Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kĩ thuật pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 Sinh viên thực hiện NGUYỄN ANH KHOA Niên khóa: 2002 - 2006 Giáo viên hƣớng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology HCMC, 9/2006 Professor BUI CACH TUYEN Student NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.  TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài.  ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây.  Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa iv TÓM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn. Kết quả đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA. - Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm mô mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx. - Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR. v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”. Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively. The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV. - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm. - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process. - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR. vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii TÓM TẮT .......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP ................................................................ x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................xi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu ...................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ................................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................ 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ....................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại .................................................................................................... 3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 3 2.1.4. Nhân giống ................................................................................................ 4 2.1.5. Sản lƣợng ................................................................................................... 4 2.1.6. Chế biến và sử dụng .................................................................................. 5 2.2. Bệnh trên cây mía ............................................................................................. 5 2.3. Bệnh khảm lá mía ............................................................................................. 7 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 7 2.3.2. Triệu chứng................................................................................................ 7 2.3.3. Tác nhân gây bệnh ..................................................................................... 8 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía..................................................... 9 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh ............................................................. 9 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế ............................................................................. 9 2.3.7. Phòng trừ ................................................................................................. 10 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía ........................................ 10 vii 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh ...................................................... 10 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi ...................................... 10 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) .............. 10 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................... 12 2.4. Bệnh cằn mía gốc ............................................................................................ 14 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................. 14 2.4.2. Triệu chứng.............................................................................................. 14 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài ..................................................................... 14 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây ............................................................... 15 2.4.3. Tác nhân gây bệnh ................................................................................... 16 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh .......................................................... 16 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế ........................................................................... 17 2.4.6. Kiểm soát bệnh ........................................................................................ 17 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía ................. 17 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi ....................... 17 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học .......................................................... 