Phân tích chất lượng sữa tươi tiệt trùng

ng Xuất kho, vận chuyển 2.2.2. Thuyết minh quy trình: 2.2.2.1. Nguyên liệu: Sữa tươi được khai thác từ đàn bò sữa của các hộ nông dân chăn nuôi bò lấy sữa. 2.2.2.2. Phân loại, làm sạch: Sau khi tiếp nhận sữa tươi từ các hộ nông dân, những người thu mua sử dụng các thiết bị thí nghiệm để kiểm tra chất lượng sữa và các thiết bị làm lạnh để bảo quản sữa sau khi thu mua. Cán bộ thu mua có trách nhiệm kiểm tra chất lượng sữa và cân đong lượng sữa cho từng hộ vào hai buổi sáng, chiều theo đúng qui định. Sữa đúng tiêu chuẩn được bảo quản trong bồn lạnh có nhiệt độ 2 – 40C. Cán bộ kỷ thuật thu mua mang mẫu sữa nguyên liệu về kiểm tra chất lượng sản phẩm tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu. Sữa tươi hàng ngày được hút qua hệ thống bơm lên xe và vận chuyển về nhà máy. 2.2.2.3. Kiểm tra chất lượng, tiếp nhận và làm sạch: Các xe bồn chở sữa về nhà máy được các phòng kiểm tra chất lượng tiến hành lấy mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu thành phần, chất lượng vi sinh, nhiệt độ, tỷ trọng, hàm lượng chất khô, chất béo, vi sinh,….Sau khi có kết quả kiểm tra, sữa tươi được hút từ xe bồn vào hệ thống thiết bị tiếp nhận có nhiệm vụi lọc lại và cân đong trước khi cho vào hệ thống làm lạnh. Sữa sau khi qua thiết bị lọc và đong đếm được chuyển tới thiết bị làm lạnh từ 3 – 60C trước khi chuyển vào các bồn chứa. Các công đoạn này đwocj thực hiện bởi các thiết bị tiên tiến bằn các vật liệu Inox dùng trong công nghệ chế biến sữa hàng đầu châu Âu. 2.2.2.4. Tiêu chuẩn hoá: Khi nói đến tiêu chuẩn hoá người ta nhắc đến một chỉ tiêu duy nhất đó là chất béo. Khi tiêu chuẩn hoá sữa, người ta cho thêm cream( nều hàm lượng chất béo trong sữa thấp hơn yêu cầu) hoặc cho thêm sữa gầy( nếu hàm lượng chất béo trong sữa cao hơn yêu cầu). Có thể tiến hành bằn hai phương pháp: bằng máy li tâm tiêu chuẩn hoá tự động hoặc bằn máy phối trộn. Tốt nhất là dùng máy li tâm - điều chỉnh tự động làm đồng thời hai nhiệm vụ: làm sạch và tiêu chuẩn hoá chất béo. Người ta đưa sữa vào máy thanh trùng kiểu khung bản. Đun nóng đêế 40 – 450C rồi chuyển sang máy li tâm làm sạch, li tâm tiêu chuẩn hoá. Sau khi điều chỉnh tới hàm lượng chất béo đạt yêu cầu người ta đưa sữa đi làm lạnh. 2.2.2.5. Đồng hoá, tiệt trùng, rót hộp: Các nguyên liệu sữa tươi, đường kính, ca cao,….. đạt chất lượng sau khi tiếp nhận về nhà máy được chuyển tới các thiết bị chế biến theo công nghệ hiện đại. Ở đây sữa được đồng nhất và tiến hành tiệt trùng ở nhiệt độ 1390C trong thời gian 4 giây. Qúa trình tiệt trùng xong sữa được hạ nhệt độ xuống 20 – 250C chuyển sang thiết bị rót hộp tự động. 2.2.2.6. Lưu kho, bảo quản, kiểm tra chất lượng: Sữa sau khi rót hộp xong đenm đi lưu kho bảo quản. Trong suốt quá trình lưu kho phải luôn luôn kiểm tra chất lượng của sản phẩm đồng thời phát hiện ịp thời những hư hỏng để xử lý. 2.2.2.7. Xuất kho, vận chuyển: Các nhà sản xuất vận chuyển sữa tiệt trùng tới các nhà phân phối chính. Từ các nhà phân phối sản phẩm sữa tiệt trùng được cung cấp tới các đại lý và người tiêu dùng. 2.2. Phương pháp phân tích: - Phương pháp cảm quan - Phương pháp hoá lý - Phương pháp vi sinh 2.3. Các chỉ tiêu cần kiểm tra: 2.3.1. Chỉ tiêu cảm quan: - Trạng thái sữa - Màu sắc - Mùi vị 2.3.2. Chỉ tiêu hoá lý: - Tỷ trọng - Độ chua - Hàm lượng lipid - Hàm lượng protid - Hàm lượng glucid - Hàm lượng Canxi - Hàm lượng các kim loại nặng: Đồng (Cu), Chì (Pb), Kẽm (Zn),Thiếc (Sn ), Asen (As),…… 2.3.3. Chỉ tiêu vi sinh: - Xác định Coliorms - Xác định E.Coli - Xác định Staphylococus Aureus - Xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S - Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sinh H2S - Xác định tổng số nấm men, nấm mốc Phần 3: TIẾN HÀNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG Chương 1: PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU 1. Gới thiệu chung về phương pháp lấy mẫu: 1.1. Ý nghĩa của việc lấy mẫu: - Lấy mẫu là giai đoạn quan trọng trong việc đánh giá chất lượng của lô sản phẩm. - Lấy mẫu thường nhằm các mục đích sau: Kiểm tra quá trình sản xuất. Kiểm tra nghiệm thu. Xác định đặc trưng của lô hàng. Để tiến hành các phép thử. Đánh giá thị trường. 2. Tiến hành: 2.1. Lấy mẫu: - Tuỳ theo khối lượng của mỗi lô hàng mà quy định số mẫu lấy như sau: + Khối lượng sữa = 10000 lít/ngày thì lấy 5 mẫu - Thời gian lấy 2 mẫu liên tục không cách nhau quá 15 phút. Mỗi mẫu tối thiểu là 500ml. - Khi vận chuyển chú ý nên để sữa ở nhiệt độ thấp và chai đặt theo vị trí nằm nghiêng, để tránh bơ vón cục đóng dưới đáy chai. - Mẫu sữa được đưa về phòng kiểm nghiệm được đưa đi phân tích ngay. 2.2. Chuẩn bị mẫu thử: - Trước khi kiểm nghiệm phải đưa mẫu thử về nhiệt độ quy định 20 50C - Sau đó làm cho mẫu đồng đều bằng cách lắc đều chai đựng mẫu sữa một cách nhẹ nhàng. Chương 2: PHÂN TÍCH CẢM QUAN 1.Giới thiệu chung về phương pháp cảm quan: Phân tích cảm quan là kỷ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm thực phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc. 2. Quy trình cảm quan: Mẫu Phòng cảm quan Dụng cụ Danh mục chỉ tiêu và hệ số quan trọng Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị thanh vị Tiến hành thử Bảng điểm Xử lý và báo cáo kết quả 3.Tiến hành: 3.1. Xác định trạng thái sữa: - Xác định trạng thái của sữa, người ta chú ý đến sự đồng nhất của dịch sữa. - Cách xác định: + Rót sữa vào cốc thuỷ tinh khô, sạch. + Quan sát sự đồng nhất của dịch sữa. - Sữa tốt ở dạng nhũ tương đồng đều, không vón cục, không có lớp bơ nổi váng trên bề mặt, không có lẫn rác, rơm, cỏ,..... 