục tách ròng cho đến khi thu được dòng thuần. Các dòng vi khuẩn phân lập được nuôi tăng sinh trong môi trưuờng TSB (thêm 1,5% NaCl). Sau đó trữ vi khuẩn với glycerol 25% trong các ống cryobead và giữ ở -80oC trước khi phân tích tiếp. 3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn phân lập (Bảng 3.1) được chọn theo Andretta et al. (2004). Xác định tính di động, sản sinh catalase, sự khử nitrate, khả năng sử dụng citrate, sản sinh indole, sử dụng urê, thủy phân gelatin, thủy phân tinh bột, phản ứng Voges-proskauer (VP), các phản ứng lên men đường (glucose, xylose, arabinose, sucrose, mannitol), phát triền tại các nồng độ muối khác nhau, phát Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu triển tại các nhiệt độ khác nhau được thực hiện theo Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Phương pháp nhuộm Gram, methyl red thực hiện theo Sharmin and Rahman (2007). Nhuộm bào tử, phát triển ở các pH khác nhau theo Brown (2005). Thủy phân Casein theo Elnasser et al. (2007). Cách tiến hành các chỉ tiêu trên được mô tả chi tiết ở phần phụ lục. Bảng 3.1: Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá để định danh Bacillus subtilis Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá Kết quả Gram Hình dạng bào tử Vị trí bào tử Hình dạng tế bào chứa bào tử Di động Starch Catalase Citrate Phát triển tại pH 5,7 Phát triển tại pH 6,8 Phát triển trong điều kiện kỵ khí Phát triển ở 2% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl Thuỷ phân Gelatin Sản sinh Indole Tạo Nitrite từ Nitrate Tyrosine Voges-proskauer (VP) Methyl red Lên men Arabinose Xylose Glucose Sucrose Mannitol Sinh gas từ Glucose Thuỷ phân Casein Phát triển tại 55ºC 65ºC Lecithinase Urease + Oval Chính tâm /lệch tâm Que, không sưng phồng + + + + + + - + + + + + - + - + + + + + + + - + + + - _ Ghi chú: (+) dương tính; (-)âm tính Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3.6 Phương pháp PCR 3.6.1 Ly trích ADN Ly trích ADN từ dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 (từ Bộ môn di truyền Sinh học và Động vật, trường đại học Florence, Italia) Phương pháp ly trích ADN dựa theo Boon (2000). Các bước như sau: 1. Lấy 2ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB ly tâm 5.000 vòng trong 15 phút. 2. Lấy 400 µl cho vào tuýp có chứa sẳn 3g hạt thủy tinh. 3. Thêm 800 µl Na3PO4 (0,1M), lắc đều. 4. Đập hỗn hợp trong 90 giây, tốc độ 27 (1/s), 5 lần. 5. Thêm 32 µl lysozyme (50 mg lysozyme/ml Tris-HCl (10 mM, pH 9,0), lắc đều. Sau đó trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 30 phút. 6. Thêm vào 60 µl SDS (20%) và 0,2 ml CH3COONH4 (8M), lắc đều. 7. Trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 10 phút. 8. Ly tâm 15 phút, 7000 vòng. Lấy dung dịch ở phần trên sang tuýp khác. 9. Thêm 800 µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), lắc đều. 10. Trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 60 phút. 11. Ly tâm 15 phút, 7000 vòng. Lấy dung dịch ở phần trên sang tuýp khác. 12. Thêm 0.8 thể tích isopropanol (100%) so với phần nước đã lấy, lắc đều. 13. Giữ ở nhiệt độ -20oC (qua đêm). 14. Ly tâm 25 phút, 12.000 vòng. 15. Đổ bỏ phân nước, giữ lại phần ADN kết tủa. 16. Để khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. 17. Hòa tan ADN kết tủa bằng TE-buffer (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0) 250-500 µl tùy theo khối lượng ADN. 18. Giữ ở -20oC (để làm các bước tiếp theo). Qui trình làm sạch: 19. Thêm 800 µl Clean up vào tuýp có chứa ADN. Cho hỗn hợp vào bộ làm sạch. 20. Thêm tiếp 2ml isopropanol (80%). 21. Hút sạch nước, lấy phần ống có chứa ADN gắn vào tuýp. 22. Ly tâm 10.000 vòng trong 2 phút, lấy ống để sang tuýp khác. 23. Cho vào 25µl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0) (TE trước khi sử dụng được giữ ấm ở 65-70oC). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3.6.2 Quy trình chạy PCR (theo Andretta et al., 2004) Hỗn hợp của 1 mẫu chạy PCR bao gồm: - Nước cất 2 lần: 11,15 µl - Buffer: 2 µl - MgCl2 (1,5mM): 1,2 µl - dNTP (0,2mM): 3,2µl - Mồi xuôi (5’ GAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’): 0,6µl - Mồi ngược (5’ AGAAAGGAGGTGATCCAGCC 3’): 0,6µl - Taq ADN polymerase: 0,25µl - ADN: 2µl Tổng thể tích của 1 mẫu là 20µl Điều kiện phản ứng: 94ºC trong 2 phút Sau đó: 94ºC trong 1 phút 55ºC trong 1 phút 72ºC trong 2 phút Lặp lại chu kỳ trên 35 lần Kéo dài 72ºC trong 3 phút 3.6.3 Chạy điện di và đọc kết quả Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 1X và bản thạch chứa 1,5% agarose. Chuẩn bị bản thạch: Đun nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn, để dung dịch nguội khoảng 50oC. Cho ethidium bromide (2µl/100 ml dung dịch gel) vào khuấy đều. Sau đó đổ vào khay đã chuẩn bị trước (đổ sao cho bề dày của gel cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm). Khi gel đặc lại cho vào bồn điện di và thêm dung dịch TAE 1X vào cho vừa bao phủ gel. Dùng pipet hút 8µl mẫu cần phân tích trộn với 2µl Loading Dye 6X cho vào từng giếng. Sử dụng thang ADN (giới hạn 100 -1517 bp) để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Đối chứng âm được dùng là nước cất. Khi đã cho mẫu vào các giếng, nối bồn điện di với nguồn điện (50V) để chạy điện di. Ngừng dòng điện khi màu xanh di chuyển đến khoảng 1/2 gel. Sau đó đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel. Trọng lượng phân tử để xác định ADN Bacillus subtilis S19 là 1500bp. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Qua 4 đợt thu mẫu (tổng số mẫu thu là 16 mẫu), phân lập được 53 chủng vi khuẩn. Trong đó có 39 chủng thuộc giống Bacillus do thuộc nhóm Gram dương, hình thành nội bào tử và catalase dương tính (Collins and Lyne’s, 1986). Còn lại 14 chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương (hình cầu) sẽ bị loại bỏ. Tên của các chủng phân lập được đặt theo mã số a-b-c-d và liệt kê trong Bảng 4.1. Với: a : Đợt thu mẫu (I: đợt 1, II: đợt 2, III: đợt 3, IV: đợt 4) b: Ao thu mẫu (A1: ao 1, A2: ao 2, A3: ao 3, A4: ao 4) c: Số thứ tự của chủng phân lập (từ 1 đến 39) d: Loại mẫu (S: mẫu bùn) Bảng 4.1 Danh mục các chủng vi khuẩn phân lập được STT Tên chủng STT Tên chủng STT Tên chủng 1 I-A1-1-S 14 II-A4-14-S 27 III-A4-27-S 2 I-A1-2-S 15 III-A1-15-S 28 III-A4-28-S 3 I-A3-3-S 16 III-A1-16-S 29 III-A4-29-S 4 II-A2-4-S 17 III-A1-17-S 30 III-A4-30-S 5 II-A2-5-S 18 III-A2-18-S 31 IV-A1-31-S 6 II-A2-6-S 19 III-A2-19-S 32 IV-A1-32-S 7 II-A3-7-S 20 III-A2-20-S 33 IV-A1-33-S 8 II-A3-8-S 21 III-A2-21-S 34 IV-A2-34-S 9 II-A3-9-S 22 III-A3-22-S 35 IV-A2-35-S 10 II-A3-10-S 23 III-A3-23-S 36 IV-A3-36-S 11 II-A4-11-S 24 III-A3-24-S 37 IV-A4-37-S 12 II-A4-12-S 25 III-A4-25-S 38 IV-A4-38-S 13 II-A4-13-S 26 III-A4-26-S 39 IV-A4-39-S 4.2 Kết quả xác định các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa Sau khi xác định các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa 39 chủng vi khuẩn, có 8 chủng vi khuẩn cho kết quả gần giống với các chỉ tiêu định danh B. subtilis. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Bao gồm các chủng: IV-A4-37-S, IV-A2-35-S, II-A2-6-S, III-A4-30-S, II-A4- 12-S, III-A4-29-S, III-A3-23-S, IV-A4-38-S. Kết quả xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn này được trình bày ở Bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết quả xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Các chỉ tiêu Chủng vi khuẩn định danh Gram + Catalase + Di động + V-P + Methyl red + Casein + Gelatin + Starch + Sử dụng urê - Khử Nitrate + Sinh Indole - 2% NaCl + 5% NaCl + 7% NaCl + 10% NaCl + pH 5,7 + pH 6,8 + 55ºC + 65ºC + Glucose + Xylose + Arabinose + Sucrose - Mannitol + Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính Các chỉ tiêu: Phát triển trong điều kiện kỵ khí, sinh gas từ Glucose, Citrate, Tyrosine, Lecithinase chưa thực hiện được. Theo Collin and Lyne (1986), B. subtilis cho kết quả lên men đường xylose dương tính, phản ứng V-P dương tính, có khả năng thủy phân tinh bột, và phát triển được ở 60ºC. Trong khi đó, B. pumilus, B. laterosporus, B. brevis không có khả năng thủy phân tinh bột; B. cereus, B. anthracis không có khả năng lên men đường xylose; B. megaterium, B. macerans, B. circulans cho phản ứng V- P âm tính; B. polymyxa không phát triển tại 60ºC. Qua đó cho thấy kết quả định danh B. subtilis là phù hợp. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình dạng khuẩn lạc: tròn, hơi rìa, khuẩn lạc phẳng. Bề mặt nhẵn hoặc hơi nhăn. Màu trắng đục đến hơi vàng. Sau thời gian nuôi lâu khuẩn lạc có hiện tượng bám sát vào thạch của môi trường. Hình 4.1 Khuẩn lạc sau 24 giờ ở nồng độ 10-2 Hình 4.2 Khuẩn lạc thuần trên TSA sau 24 giờ Mẫu bùn sau khi pha loãng và để ở 80ºC trong 10 phút, sau đó trãi đều trên môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl). Sau 24 giờ cho thấy khuẩn lạc mọc lên có hình dạng tương đối giống nhau (Hình 4.1). Theo Banwart (2000), ở nhiệt độ khoảng 65-85ºC trong 10-30 phút sẽ kích thích phần lớn các bào tử và gây cảm ứng nảy mầm. Bên cạnh đó, có thể giết chết các loại vi khuẩn tạp không hình thành bào tử và chỉ còn các bào tử sống sót (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Hình dạng tế bào vi khuẩn: vi khuẩn phân lập có dạng hình que ngắn, nhiều khi nối lại thành sợi dài (Hình 4.3). Qua hình 4.3 cũng cho thấy vi khuẩn gram dương và một vài tế bào có hình thành bào tử (mũi tên). Tuy nhiên, theo Collins and Lyne (1986), Bacillus subtilis là loại vi khuẩn đặc biệt, sau thời gian nuôi lâu vi khuẩn này có thể chuyển thành Gram âm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.3 Vi khuẩn Gram dương Hình 4.4 Bào tử vi khuẩn sau 28 giờ Hình 4.5: Các bào tử tự do sau 36 giờ Qua hình 4.4 cho thấy bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của safranin. Qua kết quả phân tích cho Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu thấy thời gian nuôi vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càng nhiều. Từ Hình 4.4, sau 28 giờ, bào tử còn nằm trong tế bào, số lượng bào tử ít (9 bào tử/thị trường kính hiển vi). Trong khi vi khuẩn sau thời gian nuôi 36 giờ cho thấy thành tế bào đã bị phân hủy và chỉ còn các bào tử tự do với số lượng tương đối nhiều (130 bào tử/ thị trường kính hiển vi). Điều này có thể được giải thích do thời gian nuôi lâu dinh dưỡng ngày càng ít kích thích sự hình thành bào tử. Theo Banwart (2000), trong tất cả các loài không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kỳ điều kiện nào. Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào trong môi trường nuôi hình thành bào tử còn một số khác thì không. Tuy nhiên có sự chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh và trong suốt pha tĩnh. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983), khi quan sát tiêu bản vi khuẩn sống rất dễ dàng phân biệt được bào tử vì chúng làm chiết quang rất mạnh. Với các phương pháp nhuộm màu thông thường bào tử không bị nhuộm màu hoặc chỉ được nhuộm màu rất nhạt. Để nhuộm bào tử phải dùng các dung dịch thuốc nhuộm đậm đặc (malachite green hoặc xanh methylen) và vừa nhuộm vừa đun nóng. Để xác định được vị trí của bào tử trong tế bào phải tạo ra được sự nhuộm màu tương phản so với phần còn lại của tế bào. Hình 4.6, 4.7, 4.8 cho thấy chủng vi khuẩn phân lập có khả năng thủy phân tinh bột, casein và gelatin. Theo Brown (2005), vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do thành tế bào cứng nên chúng bài tiết ra các ngoại enzyme để thủy phân các đại phân tử lớn, như protease thủy phân protein, amylase thủy phân tinh bột thành các amino acid và monosaccharide sau đó vận chuyển vào tế bào cho quá trình trao đổi chất. Theo Sharmin and Rahman (2007), Bacillus sẽ bài tiết ngoại enzyme trong môi trường sống của nó như môi trường lỏng chứa protein tripticase soya. Theo tác giả , enzyme hoạt động tối ưu tại pH 8,5 và hoạt tính của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, cao nhất tại nhiệt độ 55ºC. Tuy nhiên đề tài này chỉ thực hiện đến mức định tính enzyme, chưa xác định nồng độ và khả năng thủy phân của các enzyme. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.6 Thủy phân Starch Hình 4.7 Thủy phân Casein Hình 4.8 Thủy phân Gelatin Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.9 Phản ứng VP dương tính (mũi tên) Hình 4.10 Sự khử Nitrate dương tính (mũi tên) Hình 4.11 Methyl red dương tính (mũi tên) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.12: Vi khuẩn phát triển ở các nồng độ muối khác nhau (đối chứng, 2%, 5%, 7%, 10% thứ tự từ phải qua trái) Qua xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa, cho thấy Bacillus subtilis có khả năng thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau. Vi khuẩn có khả năng sống ở nồng độ muối 7% và 10%, pH 5,7 và có thể phát triển ở nhiệt độ 65ºC. Do đó vi khuẩn này có khả năng phân bố rộng và chiếm ưu thế. Qua Hình 4.12, độ đục của dung dịch giảm d n khi nồng độ muối tăng cho thấy vi khuẩn phát triển mạnh ở nồng độ muối dưới 5%. Hình 4.13: Lên men đường Xylose(+), Arabinose (+), Mannitol(+), Glucose(+), Sucrose(-) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4.3 Kết quả PCR dòng chuẩn Do thời gian có hạn nên việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được theo phương pháp phân tử chưa thực hiện được. Đề tài này chỉ thực hiện đến việc xác định lại chính xác dòng chuẩn bằng phương pháp PCR và được dùng làm đối chứng dương cho các phản ứng PCR của các chủng vi khuẩn phân lập được. Hình 4.14: Kết quả chạy điện di ADN dòng chuẩn Bacillus subtilis S19 Qua hình 4.14, M là thang ADN 100 bp, giếng 1 và 2 là mẫu ADN của dòng chuẩn được lập lại 2 lần, giếng 3 là đối chứng âm. Ở giếng 3 không hiện vạch sáng chứng tỏ phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Hai vạch sáng từ giếng 1 và 2 hiện tương ứng với vạch 1.500 bp nên phản ứng PCR thực hiện đúng. 1 2 3 M 1517 bp 1500 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết kuận Phân lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus. Qua kết quả xác định đặc tính sinh hóa loại trừ còn 8 chủng vi khuẩn thoả các chỉ tiêu định danh cho Bacillus subtilis. Bao gồm các chủng: IV-A4-37-S, IV-A2-35-S, II-A2-6-S, III- A4-30-S, II-A4-12-S, III-A4-29-S, III-A3-23-S, IV-A4-38-S. Tuy nhiên chưa thể kết luận chính xác 8 chủng trên là B. subtilis do còn vài chỉ tiêu sinh hóa chưa xác định (Phát triển trong điều kiện kỵ khí, sinh gas từ Glucose, Citrate, Tyrosine, Lecithinase). Kết quả PCR đã khẳng định chính xác dòng chuẩn Bacillus subtilis S19 và sẽ được dùng làm đối chứng dương để nhận định sản phẩm PCR cho việc định danh tiếp 8 chủng phân lập theo phương pháp phân tử. 5.2 Đề xuất Tiếp tục định danh các chủng vi khuẩn phân lập theo phương pháp PCR Nghiên cứu khả năng phân huỷ các chất hữu cơ và khả năng diệt khuẩn của Bacillus subtilis phân lập từ ao nuôi tôm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andretta, C.W.S., R.M. Rosa, E.C. Tondo, C.C. Gaylarde and J.A.P. Henriques. 2004. Identification and molecular characterization of a Bacillus subtilis IS13 strain involved in the biodegradation of 4,5,6- trichloroguaiacol. Chemosphere 55 (2004) 631-639. 2. Austin, B., L.F. Stuckey, P.A.W. Robertson, J. Effendi and D.R.W. Griffith. 1995. A probiotic reducing disease caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. Journal of Fish Diseases 18, 93-96. 3. Banwart, G.J. 2000. Basic food microbiology. Department of Microbiology. The Ohio State University. 4. Boon, N., J. Goris, P.D. Vos, W. Vertraete and E.M. Top. 2000. Bioaugmentation of activated sludge by an indegenous 3-chloroaniline- degrading Comamnas testosteroni strain, I2gfp. Appl. Environ. Icrobiol. 66: 2906-2913. 5. Brown, A.E. 2005. Benson’s Microbiological Applications. Ninth edition. 6. Collins, C.H., P.M .Lyne and J.M. Grange. 1986. Microbiological Methods. Sixth edition. 7. Driks, A. 1999. Bacillus subtilis spore coat. Microbiology and Molercular biology reviews, p.1-20, vol.63, No.1. 8. Đặng Thị Hoàng Oanh. 2007. Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản. Khoa Thủy Sản-Trường Đại Học Cần Thơ. 9. Đặng Thị Hoàng Oanh. 2007. Xác định các chỉ tiêu hình thái sinh lý và sinh hóa vi khuẩn. Trong: Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn Bệnh Học Thủy Sản. Bộ môn sinh học và bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 10. Elnasser, Z., A. Maraqa, W. Owais, A. Khraisat. 2007. Isolation and characterization of new Thermophilic bacteria in Jordan. The internet journal of microbiology. Vol 3. Number 2. 11. Fuller, R. 1987. A review, probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology 66, 365-378. 12. Gatesoupe, F.J. 1991. Siderophore production and probiotic effect of Vibrio sp. Associated with turbot larvae, Scophthalmus maximus. Aquatic Living Resources 10, 239-246. 13. Gong, M., J.D. Wang, J. Zhang, H. Yang, X.F. Lu, Y. Pei and J.Q. Cheng. 2006. Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in Vitro and identification of its antifungal substance (Iturin A). Acta Biochim Biophys Sin 38: 233-240. 14. Gram L., J. Melchiorsen, B. Spanggaard, I. Huber and T.F. Nielsen. 1999. Inhibition of Vibrio anguillarum by Pseudomonas fluorescens AH2, a possiple probiotic treatment of fish. Applied and Environmental Microbiology 65, 969-973. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15. Hastings, J.W. and K.H. Nealson. 1981. The symbiotic luminous bacteria. In: The Prokaryotes II. Springer- Verlag, Newyork, 1960 pp. 16. Huys, G. 2003. Sampling and sample processing procedures for the isolation of aquaculture assosiated bacteria. 17. Irianto, A., and B. Austin. 2002. Probiotics in aquaculture. 633-642. 18. Marlowe, E.M., K.L. Josephson and I.L. Pepper. 2005. Nucleic acid-based methods of analysis. 287-315. 19. Mirel, D.B., W.F. Estacio, M. Mathieu, E. Olmsted, J. Ramirez, and L.M. Marquez-Magana. 2000. Environmental Regulation of Bacillus subtilis σD –Dependent gene expression. Journal of Bacteriology, June 2000, p.3055- 3062. Vol.182, No.11. 20. Moriarty, D.J.W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture 164 : 351 – 258. 21. Moriarty, D.J.W. 1997. The role of microorganism in aquaculture ponds. Aquaculture 151, 333-349. 22. Moriarty, D.J.W. 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. 23. Nguyễn Lân Dũng. 1983. Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 24. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan. 2005. Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản giáo dục. 25. Nguyễn Khắc Thái Sơn. 2007. Một vài suy nghĩ về công nghệ vi sinh vật và ứng dụng của nó. Khoa Tài Nguyên và Môi Trường. 26. Olmos, S.J. and J.L.S. Ochoa. 2005. The functional property of Bacillus for shrimp feeds. Food Micrology 23, 519-525. 27. Phạm Thị Tuyết Ngân. 2006. Giáo trình vi sinh học ứng dụng trong thủy sản. Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. 28. Rengpipat, S., W.Phianphak, S. Piyatirativivorakul and P. Menasveta. 1998. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth . Aquaculture 167, 301-313. 29. Robertson, P.A.W., C. O’Dowd, C. Burrells, P. Williams and B. Austin. 2000. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquaculture 185, 235-243. 30. Rosenthal, H. 1980. Ozonation and sterilization. In: Symposium on New Developmants in Utilization of Heated Effluents and of Recirculation Systems for intensive Aquaculture. FAO EIFAC /80/ Symp: R/8/ May 1980. European Inland Fisheries Advance Committee, Norway, 75 pp. 31. Salminen S., A. Ouwehand, Y. Benno and Y.K. Lee. 1999. Probiotics: how should they be defined? Trends in Food Science Technology 10, 107- 110. 32. Salyers, A.A. and D.D. Whitt. 2001. Microbiology- Diversity, Disease, and the environment. 33. Sharmin, F. and Rahman, M. 2007. Isolation and characterization of protease producing Bacillus strain FS-1. Agricultural Engineering International: the CIGR Ejournal. Vol. IX. April, 2007. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34. Vaseeharan, B. and P. Ramasamy. 2002. Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatmant for black tiger shrimp Peaneus monodon. Appplied Microbiology 36, 83-87. 35. Vaseeharan, B., J. Lin and P.Ramasamy. 2004. Effect of probiotics, antibiotic sentivity, pathogenicity and plasmid profiles of Listonella anguillarum- like bacteria isolatedfrom Penaeus monodon culture systems. Aquaculture 241 (2004), 77-91. 36. 37. 38. 39. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu PHỤ LỤC A. Các bước thực hiện các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá 1 Tính di động Sự di động của vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt treo. Các bước: - Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lam trên bàn. - Dung que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle. - Lấy một ít vi khuẩn cho lên lam hòa vào nước muối sinh lý - Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. - Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle. - Đặt lame trên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X 2. Nhuộm Gram vi khuẩn Cố định vi khuẩn trên lam: Nhỏ một giọt nước cất lên lam, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ lướt lam trên ngọn lửa đèn cồn hai hoặc ba lần. Nhuộm với dung dịch Crystal violet trong 30 giây, rửa lam dưới vòi nước nhẹ. Sau đó nhỏ dung dịch Iodine lên lam để trong 1 phút rồi rửa với 95% alcohol trong 10 giây, để ráo và rửa dưới vòi nước nhẹ. Nhuộm tiếp với dung dịch Safranin trong một phút. Rửa dưới vòi nước, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. 3. Nhuộm bào tử Cố định vi khuẩn (khuẩn lạc được ủ trên 36 giờ) trên lam (giống phương pháp nhuộm Gram). Nhỏ dung dịch malachite green 5% lên vi khuẩn được cố định trên lam, đặt lam lên cốc thủy tinh 25 ml chứa nước đang đun sôi trên bếp điện, để trong 5 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước., để ráo ở nhiệt độ phòng. Nhuộm tiếp với dung dịch safranin trong 45 giây. Sau đó rửa sạch bằng nước và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. Bào tử bắt màu xanh và thành tế bào bắt màu hồng. 4. Phản ứng Catalase Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lam, sau đó nhỏ lên vi khuẩn một giọt dung dịch H2O2 3%. Vi khuẩn cho phản ứng catalase dương sẽ gây hiện tượng sủi bọt. 5. Phản ừng Voges – Proskauer (VP) Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi trường MR – VP broth + 1,5% NaCl đã thanh trùng, ủ ở 30oC. Sau 48 giờ nhỏ 0,6ml thuốc thử A (5g alpha naphthol trong 100 ml ethylalcohol) và 0,2ml thuốc thử B (40g KOH trong 100ml nước cất) vào ống nghiệm. Lắc đều và để nghiêng ống nghiệm khoảng 30 phút. Sự chuyển màu hồng của môi trường sẽ cho phản ứng dương và ngược lại. 6. Phản ừng tạo Nitrite từ Nitrate Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi trường Nitrare broth +1,5% NaCl đã thanh trùng. Ủ ở 30oC, sau 24 giờ nhỏ 1ml thuốc thử A (0,8% sulphanilic acid trong 5N acid acetic) và thêm 1ml thuốc thử B (0,5% alpha naphthylamine trong 5N acid acetic) vào ống nghiệm. Sự xuất hiện màu đỏ trong vòng 1 – 2 phút cho phản ứng dương và gược lại. 7. Khả năng thủy phân Starch Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường bao gồm nutrient agar + 0,5% Starch + 1,5% NaCl đã thanh trùng. Ủ ở 30oC, sau 24h nhỏ thuốc thử Lugol’s iodine lên bề mặt agar. Nếu xuất hiện một vòng rõ xung quanh chỗ có chứa vi khuẩn phát triển trong 30 phút cho phản ứng dương và ngược lại. 8. Khả năng thủy phân Gelatin Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường (chứa nutrient agar + 1% gelatin + 1,5% NaCl) đã thanh trùng. Ủ ở 30oC. Sau 24 giờ nhỏ thuốc thử HgCl2 (12g HgCl2, 80ml nước cất, 16ml HCl đậm đặc) lên bề mặt agar. Nếu xuất hiện một vòng rõ xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển thì cho phản ứng dương và ngược lại. 9. Khả năng thủy phân Casein (skimmed milk) Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường skimmed milk agar (chứa 1% casein, 0,2% yeast extract, 0,01% KH2PO4, 0,03% K2HPO4, 0,5 NaCl và 2% agar – pH 6,5) và ủ ở 55oC trong 72h. Nếu xuất hiện một vòng rõ xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho thấy có sự thủy phân casein. 10. Khả năng sinh indole Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường Nutrient broth + 1,5% NaCl đã thanh trùng. Ủ ở 30oC từ 24 – 48h, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Kovac’s vào, vi khuẩn sinh indole sẽ cho phản ứng dương với một vòng màu từ hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. 11. Khả năng sử dụng Citrate Môi trường Simmon’s Citrate agar + 1,5% NaCl đun sôi và khuấy cho tan, sau đó cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, sau khi thanh trùng để nghiêng ống nghiệm tạo thành mặt phẳng nghiêng và để nguội. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của môi trường. Ủ ở 30oC, sau 2 – 7 ngày vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ sẽ cho phản ứng dương và ngược lại. 12. Khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối: 2%, 5%, 7%, 10% Môi trường 1% Tryptone. Thêm NaCl ứng với các nồng độ 2, 5, 7, 10% NaCl. Cho 3ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút. Cấy một ít vi khuẩn vào trong các ống nghiệm và ủ ở 30ºC. Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết quả dương tính và ngược lại. 13. Khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nhiệt độ: 50oC, 65oC Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường TSB + 1,5% NaCl. Ủ ở các nhiệt độ 55ºC và 65ºC. Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết quả dương tính và ngược lại. 14. Khả năng sử dụng carbohydrate (glucose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol) - Môi trường TSB + 1,5% NaCl - 0,4% Bromothymol blue (1,6%) - 1% đường (Glucose, Arabinose, Xylose, Sucrose, Mannitol) - Chỉnh pH 6,8 - Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. - Thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút. - Cấy vi khuẩn vào các môi trường đường tương ứng. Ủ ở 30ºC. - Sau 2-7 ngày nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính và ngược lại. 15. Methyl Red Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường MR-broth + 1,5% NaCl Sau 24-48 giờ nhỏ 2 giọt thuốc thử methyl red (0,04g methyl red + 40ml ethanol +100ml nước cất). Xuất hiện vòng màu đỏ cho phản ứng dương tính, màu vàng cho phản ứng âm tính. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 16. Khả năng sử dụng urê - Dung dịch 0,1% pepton +1% NaCl + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% Phenol red + 1% glucose - Thêm 2% urê cho phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có urê. - Cho 3ml môi trườg vào ống nghiệm. - Thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút. - Cấy 1 ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Ủ ở 30ºC. - Sau 2 ngày nếu môi trường chuyển màu hồng cho kết quả dương tính và ngược lại. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu B. Kết quả test sinh hóa 39 chủng vi khuẩn phân lập Chỉ tiêu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Gram + + + + + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + + + + VP + + - - + + - + + - + + - + - Methyl red + - - - - + + + + - - + - + + Casein + - - - - + + + + - + + - + + Gelatin + - - - - + + + + - + + - +. + Starch + - - - - + + + + - - + - - - Urê - - - - - - - - - Khử Nitrate + + + + + - + - - 2% NaCl + + + + + + + + + 5% NaCl + + + + + + + + + 7% NaCl - + - - - - + - - 10% NaCl - + - - - - + - - 55ºC - + - - - - + + - 65ºC - + - - - - + - - pH 5,7 - + - - - - + - - pH 6,8 + + + + + + + + + Glucose + + + + + - + + + Arabinose + + + + + - + + + Xylose + + - - - - + - + Sucrose - - - - - - - - - Mannitol - + + + + - + - + Sinh indole - - - - - - - - - Ghi chú: (+) phản ứng dương tính, (-) âm tính Những chủng cho kết quả âm tính với Casein, Gelatin, Starch sẽ bị loại bỏ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Chỉ tiêu 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Gram + + + + + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + + + + VP + + + + + - - + - - - - + + + Methyl red - - - - + + + + + + + - + + + Casein + + + + + + + + + + + + + + + Gelatin + + + + + + + + + + + + + + + Starch - - + - - - - + + + - + + + + Urê - - - - - - - - - - - - - - - Khử Nitrate + + + + + + + + + + + + + + + 2% NaCl + + + + + + + + + + + + + + + 5% NaCl + + + + + + + + + + + + + + + 7% NaCl - - + - - - - + + + - + + + + 10% NaCl - - - - - - - + - - - - - + + 55ºC + - - - - - - + + - - - - + + 65ºC - - - - - - - + - - - - - + + pH 5,7 - - - - - - - + - - - - - + + pH 6,8 + + + + + + + + + + + + + + + Glucose + + + + + + + + + + + + + + + Arabinose + + + + + + + + + + + + + + + Xylose + + + + + + + + + + + + + + + Sucrose - - - - - - - - - - - - - - - Mannitol - - - - - - - + + + + + + + + Sinh indole - - - - - - - - - - - - - - - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Chỉ tiêu 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Gram + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + VP - - - + + - + + - Methyl red - - - - + - + + - Casein - - - + + + + + + Gelatin - - - + + + + + + Starch - - - + + + + + - Urê - - - - - - Khử Nitrate + + + + + + 2% NaCl + + + + + + 5% NaCl + + + + + + 7% NaCl + + + + + - 10% NaCl - + - + + - 55ºC + + + + + + 65ºC - - - + + - pH 5,7 - + - + + - pH 6,8 + + + + + + Glucose + + + + + + Arabinose + + + + + + Xylose - + - + + - Sucrose - - - - - - Mannitol + + + + + + Sinh indole - - - - - -