Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. Coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN QUỲNH NAM PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88 Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student Dr. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hoàn tất khóa luận này. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. Các Thầy, Cô tại phòng thực tập vi sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh đã khuyến khích , ủng hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006 Nguyễn Quỳnh Nam iv TÓM TẮT Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12 giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................... ii Mục lục .................................................................................................................. iii Danh mục các chữ viết tắt ..................................................................................... iv Danh sách các hình ................................................................................................ v Danh sách các bảng ............................................................................................... vi 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy ......................................................................... 3 2.2. Enterotoxigenic E. coli .............................................................................. 4 2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT ...................................................................... 4 2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 .................................................................. 4 2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 ......................................... 4 2.2.2. Độc tố kháng nhiệt .......................................................................... 5 2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa ........................................................ 5 2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb ........................................................ 6 2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC ................................... 7 2.3. Chế phẩm sinh học .................................................................................... 9 2.3.1. Định nghĩa ....................................................................................... 9 2.3.2. Cơ chế tác động .............................................................................. 9 2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học .................................................. 9 2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học .................................................... 10 2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10 2.4. Bacillus subtilis ....................................................................................... 11 2.4.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................ 11 2.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 11 2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis ...................................... 13 2.5.1. Giới thiệu ........................................................................................ 13 2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome ........................... 14 2.5.2.1. Subtilin ............................................................................... 14 2.5.2.2. Subtilosin ............................................................................ 15 2.5.2.3. Sublancin ............................................................................ 16 2.5.2.4. TasA ................................................................................... 16 2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome ............... 18 2.5.3.1. Surfactin ............................................................................. 17 2.5.3.2. Fengycin ............................................................................. 19 2.5.3.3. Mycosubtilin ....................................................................... 29 2.5.3.4. Bacilysocin ......................................................................... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22 vi 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................... 22 3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22 3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................... 22 3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................. 22 3.2.2. Hóa chất ......................................................................................... 22 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................................... 22 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 22 3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ...................... 22 3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa ............................................................ 23 3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ........................... 