3.2. Xác định màu sắc: - Quan sát kỹ sữa dưới cố thuỷ tinh dưới ánh sáng. - Sữa tốt phải có màu trắng hợc vàng nhạt. - Màu sắc của sữa có thể cho biết sơ bộ khái niệm về chất lượng của sữa. - Ví dụ: + Sữa càng vàng khi hàm lượng bơ quá nhiều. + Sữa có màu xanh lơ có thể sữa bị lấy bớt bơ hoặc pha thêm nước + Sữa có màu xám hoặc đỏ nhạt có thể do vú bò bị viêm hoặc có thể do ảnh hưởng của thức ăn lạ. + Những vi sinh vật ô nhiễm sữa có thể làm thay đổi màu sắc của sữa thẫm lên hoặc nhạt đi. 3.3. Xác định mùi vị: - Xác định mùi vị của sữa bằn cách thử nếm. - Chú ý: Chỉ thử nếm mùi vị của sữa đối với sữa có màu sắc của sữa tốt. - Sữa tốt có mùi vị thơm ngon đặc biệt của sữa. - Sữa có mùi vị đắng có thể do ảnh hưởng của thức ăn chăn nuôi. - Sữa có mùi vị của thuốc sát trùng do bị ảnh hưởng của thuốc dùng để sát trùng chuồng trại, dụng cụ chứa đựng, dụng cụ vắt sữa,.... - Sữa có mùi vị kim loại, có thể do dụng cụ bằng kim loại bị hoà tan vào. - Sữa có vị chua, cháy, đắng,...do bị ảnh hưởng của vi sinh vật ô nhiễm sữa gây nên. - Sữa có mùi ôi khê do sữa đã bị phân huỷ chất béo. 4. Kết quả: Sau khi tiến hành đánh giá chất lượng cảm quan sữa bằn hai phương pháp profil và cho đểm ta có bảng kết quả như sau: 4.1. Đánh giá bằng phương pháp profil: - Phép thử gốm hai mẫu sữa tiệt trùng Zinzin (A) và sữa tiệt trùng Flex (B). - Các yêu cầu của phép thử: + Chọn các đặc tính cần đánh giá : về ngoại hình (màu sắc, trạng thái,…), ngửi sản phẩm và nếm sản phẩm. +Thực hiện các phép thử sơ bộ để các thành viên thống nhất sử dụng. + Đánh giá cường độ các đặc tính được lựa chọn đánh giá. + Vẽ biễu đồ dưới dạng đồ thị biểu diễn kết quả. Sau khi thử kẹo ta có đồ thị biểu diễn kết qủa của các kiểm nghiệm viên như sau: A. Ngoại hình: - Màu sắc: 1……. 2…….3……..4…….5…….6……..7……8……9 - Trạng thái: - Tạp chất lạ: B. Ngửi sản phẩm: - Mùi thơm: - Mùi chua: - Mùi khét: - Mùi kim loại: - Mùi ôi khê: - Mùi thuốc hhọc: - Mùi bơ: C. Nếm sản phẩm: B A - Vị ngọt: - Vị chua: - Vị đắng: - Vị tanh kim loại: Chú thích: sữa tiệt trùng ZinZin (A) sữa tiệt trùng Flex (B) - Dựa vào đồ thị ta có nhận xét sau: + Mẫu A có chất lượng tốt hơn mẫu B. + Màu sắc và mùi thơm nổi trội hơn (đây là tính chất có giá trị cảm quan lớn nhất). + Các chỉ tiêu khác của mẫu A cũng hơn mẫu B. Tóm lại dựa vào phương pháp này ta so sánh được chất lượng giữa hao mẫu thử. Và kẹo cứng bạc hà (A) đạt chất lượng về giá trị cảm quan. 4.1. Đánh giá bằng phương pháp cho điểm: - Là phương pháp được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với những sản phẩm còn lại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan như: màu sắc, mùi vị,… tính trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Gía trị điểm tăng theo mức tăng của chất lương. - Các điểm được cho theo quy định của tiêu chuẩn Việt Nam: TCVN 3215 – 79 gồm 20 điểm và 6 bậc. - Sau khi các kiểm nghiệm viên đánh giá chất lượng cảm quan ta có bảng kết quả sau: Tên chỉ tiêuĐiểm của các kiểm nghiệm viênTổng số điểmĐTB chưa có trọng lượngHệ số quan trọngĐTB có trọng lượngKNV1KNV2KNV3KNV4KNV5T/chất bên trong453442040,83,2T/chất bên ngoài44455224,41,04,4Mùi44445214,20,20,84Vị55445234,62,09,2Điểm chung16,64 Loại sữa tiệt trùng có điểm chung là 16,64 và điểm trung bình chưa có trọng lượng của chỉ tiêu quan trọng nhất ( mùi vị) >= 4,7 nên theo TCVN 3215 – 79 thì sữa tiệt trùng đạt chất lượng loại khá. Chương 3: PHÂN TÍCH LÝ HOÁ 1.Giới thiệu chung về phương pháp lý hoá: Là phương pháp dùng để đánh giá các chỉ tiêu hoá lý của sản phẩnm thực phẩm như: tỷ trọng, độ chua, hàm lượng đường, chấy béo, protít,... 2. Tiến hành: 2.1. Xác định tỷ trọng: 2.1.1. Nguyên tắc: Là phương pháp xác định khối lượng của sữa ở 200C so với khối lượng của nước cất ở 200C Khối lượng sữa ở 200C d = Khối lượng của nước cất ở 200C 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Tỷ trọng kế sữa ở 200C - Sữa tiệt trùng. - Nhiệt kế, ống đong. 2.1.3. Tiến hành: - Mẫu thử được làm đồng đều, hạ nhiệt độ xuống 16 – 170C. - Cho mẫu thử vào ống đong từ từ tránh sủi bọt. - Cho tỷ trọng kế thật nhẹ nhàng vào sữa, tránh chạm vào thành ống, cho tới khi chìm tới vạch 1,030 bỏ tay ra thật nhẹ nhàng. - Đọc kết quả trên tỷ trọng kế. - Ghi nhiệt độ bằng nhiệt kế. 2.1.4. Kết quả: Tỷ trọng của sữa được tính theo công thức: d = dQX + 0,0002(t – 20) Trong đó: dQX: tỷ trọng đọc được trên tỷ trọng kế. t : nhiệt độ của mẫu lúc xác định. 2.2. Xác định độ chua: Sữa tiệt trùng coa phản ứng axit yếu. Khi bảo quản độ axit của sữa tăng lên do tích tụ axit lactic - sản phẩm của sự chuyển hoá đường lactoza do quá trình lên men lactic. 2.2.1. Nguyên tắc: Nguyên tắc xác định dựa vào phản ứng trung hoà: H+ + OH- = H2O Dùng dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ hết lượng axit có trong mẫu với chỉ thị phenolphtalein. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Ống đong, phễu thuỷ tinh - Buret, pipet - Bình nón 250ml - Cốc thuỷ tinh - Phenolphtalein - Sữa thiệt trùng 2.2.3. Tiến hành: - Lấy 10ml sữa cho vào bình nón thêm vào bình nón 20ml nước cất và 3 giọt phenolphtalein, lắc đều. - Chuẩn độ dung dịch trong bình nón bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây là dừng. - Ghi VNaỌH tiêu tốn. 2.2.4. Kết quả: Độ axit của sữa tính bằng độ Tecne: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn 100ml sữa T = = VNaOH x 10 ( 0T) Chú ý: Độ axit của sữa tiệt trùng khoảng 16 – 180T và = 11. - Khi chưa chuẩn độ trong bình nón Muretxit kết hợp với Ca2+ tạo ra phức có màu đỏ. - Khi định phân bằng Trilon B và đến điểm tương đương thì chỉ thị được giải phóng hoàn toàn ở dạng tự do, dung dịch chuyển sang màu tím. - Định phâncho đến khi dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu tím thì ngừng chuẩn độ. 2.4.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Bình nón, pipet, buret. - Chất chỉ thị Muretxit. - Dung dịch NaOH 20%. 2.4.3. Tiến hành: - Trên buret chứa dung dịch Trilon B. - Trong bình nón dung tích 250ml (đã tráng rửa bình bằng nước cất) chứa 50ml sữa, 1ml dung dịch NaOA 20% và vài giọt Muretxit, lắc đều. - Xảy ra hai trường hợp: + Nếu dung dịch trong bình nón có màu tím thì chứng tỏ trong sữa không có Ca2+. + Nếu trong bình nón có màu đỏ thì ta tiến hành chuẩn độ cho đến khi dung dịch trong bình nón xuất hiện màu tím thì dừng lại. - Ghi thể tích Trilon B tiêu tốn. 2.4.4. Kết quả: - Ta có nồng độ đương lượng của Canxi là: NCanxi = (N) - Vậy hàm lượng Canxi có trong sữa là: aCanxi = (g/l) Trong đó: N: nồng độ đương lượng của Canxi. Đ: khối lượng đương lượng của Canxi ( ĐCa = 40). V: thể tích mẫu. 2.5. Xác định hàm lượng các kim loại nặng (Dùng phương pháp Ditizon): 2.5.1. Xác định Đồng (Cu), Chì (Pb), Kẽm (Zn): Bản chất của phương pháp Ditizon: NH-NH-C5H6 S=C N=N- C5H6 Ditizon tan trong cacbontetraclorua và cloroform có màu xanh lá cây. Trong môi trường nước Ditizon tồn tại cân bằng: HDz ↔ Dz- + H+ Do đó ở trong môi trường trung tính hay axit, Ditizon ở dạng phân tử nhiều hơn nên chúng ít tan. Trong môi trường kiềm Ditizon tan nhiều hơn do ở dạng ion nhiều hơn. Ditizon tạo với các ion kim loại thành các Ditizonnat có màu, ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong cacbontetraclorua và cloroform. Các Ditizon tồn tại ở 2 dạng tuỳ thuộc vào pH của môi trường: - pH ≤ 7: Chúng tồn tại ở dạng xeton - pH ≥ 7: Chúng tồn tại ở dạng enol. Nguyên tắc chung của phương pháp: - Dùng phương pháp chiết - Dùng dung môi cacbontetraclorua hay cloroform. - Cho các ditizon tác dụng với kim loại cần xác định tạo thành Ditizonat. - Điều chỉnh pH để Ditizonnat tách ra khỏi dung môi. Nguyên tốĐiều kiên chiết Màu của DitizonpH chiết hoàn toànDung môi chiếtChì Đồng KẽmMôi trường kiềm:đỏ Môi trường axit: đỏ tím Trung tính hay kiềm yếu:đỏ7-10 2-5CCl4 CCl4 CCl4 Chuẩn bị dung dịch để xác định Đồng, Chì, Kẽm: Các kim loại này có trong thực phẩm với lượng nhỏ do đó phải vô cơ hoá mẫu để xác định chúng. Có 2 phương páp vô cơ hoá mẫu: *Vô cơ hoá mẫu bằng phương pháp khô: Đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ có trong mẫu bằng lò nung. Trong quá trình đốt có bổ sung thêm chất MgO2 và (CH3COO)2Ca để tăng tốc độ đót cháy và ngăn tạo thành các hợp chất bay hơi của kim loại. -Dụng cụ, hoá chất: + Capxun dung tích 250ml + Bình định mức dung tích 250ml + Bếp cách cát, lò nung + Phễu, pipet 100ml, cân kỹ thuật + Giấy lọc, bếp điện + Hoá chất: MgO2 và (CH3COO)2Ca , HNO3 đâm đặc. -Tiến hành: Lấy mẫu Vô cơ hoá mẫu Định mức mẫu + Lấy mẫu: Dùng pipet hút 100ml mẫu cho và capxun + Vô cơ hoá mẫu: Thêm vào acpxun 0,5g MgO2 và 0,5g (CH3COO)2Ca. Đặt capxun lên bbếp các đốt cho mẫu cháy thành than, sau đó đặt vào lò nung ở nhiệt độ t= 600-700oC, đến khi mẫu biến thành tro xám hoàn toàn. Và sau đó lấy capxun ra khỏi là nung, để nguội, cho vào capxun 20ml HNO3 đậm đặc và 50 ml nước cất 2 lần. Đặt capxun lên bếp điện đun cho tan hết muối bám ở trên capxun, đun sôi thên 10 phút nữa. + Định mức mẫu: Chuyển toán bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức 250 ml, tráng rữa capxun nhiều lần, sau đó thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỷ. *Vô cơ hoá mẫu bằng phương pháp ướt: Đốt cháy hoàn toàn chất hữu cơ trên bếp điện với xúc tác H2SO4 đậm đặc, đó là những chất oxy hoá mạnh làm tăng tốc độ đốt cháy. - Dụng cụ: Như phương pháp khô. - Hoá chất: + H2SO4 đậm đặc (d=1,84) + HNO3 đâm đặc(d=1,4) + Amonxetat :NH4CH3COO - Tiến hành : + Lấy mẫu giống như phương pháp khô. + Thêm vào capxun đựng mẫu 3ml HNO3 đâm. đặc, 50ml H2SO4 đậm đặc. Đặt capxun lên bếp điện và đun sôi daung dịch traong capxun, tiếp tục đun cứ 10 phút nhỏ 5-20 giọt HNO3 đậm đặc, khí NO2 sẽ thoát ra . Nếu thấy màu trong capxun sẫm lại thì thăng cường nhỏ HNO3 và khi dung dịch trở nên nhạt màu thì giãm nhỏ HNO3 lại đên khi dung dịch không màu thì thôi. + Tiếp tục đun cho đến khí khói trắng bốc hết, tiếp tục đun thêm 10 phút nữa. Nếu dung dịch không màu thì việc vô cơ hoá đã xong. + Lấy capxun ra khỏi bếp điện, nhỏ 0,2g NH4CH3COO, khuấy cho tan hết. + Định mức dung dịch trong capxun thành 250ml, nếu thấy dung dịch trong capxun đục thì lọc trước khi định mức. 2.5.2. Xác định hàm lượng Đồng( Cu): 2.5.2.1. Nguyên tắc: Ditizon tác dụng với ion Cu2+ xảy ra các phản ứng sau: Cu2+ + 2H2Dz = Cu(HDz)2 + 2H+ Cu2+ + Cu(HDz)2 = 2CuDz + 2H+ Cu2+ + H2Dz = CuDz + 2H+ Cu(HDz)2 : màu đỏ tín CuDz : màu vàng nâu Cu(Dz)2 và CuDz đều tan trong dung môi hữu cơ và không tan trong nước - Trong môi trường axit yếu và có dư ditizon thì việc tạo thành Cu(HDz)2 thuận lợi hơn - Trong môi trường trung tính thì cả 3 phản ứng trên đều xảy ra - Ở nnồng độ cao và pH=2 việc tạo thành CuDz xảy ra thuận lợi hơn Trong phần dung môi hữu cơ, Cu(HDz)2 dễ bị phân ly tạo thành CuDz: Cu(HDz)2 = CuDz + H2Dz - Do các điều kiện trên, để xác định đồng bằng ditizon, thường tiến hành ở pH=3-4 để thu Cu2+ dưới dạng Cu(HDz)2 là hoàn toàn. 2.5.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Cân phân tích - Cốc thuỷ tinh 250ml - Bình định mức dung tích 1000 ml - Giấy thử pH. - Phễu chiết dung tích 100ml. - Buret 100ml - Amoniac 2N - Dung dịch Ditizon trong cloroform 50µM. - H2SO4 2N: Hoà tan 55ml H2SO4 (d = 1,84) vào nước cất thành 1000ml. - Dung dịch đồng tiêu chuẩn 25 µM: Hoà tan 19,64 g CuSO4.5H2O tinh khiết loại I trong nước cất hai lần, đổi thành 1000ml. 1ml dung dịch này chứa 5 đồng. 2.5.2.3. Tiến hành: - Loại Sn2+ dung dịch mẫu: Lấy 25ml dung dịch từ bình định mức (đã vô cơ hoá) cho vào cốc thuỷ tinh dung tích 250ml, cho vào cốc 10ml Br2 lỏng và đun tren bếp điện để đuổi hết SnBr4.tiếp tục đun, thêm nứơc cất vào rồi tiếp tục đun cho đén khi dung dịch không còn màu đỏ của brom. Lúc này dung dịch chỉ còn các ion Cu2, Zn2+, Fe2 , Pb2+ … - Cho dung dịch đã loại chì vào phễu chiết, điều chỉnh độ pH của dung dịch đến có pH = 3 – 4 bằng amoniac 2N hay H2SO4 2N (dùng giấy thử pH). - Chiết chuẩn độ: Nạp Ditizon 50µM vào buret. Nhỏ 1ml Ditizon vào phễu chiết chứa dung dịch mẫu, lắc 30 giây. Nếu có Cu2+ thì trong phần dung môi cloroform sẽ có màu đỏ của chì ditizonat. Chiết bỏ phần màu đỏ tím (phải chiết thật cẩn thận để dung dịch mẫu không chảy ra ) Lại cho thêm 1ml dung dịch Ditizon vào phễu chiết, lắc 30 giây và lại tách bỏ màu đỏ tím. Cứ tiếp tục như thế cho đến khi phần dung môi trong phễu chết kém đỏ, khi đó lượng đồng trong dung dịch đã giảm rất nhiều. Lúc đó nhỏ 0,2ml ditizon vào phễu chiết, lắc và tách như trên cho đến khi nhỏ ditizon vào phễu chiết ditizon vẫn giữ đựơc màu xanh sau khi lắc 30 giây thì thôi. Ghi tổng số ml Ditizon đã dùng để chuẩn độ ion đồng. - Xác định độ chuẩn của Ditizon: Lấy chính xác 10ml dung dịch chì tiêu chuẩn vào phễu chiết sạch. Nạp dung dịch Ditizon 50µM vào buret. Tiến hành chuẩn độ như trên và căn cứ vào độ chuẩn của Ditizon này tính kết quả hàm lượng đồng. 2.5.2.4. Kết quả: Tính: 1ml dd ditizon ứng với bao nhiêu g đồng 1ml CuSO4.5H2O 25µM chứa 5 chì Vậy: 1ml dd Ditizon ứng với số g chì Hàm lượng chì tính bằng gam chứa trong 1lít sữa là: 3,45.a.V.100 X= (/l) V1.Vo Trong đó: 3,45: Số gam đồng tương ứng với 1ml dd ditizon a: Thể tích dung dịch ditizon đã dùng để chuẩn độ(ml) V: Dung tích bình định mức(ml) V1: Thể tích dung dịch hút từ bình đem phân tích Vo : Thể tích sữa lấy phân tích 2.5.3. Xác định hàm lượng Chì( Pb): 2.5.2.1. Nguyên tắc: - Trong môi trường trung tính hay kiềm, ion Pb2+ tạo với Ditizon tạo thành chì ditizonat màu đỏ tan trong dung môi hữu cơ: Pb2+ +2H2DZ = Pb(Dz)2 + 2H+ - Vì Pb(Dz)2 tan rất ít trong dung môi hữu cơ do đó khi dùng mmôi trường trung tính tốt nhất nên dùng nồng độ Ditizon trong CCl4 50µM(micro phân tử gam :12,81mg/l). Trong CHCl3, Pb(Dz)2 tan gần 17 lần trong CCl4. Do đó để xác định Pb người ta thường dùng CHCl3 để hoà tan ditizon. - Ở pH > 7 việc thu Pb2+ vào dạng Pb(Dz)2 là hoàn toàn. Tuy nhiên pH>9,5 thì Pb(Dz)2 trong CHCl3 bị phân huỷ. - Trong dung dịch sau khi vô cơ hoá có thể có mặt của oin Sn2+, Cu2, Zn2+, Fe2+…Các ion này có thể bị che dấu bởi KCN, tuy nhiên Sn2+ không bị che bởi KCN do đó phải tích ion này ra khỏi dung dịch trước khi xác định chì.2.5.