17 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) ............... 19 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ........... 19 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc ................. 19 2.5.1. Trên thế giới ............................................................................................ 19 2.5.2. Trong nƣớc .............................................................................................. 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 22 3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 22 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 22 3.3. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 22 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu ....................................................................... 22 3.3.2. Virus gây bệnh......................................................................................... 22 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh ................................................................................... 22 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm ................................................................................ 23 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 23 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ................................................................................... 23 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu ................................................................. 23 viii 3.4.2. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA ............................ 24 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm ............................. 24 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA .......................... 26 3.4.3. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng .................. 27 3.4.4. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng pháp nhuộm STM .................................................................................... 27 3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx ................ 28 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx .............................................. 29 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 31 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA ......................................... 31 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR ......................... 32 4.2.1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng. Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. ............................................................................................ 32 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy ....................... 36 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx .................................................................... 37 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 41 5.2. Đề nghị ............................................................................................................ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 43 PHỤ LỤC ................................................................................................................... xii ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. ........................ 6 Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt ..................... 30 Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi ........................................................................ 34 Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. .. 35 Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. .......................................................... 36 Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp ..................................... 11 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR ................................................. 13 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra .......................................................................................... 24 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA ........................................................ 25 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA .......................................................... 25 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cây mía ..................................................................................................... 3 Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía ............................................................... 6 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía ................................................................ 7 Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus ............................................................................ 8 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA ......................................... 12 Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. ............................................. 