24 3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB .............. 24 3.3.5. Thử kháng sinh đồ ......................................................................... 24 3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% ........... 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 25 4.1. Kết quả .................................................................................................... 25 4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo ........................ 25 4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ............... 27 4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trƣờng TSB ....................................... 29 4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ ............................................................. 30 4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột ............................... 32 4.2. Thảo luận .................................................................................................. 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 33 5.1. Kết luận ................................................................................................... 33 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 34 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 39 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ETEC : Enterotoxigenic E. coli EAEC : Enteroaggregative E. coli LT : Heat-labile toxin ST : Heat-stable toxin CT : Cholera enterotoxin EAST : Enteroaggreative stable-toxin ENS : Enteric nervous system GC-C : Guanylate cyclase C ABC : ATP-binding cassette viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA .............................................. 25 Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 ............................................................... 27 Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................ 31 Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm ................. 28 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trƣờng TSA ................... 27 Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ .......................................................................................... 29 Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng ....... 30 Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên môi truờng thạch tinh bột 1% ................................................................. 32 1 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU 2. 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Enterotoxigenic E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đƣờng tiêu hóa của heo và ngƣời, chiếm đến 66,7% trƣờng hợp tiêu chảy trên heo còn non và heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngƣời chăn nuôi. Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E. coli, thì việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đó sử dụng probiotic đƣợc xem nhƣ là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Hiện nay Bacillus subtilis đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều do có nhiều ƣu điểm thỏa mãn đƣợc yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác. Mặc dù vậy vẫn chƣa có một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis có thể ngăn ngừa một cách có hiệu quả bệnh tiêu chảy. Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên thị trƣờng của Việt Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú. Do đó tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết. Trƣớc tình hình đó đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”. 2 1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng dụng vào trong chăn nuôi. 1.2.2 Yêu cầu Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo ở Đồng Nai và Bình Dƣơng. Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli. Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong môi trƣờng TSB. Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp kháng sinh đồ. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1%. 3 3. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4. 2.1 E. coli gây bệnh tiêu chảy Escherichia coli là vi khuẩn đƣờng ruột gram -, là loài chiếm ƣu thế trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật, hầu hết E. coli là những chủng có lợi giúp cân bằng hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột tuy nhiên có một số chủng có khả năng gây bệnh cho ngƣời và động vật, trẻ sơ sinh và động vật còn non dễ bị xâm nhiễm bởi những chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định. Để có thể gây bệnh các chủng E. coli này cần phải gắn đƣợc vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lƣợng sau đó làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột, các loại E. coli gây bệnh khác nhau có cơ chế gây bệnh khác nhau, do đó dựa vào sự tƣơng tác của E. coli với tế bào thành ruột có thể chia các chủng E. coli gây bệnh thành ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), diffusely adherent E. coli (DAEC) (12). Các chủng E. coli gây bệnh còn đƣợc phân biệt với nhau bằng các phản ứng ngƣng kết kháng nguyên. Sự xâm nhiễm của các chủng E. coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ thống tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng, sau khi cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn đƣợc mã hóa trên cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn, có một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hóa trên transposome hay phage. Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên heo. 2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST (heat-stable toxin). ETEC có khả năng gây ra hiện tƣợng tiêu chảy trên heo, trên ngƣời và các loài thú khác. Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố 4 hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng đƣợc biểu hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hƣởng rất lớn đối với độc tính của vi khuẩn (11). 2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT có hai nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với nhau. LT-1 đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật còn LT-2 chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu vào LT-1. 2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1 LT1-1 trọng lƣợng phân tử là 86 kDa đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng lƣợng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lƣợng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 có hai loại là LTh-1 có độc tính trên ngƣời và LTp-1 có độc tính trên heo. 2.2.1.2 Cơ chế tác động của độc tố LT-1 Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 đƣợc chuyển vào trong tế bào, mục tiêu của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào biểu mô ruột. Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khi hàm lƣợng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A, enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nƣớc bên 5 trong tế bào bị kéo ngƣợc ra ngoài và dẫn đến hiện tƣợng tiêu chảy bên cạnh đó còn có các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch của tế bào thành ruột với độc tố cho nên có ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với cơ chế tăng hàm lƣợng cAMP. LT bị sử lý để mất hoạt tính ADP-ribosyltransferase còn có tác động nhƣ một tá dƣợc. LT-2 có 55 – 57 % tƣơng đồng với LT-1 ở tiểu đơn vị A, nhƣng không cho thấy sự tƣơng đồng ở tiểu đơn vị B, LT-2 có hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-2a và LT-2b hai kiểu kháng nguyên này có sự tƣơng đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A và 66% ở tiểu đơn vị B. LT-2 có cơ chế tác động tƣơng tự LT-1 là gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-2 là GD1 còn của LT-1 là GM1, tuy nhiên nhƣ đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của ngƣời và động vật. 2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST) ST là protein nhỏ chỉ đƣợc cấu tạo từ một đơn vị, nhƣng trong cấu trúc chứa nhiều amino acid cystein, do đó trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố. Độc tố này có hai loại, có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb, gene mã hóa cho hai loại độc tố này đƣợc đƣợc qui định trên plasmid, một số gene đƣợc phát hiện nằm trên transposon. 2.2.2.1 Độc tố kháng nhiệt STa STa có trọng lƣợng phân tử là 2kDa, có hai dạng khác nhau là STap trong cấu trúc chứa 18 amino acid có khả năng gây độc cho heo và ngƣời, dạng còn lại là STah cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho ngƣời. Ban đầu STa đƣợc tổng hợp dƣới dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đó đƣợc phân cắt thành peptide có 52 acid amine, dạng peptide này đƣợc chuyển vào vùng periplasm sau đó hình thành cầu nối disulfic nhờ enzyme DsbA đƣợc mã hóa trên genome của vi khuẩn, sau đó dạng protoxin sẽ đƣợc cắt thành dạng toxin hoàn chỉnh và đƣợc khuếch tán qua vách tế bào. Ngoài ETEC ra thì STa còn đƣợc tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (–) khác nhƣ Yersinia enterocolitica và V. cholerae non-O1, bên cạnh đó STa có 50% protein tƣơng đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC. 6 Receptor của STa là enzyme xuyên màng đƣợc gọi là guanylate cyclase C (GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4 cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thƣờng của ruột, cơ chế tác động của receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các enzyme nội bào. Tƣơng tự nhƣ vậy sau khi liên kết với receeptor STa thúc đẩy họat tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lƣợng cGMP nội bào, cGMP hoạt hóa protein kinase G hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh clorua, làm đẩy mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp thu NaCl dẫn đến dịch ruột bị tiết ra ngoài gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Độc tố STa tác động nhanh hơn LT do không cần phải chuyển vào bên trong tế bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong. Ngoài GC-C ra thì STa có thể còn có các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor chiếm ƣu thế nhất. 2.2.2.2 Độc tố kháng nhiệt STb STb ban đầu cũng đƣợc tổng hợp dƣới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó đƣợc chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng lƣợng phân tử là 5,1kDa, cấu trúc của STb không tƣơng đồng với STa mặc dù trong cấu tạo của nó cũng có 4 amino