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Cân phân tích - Cốc thuỷ tinh 250ml - Bình định mức dung tích 1000 ml - Giấy thử pH. - Phễu chiết dung tích 100ml. - Buret 100ml - Dung dịch tiêu chuẩn 25µM(hoà tan 8,28mg Pb(NO3)2 tinh khiết loại 1 trong nước cất 2 lần, đến thành 1000ml, 1ml dung dịch này chứa 1,175 chì) - Dung dịch amoniac 2N - KCN tinh thể - Dung dịch Ditizon tiêu chuẩn (Dung dịch Ditizon trong Cloroform 50µM): Cân chính xác 12,81mg Ditizon tinh khiết cho vào cốc, thêm 200ml CHCl3 vào cốc và khuấy nhẹ cho tan Ditizon, định mức trong 1000ml, lắc kỹ. - Hydroxylamin hydroclorua (NH2 OH.HCl) tinh thể. 2.5.2.3. Tiến hành: - Loại Sn2+ ra khỏi dung dịch mẫu: Lấy 25ml dung dịch từ bình định mức (đã vô cơ hoá) cho vào cốc thuỷ tinh dung tích 250ml, cho vào cốc 10ml Br2 lỏng và đun tren bếp điện để đuổi hết SnBr4.tiếp tục đun, thêm nứơc cất vào rồi tiếp tục đun cho đén khi dung dịch không còn màu đỏ của brom. Lúc này dung dịch chỉ còn các ion Cu2, Zn2+, Fe2 , Pb2+ … - Che dấu các ion Cu2, Zn2+, Fe2 , …: Chuyển dung dịch đã loại Sn2+ vào phễu chiết. Cho vào phễu chiết vài tinh thể NH2 OH.HCl lắc cho tan hết. Cho vào phễu một lương KCN (bằng hạt ngô), lắc cho tan hết. Điều chỉnh pH dung dịch đến pH>7,5 bằng NH4OH 2N hoặc HNO3 2N. - Chiết chuẩn độ: Nạp Ditizon 50µM vào buret. Nhỏ 1ml Ditizon vào phễu chiết chứa dung dịch mẫu, lắc 30 giây. Nếu có Pb2+ thì trong phần dung môi cloroform sẽ có màu đỏ của chì ditizonat. Chiết bỏ phần màu đỏ tím (phải chiết thật cẩn thận để dung dịch mẫu không chảy ra ) Lại cho thêm 1ml dung dịch Ditizon vào phễu chiết, lắc 30 giây và lại tách bỏ màu đỏ tím. Cứ tiếp tục như thế cho đến khi phần dung môi trong phễu chết kém đỏ, khi đó lượng chì trong dung dịch đã giãm rất nhiều. Lúc đó nhỏ 0,2ml ditizon vào phễu chiết, lắc và tách như trên cho đến khi nhỏ ditizon vào phễu chiết ditizon vẫn giữu đựơc màu xanh sau khi lắc 30 giây thì thôi. Ghi tổng số ml Ditizon đã dùng để chuẩn độ ion chì. - Xác định độ chuẩn của Ditizon: Lấy chính xác 10ml dung dịch chì tiêu chuẩn vào phễu chiết sạch. Nạp dung dịch Ditizon 50µM vào buret. Tiến hành chuẩn độ như trên và căn cứ vào độ chuẩn của Ditizon này tính kết quả hàm lượng chì. 2.5.2.4. Kết quả: Tính: 1ml dd ditizon ứng với bao nhiêu g chì 1ml Pb(NO3)2 25µM chứa 5,175 chì Vậy: 1ml dd Ditizon ứng với số g chì Hàm lượng chì tính bằng gam chứa trong 1lít sữa là: 3,45.a.V.100 X= (/l) V1.Vo  Trong đó: 3,45: Số gam chì tương ứng với 1ml dd ditizon a: Thể tích dung dịch ditizon đã dùng để chuẩn độ(ml) V: Dung tích bình định mức(ml) V1: Thể tích dung dịch hút từ bình đem phân tích Vo : Thể tích sữa lấy phân tích 2.5.3. Xác định hàm lượng Kẽm( Zn): 2.5.3.1. Nguyên tắc: - Trong môi trường trung tính hay kiềm yếu, Zn2+ tác dụng với ditizon tạo thành phức chất Zn(HDz)2 màu đỏ. Zn2+ + 2H2Dz = Zn(HDz)2 + 2H+ - Phản ứng tren thích hợp khi pH=6,3 tương ứng với dung dich chứa dung dịch đệm citrat. - Nồng độ của Zn2+ càng lớn màu của Zn(HDz)2 càng đậm. - Đem đo màu của dung dịch tạo phức chất màu đỏ sã xác định nồng độ của Zn2+ trong mẫu. - Phải loại bỏ ion Cu2+, Pb2+  trước khi xác định Zn2+ . 2.5.3.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: -Cân phân tích -Cốc thuỷ tinh 250ml -Bình định mức dung tích 1000 ml -Giấy thử pH. - Phễu chiết dung tích 100ml. - Buret 100ml - Amoniac 2N - Kali-Natri tactrac dung dịch 20%. - Dung dịch Natrisunfua Na2S bão hoà - Dung dịch Ditizon trong Cloruaform 50µM - Dung dịch kẽm tiêu chuẩn: cân 43,97mg ZnSO4.7H2O tinh khiết loại 1 cho vào bình định mức dung tích 1000ml, thêm vào 10ml H2SO4 2N, thêm nước cất đến vạch định mức và lắc kĩ. 1ml dung dịch chứa 10kẽm. 2.5.3.3. Tiến hành: Loại bỏ Cu2+ Chiết kẽm bằng Ditizon và loại bỏ chì Đo màu dung dịch mẫu Đo màu dung dịch kẽm tiêu chuẩn - Loại bỏ Cu2+ : + Lấy 25ml dung dịch đã vô cơ háo cho vào phễu chiết. Trung hoà bằng NH3 2N đến pH=7 với giấy thử pH. Cho vào phễu chiết 5ml dung dịch ditizon, lắc mạnh phễu chiết 1-2 phút rồi để yêu cho phân lớp. + Tách bỏ lớp dưói có phức đồng-ditizonat có màu đỏ tím. Thêm ditizon và tiếp tục lắc cho đén khi không còn màu đỏ tím ở phần ditizon. - Chiết kẽm bằng Ditizon và loại bỏ chì: + Cho phần dung dịch ditizon và một cốc, cho vào cốc 3ml kili-natri tactrac dung dịch 20% để chúng kết tủa các hydroxyt khin loại trung hoà amoniac. + Chuyển toàn bbộ dung dịch từ cốc vào phễu chiết, lắc kỹ. Dung dịch sẽ có màu đỏ của kẽm-ditizonat. Cho vào phễu 10ml Natrisunfua dung dịch bão hoà (để loại chì và ditizon dư), lắc kỹ, để yên cho tách lớp. loại bỏ lớp dưới, tiếp tục rửa với Natrisunfua cho đến khi lớp dưới không màu thì thôi. - Đo màu dung dịch mẫu: +Chuyển dung dịch màu đỏ của kẽm-ditizonat vào bình định mức dung tích 25ml, thêm cloruaform đến vạch định mức, lắc kỹ. + Đem dung dịch này đo màu trên máy đo màu, trị số đọc được là mật độ quang của mẫu phân tích: D1 - Đo màu dung dịch kẽm tiêu chuẩn: Lấy 10ml dung dịch kẽm tiêu chuẩn vào phễuchiết khác. Tiến hành chuẩn độ Zn2+ với ditizon và cũng thu phần dung môi chứa kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức 25ml, thêm nước cất đến vạch định mức và tiien hành đo màu dung dịch này. Trị số đo được là mật độ quang của mẫu chuẩn: Do 2.5.3.4. Kết quả: Hàm lượng Kẽm trong sữa được tính theo công thức: 10.V2.Do.Vo 1000 Zn2+ = × (/l) D1.V V1 Trong đó: V2 : Số ml kẽm tiêu chuẩn Do : Trị số đo mật độ quang đối với mẫu chuẩn D1: Trị số đo mật độ quang đối với mẫu phân tích Vo : Thể tích bình định mức (ở phần vô cơ hoá) V1 : Thể tích dung dich mẫu lấy để chuẩn V :Thể tích sữa lấy để phân tích 2.5.4. Xác định hàm lượng Thiếc: 2.5.4.1. Nguyên tắc: - Sau khi vô cơ hoá mẫu thực phẩm, dng dịch chứa thiếc cả hai dạng Sn2+ và Sn4+. - Dùng hyđro khử toàn bộ lượng Sn4+ về dạng Sn2+. - Cho I2 dư tác dụng với Sn2+ trong môi trường acid. - Xác định I2 thừa bằng chất chuẩn Na2S2O3. Từ đó tính được hàm lượng Sn có trong mẫu.  Các phản ứng xảy ra trong quá trình xác định thiếc:  Khi đốt mẫu HNO3 và H2SO4 tác dụng với nhau tạo thành acid nitro zynsunfic, chất này có tác dụng oxy hoá mạnh các chất hữu cơ và cả Sn2+, Sn có trong mẫu. HO SO2 + HOH = H2SO4 + NO + NO2 ONO NO và NO2 bốc đi khi đun mạnh Khi đun nóng và sự có mặt của các chất hữu cơ, HNO3 phân giải theo phương trình: 2HNO3 = H2O + 2NO = 3O Oxy hoá hoạt động này sẽ oxy hoá các hợp chất hữu cơ thành H2O và CO2, CO2 sẽ bốc đi khi đốt. H2SO4 hút nước và phá huye các liên kết phức tạp của protic. Glucid, lipid. Ngoài ra nó cũng bị khử một phần thành SO2 H2SO4 = H2O + SO2 + O Oxy này giúp cho quá trình oxy hoá các chất hữu cơ, còn SO2 bốc đi khi đun.  Khi nhôm gặp HCl xảy ra phản ứng: Al + 3HCl = AlCl3 + 3H Hydro này sẽ khử Sn4+ thành Sn2+ SnCl4 + 2H = SnCl2 + 2HCl Hoặc Sn2+ thành Sn kim loại SnCl2 + 2H = Sn + 2HCl Sn khim loại này tan trong HCl Sn + 2HCl = SnCl2 + 2H  Khi CaCO3 gặp HCl sãe tạo ra CO2 CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Phản ứng này thực hiện trong bình kín.  Sn2+ oxy hoá bởi Iốt trong môi trường HCl SnCl2 + I2 + 2HCl = SnCl4 + 2HI  Phản ứng chuẩn độ I2 bằng Na2S2O3 I2 + Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6 2.5.4.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Pipet 50, 25ml - Bình đốt Kiendan dung tích 500ml - Bình kíp - Nút cao su - Ống thuỷ tinh - Buret, cân kỷ thuật - H2SO4 đậm đặc (d= 1,84) - HNO3 đậm đặc (d=1,4) - Amôn oxalat (NH4C2O4) tinh thể - HCl đậm đặc (d = 1,19) - Nhôm kim loại (hạt hoặc bột) - Canxi cacbonat (CaCO3) - I2 dung dịch 0,02N - Na2S2O3 0,01N - Hồ tinh bột 1% 2.5.4.3. Tiến hành: 1. Vô cơ hoá mẫu: Lấy mẫu: Hút 50ml sữa, cho vào bình đốt Kiendan. Thêm vào bình 50ml H2SO4 và 10ml HNO3 đậm đặc, lắc đều. Đun bình Kiendan trên bếp điện để dung dịch trong bình sôi mạnh để hơi nước và khói trắng bốc lên (làm trong tủ hơi nước). Sau đó cho HNO3 vào từng giọt một (đến hết 3 – 4ml) và tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong bình có màu vàng nhạt lúc để nguội không màu mới thôi. Cho vào bình 5g amon oxalat tiinh thể để khử hết các hợp chất chứa Nitơ. Đun tiếp trên bếp điện cho tới khi có khói trắng bốc lên. 2. Định mức: Sau khi để nguội, chuyển toàn bộ dung dịch thừ bình đốt Kiendan sang bình nón dung tích 500ml. Dùng nước cất tráng bình đốt nhiều lần, nước tráng cũng cho vào bình nón. Thêm vào bình nón 50ml dung dịch HCl đậm đặc. 3. Chuyển Sn4+ về dạng Sn2+: Đậy bình nón bằn nút cao su có hai lỗ, một lỗ cắm ống thuỷ tinh để dẫn khí CO2 vào, ống này cắm sát xuống đáy bình nón. Lỗ kia cắm một ống thuỷ tinh khác dài 10cm và sâu xuống quá nút 3cm. Cho 0,5d Nhôm (không chứa thiếc) vào bình nón và bắt đầu dẫn khí CO2 từ bình kíp vào. CO2 đuổi oxy của không khí ra khỏi bình nón, chống sự oxy hoá Sn2+. Đun sôi dung dịch trong bình nón, nếu thấy có kết tủa Sn thì đun kỹ cho tan hết. Để nguội bình xuống đến nhiệt độ 15 – 200C vào bình nón. 4. Cho Sn2+ tác dụng với I2: Nhanh chóng tháo bình nón ra khỏi bình kíp, mở nút và cho nhanh 25ml dung dịch I2 0,01N (chứa trong buret) lắc mạnh và đều. Dùng nước cất tráng tất cả chất lỏng dính ở nút, ống thuỷ tinh và thành trong bình vào bình nón. 5. Chuẩn lượng I2 dư: Cho vào bình nón 1ml tinh bột 1%, chuẩn độ I2 dư bằng Na2S2O3 0,01N đến khi dung dịch mất màu xanh. Phải chuẩn thật nhanh, tránh oxy không khí vào nhiều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. 6. Làm mẫu trắng: Lấy 25ml I2 0,01N vào bình nón mới, thêm 100ml nước cất và 1ml tinh bột 1%, chuẩn độ I2 bằng Na2S2O3 0,01N đến khi dung dịch mất màu xanh. 2.5.4.4. Kết quả: Hàm lượng thiếc được tình bằng công thức: 0,5935(a – b).100 Sn = (mg/l) V Trong đó: a: số ml Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu trắng b: số ml Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích V: thể tích lấy mẫu sữa để phân tích 2.5.5. Xác định hàm lượng Asen( As): 2.5.5.1. Nguyên tắc: - Hợp chất asen có trong mẫu được khử bởi hyđro tạo thành asen hyđrua (AsH3). - Asen hyđro phản ứng với thuỷ ngân clorua tẩm trên giấy lọc tạo thành hợp chất màu nâu. - So sánh độ màu của giấy này với dãy giấy tẩm HgCl2 tiêu chuẩn, sẽ tính được lượng Asen có trong mẫu.  Các phản ứng xảy ra trong quá trình xác định Asen: 1. Khi đốt lượng mẫu sữa, Asen ở dạng kim loại hoặc oxyt đều được chuyển sang dạng As5+ 6As + 10HNO3 = 3As2O5 + 10NO + 5H2O As2O5 + 3H2O = H3AsO4 3 H3AsO4 + 2MgO = MgHAsO4 + 2H2O 2. Khi kẽm gặp HCl sẽ có phản ứng: Zn + 2HCl = ZnCl2 + 4H2O Hydro này tác dụng với các muối asen tạo thành Asen hyđrua: H3AsO4 + 8H = AsH3 + 4H2O Và AsH3 phản ứng với HgCl2 AsH3 + HgCl2 = Hg3As (màu nâu) 3. Phương pháp này xác định lượng asen nhỏ và vì AsH3 là chất dễ bay hơi, nên dụng cụ xác định asen phải phải thật kín, nếu không sẽ làm giảm kết quả phân tích, nút cao su không đậy kín bình nón thì phải trát một lớp parafin. 2.5.5.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Ống đong - Pipet 110ml, 25ml, 5ml - Bình định mức 1000ml - Capxun 250ml - Cân kỷ thuật - Cân phân tích - Bếp điện, bếp cách cát - Lò nung điều chỉnh nhiệt độ 400–5000C - Bình nón 100ml - Giấy lọc cắt thành dải hữ nhật (0,5x15cm) - HNO3 đậm đặc (d=1,4) - HCl đậm đặc (d=1,19) - MgO bột - Kẽm hạt (không chứa Asen) - Chì axêtat 3% - HgCl2 tinh khiết loại I - Ống thuỷ tinh dài 30cm, đường kính 0,7cm, có một lỗ đường kính 0,3cm cách đầu dưới ống 22cm, ống được cắm quá lỗ của nút cao su 3cm. Giấy tẩm HgCl2 được đặt vào trong ống khoảng giữa nút và lỗ. Giấy lọc tẩm chì axêtat được cuộn tròn lại và đặt phía trên lỗ. - Giấy tẩm HgCl2, nhúng ngập giấy tẩm lọc (1x8cm) vào chì axêtat vớt ra, để khô, cuộn tròn giấy thành ống hình trụ, cho vào đầu trên ống thuỷ tinh. 2.5.5.3. Tiến hành: 1. Chuẩn bị dung dịch thử: Dùng pipet lấy 100ml sữa cho vào capxun 250ml. Thêm vào capxun 1b MgO và 10ml HNO3 đậm đặc, khuấy đều. Đặt capxun lên bếp cách cát, đun dung dịch trong capxun cho tới khô. Đưa capxun vào lò nung, nung ở nhệt độ t = 400 – 5000C, nung đến tro. Để nguội, cho vào capxun 10ml HCl đậm đặc vào 20ml nước cất/ Đặt capxun lên bếop điện đun ho sôi dung dịch đến khi lớp tro tan hết. Để nguội, lọc lấy dung dịch từ capxun vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. 