15 Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002). ..................................................... 16 Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. ..... 32 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) ........................ 34 Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). ............................................................... 35 Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B). ...... 36 Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. ........................................................ xvi Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. .................................................................. xvi Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. ................................................ xvi Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát. ....................... xvi Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. ................................................................ xvi Hình PL6. Gốc mía bị cằn. ....................................................................................... xvi Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. ................................................ xvii Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. ................ xvii Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân. ....................................................................... xvii xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ELISA: enzym linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay. TTNCMĐ: Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng. RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid. ctv: Cộng tác viên. NCM: Màng nitrocellulose ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate. DEPC: Diethyl pyrocarbonate. dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate. p-NPP: p - nitrophenol phosphate. PVP: Polyvinylpyrrolidone. BSA: Bovine serum albumin. PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide. RNA: Ribonucleic acid. bp: Base pair. EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid. mRNA: Messenger RNA. PCR: Polymerase chain reaction. RNase: Ribonuclease. SCMV: Sugarcane Mosaic Virus. RSD: Ratoon stunting disease. Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli. STM: Stainning transpiration. TTPT: Trung tâm phân tích. Taq: Thermus aquaticus. 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhƣng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ƣớc, 1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hƣởng đến năng suất mía hiện nay có rất nhiều, trong đó phải kể đến bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc. Bệnh khảm lá mía do virus Sugarcane Mosaic gây ra là bệnh rất phổ biến và có ảnh hƣởng lớn đến ngành sản xuất mía đƣờng của nhiều nƣớc trên thế giới. Thiệt hại nghiêm trọng về năng suất đã đƣợc ghi nhận tại các vùng trồng mía lớn thuộc châu Mỹ, châu Úc; mức thiệt hại có thể lên đến 50% đối với các giống mẫn cảm (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Bệnh thƣờng gây hại ở các vùng ôn đới và ít hơn tại các vùng nhiệt đới. Cụ thể theo kết quả điều tra của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987), bệnh khảm lá mía đã xuất hiện nhƣng rải rác, thiệt hại gây ra chƣa ở mức đáng quan tâm. Chính vì vậy mà hiện nay ở nƣớc ta bệnh khảm lá mía chƣa đƣợc quan tâm đúng mức trên cả phƣơng diện thống kê giống – vùng bị bệnh và các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh hiệu quả. Do vậy việc điều tra phát hiện bệnh khảm lá trên các giống mía nhập nội và sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng nhằm thống kê lại tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống khảo sát, kiểm định giống mới nhập nhằm nâng cao hiệu quả chọn lọc giống và kiểm soát bệnh. Bệnh cằn mía gốc (RSD) gây ra bởi vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) đây là một loại vi khuẩn gram dƣơng nhỏ chỉ gây bệnh trên mía. Bệnh có thể gây tổn thất lên đến 50% tổng sản lƣợng mía thu đƣợc (Davis, 1980). Việc chẩn đoán phát hiện Lxx rất khó vì nó ít gây ra các triệu chứng lâm sàng đặc trƣng có thể phát hiện đƣợc trên đồng ruộng. Nhìn chung cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng 2 độ tuổi. Do vậy ngƣời sản xuất thƣờng lầm tƣởng hay lẫn lộn nguyên nhân của sự chậm lớn trên là do vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị thiếu chất. Các phƣơng pháp phát hiện Lxx nhƣ là nhìn dƣới kính hiển vi, phát hiện bằng phƣơng pháp miễn dịch học,.v.v. cũng đƣợc phát triển nhƣng độ chính xác và độ nhạy chƣa cao. Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ cho công tác chọn giống, kiểm định giống từ đó đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm soát và quản lí bệnh có hiệu quả. Trƣớc tình hình trên, đƣợc sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện trên một số giống mía nhập nội và sản xuất tại tỉnh Bình Dƣơng (Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng) và Đồng Nai (Nông trƣờng Thọ Vực)”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. - Kiểm định các giống mía mới nhập nội năm 2005. - Phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM (Stainning transpiration). - Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx. - Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía bằng kỹ thuật PCR. 1.3. Giới hạn đề tài - Thời gian thực hiện đề tài có hạn vì vậy không thể tiến hành điều tra khảo sát và theo dõi diễn biến bệnh trên các giai đoạn tăng trƣởng đƣợc. - Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Lxx cần thời gian dài vì đây là loại vi khuẩn khó nuôi cấy trên môi trƣờng. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây mía 2.1.1. Lịch sử phát hiện Cây mía (Saccharum spp.) đã đƣợc biết từ rất lâu (cách nay khoảng 2200 năm), khi quân đội của Alexander chinh phục Ấn Độ vào năm 326 trƣớc Công Nguyên họ đã thấy đƣợc cây mía (Hình 2.1). Cây mía đến Persia vào thế kỉ thứ 6 và ngƣời Ả Rập đã mang cây mía đến Ai Cập vào năm 641 sau Công Nguyên trong quá trình chinh phục các miền đất của họ. Cây mía cũng đƣợc mở rộng phân bố bằng cách này đến Syria, Cyprus, Crete, và đến Tây Ban Nha vào khoảng những năm 714 sau công nguyên. Vào những năm 1150 ngành công nghiệp mía đƣờng ở Tây Ban Nha rất phát triển với khoảng 30000 ha mía đƣợc trồng. Vào khoảng năm 1420 ngƣời Bồ Đào Nha đã đƣa cây mía đến Madeira nơi mà chúng ngay lập tức lan rộng sang các quần đảo Canary, Azores. Nhà máy xử lí mía hoạt động đầu tiên vào năm 1516 ở nƣớc cộng hòa Dominica. Sản phẩm đƣờng đƣợc đƣa đến Cuba, Jamaica, Puerto Rico vào những năm cuối của thế kỷ 15. 2.1.2. Phân loại Cây mía thuộc họ Gramineae, giống Saccharum (S) là hỗn hợp của sáu loài cỏ lƣu năm thuộc giống Saccharum L., trong đó có hai loài hoang dại (S. spontaneum L. và S. robustum Brvaes & Jeswiet ex Grassl) và 4 loài cây trồng ở vƣờn (S. officinarum L., S. barberi Jeswiet, S. sinense Roxb., và S. edule Hassk . Bốn loài cây trồng ở vƣờn có sự lai giống phức tạp và luôn có thể giao phấn chéo với nhau. Tất cả các loại giống mía thƣơng mại đƣợc trồng hiện nay đều là các giống lai giữa các loài này với nhau. 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố Cây mía đƣợc cho là có nguồn gốc từ vùng nam Thái Bình Dƣơng.  S. spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đông và nam Châu Phi, từ suốt vùng trung đông đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia, và từ suốt vùng Thái Bình Dƣơng đến New Guinea. Hình 2.1. Cây mía (Nguồn: Philipe Rott, 2000) 4  Trung tâm xuất xứ của cây mía có thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện giống S. robustum có số lƣợng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sông ở New Guinea và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này.  S. officinarum còn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở New Guinea. Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất đai và khí hậu thuận lợi.  S. barberi có thể có nguồn gốc ở Ấn Độ.  S. sinense có xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung Quốc và Triều Tiên.  S. edule là loại không thể sản xuất mùa màng nhƣ S. robustum và chỉ tìm thấy đƣợc ở New Guinea và các đảo kế cận. Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới. Vĩ độ cao nhất mà cây mía đƣợc trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), và khoảng 34 độ N phía tây nam Pakistan, và 37 độ N ở nam Tây Ban Nha. 2.1.4. Nhân giống Để nhân giống mía ngƣời ta thƣờng trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chƣa trƣởng thành có thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi. Những đoạn thân này đƣợc gọi là "setts", "seed", "seed - cane" hay "seed - pieces". “Sett” đƣợc cho là tốt nhất nếu đƣợc lấy từ đốt thứ ba từ dƣới lên của cây mía vì chồi ở đốt này còn non và ít bị khô. “Sett” có thể đƣợc trồng xiên theo một góc 45OC hay cũng có thể đặt nằm ngang luôn lên trên luống. Ƣớc tính cần 12.500 - 20.000 “sett” để trồng hết 1 hecta. Mía là cây trồng quanh năm với thời gian từ 3 - 6 năm trƣớc khi đƣợc đốn bỏ và trồng lại. Vụ đầu tiên đƣợc gọi là mía tơ và thƣờng mất khoảng 9 - 24 tháng để cây trƣởng thành, nó phụ thuộc vào vùng địa lý. Các vụ mía gốc mất khoảng 1 năm để trƣởng thành và thƣờng thì sau khoảng hai vụ mía gốc là ngƣời ta đã thay bằng các ruộng mía mới, điều này phụ thuộc vào năng suất và sự chậm suy tàn của giống. 