acid cystein, STb làm tổn thƣơng các tế bào ruột do tác động lên các lông ruột dẫn đến các lông tơ trên tế bào biểu mô bị mất hoặc bị thu ngắn lại, receptor của STb vẫn chƣa đƣợc xác định có thể độc tố này gắn vào những vùng không chuyên biệt trên màng tế bào trƣớc khi đƣợc đƣa vào trong, tác động của STb trong tế bào không giống nhƣ STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến việc phân tiết bicarbonat, STb không làm gia tăng hàm lƣợng cAMP hay cGMP nội bào mà tác động của nó làm tăng hàm lƣợng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài, ngoài ra tác động của nó còn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin cho thấy tác động của STb có liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS). Cơ chế tác động của độc tố LT và ST đƣợc trình bày ở hình bên dƣới 7 2.2.3 Các yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC Để có thể gây bệnh các chủng ETEC phải gắn đƣợc vào thành tế bào biểu mô ruột, khả năng gắn đƣợc vào thành tế bào ruột non càng lớn thì mức độ gây bệnh càng lớn, việc gắn vào thành tế bào ruột đƣợc thực hiện bởi một thành phần trên lớp capsule của vi khuẩn gọi là fimbriae, fimbriae có cấu tạo nhỏ và chiếm một số lƣợng lớn hơn tiêm mao (flagella) của vi khuẩn, fimbriae có nhiều hình dạng và cấu trúc khác nhau, mỗi fimbriae có một receptor chuyên biệt trên thành biểu mô ruột các receptor này có cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein). Fimbriae xuất hiện trên cả vi khuẩn E. coli gây bệnh cũng nhƣ không gây bệnh nó giúp cho vi khuẩn chống việc bị loại thải bởi nhu động ruột, một vi khuẩn có thể có nhiều loại fimbriae khác nhau, fimbriae nằm trên capsule cho nên kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên K tuy nhiên nó đƣợc cấu tạo là protein nên còn đƣợc gọi là kháng nguyên F, các fimbriae khác nhau đƣợc phân biệt bằng hình thái và khả năng ngƣng kết hồng cầu. Mỗi loại ETEC gây bệnh cho những loài khác nhau thƣờng biểu hiện một loại fimbriae riêng biệt. 8 Bảng bên dƣới thể hiện một vài kháng nguyên và đối tƣợng gây bệnh của nó (13). Kháng nguyên Đối tƣợng gây bệnh Serogroup O K88 Heo con 08, 045, 0138, 0141, 0147, 0149, 0157 987P Heo con 09, 020, 0141 K99 Cừu, bê 08, 09, 020, 0101 K99 Heo con 064, 0101 K41 Bê 09, 0101 CFA\1 Ngƣời 015, 025, 063, 078 CFA\2 Ngƣời 06,08 Khả năng tổng hợp enterotoxin và hiện diện của fimbriae có sự liên hệ với nhau (13). Fimbriae Enterotoxin ST LT LT+ST K880 987P K99 K41 CFA\1 CFA\2 + + + + - - + - - + - - + + + - - + 2.3 Chế phẩm sinh học (probiotic) 2.3.1 Định nghĩa Probiotic đã đƣợc sử dụng hàng ngàn năm trƣớc khi mà các sản phẩm sữa chua (yaourt) đƣợc sử dụng. Có nhiều định nghĩa khác nhau về probiotic, hiện nay thuật ngữ probiotic đƣợc sử dụng để chỉ những sản phẩm chứa vi sinh vật sống để cải thiện hệ vi sinh vật nội tại (Trần Thị Dân, 2005). Có nhiều chế phẩm sinh học khác nhau đã đƣợc thƣơng mại hóa, có loại chỉ chứa một loài vi sinh vật, có loại chứa hai hay nhiều loại vi 9 sinh vật khác nhau. Các loại vi sinh vật có lợi đƣợc sử dụng phổ biến nhất là các loài của lactobacilli, streptococcus, bifidobacterium ssp, bacillus ssp.v.v..(2), (9). 2.3.2 Cơ chế tác động Tuy đã đƣợc sử dụng từ rất lâu nhƣng cơ chế tác động của probiotic vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nó chịu ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố khác nhau. Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể là (2)  Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa.  Cạnh tranh chất dinh dƣỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên cơ chế này chƣa đƣợc chứng minh một cách rõ ràng trong điều kiện in vivo.  Sản xuất chất kháng khuẩn nhƣ các acid hữu cơ, bacteriocin.v.v.  Kích thích hệ miễn dịch. Probiotic có giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nó chỉ thể hiện khi thú có sức khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đƣờng ruột (2). 2.3.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học Probiotic đƣợc sử dụng để phòng và chữa trị một phổ lớn các bệnh đƣờng ruột nhƣ là bệnh tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng sinh và dinh dƣỡng, bệnh viêm ruột, hội chứng dễ bị kích thích của ruột, ngoài ra còn đƣợc sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hóa mà cơ thể tiết ra không đủ nhƣ sucrase, maltase (9). Các vi sinh vật có lợi trong probiotic sẽ ức chế vi sinh vật gây bệnh để hệ thống vi sinh vật trong đƣờng ruột có thể phục hồi. Probiotic giúp cho thú tăng trọng nhanh hơn trên một đơn vị thức ăn do vi sinh vật trong probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa nhƣ amylase, protease làm tăng hệ số chuyển hóa thức ăn của thú. 2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học An toàn là điều tiên quyết đối với một chế phẩm sinh học, các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải không mang gene gây độc cho ngƣời và động vật. Chủng vi sinh vật đƣợc chọn để làm chế phẩm phải chống chịu đƣợc điều kiện pH thấp của dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa đồng thời phải có khả năng bám và tạo khuẩn lạc trên thành ruột (9). 10 Chế phẩm sinh học phải cho đƣợc hiệu quả cao trong phòng, trị bệnh hoặc trong cải thiện dinh dƣỡng của thú. Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải có tính đối kháng mạnh với nhiều chủng vi sinh vật khác nhau hoặc làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn một cách có ý nghĩa. Giá thành có ý nghĩa rất lớn đối với sự phổ biến của sản phẩm, vi sinh vật đƣợc tuyển chọn làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình nuôi cấy và sản xuất phải đơn giản không tốn kém. Dễ sử dụng và bảo quản, cách sử dụng phải đơn giản, vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản bình thƣờng. 2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic có nguồn gốc từ bacillus sp đƣợc sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm này có nhiều ƣu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành sản xuất rẽ, bào tử chịu đựng đƣợc các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa….Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis đƣợc tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang những gene gây độc cho ngƣời và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis đƣợc nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm đƣợc trên phần đầu của ruột non (3). Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic đƣợc đẩy mạnh. 2.4 Bacillus subtilis 2.4.1 Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994). Bacillus subtilis thuộc. Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.4.2 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn, gram (+), sinh nội bào tử, kích thƣớc 0,5- 0,8μm x 1,8-3μm là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tế bào ít khi tạo thành chuỗi thƣờng ở 11 dạng đơn bào, hiện diện nhiều trong đất, nƣớc, trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. Hình dạng của Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA là khuẩn lạc khô, có rìa răng cƣa, có đƣờng kính 3-5mm nằm sát trên bề mặt thạch. Hình 2.1: Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA và nhuộm gram của Bacillus subtilis Các phản ứng sinh hóa đƣợc sử dụng để để khẳng định Bacillus subtilis. Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đƣờng nhƣ: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho đến thời điểm hiện nay, bộ genome của loài này đã đƣợc giải mã toàn bộ, bộ gene có 4 Mbp (23), trọng lƣợng của bộ genome khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton đặc biệt trong genome của Bacillus subtilis có nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại kháng sinh nhƣ gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin, chloramphenicol, penicilin.v.v…(8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh đƣợc qui định trên genome hay trên plasmid nó cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật đƣờng ruột. Ở điều kiện kỵ khí Bacillus subtilis sử dụng nitrate nhƣ chất nhận điện tử cuối cùng, nếu trong môi trƣờng thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên men. Trong môi trƣờng nuôi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) (10). Màng sinh học giúp cho Bacillus subtilis có ƣu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi 12 trƣờng tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trƣờng giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc trực tiếp với oxy trong không khí. Sản xuất các chất diệt khuẩn khác nhau, có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis có khả năng sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn khác nhau có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Clostridium perfringens, Helicobacter pylori, Escherichia coli 078:K80.v.v… (5). Vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau nhƣ amylase, protease đồng thời cũng đƣợc ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống natto của Nhật Bản. Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử, bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn năm và có thể phát triển lại thành tế bào sinh dƣỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang đƣợc quan tâm để sản xuất ra các vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gene qui định độc tố thƣơng hàn vào Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gene này cũng đƣợc biểu hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử (7). 2.5 Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 2.5.1 Giới thiệu Peptide antibiotic là sản phẩm chuyển hóa bậc hai của nhiều loại vi sinh vật khác nhau, giúp chúng có ƣu thế trong cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trƣờng cũng nhƣ trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm. Peptide antibiotic có bản chất là các peptide có trọng lƣợng phân tử nhỏ, depsipeptide, peptidolactone, lipopeptide, đƣợc phân thành hai lớp là peptide đƣợc tổng hợp bằng ribosome còn đƣợc gọi là bacteriosin, còn lại là lớp peptide không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (16). Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau nhƣ subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin có bản chất là bacteriocin còn bacilysin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có tính kháng khuẩn là các antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (20). Bacteriocin đƣợc tổng hợp dƣới dạng tiền peptide có chứa một đoạn tín hiệu giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế bào, dạng tiền peptide sau đó đƣợc chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra 13 các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để thành dạng hoàn chỉnh, sau đó đƣợc tiết ra ngoài bằng phức hợp bơm protein ABC (ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16). Các peptide antibiotic không tổng hợp bằng ribosome thì đƣợc tổng hợp bằng các enzyme có cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc đƣợc chia thành nhiều module khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt, các module đƣợc sắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi peptide (16). Lipopeptide có tính kháng khuẩn đƣợc chia thành 3 họ khác nhau là surfactin, fengycin và iturin, lipopeptide đƣợc cấu tạo bằng vòng peptide có cấu tạo từ 7 (họ surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhóm –COOH và nhóm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhóm amino (họ iturin) tại vị trí β của acid béo. Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C13 đến C16 đối với lipopeptide thuộc họ surfactin, từ C14 đến C17 đối với họ iturin và từ C14 đến C18 trong trƣờng hợp của họ fengycin (20). 2.5.2 Peptipe antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome 2.5.2.1 Subtilin Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những antibiotic thuộc nhóm Lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và clostridia. Cấu tạo của subtilin có chứa các amino acid không bình thƣờng lanthionin, β-methyllanthionin, D- alanin, dehydroalanin, dehydrobutyrin, cầu nối sulfic đƣợc hình thành giữa các amino acid này tạo nên nhiều cấu trúc dạng vòng trong cấu tạo của subtilin. Các amino acid không bình thƣờng đƣợc tạo ra do quá trình biến đổi sau dịch mã của subtilin (28). Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tƣơng tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hƣởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Subtilin đƣợc tổng hợp trong pha tăng trƣởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cân bằng (29). 14 Operon của subtilin gồm có spaS mã hóa cho tiền peptide của subtilin, spaB và spaC mã hóa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hóa cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK mã hóa cho protein điều hòa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hóa cho thành phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hóa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết subtilin ra ngoài môi trƣờng bên ngoài (26). Cấu trúc của subtilin, thứ tự các gene trên operon spaIEFG đƣợc thể hiện ở Hình 2.2 (phụ lục). Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp subtilin đƣợc điều hòa bằng hệ thống điều hòa hai thành phần là protein SpaK và SpaR. SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào chất. Khi nồng độ vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy tăng cao hoặc có sự hiện diện của subtilin hay các antibiotic có cấu trúc tƣơng tự (nisin) trong môi trƣờng nuôi cấy. SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hóa His ở vị trí 247 ở đầu N sau đó sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT, spaC, spaS đồng thời cũng điều hòa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG. Ngoài ra operon của subtilin còn đƣợc điều hòa bởi yếu tố H (27). Subtilin ban đẩu đƣợc tổng hợp ở dạng tiền chất có 56 amino acid, dạng tiền chất này đƣợc SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin đƣợc biến đổi thành dạng subtilin hoàn chỉnh có 32 amino acid. Sau đó subtilin đƣợc chuyển ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành. Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngoài của lớp màng tế bào có tác dụng ngăn chặn sự tác động của subtilin vừa đƣợc tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26). 2.5.2.2 Subtilosin Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vòng, tiền peptide có 43 amino acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N đƣợc cắt để tạo thành cấu trúc dạng vòng, Phe và Thr đƣợc biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự 15 hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hoàn chỉnh dạng vòng có 32 amino acid (25). Cấu trúc của subtilosin đƣợc thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục). Toàn bộ gene chịu trách nhiệm cho toàn bộ quá trình tổng hợp subtilosin đƣợc mã hóa trên cùng 1 operon. Operon sbo-alb đƣợc điều kiển bởi promotor ở upstream của sboA, giữa 2 gene sboA và albA có một cấu trúc terminator cho nên các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp và phân tiết subtilosin đƣợc tổng hợp với số lƣợng ít hơn cơ chất của nó. Operon của subtilosin bao gồm các gene là sboA mã hóa cho dạng tiền chất của subtilosin, albA, albF và albE mã hóa cho protein thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã và hoàn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hóa cho protein chịu trách nhiệm cho sự tự đề kháng của Bacillus subtilis với subtilosin (24). Cấu trúc của operon đƣợc thể hiện ở Hình 2.3B (phụ lục). Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp của subtilosin đƣợc kiểm soát bởi hệ thống điều hòa spo0-abrB, ở pha tăng trƣởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dƣỡng trong môi trƣờng và nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hóa cuối cùng là phosphoryl hóa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo bào tử, SpoA đƣợc phosphoryl hóa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy sự biểu hiện của operon sbo-alb. Quá trình dịch mã đƣợc thực hiện bởi RNA polymerase đƣợc kiểm soát bởi yếu tố điều hòa A, trong điều kiện thiếu oxy operon sbo-abl đƣợc điều hòa bởi hệ thống truyền tín hiệu ResDE (25), (24). Tiền chất của subtilocin đƣợc tổng hợp ở dạng thẳng có 42 amino acid sau đó đƣợc AlbA và AlbF biến đổi thành dạng hoàn chỉnh. Trong cấu tạo của AlbB có hai nhóm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhóm này đƣợc xem là trung tâm S- Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hóa hoặc dehydrate cơ chất, còn AlbF trong cấu trúc có một đoạn peptide tƣơng tự nhƣ là peptidase nằm giữa đầu N còn ở đầu C có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc protein gắn vào peptide cho nên hai enzyme này đƣợc thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre- subtilocin thành dạng hoàn chỉnh (24). 16 Sau khi đƣợc biến đổi thành dạng hoàn chỉnh thì subtilocin đƣợc tiết ra ngoài chủ yếu bằng AlbC có sự tham gia của AlbD. AlbB có tác dụng giữ cho Bacillus subtilis tránh đƣợc sự tác động của subtilocin (24). 2.5.2.3 Sublancin Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu có 1 motif GS kế tiếp nó là một site cắt, do đó sublancin đƣợc tiết ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra môi trƣờng, trong cấu tạo có 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tƣơng tự nhƣ antibiotic thuộc họ lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn gram âm nhƣng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng kể cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thƣờng trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin (21). Operon của sublancin gồm các gene sunA, sunT, bdbA, bdbB, bdbC, và bdbD. SunA là tiền peptide của sublancin có 56 amino acid sau đó đoạn tín hiệu bị cắt đi trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hoàn chỉnh có 37 amino acid, sunT mã hóa cho hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT có 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N tồn tại domain có hoạt tính peptidase, còn ở đầu C là domain liên kết với ATP (21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nó mã hóa cho enzyme xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin, bdbA, bdbC và bdbD thì không có tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin. Cấu trúc của sublancin, trình tự amino acid và cấu trúc operon của sublancin đƣợc trình bài ở Hình 2.4 (phụ lục). 2.5.2.4 TasA TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng khuẩn rộng đƣợc tổng hợp và tiết vào môi trƣờng 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử đƣợc bắt đầu, đồng thời TasA cũng đƣợc chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ƣu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (30). Operon của TasA bao gồm 3 gene là yqxM, sipW và tasA. yqxM là gene mã hóa cho kháng sinh đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng có nồng độ muối cao (32), SipW chịu 17 trách nhiệm cắt đoạn peptide tín hiệu và chuyển TasA ra ngoài môi trƣờng và giữa lớp màng kép của tiền bào tử trong cấu tạo của SipW có 4 đoạn peptide xuyên màng, amino acid serine ở vị trí 47 và Histidin ở vị trí 87 là trung tâm hoạt động của đoạn peptide đóng vai trò là peptidase của SipW (31). Gene tasA mã hóa cho tiền peptide của TasA. Trong cấu trúc của đoạn peptide tín hiệu ở vị trí 7 và 9 là kế tiếp là một đoạn peptide kỵ nƣớc (G ở vị trí 10 đến A ở vị trí 15) cấu trúc bậc 3 có dạng α-helic cho phép đoạn peptide này có thể xuyên màng, kế tiếp là đoạn peptide chứa 3 L, 5 amino acid, kế tiếp là site cắt cho peptidase. Trình tự amino acid tiền chất của TasA và cấu trúc của operon đƣợc đƣợc biểu diễn ở Hình 2.5A (phụ lục). Quá trình điều hòa tổng hợp và phân tiết của TasA. TasA đƣợc tổng hợp ngay đầu phag cân bằng cho nên nó đƣợc điều hòa bởi các yếu tố điều hòa chuyển phag. Tƣơng tự nhƣ subtilosin quá trình tổng hợp TasA đƣợc điều hòa hệ thống spo0-abrB nhƣng RNA polymerase chịu trách nhiệm dịch mã cho operon cùa TasA đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa H (31). Sau khi đƣợc tổng hợp dạng tiền chất của TasA đƣợc chuyển lên màng tế bào chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dƣơng liên kết với màng tế bào chất, sau đó đoạn peptide kỵ nƣớc sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide còn lại xuyên màng sau đó peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phóng TasA hoạt động, đoạn tín hiệu sau đó tiếp tục đƣợc cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36). Cơ chế chuyển TasA vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử cũng xãy ra tƣơng tự. Khác với các loại protein tiết khác TasA sau khi đƣợc chuyển qua màng tế bào chất thì một phần không khuếch tán ra môi trƣờng mà định vị trong lớp peptidoglycan của vách tế bào Bacillus subtilis và bào tử (33). Vị trí của TasA bên trong vách tế bào và bào tử đƣợc thể hiện ở Hình 2.5B (phụ lục). 