2. Xác định: Dùng pipet hút lấy 25nl dung dịch Dùng pipet hút lấy 25ml dung dịch trong binhd định mức, cho vào bình nón 100ml, thêm vào 5ml nước cất, cho tiếp vào bình nón 10ml HCl đậm đặc và 3g kẽm, nhanh chóng đậy nút lại. Nút cao su có gắn ống thuỷ tinh chứa giấy tẩm dung dịch HgCl2 5% đã sấy khô và giấy tẩm chì axêtat 3%. Để Asen phản ứng với hyđro mới sinh ra trong 30 phút (kể từ khi đậy nút). Trong quá trình này, giấy tẩm HgCl2 sẽ có màu nâu nếu mẫu có Asen. Sau khi mở nút ra khỏi bình nón, lấy giấy đem so màu với giấy tẩm HgCl2 tiêu chuẩn. Tính kết quả theo lượng Asen ghi trên giấy tẩm HgCl2 tiêu chuẩn, nếu màu của giấy làm mẫu thử và giấy tiêu chuẩn trùng nhau. 3. Chuẩn bị giấy tẩm HgCl2 tiêu chuẩn: Cân chính xác 1,32g As2O3 tinh khiết loại I, cho vào bình định mức 1000ml. Thêm vào bình định mức 10ml H2SO4 đậm đặc, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. Dùng pipet hút lấy 10ml dung dịch đã pha trên, cho vào bìnhđịnh mức dung tích 1000ml khác, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ, 1ml dung dịch này chứa 10 As Lần lượt cho vào 10 bình nón dung tích 100ml: + Bình 1: 2ml dung dịch trên ứng với 20 As + Bình 1: 4ml dung dịch trên ứng với 40 As ………. + Bình 1: 20ml dung dịch trên ứng với 200 As Sau đó thêm nước cất vào từng bình nón ch đủ 30ml và cho vào mỗi bình 10ml HCl đậm đặc và 3g kẽm. Đậy nút bình. Nút có gắn ống thuỷ tinh chứa giấy tẩm HgCl2 và giấy tẩm chì axêtat rồi làm như cách làm ở mẫu thử. Sau 30 phút, các giấy tẩm HgCl2 hiện màu đầy đủ. Tháo nút, lấy các tấm giấy ra, ghi lượng As ứng với mỗi giấy lên từng giấy, được dãy màu tiêu chuẩn. Tuỳ lương Asen tăng dần mà các tấm giấy khi đó có cường độ màu tăng dần (từ vàng đến nâu và nâu đậm) và chiều dài đoạn màu tăng dần từ 0,5cm đến 5cm 2.5.5.4. Kết quả: - Mẫu thử có màu trúng với màu nào của giấy tiêu chuẩn thì lượng Asen có trong mẫu ở khoảng đó. - Từ đó tính lượng Asen có trong 1 lít sữa. Chương 4: PHÂN TÍCH VI SINH 1. Giới thiệu về phương pháp vi sinh: Là phương pháp xác định hàm lượng vi sinh vật có trong sữa bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trường và đếm số lượng.  Một số môi trường sử dụng trong nuôi cây vi sinh vật: Môi trường Sabourand: - Thạch: 20g - Pepton: 20g - Glucoza (hoặc maltoza): 40g - Nước: 100ml Đun cho tan hết, điềuchỉnh pH = 5,5 hấp tiệt khuẩn ở 1200C trong 20 phút. Môi trường thạch thường: - Pepton: 10g - Cao thịt: 3g - NaCl: 5g - Agar: 12g Đun ta các hợp chất trên với 1 lit nước cất, pH = 7, hấp ở 1210C trong 15 phút. Môi trường nước pepton: - Pepton: 10g - NaCl: 10g Đun tan các hợp chất trên với 1lit nước cất, pH = 7,2 và hấp ở 1210C trong 15 phút. Môi trường Wilson Blair Agar: - NaCl: 5g - Pepton: 10g - Glucoza: 10g - Cao thịt: 3g - Agar: 10g Đun tan các hợp chất trên với 1 lit nước cất, hấp ở 1210C trong 15 phút. 2. Tiến hành: 2.1. Xác định Coliforms: 2.1.1. Nguyên tắc: Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Trên môi trường Endo có chứa Natri sulfit và fucsin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram ( + ). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliforms lên men đường lactose tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucsin – sulfit và giải phóng fucsin. Fucsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không . 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Đĩa petri - Dụng cụ đồng nhất mẫu - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 2.1.3. Hoá chất, môi trường: - Môi trường lactose lục đỏ sáng mật bò - Môi trường EMB - Môi trờng Endo - Môi trường Istrati Tất cả các dụng cụ phải khử trùng trước khi tiến hành thí nghiệm. Môi trường đã được pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và đượcbảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. 2.1.4. Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng: Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 - Gieo cấy: Cấy 1 giọt mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa petri đã có chứa môi trường thạch Endo, mỗi độ pha loãng làm đĩa lặp lại. Tráng đều mẫu trên mặt thạch. - Nuôi ủ: Đưa đĩa đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 48 – 72h. Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim. 2.1.5. Kết quả: Đếm các khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ trong các đĩa petri có trong khoảng 15 –150 khuẩn lạc Số lượng Coliforms có trong 1g mẫu được tính theo công thức: N = ( CFU/ml, CFU/g ) Trong đó: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1:số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ1 n2 : số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ2 f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1 V : thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri 2.2. Xác định E.Coli : 2.2.1. Nguyên tắc: Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Trên môi trường Endo có chứa Natri sulfit và fucsin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram ( + ). Trong quá trình phát triển trên môi trờng này, Coliforms lên men đường lactose tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucsin – sulfit và giải phóng fucsin. Fucsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không . Nếu khuẩn lạc có màu hồng có ánh kim có thể giả định là E.Coli thì kiểm tra có sinh Indol hay không. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Đĩa petri - Dụng cụ chẩn bị mẫu - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 700 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 2.2.3. Hoá chất, môi trường: - Môi trường thạch lactose lục đỏ sáng mật bò. - Môi trường EMB - Môi trường Endo - Môi trường Istrati - Dung dịch Trypton ( pepton ) - Thuốc thử Indol -Tất cả các dụng cụ phải khử trùng trước khi tiến hành thí nghiệm. Môi trường đã đựoc pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng 2.2.4. Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng: Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. - Gieo cấy: Cấy 1 giọt mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa petri đã có chứa môi trường thạch Endo, mỗi độ pha loãng làm đĩa lặp lại. Tráng đều mẫu trên mặt thạch. - Nuôi ủ: Đưa đĩa đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 48 – 72h. Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim để tiến hành khẳng định đó là E.Coli. - Phép thử khẳng định: Kiểm tra hình thái: Nhuộm Gram,soi kính để các định Gram ( - ), trực khuẩn nhỏ dài. Từ ống cạnh trường cấy ria sang môi trườngEndo hoặc EMB đặt trong tủ ấm ở 370C trong 24h. Nếu phát hiện thấy những khuẩn lạc đỏ ánh kim chúng ta cấy tiếp sang môi trường thạch thường để thực hiện phản ứng IMVIC Phản ứng IMVIC: Phản ứng sing Indol: Dùng que cấy vòngchuyển dịchmẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường EC dương tính sang các ống nghiệm có chứa Trypton. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 440C trong 48h. Thêm 0,5 ml thuốc thử indol vào các ống nghiệm có chứa Ttrypton đã nuôi cấy, lắc đều và sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ. Phản ứng MR: Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch thường vào môi trường Clark Lubs. Nuôi ở tủ ấm 370C trong 48 – 96h. Sau đó hút 5ml môi trường đó cho vào một ống nghiệm khác để dùng cho phản ứng VP. Môi trường Clark Lubs còn lại cho 5 giọt metyl đỏ 0,2% vào. Phản ứng dương khi môi trường có màu đỏ ngay sau khi cho thuốc thử vào. Phản ứng VP: Phương pháp 1 : Cho 5ml dung dịch amonium sulfat đồng vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi có màu đỏ xuất hiện trong vòng 15 –20 phút sau khi cho thuốc thử vào. Phương pháp 2: Cho 3ml dung dịch napton 5% và 1ml dung dịch KOH 40% vào môi trường Clark Lubs ở phần trên. Quan sát phản ứng: phản ứng dương khi có màu đỏ xuất hiện trong vòng 15 – 20 phút sau khi cho thuốc thử vào. Phản ứng citrate: Cấy chuyền vi khuẩn nghi ngờ từ thạch thường vào môi trường Simonos Citrate. Nuôi ở tủ ấm 370C trong 24h. Phản ứng dương khi môi trường đổi sang màu xanh dương. 2.2.5. Kết quả: Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là E.Coli đã đếm được trên các đĩa, tỷ lệ số ống nghiệm thử Indol dương tính ( có màu đỏ ) và tổng số ống thử Indol để tính kết quả. Số lượng E.Coli có trong 1g mẫu được tính theo công thức: N = x R ( CFU/ml, CFU/g ) Trong đó: : tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1:số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ1 n2 : số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ2 f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm th ứ 1 V : thể tích mẫu cấy vào mỗi đ ĩa petri R: số ống thử Indol dương tính/tổng số ống thử 2.3. Xác định Staphylococus Aureus: 2.3.1. Nguyên tắc: Dựa vào tínhchất đặc biệt của Staphylococus Aureus là phát triển trên môi trường muối manitol cũng như trên môi trường Chapma tạo khuẩn lạc màu vàng hoặc trên môi trường Baird - Packer cho khuẩn lạc màu đen. Nếu sau khi nuôi cấy, không có khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch chọn lọc nói trên thì cũng chưa khẳng định là không có Staphylococus Aureus trong mẫu phân tích vì vi khuẩn này ở lượng rất nhỏ. Trong trường hợp này nên tăng lượng vi khuẩn này bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch Chapman chọn lọc. Như vậy ta có thể xác định được số lượng ít nhất của Staphylococus Aureus trong thể tích sản phẩm ban đầu. 2.3.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Đĩa petri - Tủ sấy - Pipet 2, 5, 10, 50ml - Tủ hấp - Tủ lạnh - Tủ ấm - Kéo, kẹp - Cồn 700 - Ống nghiệm - Cân kỷ thuật 2.3.3. Môi trường, hoá chất: - Môi trường Chapman lỏng ( cực mặn ) - Môi trường Chapman - Môi trường Baird - Packer - Môi trường đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm, tiệt trùng và đã được bảo quản trong tủ lạnh nếu chưa sử dụng ngay. 2.3.4. Tiến hành: - Chuẩn bị mẫu thử để tạo thành một thể đồng nhất và pha loãng mẫu nếu thấy cần thiết. Trong trường hợp dự đoán là lượng vi khuẩn Staphylococus Aureus ít thì có thể nuôi cấy tăng sinh như sau: lấy 1ml mẫu nguyên hay 1ml dịch huyền phù ( nếu mẫu ở dạng rắn cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Chapman lỏng và nuôi ở tủ ấm ở 370C trong 24h.Nếu nhìn thấy có sự phát triển của vi sinh vật thì tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo. - Cho 0,05ml hoặc 1 giọt mẫu đã pha loãng hay mẫu đã qua nuôi cấy tăng sinh và cấy lên trên bề mặt thạch Chapman hoặc Baird - Parker - Nuôi trong tủ ấm 370C trong 24 - 72h - Quan sát khuẩn lạc mọc trên đĩa. - Trên môi trường Chapman, đếm khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhỏ - Trên môi trường Baird- Parker đém những khuẩn lạc có màu đen bóng, có một mép viền màu trắng xám, xung quanh khuẩn lạc có một vùng sáng trong rộng Nếu kiểm tra các khuẩn lạc dưới kính hiển vi là vi khuẩn Gram ( + ), tạo thành từng chùm như các chùm nho thì nghi ngừ có thể là Staphylococus aureus và nên làm phản ứng sinh hoá coagulase để khẳng định Phép thử khẳng định: Phản ứng đông huyết tương: Đây là phẩn ứng rất quan trọg để xác định Staphylococus aureus. Cho vào ống nghiệm nhỏ 0,5ml huyết tương thỏ, dung que cấy còng chuyển vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập. Lắc nhẹ cho hai môi trường trộn đều, để ở 370C, tiếp tục kiểm tra mẫu sau mỗi 2h. Mọi sự ngưng kết tạo thành một thể đông trong ống nghiệm gọi là dương tính. Nếu sau 4h phản ứng vẫn âm tính cần để ở 370C trong 24h để phát hiện những chủng men glucose yếu. Tiếp tục nuôi cấy đến 24h thì ngưng nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Nếu thực hiện thêm 2 thí nghiệm khác để đối chứng như sau: Một ống đối chứng âm tính không có vi khuẩn mà chỉ cấy huyết tương thỏ với vài giọt nước cất tiệt trùng Một ống đối chứng đã cấy sẵn tụ cầu gây bệnh. 2.3.5. Kết quả: Căn cứ vào những đặc tính sau để kết luận mẫu có nhiễm Staphylococus aureus là: - Sắp xếp thành chùm nho điển hình - Lên men đường manitol - Đông huyết tương Công thức tính : N = ( CFU/ml, CFU/g ) Trong đó: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n: Số đĩa petri đã nuôi cấy f: Hệ số pha loãng của mẫu v : thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri. R: Số ống thử phản ứng coagulase dương tính/ tổng số ống thử 2.4. Xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S ( chủ yếu là vi khuẩn kị khí): 2.4.1. Nguyên tắc: Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật kị khí trong môi trường thạch có chứa natri sunfit và phèn sắt, sau đó đếm số lượng. 2.4.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Ống nghiệm, cân. - Pipet, bếp đun. 2.4.3.Môi trường, hoá chất: Môi trường thạch Wilson Blair Dung dịch Na2SO3 Dung dịch phèn sắt 5% ( FeSO4.7H2O) 2.4.4. Tiến hành: Pha loãng mẫu: Tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà pha loãng dung dịch mẫu thành các độ pha loãng khác nhau. Gieo cấy: Cho 1ml dung dịch mẫu vào ống chứa sẵn 2ml dung dịch natri sufit 20% và 5 giọt phèn sắt 5%. Sau đó đổ thạch Wilson Blair đã đun tan chảy và làm nguội đến 45 - 500C vào khoảng 2/3 ống nghiệm. Cho một giọt parafin lỏng trên mặt thạch ống nghiệm đã cấy mẫu. Đun cách thuỷ ở 750C trong 5 phút. Làm đông ngay bằng cách để vào tủ lạnh hoặc ngâm vào nước lạnh. Để ở 370C trong 24 - 48h, nếu môi trường đục được xem như là dương tính. Các khuẩn lạc Clostridium Welchi trên môi trường này có màu đen, tròn đều. 2.4.5. Kết quả: Tất cả các khuẩn lạc đen, to, nhỏ mọc trong ống nghiệm đều là vi khuẩn kị khí sinh H2S. 2.5. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sinh H2S: 2.5.1. Nguyên tắc: Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật hiếukhí trên môi trường pepton nới giấy chì axtêtat. 2.5.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Ống nghiệm, cân. - Pipet, bếp đun. - Môi trường pepton. - Giấy chì axêtat. 2.5.3. Tiến hành: Pha loãng mẫu: Tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn của sữa mà pha loãng dung dịch 1:10, 1:100 Gieo cấy: - Dùng haiống nước pepton có thêm 2ml Na2SO3 đặc: + 1 ống 10ml sữa chưa pha loãng. + 1 ống 1ml sữa chưa pha loãng. - Dùng hai ống nước pepton khác có thêm 2ml Na2SO3 25%: + 1ống cấy 10ml mẫu pha loãng 1:10. + 1 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 1:100. Trên mỗi ống đều treo một giấy chì axêtat. Chì axêtat có độc tính đối với vi khuẩn, vì vậy không nên để giấychạm vào dịch nuôi. - Để ở 370C trong tủ ấm 48 - 72 giờ. Nếu có vi khuẩn hiếu khí sinh H2S thì giấy tẩm chì axêtat có màu đen. 2.5.4. Kết quả: - Đối với mẫu trắng không xuất hiện khuẩn lạc, không bị đục, không tạo kết tủa, không sinh khí tạo bọt, không tạo màng là đạt yêu cầu. - Đối với mẫuphân tích: xuất hiện một trong các hiện tượng trên. Sau đó ta đếm số lượng ống nghiệm dương tính ở mỗi nồng độ. Sau đó tra bảng và tính ra kết quả. 2.6. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc: 2.6.1. Nguyên tắc: - Là phương pháp nuôi cấy chúng lên môi trường sau đó đếm số lượng và tính kết quả. 2.6.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Tủ sấy - Đĩa petri - Nồi hấp - Pipet 1, 10ml. - Tủ ấm - Bình tam giác 100, 250ml - Tủ lạnh - Kéo, kẹp - Cồn 700 - Ống nghiệm, giá đựng. - Cân kỷ thuật - Môi trường Sabourand. - DG 18 - DGBG Tất cả các dụng cụ phải được khử trùng trước khi đưa vào sử dụng. 2.6.3. Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng: Pha loãng mẫu cho đến khi có được dộ pha loãng cần thiết đủ đếm được khuẩn lạc trên hộp petri như dự định. - Gieo cấy: Lấy 7 hộp petri, cho vào ở mỗi hộp 1ml dung dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng thích hợp, thông thường cấy ở 2- 3 nồng độ liên tục. Hút 1ml dung dịch pha loãng đầu tiên cho vào hai hộp, 1ml dung dịh pha loãng tiếp theo vào hai hộp khác, 1ml dung dịch pha loãng tiếp theo cho vào hai hộp khác và cuối cùng là 1ml nước cất cho vào hộp (mẫu trắng). Rót môi trường thạch dinh dưỡng đã đun chảy và giữ ở nhiệt độ 45 - 500C vào trong đĩa petri, mỗi đĩa một ống nghiệm môi trường đã chuẩn bị sẵn, Trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa theo hai chiều. - Nuôi ủ: Đưa vào tủ ấm nuôi ủ ở nhiệt độ 24 ± 10C trong thời gian 3 - 5 ngày. 2.6.4. Kết quả: Đếm sốlượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa sau 3 ngày nuôi ủ. Số nấm mốc có trong 1ml sản phẩm được tính theo công thức X = ( CFU/ml) Trong đó: : tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai D: hệ số thập phân củặcp đĩa đếm được ở độ pha loãng thứ nhất Chương 5: CÁC NGUYÊN NHÂN GÂY SAI SỐ Sai số trong phương pháp lấy mẫu: Sai số trong quá trình lấy mẫu: Vị trí và số mẫu lấy không chính xác, mẫu không đại diện cho cả lô hàng. Không tuâm thủ quy trình lấy mẫu. Thời gian lấy mẫu quá dài. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ quá cao, đặt mẫu sau khi lấy không chính xác. Mẫu đem về không đem phân tích ngay mà phải chờ đợi. Dụng cụ lấy mẫu không được vệ sinh sạch sẽ và khô ráo trước khi lấy mẫu. Sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu: Nhiệt độ của mẫu thử không đạt yêu cầu (t0 = 20 50C là đạt yêu cầu). Khi tiến hành phân tích khối sữa không được làm đồng nhất. Sai số trong quá trình phân tích cảm quan: Sai số trong việc xác định tỷ trọng: - Cốc thuỷ tinh chứa sữa không khô, không sạch. - Người kiểm nghiệm viên không quan sát kỹ, không chú tâm vào công việc. - Quy trình đánh giá không chính xác. 2.2. Sai số trong quá trình xác định màu sắc: - Quan sát không kỹ, nơi tối, thiếu ánh sáng. - Cốc chứa sữa có màu tối, không khô, không sạch, có lẫn tạp chất. - Quy cách thực hiện không chính xác, sức khoẻ của người cảm quan không tốt.. 2.3. Sai số trong việc xác định mùi vị: - Cốc chứa sữa không sạch, có mùi vị lạ. - Tâm trạng của người kiểm nghiệm không tốt. Sai số trong quá trình phân tích hoá lý: Tỷ trọng kế bị hỏng. Khi kiểm tra tỷ trọng kế chạm vào thành ống đong. Đọc kết quả, tính toán không chính xác. Nhiệt độ của sữa lúc xác định không đạt yêu cầu. Khi đưa tỷ trọng kế vào ống đong trong lúc sữa trong ống đong đang có nhiều bọt. Dùng các pipet để hút mẫu và hoá chất không khô, không sạch. Hoá chất sử dụng trong quá trình xác định không tinh khiếy, có lẫn tạp chất. Qúa trình chuẩn độ không đúng (kết thúc phản ứng quá sớm hoặc quá muộn). Qúa trình hút mẫu và các hoá chất không đúng (bị sai số). Pha chế dung dịch Adam (trong xác định hàm lượng lipit) không đúng. Qúa trình vô cơ hoá mẫu không triệt để,lấy mẫu không chính xác. Thời igan cất đạm quá ngắn (trong xác định hàm lượng prôtêin). Qúa trình tạo kết tủa Cu2O (trong xác định hàm lượng đường lactoza) quá ngắn, phản ứng chưa xảy ra hoàn toàn. Qúa trình gạn lọc kết tủa không chính xác, lượng kết tủa còn sót lại trong bình tam giác nhiều. Hoà tan kết tủa không hết. Đọc kết quả và tính toán không đúng. Sai số trong quá trình phân tích vi sinh: Quá trình chuẩn bị môi trường không đúng, môi trường bị ô nhiễm vi sinh vật, hàm lượng các chất trong môi trường không đạt yêu cầu. Các hoá chất sử dụng để tạo môi trường có độ tinh khiết thấp. Qúa trình thao tác sai, khi thực hiện cấy không đảm bảo độ vô trùng và các cấy và lấy mẫu không đúng. Pha loãng mẫu không đạt yêu cầu, thời gian nuôi cấy ngắn hoặc quá dài, nhiệt độ nuôi cấy không đạt yêu cầu. Đếm số lượng và tính toán kết quả sai. TÀI LIỆU THAM KHẢO