2.1.5. Sản lƣợng Năng suất cao nhất của mía về chỉ số calories trên đơn vị diện tích là 10 tấn đƣờng (sucrose) trên hecta ở Barbardos. Sản lƣợng cao nhất đạt đƣợc ở Hawaii là 22 tấn sucrose trên hecta, nhƣng giống mía này cần đến 2 năm hay hơn mới có thể đạt đƣợc trạng thái thành thục ở khu vực này. Sản lƣợng mía đã đƣợc cải thiện và gia tăng đáng 5 kể trong suốt 100 năm qua nhờ quá trình cải tiến giống, đặc biệt là nhờ vào việc sử dụng phân bón, kiểm soát đƣợc côn trùng và các loại bệnh, cơ giới hóa đồng ruộng và nhà máy, và việc tạo ra nhiều giống mới cho năng suất cao. 2.1.6. Chế biến và sử dụng Trƣớc khi sản phẩm đƣờng đƣợc làm ra lần đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1000 năm trƣớc công nguyên, nhờ vào việc đun sôi dịch chiết nƣớc mía thì cây mía ban đầu đƣợc trồng chỉ nhằm mục đích làm thực phẩm mà thôi. Ngày nay cây mía đƣợc nhiều ngành công nghiệp sử dụng và là một trong những sản phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi và có giá trị của mỗi quốc gia. - Khoảng 1 tấn đƣờng thô có thể thu đƣợc khi chế biến 8 - 9 tấn mía. Loại đƣờng thô màu nâu này có thể đƣợc tinh chế thành đƣờng trắng sạch hơn. - Cây mía đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ không riêng gì việc sản xuất ra đƣờng:  Mật đƣờng là sản phẩm phụ trong quá trình chế biến đƣờng, nó là chất lắng xuống khi không còn khả năng kết tinh thành đƣờng. Gần 2,7% mật đƣờng hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía. Mật đƣờng đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau: dùng để làm phân bón cho đất trồng mía, đƣợc vô trùng và lên men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau nhƣ cồn vô trùng, rƣợu rum, hay ethyl alcohol.  Sản phẩm còn lại sau quá trình ép nƣớc mía đó là bã mía đƣợc dùng nhƣ là nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đƣờng, nó còn đƣờc dùng để làm giấy, bìa cứng, bảng và tƣờng bằng giấy ép cứng. 2.2. Bệnh trên cây mía Theo thống kê ở các nƣớc trồng mía hiện nay thì có tất cả 126 bệnh hại mía trên thế giới (Philippe Rott, 2000), trong đó có 73 bệnh hại phổ biến. Bệnh hại đƣợc gây ra bởi 8 nhóm tác nhân chính cho ở Bảng 1.1. Trong đó bệnh do virus là loại bệnh khó kiểm soát nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng nhƣ bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic), bệnh vàng gân lá (Yellow leaf syndrome), bệnh Fiji (Fiji disease),.v.v. Bệnh do nấm gây ra có số lƣợng nhiều nhất cũng nhƣ là gây thiệt hại nhiều nhất nhƣ bệnh đốm vòng (Ring spot), bệnh mốc sƣơng (Downy mildew), bệnh than (Smut). 6 Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh đang xảy ra trên cây mía (Haø Ñình Tuaán, 2004). Nhóm tác nhân gây bệnh Số lƣợng bệnh gây ra 1. Bệnh do virus 9 2. Bệnh do phytoplasma 2 3. Bệnh do vi khuẩn 9 4. Bệnh do nấm 68 5. Tuyến trùng và chƣa rõ tác nhân 24 6. Thực vật bán ký sinh 3 7. Dinh dƣỡng, môi trƣờng 9 8. Hình hƣởng của thuốc trừ cỏ 2 Tổng cộng 126 Vi khuẩn gây ra 4 loại bệnh nghiêm trọng là bệnh gôm (Gumming), bệnh cháy lá (Leaf scald), bệnh cằn mía gốc (Ratoon strunting disease) và bệnh sọc đỏ (Red stripe). Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên mía cây mía (Philippe Rott, 2000) Chú thích: A: Bệnh khảm lá mía; B: Bệnh vàng gân lá (YLSD); C: Bệnh thối đỏ; D: Bệnh than (Smut); E: Bệnh gôm (Gumming disease); F: Bệnh cằn mía gốc. 7 2.3. Bệnh khảm lá mía 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố Bệnh khảm đƣợc công nhận đầu tiên vào năm 1892, đƣợc xem nhƣ là một đặc tính bất thƣờng trên mía bởi Musschenbrock ở Java. Ông đã đặt tên cho nó là bệnh đốm sọc vàng “gelestrepenziekte”. Nguồn gốc của bệnh khảm trên mía thì không đƣợc biết rõ, nhƣng qua các lần quan sát, theo dõi thì Brandes đã kết luận rằng kí chủ là virus có cùng một điểm phát sinh. Nên theo ông virus này phải xuất phát từ New Guinea, nơi mà mía là một loài địa phƣơng. Ngƣời ta phỏng đoán rằng bệnh có từ thời kì tiền sử và lan đến các vùng khác cùng với sự di chuyển của cây mía từ New Guinea. 2.3.2. Triệu chứng Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), triệu chứng đặc trƣng của bệnh là các vết khảm xanh nhợt hoặc vàng trên lá. Vết bệnh sau đó sẽ chuyển thành vết chết hoại, hiện tƣợng này đôi khi còn thấy trên thân. Sự biểu hiện triệu chứng còn phụ thuộc vào chủng virus, cây kí chủ và điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ. Bênh khảm virus đƣợc xác định chủ yếu trên lá, mức độ khác nhau tùy vào dòng mía, điều kiện sinh trƣởng, nhiệt độ và chủng virus có liên quan. Triệu chứng thông thƣờng là vết đốm đặc trƣng màu xạnh nhạt mờ ảo, tƣơng phản trên phiến lá, hoặc những vùng màu xanh nhạt hay biến vàng là kết quả phân bố của các mức độ hàm lƣợng diệp lục tố khác nhau (Hình 2.3). A B C Hình 2.3. Triệu chứng của bệnh khảm lá mía. (Bailey, 1998) Chú thích: A: Cây còi cọc và vàng lá; B: Vết khảm màu xanh nhợt trên lá; C: Vết khảm vàng trên lá non. 8 Những vùng biến vàng thông thƣờng thấy rõ nhất ở lá non, lá đang sinh trƣởng mạnh. Sự phân bố của những vùng biến vàng cũng khác nhau, đôi khi chỉ xuất hiện những vết sọc rất nhạt trên mặt lá, nhƣng phổ biến hơn là các vùng biến vàng chiếm phần lớn trên nền lá màu xanh bình thƣờng, và phân bố đều hơn trên mặt lá. Bệnh đôi khi gây những vùng hoại tử kéo dài bên trong mô tế bào thân. Ở phần mắt lóng của thân nhiễm bệnh có màu hồng đến hơi nâu. Sau khi cây bị nhiễm bệnh, virus có thể lan đến toàn bộ các bộ phận của cây, nhƣng triệu chứng khảm chỉ xuất hiện trên lá non, đang phát triển, và không xuất hiện ở chổ khác đã phát triển đầy đủ trƣớc đó. Ở lá bị bệnh, tế bào của vùng biến vàng có thể bị kìm hãm nên tại đó sự sinh trƣởng giảm, có ít hoặc không có sự khác biệt về cấu trúc mô về tế bào so với lá bình thƣờng. Lục lạp ở những vùng biến vàng thì nhỏ, ít về số lƣợng và phần lá biến vàng mỏng hơn so với vùng màu xanh của lá bình thƣờng. 2.3.3. Tác nhân gây bệnh Sugarcane mosaic virus là tác nhân gây ra bệnh khảm lá mía, thuộc nhóm Potyvirus. Những nghiên cứu về điện di cho thấy virus SCMV có hình sợi, kích thƣớc 750 x 13nm, acid nucleic của virus là dạng sợi đơn RNA, RNA có hệ số kết tủa là 34 - 38,9 S. Trọng lƣợng phân tử là 2,7 - 3,1 x 106 daltons, trong đó gồm 33,5% A, 20,3% G, 16,2% C và 30% U. Á đơn vị protein của SCMV có trọng lƣợng phân tử là 28.500 - 36.500 daltons và có 264 - 273 gốc amino acid. Thể vùi của virus trong tế bào cây có dạng hình trụ. Ngƣỡng pha loãng là 10-2 - 10-5. Những phân tử virus đƣợc sắp xếp ngẫu nhiên trong tế bào chất, trong khi những siêu thể vùi với lớp màng mỏng xuất hiện giữa chất nguyên sinh và thành tế bào. Nhiều đặc tính của virus SCMV cũng đƣợc nghiên cứu. Hệ số lắng đọng là 176 ± 5S và mật độ lơ lửng là 1,3327 của SCMV-D, và giá trị 148 ± 2 – 170 ± 5S tƣơng ứng với 1,285 – 1,3421 của SCMV –J. Hình 2.4. SCMV dƣới kính hiển vi điện tử (x 30.000 lần) (Nguồn: www. Plantpathology) 9 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía Có nhiều chủng virus khác nhau, khác biệt trong khả năng gây nhiễm và mức độ thiệt hại do chúng gây ra. Những chủng virus khác nhau thƣờng tạo ra những triệu chứng tƣơng tự nhau trên hầu hết các dòng mía thƣơng mại hiện nay. Tuy nhiên chúng cũng có thể đƣợc phân biệt bằng các dòng chỉ thị chọn lọc. Theo Koike và Gillaspie (1989) thì có tổng cộng 14 chủng virus SCMV gây bệnh khảm lá phân bố khắp thế giới là A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N. 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh Virus khảm lá mía lan truyền qua nhiều loại rệp muội theo phƣơng thức nửa bền vững. Rệp ngô Rhapalosiphum maidis Fitch, rệp bông Aphis gossipii, rệp đào Myzus persicae, rệp mía Melanaphis sacchari … là môi giới chủ yếu truyền bệnh. Ngoài ra bệnh còn có thể truyền qua con đƣờng nhân giống vô tính. Virus gây bệnh cũng có thể truyền qua hạt ngô. Cây mía mẫn cảm với bệnh ở giai đoạn cây con. Sự phát triển của bệnh trên đồng ruộng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: sức chống chịu của giống mía, sự có mặt của các chủng virus gây bệnh và sự tồn tại của quần thể rệp trên đồng ruộng. Điều kiện canh tác cũng ảnh hƣởng đến sự mẫn cảm của cây và hoạt động của rệp. Virus có phạm vi kí chủ rộng, gây hại trên một số loại cây trồng nhƣ ngô, cao lƣơng và nhiều loại cỏ khác. 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế Trong suốt thời kì từ năm 1928 - 1930, khi bệnh khảm lan rộng nhanh chóng ở Tây Hamiphere, thì việc năng suất giảm 30 - 40% là phổ biến, đôi khi lên đến 60 - 80%. Bệnh khảm thƣờng xuyên kéo dài là yếu tố gây ra sự giảm toàn bộ năng suất, không kể có hay không các yếu tố khác có liên quan đến (Koike và Gillaspie, 1989). Sự mất mát về kinh tế phụ thuộc vào tính mẫn cảm với bệnh của các dòng mía, chủng virus gây bệnh, sự tƣơng tác với các bệnh khác, quần thể môi giới, thời tiết và điều kiện môi trƣờng canh tác. Sự kết hợp của bệnh khảm và các bệnh khác làm giảm sự sinh trƣởng của cây cao hơn khi bệnh tác động riêng rẻ. Ngƣời ta đã theo dõi và nhận thấy rằng có sự giảm sút lớn về năng suất khi bệnh khảm và bệnh cằn gốc mía cùng xuất hiện trên các giống CP44-101, CP52-68 và NCo hơn từng bệnh riêng lẻ (Koike và Gillaspie, 1989). 10 2.3.7. Phòng trừ Sử dụng giống kháng, chọn nguồn giống khỏe, sạch bệnh làm vật liệu trồng. Tiêu diệt cây bệnh và cỏ dại, hạn chế bệnh lây lan, ẩn náu trên đồng ruộng. Luân canh với cây trồng khác họ. Xử lí hom giống bằng nhiệt độ hoặc thuốc hóa học. Nuôi cấy mô phân sinh ngọn hoặc nuôi cấy mô kết hợp với xử lí nhiệt. Tránh trồng và đốn mía vào thời kỳ có mật độ cao của quần thể môi giới. 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh nhất nhƣng hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả cũng cao nhất. Đơn giản vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh không phát ra ngoài. Một số trƣờng hợp khác nhƣ vết bệnh không rõ ràng, bệnh trong giai đoạn tiềm ẩn cũng gây khó khăn trong chẩn đoán. 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chiết từ lá cây bệnh hoặc thông qua làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản. 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) Phƣơng pháp ELISA là phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym. Năm 1972 - 1973, ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virus. Đến năm 1977 Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus hại thực vật tại Scottlen. Đây là kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001). Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là: - Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). - Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). 11 - Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA - Triple antibody sandwich). Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện chẩn đoán SCMV. Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng. Quy trình các bƣớc thực hiện DAS ELISA đƣợc sơ đồ hóa nhƣ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng máy đọc ELISA. Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá trị OD của các giếng ở bƣớc sóng 405 nm. Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa Bổ sung kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả 12 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA. 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phƣơng pháp này do K. Mullis và ctv phát minh năm 1985 và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất, trở thành một công cụ cần thiết trong các thí nghiệm phân tử. Năm 1993, Henson và French đã đƣa kỹ thuật PCR vào việc chẩn đoán bệnh hại thực vật và phát triển đến nay. PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym chịu nhiệt (thƣờng dùng enzym “Taq” đƣợc chiết xuất từ vi khuẩn từ suối nƣớc nóng Thermus apquaticus), có 2 đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Đối với một số loại virus có cấu trúc acid nucleic là RNA nói chung và virus SCMV nói riêng thì bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase - RT) là cần thiết để tồng hợp nên complementary DNA (cDNA) trƣớc khi tiến hành phản ứng PCR. Phản RT - PCR gồm 2 quá trình: (Sơ đồ 2.2)  Quá trình reverse transcriptase (RT) 13 Để chuyển RNA thành DNA, phản ứng này dựa trên khả năng của enzyme phiên mã ngƣợc, một polymerase RNA phụ thuộc DNA để tạo ra một sợi DNA bổ sung (first-strand cDNA) sử dụng mRNA nhƣ một khuôn mẫu.  Quá trình PCR Để khuyếch đại cDNA vừa tạo thành ở quá trình Reverse Transcriptase Complementary DNA đƣợc xem nhƣ DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Khởi đầu quá tình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ từ 6 - 30 nucletides). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và đƣợc enzym DNA- polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù. Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR (Trích dẫn Vương Hồ Vũ, 2005). Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA đƣợc tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn cặp nucleotid. 14 Nhƣ vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới đƣợc tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại đƣợc nâng nhiệt độ thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới đƣợc tổng hợp, các sợi này sau đó đƣợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ (thƣờng từ 25-35 chu kỳ), tính theo lý thuyết ta có: 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA định trƣớc đƣợc nhân lên với một số lƣợng rất lớn. 2.4. Bệnh cằn mía gốc 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố Bệnh cằn mía gốc hiện nay đƣợc xếp vào loại bệnh có tầm quan trọng kinh tế lớn trên thế giới (Davis và Bailey, 2000). Nguyên nhân là do sự phân bố rộng khắp của nó trên thế giới, sự thiếu các triệu chứng có thể nhận diện đƣợc ở cây kí chủ, thiếu các đặc tính của tác nhân gây bệnh, sự nghiên cứu về bệnh, và những chiến lƣợc cần thiết để kiểm soát bệnh có hiệu quả. Do vậy bệnh cằn mía gốc hiện đang là một trong những bệnh đang gây hậu quả nghiêm trọng cho các vùng trồng mía trên thế giới. Bệnh cằn mía gốc đƣợc phát hiện đầu tiên ở Queensland trong thời gian từ năm 1944 - 1945, lúc này trên giống mía Q28 đang trồng ngƣời ta phát hiện ra có hiện tƣợng bị hủy hoại bất thƣờng. Sau đó ngƣời ta phát hiện ra rằng RSD đã phân bố khắp vùng Queensland, và có mặt ở hầu hết các vùng trồng mía trên thế giới. 2.4.2. Triệu chứng 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài Hầu nhƣ không có triệu chứng bên ngoài có thể nhận ra đƣợc từ cây mía bị bệnh ngoại trừ sự cằn cọc và phát triển kém của cây. Tuy nhiên những đặc điểm trên đều có thể thấy đƣợc ở những vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị thiếu dinh dƣỡng. Về sự phát triển của chồi thì cây bị bệnh phát triển chậm hơn cây sạch bệnh đặc biệt là trong mùa khô khi mà các gốc mía dƣờng nhƣ không phát triển trong vài tuần hay cả khi cả tháng. Những gốc mía này thƣờng rất khỏe và không có sự bất thƣờng nào ở hệ thống rễ cũng nhƣ ở thân hay chồi ở dƣới đất. Sự cằn cỗi biểu hiện không đồng nhất giữa các chồi nhiễm bệnh, và ruộng nhiễm bệnh biểu hiện cả sự đi lên và đi xuống của sự phát triển, ngay cả khi tất cả các cây đều bị nhiễm bệnh. 15 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây Khi chẻ đôi thân cây bị nhiễm bệnh bằng một con dao sắc thì sẽ thấy ở phần dƣới các mắt mía có những chấm đổi màu hình dấu chấm hay dấu phẩy. Sự đổi màu thƣờng diễn ra từ đốt dƣới rồi mới lên đến các nốt bên trên, thƣờng định vị ở những vùng dƣới bẹ lá ngay tại vị trí của nơi xuất dịch cây. Trong vùng này là nơi phát sinh ra lá và các nhánh của các bó mạch. Sự đổi màu do RSD không diễn ra ở phẩn giữa đốt. Màu của mô nhiễm bệnh khác nhau về mức độ đậm nhạt và cƣờng độ phụ thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và các giống mía khác nhau, và nó cũng có thể khác nhau bên trong các giống. Một vài giống thì không biểu hiện các triệu chứng này. Các vùng bị biến đổi màu này rất đa dạng có thể là màu vàng, cam, hồng, đỏ, và hơi đỏ nâu và những màu này thƣờng nổi bật lên trên trên nền màu trắng sáng của mô tế bào. Có trƣờng hợp bệnh tạo ra những vết đổi màu kem, khó có thể phân biệt trong toàn bộ đốt khi so sánh với mô của cây khỏe mạnh. Nhƣng khi các vệt này xuất hiện tại một nốt mà nốt kế cận lại không biểu hiện thì vẫn không chắc là nó có bị bệnh cằn mía gốc hay không. Để chẩn đoán chính xác, thì các vệt đổi màu phải xuất hiện trên tất cả các nốt của cây. Triệu chứng của RSD trên chồi mía 1 - 2 tháng tuổi là sự chuyển hồng tại các đốt còn non, nhƣng nó diễn ra chỉ trong vài dòng mía và dƣới những điều kiện canh tác khác nhau. Sự đổi màu diễn ra và khuyếch tán từ nốt lên 1 - 2 cm đến đỉnh sinh trƣởng của nốt kết cận. Phần đầu của đỉnh sinh trƣởng không liên kết với RSD. Những triệu chứng ban đầu đƣợc thấy rõ nhất khi cắt các chồi non theo chiều dọc. A B C Hình 2.6. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Irvine, 1999). Chú thích: A: Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; B: Đốt thân ngắn; C: Vết đổi màu trong thân cây mía bị bệnh. 16 Các triệu chứng khác xảy ra trên cây mía bị bệnh cằn mía gốc là cây còi cọc, kém phát triển hơn so với các cây cùng độ tuổi, đốt thân ngắn đƣờng kính thân nhỏ hơn so với cây mía bình thƣờng (Hình 2.6). 2.4.3. Tác nhân gây bệnh Đẩu tiên ngƣời ta cho rằng tác nhân gây bệnh là virus. Tuy nhiên Davis (1980) đã chứng minh đƣợc bệnh là do vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli gây ra khi ông nuôi cấy thành công vi khuẩn này. Vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli có kích thƣớc 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm (đôi khi dài đến 10μm) và sinh sản theo cách thức nhân đôi. Hình dạng thẳng hay gậy mảnh, nhƣng một vài tế bào lại căn phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào. Mesosome thƣờng hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn. Gần đây vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli đƣợc phân loại trở lại sang một giống mới, là Leifsonia xyli subsp. xyli (Evtushenko, 2000) (Hình 2.7). Vi khuẩn Lxx vẫn giữ nguyên đƣợc khả năng xâm nhiễm và gây bệnh khi đã đƣợc lọc, ly tâm, qua quá trình đông lạnh và rã đông, ly tâm, điện di. Lxx có thể chữa trị đƣợc bằng cách đốt nóng và nó nhạy cảm với các dung môi hữu cơ và có ái lực ion cao đƣợc ứng dụng trong việc lọc và tinh sạch mẫu virus. Chữa trị bằng tetracycline không có hiệu quả đối với RSD, điều này có nghĩa là phytoplasma không có trong thành phần cấu tạo. Protein của Lxx điện di với gel polyacryamide giống với băng điện di của các chủng vi khuẩn nhƣ Corynebacterium michiganensis, và các tác nhân gây bệnh có chứa 2,4 - diaminobutyric acid. 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh Bệnh lây truyền giữa các ruộng mía thông qua các dụng cụ thu hoạch nhƣ dao, máy cắt mía,.v.v. do dịch chiết nƣớc mía từ cây bị bệnh vẫn còn dính trên dụng cụ khi chuyển sang ruộng khác thu hoạch. Bởi vì bệnh thƣờng khó nhận ra đƣợc bằng các triệu chứng bên ngoài nên các vi khuẩn này đã lan truyền từ vùng này sang vùng khác và từ quốc gia này sang các quốc gia khác thông qua các chƣơng trình trao đổi giống cây trồng. Hình 2.7. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002) 17 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế Hình hƣởng của RSD gây ra trên cây mia chủ yếu là làm giảm năng suất của cây, tác động này phụ thuộc vào yếu tố giống và điều kiện thời tiết. Năng suất giảm mạnh mẽ khi cây bị hạn hán và có thể giảm đáng kể trong điều kiện đƣợc tƣới tiêu hợp lí. Bệnh trầm trọng hơn khi mía bƣớc vào vụ mía gốc do đó bệnh làm giảm tốc độ phát triển của mía gốc và số vụ mía gốc của giống mía. Hàm lƣợng đƣờng thƣờng không bị ảnh hƣởng ngoại trừ khi cây bị chết. 2.4.6. Kiểm soát bệnh Giữ vệ sinh dụng cụ thu hoạch: trƣớc và sau mỗi lần thu hoạch chúng ta đều phải làm sạch các dụng cụ thu hoạch trƣớc khi cắt sang vƣờn cây sạch bệnh. Chúng ta có thể dùng cách đốt, hay sử dụng hóa chất không lây nhiễm. Làm sạch cây giống trƣớc khi trồng ta dùng phƣơng pháp ngâm chúng trong dòng nƣớc nóng ở 52OC trong vòng 4 tiếng là có thể loại Lxx ra khỏi vật liệu trồng. Dùng giống kháng với bệnh cằn mía gốc. 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc bằng cách đẩy khí từ đầu này sang đầu kia của một đoạn thân cây mía và xem trực tiếp dƣới kính hiển vi (không cần nhuộm). Kết quả dƣơng tính trong chẩn đoán phụ thuộc vào kinh nghiệm của ngƣời quan sát rất nhiều, nguyên nhân ở đây là rất khó để nhận ra vi khuẩn trong dịch chiết nƣớc mía, đặc biệt là khi nồng độ của chúng trong dịch chiết thấp. 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học  Nhuộm kháng thể huỳnh quang (flourescent antibody staining) Harris và Gillaspie (1978) là những ngƣời đầu tiên đƣa ra phƣơng pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (indirect flourescent antibody technique - FAT) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán RSD. Brlansky và ctv (1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). 18 Davis (1985) tăng độ nhạy của FAT lên 100 lần bằng kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF). Màng lọc đƣợc kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần.  Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu (Tissue Blot Enzym Immunoassay) Kỹ thuật T