2.5.3 Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng Ribosome. 2.5.3.1 Surfactin Surfactin có cấu tạo là lipopeptide do sự liên kết của một chuỗi heptapeptide với acid béo có một gốc –OH ở vị trí β tạo nên vòng lacton.Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ 13–16 C (20). Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do đó nó có tính đối kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thƣ nhƣng ít tác động đối với nấm. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp 18 màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase (35). Chuỗi heptapeptide của surfactin có trình tự amino acid là NH2-Gly-Leu-DLeu- Val-Asp-DLeu-Leu-COOH, chuỗi peptide này đƣợc tổng hợp bằng các phản ứng enzyme. Các gene mã hóa cho các enzyme này nằm trên cùng một operon gọi là srf operon. srf operon có tất cả 4 gene là srfA, srfB, srfC và srfD. SrfA (402 kDa) là enzyme hoạt hóa 3 amino acid đó là Gly, Leu, DLeu. SfrB (401 kDa) là enzyme hoạt hóa 3 amino acid kế tiếp, SrfC (144 kDa) hoạt hóa Leu còn lại và tách chuỗi peptide ra ngoài.Trong cấu tạo của các enzyme này đƣợc đƣợc chia thành nhiều modul khác nhau mỗi modul chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt. Bên trong mỗi modul đƣợc chia thành các domain là domain A (adenylation), domain C (condensation), domain T (thiolation), domain E (epimerization) mỗi domain thực hiện một bƣớc trong trong quá trình hoạt hóa amino acid của modul. Domain A thực hiện phản ứng adenyl hóa cơ chất tạo thành aminoacyladenylate, trung tâm hoạt động của domain A liên kết với ion Mg2+. Domain T với cofactor là 4′-phosphopantetheine (ppan) thực hiện phản ứng hoạt hóa liên kết thioeste. Domain C thực hiện phản ứng tạo liên kết este giữa 2 amino acid. Trong những modul thực hiện hoạt hóa amino acid có cấu hình D thì có thêm domain E chịu trách nhiệm chuyển amino acid từ cấu hình L sang cấu hình D (34). Cấu trúc của surfactin, quá trình điều hòa, cấu trúc của operon srf, quá trình tổng hợp chuỗi amino acid của surfactin đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 (phụ lục). Quá trình điều hòa và tổng hợp surfactin. Surfactin đƣợc tổng hợp để đáp ứng với nồng độ cao của vi sinh vật trong môi trƣờng, srf operon đƣợc đƣợc điều hòa dƣơng bởi ComA. Nhƣng quá trình phosphoryl hóa ComA đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau. Các modul của 3 enzyme SrfA, SrfB, SrfC đƣợc xắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự của amino acid của chuỗi peptide. Khi quá trình bắt đầu Gyl sẽ gắn vào domain A của modul 1 để thực hiện phản ứng adenyl hóa sau đó đƣợc chuyển qua domain T để tạo phản ứng thioeste với cofactor 4′-phosphopantetheine. Ở modul thứ 2 Leu đƣợc gắn vào domain A, domain C của modul 2 thực hiện phản ứng tạo liên kết este của Gly với gốc amine tự do của Leu sau đó đƣợc chuyển qua domain T của 19 modul 2 để thực hiện các phản ứng tiếp theo. Ở modul cuối cùng có domain TE nhận biết và tách đoạn peptide ra ngoài (34). Heptapeptide sau khi đƣợc tổng hợp sẽ tồn tại ở dạng vòng hoặc dạng thẳng sau đó sẽ liên kết với β-hydroxyl acid béo cuối cùng là đƣợc tiết ra ngoài. 2.5.3.2 Fengycin (18), (34) Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm. Fengycin bao gồm một peptide có 10 amino acid có trình tự L-Glu · D-Orn · L-Tyr · D-allo-Thr · L-Glu · D-Ala (D-Val) · L-Pro · L-Glu · D-Tyr · L-Ile với một cầu nối lacton giữa L-Tyr và L-Ile liên kết với 1 chuỗi β-hydroxyl acid béo có mạch cacbon dài từ 14 đến 18. Fengycin đƣợc tổng hợp nhiều trong phag tăng trƣởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối phag tăng trƣởng, fengycin vẫn đƣợc duy trì ở nồng độ thấp với hàm lƣợng ổn định trong phag cân bằng. Operon mã hóa cho các enzyme tổng hợp fungycin gồm fenC mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu và D-Orn, fenD mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Tyr và D-allo-Thr, fenE mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu · D-Ala (D-Val), fenA mã hóa cho enzyme hoạt hóa L-Pro, L-Glu và D-Tyr, fenB mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho amino acid cuối cùng là L-Ile, cuối cùng là gene mã hóa cho enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi acid béo. Chuỗi 81 nucleotide trên phần upstream của fenC có 2 điểm khởi đầu dịch mã và 4 promotor, 2 promotor có cấu trúc tƣơng ứng với promotor đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa A, điều này giải thích tại sao fengycin đƣợc tổng hợp trong phag tăng trƣởng, 2 promotor có cấu trúc tƣơng ứng với yếu tố điều hòa F duy trì sự tổng hợp fengycin trong phag cân bằng. Cấu trúc của fengycin, fen operon, trình tự nucleotide của phần upstream của fenC đƣợc trình bày ở Hình 2.7 (phụ lục). 2.5.3.3 Mycosubtilin (19), (34) Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin. Mycosubtilin có cấu tạo là một chuỗi β-amino acid béo có chiều dài từ 14-17 C liên kết với 1 heptapeptide mạch vòng có trình tự amino acid là Asn-DTyr-DAsn-Gln-Pro-DSer-Asn. Các lipopeptide thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhƣng c