Phát hiện một số gen độc lực của E.coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR

Download» Agriviet.com 1 Chöông 1 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Escherichia coli (E. coli) laø vi khuaån soáng coäng sinh chieám öu theá nhaát trong heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. Tuy nhieân, khi coù ñieàu kieän thích hôïp, moät soá nhoùm E. coli gaây ñoäc taêng sinh maïnh, trôû thaønh nguyeân nhaân quan troïng gaây tieâu chaûy treân ngöôøi vaø gia suùc, ñaëc bieät laø gia suùc non (tieâu chaûy treân beâ ngheù, tieâu chaûy phaân traéng ôû heo con theo meï, tieâu chaûy phuø thuûng treân heo cai söõa). E. coli ñöôïc thaûi qua phaân ra moâi tröôøng beân ngoaøi. Neáu qui trình veä sinh keùm thì E. coli deã vaáy nhieãm vaøo thòt töôi, ñaëc bieät laø trong quaù trình gieát moå. Töø ñoù neáu vieäc baûo quaûn vaø cheá bieán thöïc phaåm khoâng thích hôïp thì ngoä ñoäc thöïc phaåm do E. coli hoaøn toaøn coù theå xaûy ra. Trong soá caùc taùc nhaân gaây tieâu chaûy ôû ngöôøi thì E. coli luoân laø taùc nhaân phoå bieán nhaát ôû nhöõng nöôùc coâng nghieäp phaùt triển lẫn nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Do ñoù E. coli ñöôïc xem laø vi khuaån chæ danh oâ nhieãm thöïc phaåm vaø nöôùc ñöôïc ñaùnh giaù döïa treân soá löôïng cuûa chuùng. Döïa treân ñaëc ñieåm gaây beänh, E. coli ñöôïc chia thaønh nhieàu nhoùm. Moãi nhoùm ñeàu coù nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc nhau ñöôïc qui ñònh bôûi nhöõng gen ñoäc löïc. Moät soá gen ñoäc löïc quan troïng cuûa E. coli goàm: gen stx1, stx2, stx2e, hly cuûa nhoùm STEC (Shiga toxin-producing E. coli); gen eae cuûa nhoùm STEC vaø EPEC (Enteropathogenic E. coli); gen sta, stb, lt-I cuûa nhoùm ETEC (Enterotoxigenic E. coli )… E. coli laø vi khuaån bình thöôøng ôû ñöôøng ruoät vaø cuõng thöôøng coù maët trong thöïc phaåm neân vieäc phaân laäp ñöôïc vi khuaån E. coli trong phaân ñeå tìm nguyeân nhaân gaây beänh hay xaùc ñònh ñöôïc soá löôïng vi khuaån trong thöïc phaåm hoaøn toaøn khoâng phaûn aùnh ñöôïc khaû naêng gaây ñoäc cuûa chuùng. Do vaäy vieäc xaùc ñònh caùc gen Download» Agriviet.com 2 ñoäc löïc cuûa E. coli laø moät böôùc raát caàn thieát phuïc vuï cho vieäc ñaùnh giaù nguy cô gaây beänh treân vaät nuoâi vaø con ngöôøi. Caùc kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, ñaëc bieät laø kyõ thuaät PCR thöôøng ñöôïc aùp duïng ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc naøy. Cho ñeán nay, ôû Vieät Nam vieäc xaùc ñònh E. coli laø nguyeân nhaân gaây beänh thöôøng chæ thöïc hieän baèng kyõ thuaät phaân laäp vaø xaùc ñònh caùc ñaëc tính sinh hoùa, vaø theo Tieâu chuaån Vieät Nam, ñaùnh giaù tình traïng veä sinh thöïc phaåm hieän chæ döøng laïi ôû möùc ñoä xaùc ñònh soá löôïng vi khuaån, vieäc phaùt hieän nhöõng gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån chöa ñöôïc quan taâm. Hôn nöõa vieäc öùng duïng kyõ thuaät multiplex - PCR ñeå phaùt hieän ñoàng thôøi caùc yeáu toá ñoäc löïc cuûa E. coli chöa ñöôïc thöïc hieän ôû Vieät Nam. Vôùi muïc tieâu phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc maõ hoùa caùc protein gaây ñoäc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex – PCR, ñöôïc söï höôùng daãn cuûa Thaày Nguyeãn Ngoïc Tuaân, chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi: “Phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex - PCR”. Böôùc ñaàu aùp duïng kyõ thuaät naøy, chuùng toâi laàn löôït thöïc hieän khaûo saùt treân caùc nhoùm ñoái töôïng maãu phaân tieâu chaûy, phaân bình thöôøng, vaø thòt töôi. Ñeà taøi hy voïng trôû thaønh cô sôû ñeå aùp duïng kyõ thuaät multiplex – PCR trong vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån E. coli trong chaån ñoaùn beänh vaø ñaùnh giaù tình traïng veä sinh thöïc phaåm. Yeâu caàu: - E. coli ñöôïc phaân laäp ñònh löôïng theo qui trình cuûa FAO (1992) vaø phaân laäp ñònh tính baèng moâi tröôøng choïn loïc MacConkey ñoái vôùi maãu phaân hoaëc baèng moâi tröôøng taêng sinh choïn loïc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey vôùi khaùng sinh cefixime vaø tellurite potassium) ñoái vôùi maãu thòt. - Ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc; - Phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc (eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I) cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc baèng kyõ thuaät mutiplex - PCR. Download» Agriviet.com 3 Chöông 2 TOÅNG QUAN 2.1 Vi khuaån E. coli 2.1.1 Ñònh nghóa Vi khuaån Escherichia coli ñöôïc phaân laäp vaø moâ taû ñaàu tieân vaøo naêm 1885 bôûi nhaø nghieân cöùu ngöôøi Ñöùc Theodor Escherich. Theo heä thoáng phaân loaïi cuûa Bergey, vi khuaån E. coli thuoäc hoï Enterobacteriaceae, gioáng Escherichia. E. coli laø tröïc khuaån Gram aâm, di ñoäng, kích thöôùc khoaûng 2 – 3 x 0,5 μm, khoâng hình thaønh baøo töû vaø coù giaùp moâ. E. coli coù maët thöôøng xuyeân vaø chieám öu theá trong ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät maùu noùng, ôû phaàn cuoái cuûa ruoät non vaø ôû ruoät giaø. 2.1.2 Nuoâi caáy vaø ñaëc ñieåm sinh hoùa E. coli laø vi khuaån hieáu khí hoaëc yeám khí tuøy nghi. Nhieät ñoä thích hôïp laø 35 - 370C, pH thích hôïp 6,4 – 7,5 (toái öu nhaát laø 7,2 – 7,4). Trong moâi tröôøng loûng, sau 4 – 5 giôø E. coli laøm ñuïc nheï moâi tröôøng, caøng ñeå laâu caøng ñuïc, coù muøi hoâi thoái; sau vaøi ngaøy coù theå coù vaùng moûng treân maët moâi tröôøng. E. coli moïc toát treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng, sau 24 giôø hình thaønh nhöõng khuaån laïc daïng S maøu xaùm traéng, troøn, öôùt, beà maët boùng, kích thöôùc khoaûng 2 – 3 mm. Treân moâi tröôøng thaïch EMB: E. coli cho khuaån laïc tím aùnh kim. Treân moâi tröôøng thaïch MacConkey: E. coli cho khuaån laïc ñoû hoàng. Treân moâi tröôøng thaïch nghieâng TSI: E. coli taïo acid / acid (vaøng / vaøng). Download» Agriviet.com 4 Ñeå phaân bieät E. coli vaø caùc vi khuaån ñöôøng ruoät khaùc, ngöôøi ta duøng thöû nghieäm IMVC. E. coli cho keát quaû IMVC laø + + − − (biotype 1) hoaëc − + − − (biotype 2). 2.1.3 Yeáu toá khaùng nguyeân E. coli coù caáu truùc khaùng nguyeân raát phöùc taïp. Tröôùc kia, kyõ thuaät xaùc ñònh khaùng nguyeân beà maët laø phöông tieän chính ñeå phaân bieät caùc doøng E. coli gaây beänh. Naêm 1947, Kauffmann ñöa ra heä thoáng phaân nhoùm serotype maø vaãn coøn ñöôïc söû duïng ñeán ngaøy nay. Heä thoáng phaân nhoùm naøy döïa vaøo vieäc xaùc ñònh khaùng nguyeân beà maët O, H, K. * Khaùng nguyeân thaân O (somatic antigen): coù baûn chaát laø lipopolysaccharide cuûa maøng ngoaøi teá baøo, beàn vôùi nhieät vaø coàn. Khi ñun noùng ôû 1000C trong 2 giôø vaãn giöõ ñöôïc tính khaùng nguyeân. Khaùng nguyeân O coù theå ñöôïc phaùt hieän baèng phaûn öùng ngöng keát. Khaùng nguyeân O giöõ vai troø nhaát ñònh ñoái vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa doøng vi khuaån vaø coù tính chaát chuyeân bieät cho töøng loaøi vaät chuû. Khaùng nguyeân O taïo neàn taûng cho vieäc phaân loaïi serogroup cuûa E. coli. Coù hôn 170 serogroup khaùng nguyeân O. Trong moãi serogroup coù 1 hay nhieàu serotype ñöôïc phaân loaïi döïa vaøo khaùng nguyeân loâng H. * Khaùng nguyeân loâng H (flagellar antigen): coù baûn chaát laø protein, taïo neân khaû naêng di ñoäng cuûa E. coli, keùm chòu nhieät. Coù khoaûng 56 type khaùng nguyeân H. * Khaùng nguyeân giaùp moâ K (capsular antigen): Khaùng nguyeân K luùc ñaàu ñöôïc xaùc ñònh baèng phaûn öùng ngöng keát. Ngöôøi ta xaùc ñònh coù söï hieän dieän cuûa khaùng nguyeân K ôû vi khuaån neáu vi khuaån chæ ngöng keát vôùi khaùng huyeát thanh O khi bò ñun noùng. Döïa vaøo khaû naêng chòu nhieät ngöôøi ta chia khaùng nguyeân K thaønh 3 type laø A, L vaø B. Veà sau ngöôøi ta phaân loaïi khaùng nguyeân K döïa vaøo thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa chuùng vaø ñaõ coù hôn 80 type khaùng nguyeân K ñaõ ñöôïc xaùc ñònh. Moät vaøi E. coli, ñaëc bieät laø E. coli tieát ñoäc toá ruoät coù nhöõng loâng baùm khaùng mannose (mannose resistant - MR) cuõng ñöôïc duøng ñeå phaân loaïi veà maët Download» Agriviet.com 5 huyeát thanh hoïc. Moät vaøi loâng baùm khaùng mannose naøy (ví duï nhö K88 vaø K89) ñaõ töøng ñöôïc coi laø khaùng nguyeân K. Veà sau, khi xaùc ñònh ñöôïc thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa nhöõng loâng baùm naøy coù baûn chaát laø protein neân vieäc xeáp chuùng vaøo khaùng nguyeân K khoâng coøn phuø hôïp, chuùng ñöôïc xeáp vaøo nhoùm khaùng nguyeân tieâm mao F. * Khaùng nguyeân tieâm mao F (fimbrial antigen): Tieâm mao (fimbriae) daøi khoaûng 4μm, ñöôøng kính 2,1 – 7,0 nm, daïng thaúng hay xoaén. Tieâm mao khoâng tham gia vaøo söï di chuyeån, ngaén hôn vaø nhieàu hôn flagella. Tieâm mao giuùp vi khuaån keát dính vaøo teá baøo nieâm mao ruoät neân raát quan troïng trong khaû naêng gaây beänh cuûa vi khuaån. Hieän nay coù hôn 700 type khaùng nguyeân hay serotype cuûa E. coli töø söï toå hôïp cuûa caùc nhoùm khaùng nguyeân O, H, K, F. Tuy nhieân noùi chung, chæ nhöõng E. coli ngoaøi ñöôøng ruoät môùi khoâng coù capsul (Jann vaø Jann, 1992), do ñoù ñoái vôùi nhöõng E. coli gaây tieâu chaûy, thöôøng thì vieäc xaùc ñònh serotype chæ laø söï keát hôïp ñaëc hieäu giöõa khaùng nguyeân O vaø khaùng nguyeân H. 2.1.4 Phaân loaïi E. coli Maëc duø E. coli laø vi khuaån coäng sinh voâ haïi trong ñöôøng ruoät. Tuy nhieân trong moät ñieàu kieän thuaän lôïi, gioáng nhö haàu heát caùc taùc nhaân gaây beänh treân maøng nhaày, E. coli coù caùc yeáu toá caàn thieát ñeå gaây beänh goàm (1) cö truù treân maøng nhaày, (2) khaùng ñöôïc söï phoøng veä cuûa vaät chuû, (3) nhaân leân, vaø (4) gaây toån haïi vaät chuû. Ñaëc tính quan troïng nhaát cuûa doøng E. coli gaây tieâu chaûy laø khaû naêng cö truù treân maøng nhaày ruoät baát chaáp nhu ñoäng ruoät vaø söï caïnh tranh dinh döôõng cuûa heä vi sinh vaät bình thöôøng ôû ruoät (goàm caû nhöõng doøng E. coli khaùc). Söï hieän dieän cuûa nhöõng loâng baùm laø moät ñaëc ñieåm cuûa haàu heát caùc doøng E. coli, caû ôû nhöõng doøng E. coli khoâng gaây beänh (Nataro vaø Kaper, 1998). Tuy nhieân nhöõng doøng E. coli gaây tieâu chaûy coù nhöõng khaùng nguyeân loâng ñaëc hieäu giuùp E. coli coù theå baùm dính vaøo maøng nhaày ruoät non maëc duø ñaây khoâng phaûi laø vò trí cö truù bình thöôøng Download» Agriviet.com 6 cuûa E. coli (Levine vaø ctv, 1984). Moät khi söï cö truù ñaõ ñöôïc thieát laäp, vieäc gaây beänh cuûa caùc doøng E. coli gaây tieâu chaûy raát ña daïng. Döïa treân ñaëc ñieåm gaây beänh (goàm caùc ñaëc tính ñoäc löïc, söï taùc ñoäng khaùc nhau leân maøng nhaày ruoät, hoäi chöùng laâm saøng cuûa beänh vaø söï khaùc nhau veà maët dòch teã cuûa beänh), E. coli ñöôïc chia thaønh 5 nhoùm chính: - STEC (Shiga toxin-producing E. coli) hoaëc VTEC (Verotoxigenic E. coli) vaø EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) - EPEC (Enteropathogenic E. coli) - ETEC (Enterotoxigenic E. coli) - EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli) - EIEC (Enteroinvasive E. coli) Coù ba cô cheá chung veà khaû naêng gaây tieâu chaûy cuûa E. coli: (1) Saûn xuaát ñoäc toá (ETEC, EAEC, STEC) (2) Taán coâng / xaâm laán (EIEC) (3) Baùm dính, truyeàn tín hieäu qua maøng (EPEC vaø EHEC) Tuy nhieân, taùc ñoäng qua laïi giöõa cô theå vaät chuû vaø maøng nhaày ruoät thì ñaëc hieäu cho moãi loaïi (Nataro vaø Kaper, 1998). 2.1.5 Shiga toxigenic E. coli (STEC) 2.1.5.1 Thuaät ngöõ: Nhöõng höôùng khaùc nhau trong nghieân cöùu ñaõ ñöa ra nhöõng thuaät ngöõ khaùc nhau ñeå goïi teân cho nhoùm E. coli naøy. Teân goïi Verotoxigenic E. coli (VTEC) ñöôïc Konowalchuk vaø ctv (1977) ñaët cho nhoùm naøy khi phaùt hieän vieäc saûn xuaát ñoäc toá gaây ñoäc cho doøng teá baøo Vero. Teân goïi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) laø do doøng naøy gaây vieâm keát traøng xuaát huyeát (HC) vaø hoäi chöùng huyeát nieäu (HUS) (Nataro vaø Kaper, 1989). Vaø thuaät ngöõ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) (tröôùc ñaây goïi laø Shiga-like toxin- produccing E. coli - SLTEC) chæ roõ khaû naêng saûn sinh ñoäc toá gaây ñoäc teá baøo gioáng nhö ñoäc toá Shiga (Calderwood vaø ctv, 1996). Download» Agriviet.com 7 STEC vaø VTEC laø hai thuaät ngöõ töông ñöông nhau, vaø caû hai ñeàu chæ ra raèng nhoùm E. coli saûn sinh ra moät hay nhieàu loaïi ñoäc toá gaây ñoäc teá baøo. Maëc duø vaäy khoâng phaûi chæ caàn coù gen saûn sinh ñoäc toá laø coù theå gaây beänh neáu khoâng coù caùc yeáu toá ñoäc löïc khaùc. Nhöõng doøng E. coli mang gen sinh ñoäc toá cuõng hieän dieän trong ruoät gia suùc khoûe maïnh vôùi moät soá löôïng raát ít, nhöng nhöõng doøng naøy thieáu moät vaøi hay taát caû nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc cuûa STEC (Beutin vaø ctv, 1994). Do ñoù khoâng phaûi taát caû STEC ñeàu coù khaû naêng gaây beänh (Nataro vaø Kaper, 1998). 2.1.5.2 Shiga toxin vaø nhöõng yeáu toá ñoäc löïc lieân quan ñeán ñaëc tính gaây beänh cuûa STEC: STEC saûn xuaát ñoäc toá Shiga-like toxin (Slt), coøn goïi laø Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Hoï ñoäc toá Stx goàm hai nhoùm chính khoâng phaûn öùng cheùo vôùi nhau laø Stx1 vaø Stx2. Trong khi Stx1 coù tính baûo toàn cao thì Stx2 raát thay ñoåi veà trình töï, taïo ra nhieàu subtype nhö Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood vaø ctv, 1996), Stx2g (Leung vaø ctv, 2003). Moät doøng STEC coù theå saûn sinh Stx1, Stx2 hoaëc caû Stx1 vaø Stx2, vaø thaäm chí nhieàu daïng cuûa Stx2. Caû hai ñoäc toá Stx1 vaø Stx2 ñeàu ñöôïc caáu taïo töø 5 tieåu ñôn vò B 7,7 kDa vaø 1 tieåu ñôn vò A 32 kDa. Tieåu ñôn vò A goàm peptide A1 28 kDa vaø peptide A2 4 kDa noái vôùi nhau baèng caàu noái disulfur. Peptide A1 coù hoaït tính enzyme vaø peptide A2 coù nhieäm vuï gaén keát tieåu ñôn vò A vaøo nhöõng tieåu ñôn vò B. Nhöõng tieåu ñôn vò B giuùp ñoäc toá keát hôïp vôùi receptor ñaëc hieäu Gb3 (globotriaosylceramide) hieän dieän treân beà maët cuûa nhöõng teá baøo eukaryote (Stx2e coù receptor laø Gb4). Sau khi ñöôïc chuyeån vaøo beân trong teá baøo, tieåu ñôn vò A ñeán teá baøo chaát vaø taùc ñoäng leân tieåu phaàn 60S cuûa ribosome. Peptide A1 coù hoaït tính enzyme hoaït ñoäng nhö moät N-glycosidase caét moät goác adenin khoûi rRNA 28S cuûa ribosome, do ñoù gaây trôû ngaïi cho söï toång hôïp protein. Do khoâng toång hôïp ñöôïc protein, nhöõng teá baøo bò Stx taùc ñoäng (teá baøo noäi moâ cuûa thaän, teá baøo bieåu moâ ruoät, teá baøo Vero, teá baøo Hela hay baát cöù teá baøo naøo coù receptor laø Gb3, receptor Gb4 ñoái vôùi Stx2e) seõ cheát. Haäu quaû gaây ñoäc cho teá baøo ruoät do Stx vaø caùc yeáu toá Download» Agriviet.com 8 ñoäc löïc khaùc cuûa STEC laø gaây söï hö haïi nhöõng teá baøo nhung mao ruoät, gaây tieâu chaûy vaø vieâm keát traøng xuaát huyeát (Haemorrhagic colitis – HC). Söï hö haïi nhöõng teá baøo thaønh maïch maùu do Stx2e seõ gaây neân hieän töôïng phuø thuûng ôû heo. Nhöõng toån thöông ôû teá baøo noäi moâ thaän gaây neân hoäi chöùng huyeát nieäu (Haemolytic uraemic syndrome - HUS) ôû ngöôøi. Yeáu toá baùm dính cuûa STEC/EHEC ñaõ ñöôïc chöùng minh laø ñoùng vai troø quan troïng trong söï ñònh vò vi khuaån ôû ruoät. Ñoù chính laø intimin, moät protein maøng ngoaøi coù troïng löôïng phaân töû 94 – 97 kDa. Intimin ñöôïc maõ hoùa bôûi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin gaây toån thöông daïng baùm dính vaø phaù huûy (attaching-and-effacing, A/E) ôû ruoät giaø do vi khuaån baùm chaët vaøo teá baøo bieåu moâ (Donnerberg vaø ctv, 1993). Gen eae naøy cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû nhoùm EPEC. Gen eae gaây kieåu toån thöông A/E laø moät trong soá caùc gen naèm treân vuøng gaây beänh 35,5 kb (goïi laø vuøng gaây hö haïi teá baøo ruoät – locus of enterocyte effacement, LEE). Vuøng LEE cuûa STEC/EHEC chöùa nhöõng gen maõ hoùa cho intimin, maõ hoùa receptor cuûa intimin Tir (translocated intimin receptor) vaø moät soá gen khaùc. Vuøng LEE khoâng chæ laø ñieàu kieän caàn maø coøn laø ñieàu kieän ñuû cho vieäc hình thaønh toån thöông A/E. Tuy nhieân khoâng phaûi taát caû STEC ñeàu coù gen eae, nhöng taát caû EHEC ñeàu coù gen eae (Nataro vaø Kaper, 1998). Beänh tích A/E phuï thuoäc vaøo töông taùc giöõa protein maøng ngoaøi cuûa vi khuaån (intimin) vaø protein Tir. Protein Tir ñöôïc tieát ra khoûi vi khuaån, chuyeån vò vaøo maøng cuûa teá baøo vaät chuû (Paton vaø ctv, 1996). Yeáu toá khaùc coù lieân quan ñeán ñoäc löïc cuûa STEC laø vieäc taïo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) vaø coù theå caû ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1. EHEC-Hly ñöôïc maõ hoùa bôûi gen treân plasmid 60 MDa (pO157) maø plasmid naøy ñöôïc tìm thaáy ôû gaàn nhö taát caû caùc doøng O157:H7 vaø cuõng khaù phoå bieán caû nhöõng doøng STEC non-O157 nöõa (Nataro vaø Kaper, 1998). Treân plasmid Download» Agriviet.com 9 naøy coù söï hieän dieän cuûa moät operon goàm 4 khung ñoïc môû (open reading frame - ORF) laø hlyCABD. Trong ñoù hlyA laø gen caáu truùc khôûi ñaàu cho haemolysin. Ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1 (ñaàu tieân ñöôïc moâ taû ôû nhoùm EAEC laø EAEC heat-stable enterotoxin 1), cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu doøng STEC. Taàm quan troïng cuûa EAST1 ñoái vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa STEC vaãn chöa ñöôïc bieát, nhöng noù coù ôû moät vaøi tröôøng hôïp tieâu chaûy khoâng coù maùu maø thöôøng thaáy ôû nhöõng ngöôøi nhieãm STEC (Nataro vaø Kaper, 1998). Haàu heát caùc oå dòch cuûa STEC/EHEC laø do O157:H7, neân ngöôøi ta cho raèng coù theå serotype naøy ñoäc hôn vaø deã laây truyeàn hôn nhöõng serotype khaùc (Nataro vaø Kaper, 1998). Tuy nhieân cuõng coù nhieàu serotype khaùc ngoaøi O157:H7 coù lieân quan ñeán HC vaø HUS treân ngöôøi. Nhöõng serotype non-O157 phoå bieán nhaát lieân quan ñeán beänh treân ngöôøi thuoäc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989). Haàu heát tính chaát sinh hoùa cuûa E. coli O157:H7 ñeàu töông töï nhö nhöõng E. coli khaùc. Ñieåm khaùc bieät veà sinh hoùa cuûa doøng O157:H7 laø khoâng leân men ñöôøng sorbitol vaø β-glucuronidase döông tính. 93% chuûng E. coli thì leân men sorbitol trong 24 giôø, trong khi E. coli O157:H7 laïi khoâng. 93% chuûng E. coli cho β-glucuronidase döông tính trong khi E. coli O157:H7 thì khoâng. Ngoaøi ra trong moâi tröôøng TSB, O157:H7 phaùt trieån nhanh ôû 30 – 42oC, taêng tröôûng khoù khaên ôû 43 – 44oC vaø ngöøng taêng tröôûng ôû 45oC (daãn lieäu bôûi Traàn Thanh Phong, 1998). Lieàu gaây nhieãm cuûa E. coli O157:H7 laø raát nhoû, töø 10 – 100 vi khuaån (Griffin, 1994; Paton, 1996), nhöng cuõng may maén laø E. coli O157 hieän dieän trong phaân, thöïc phaåm vôùi taàn soá thaáp hôn nhieàu so vôùi nhoùm non-O157 (Paton, 1998). Ñaây cuõng laø trôû ngaïi cho vieäc phaùt hieän E. coli O157:H7. Döïa vaøo nhöõng tính chaát rieâng bieät cuûa doøng E. coli naøy, nhieàu moâi tröôøng taêng sinh vaø choïn loïc ñaõ ñöôïc taïo ra ñeå phaùt hieän O157:H7 trong thöïc phaåm. Ngöôøi ta duøng moâi tröôøng taêng sinh coù boå sung theâm khaùng sinh cefixime, cefsulodin, vancomycin ñeå haïn cheá söï taêng tröôûng cuûa nhöõng vi truøng Gram aâm khaùc. Sau ñoù söû duïng moâi tröôøng Download» Agriviet.com 10 tuyeån löïa ñeå phaùt hieän nhoùm E. coli O157. Thöôøng nhaát laø moâi tröôøng SMAC hoaëc SMAC coù boå sung cefixime vaø tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002). 2.1.5.3 Nguoàn laây nhieãm: STEC coù theå ñöôïc tìm thaáy trong phaân cuûa nhieàu loaøi ñoäng vaät nhö traâu boø, cöøu, deâ, heo, choù vaø meøo (Beutin, 1993; Beutin, 1995; Chapman, 1997) vaø ngöïa (Chalmer, 1997). Loaøi ñoäng vaät quan troïng nhaát trong vieäc gaây nhieãm cho ngöôøi laø traâu boø. Ñöôøng gaây nhieãm chuû yeáu cuûa STEC vaøo thöïc phaåm laø vieäc vaáy nhieãm chöùa vaät ñöôøng tieâu hoùa vaø phaân vaøo thòt trong quaù trình gieát moå (Paton, 1998). STEC laây truyeàn qua ngöôøi chuû yeáu baèng con ñöôøng thöïc phaåm, nöôùc vaø töø ngöôøi qua ngöôøi. Haàu heát caùc tröôøng hôïp laø do aên thöïc phaåm ñaõ bò nhieãm, ñaëc bieät laø thöïc phaåm coù nguoàn goác ñoäng vaät, maø thòt boø laø nguyeân nhaân chuû yeáu (Keskimaki, 2001). 2.1.6 Enteropathogenic E. coli (EPEC) EPEC laø nhoùm E. coli gaây tieâu chaûy quan troïng coù lieân quan ñeán tieâu chaûy ôû treû sô sinh taïi nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Daáu hieäu cuûa söï nhieãm beänh do EPEC laø hình thaønh beänh tích kieåu A/E (attaching-and-effacing, A/E), coù theå quan saùt ñöôïc treân maãu sinh thieát ruoät töø nhöõng beänh nhaân hay thuù bò nhieãm beänh vaø trong nuoâi caáy teá baøo (daãn lieäu Nataro vaø Kaper, 1998). Kieåu hình rieâng bieät naøy ñöôïc ñaëc tröng bôûi söï hö haïi cuûa caùc vi nhung mao vaø söï keát dính chaët giöõa vi khuaån vaø maøng teá baøo bieåu moâ. Daïng toån thöông naøy khaùc vôùi daïng toån thöông do doøng ETEC vaø Vibrio cholerae (ETEC vaø V. cholerae baùm theo kieåu khoâng chaët, khoâng gaây baøo moøn vi nhung). Maëc duø nhöõng nghieân cöùu tröôùc ñaây ñaõ baùo caùo veà nhöõng toån thöông moâ beänh hoïc daïng naøy, nhöng cho ñeán khi Moon vaø ctv (1983) baùo caùo raèng kieåu toån thöông naøy coù lieân quan roäng raõi ñeán EPEC thì thuaät ngöõ “gaén keát vaø gaây hö haïi” (“attaching and effacing” – A/E) môùi ñöôïc ñöa ra. Gen caàn thieát cho vieäc taïo ra toån thöông A/E laø gen eae maõ hoùa protein intimin. Protein naøy laø yeáu toá ñoäc löïc caàn thieát cuûa EPEC (Donnerberg, 1993). Theo Nataro vaø Kaper (1998), gen eae Download» Agriviet.com 11 hieän dieän ôû taát caû caùc chuûng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium vaø Hafnia alvei; nhöng khoâng hieän dieän ôû nhöõng doøng E. coli thuoäc heä vi khuaån ñöôøng ruoät thoâng thöôøng. Ñaùp öùng vieâm taïi choã vaø söï taêng tính thaám cuûa ruoät trong ñaùp öùng vôùi EPEC goùp phaàn vaøo tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). Ñieåm ñaùng löu yù nhaát veà maët dòch teã hoïc cuûa beänh do EPEC veà söï phaân boá veà löùa tuoåi cuûa ngöôøi beänh. Beänh chuû yeáu xaûy ra treân treû em döôùi 2 tuoåi. Beänh thöôøng bieåu hieän caáp tính vôùi tieâu chaûy nghieâm troïng. Lyù do lieân quan ñeán khaû naêng ñeà khaùng ñöôïc ôû ngöôøi tröôûng thaønh vaø treû em lôùn coøn chöa ñöôïc bieát roõ, nhöng coù leõ laø do söï maát caùc receptor ñaëc hieäu. Tuy nhieân EPEC cuõng coù theå gaây tieâu chaûy ôû ngöôøi lôùn neáu soá löôïng vi khuaån ñuû lôùn (Nataro vaø Kaper, 1998). 2.1.7 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) 2.1.7.1 Caùc yeáu toá ñoäc löïc: Nhoùm ETEC coù hai nhoùm quyeát ñònh ñoäc löïc chính laø ñoäc toá ruoät (enterotoxin) vaø yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF). ™ Ñoäc toá ruoät enterotoxin Nhoùm ETEC goàm nhöõng E. coli taïo ra ít nhaát moät trong hai loaïi ñoäc toá ñöôøng ruoät laø ST vaø LT. ETEC thöôøng ñöôïc xem laø ñaïi dieän cuûa cô cheá gaây beänh baèng caùch vi khuaån baùm vaøo beà maët maøng nhaày ruoät non vaø tieát ra ñoäc toá ruoät, laøm gia taêng tình traïng tieát dòch. Nhoùm ETEC gaây tieâu chaûy thoâng qua söï tieát ñoäc toá ñöôøng ruoät LT vaø ST. E. coli nhoùm naøy coù theå chæ tieát ñoäc toá LT, hoaëc chæ tieát ST, hoaëc coù theå tieát caû LT vaø ST. (1) Ñoäc toá khoâng chòu nhieät (Heat-labile toxin - LT): Ñoäc toá LT cuûa E. coli laø oligopeptide coù lieân heä gaàn guõi veà maët caáu truùc vaø chöùc naêng vôùi ñoäc toá taû (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tieát ra. LT vaø CT gioáng nhau nhieàu ñaëc tính nhö caáu truùc, trình töï acid amin (gioáng nhau khoaûng 80%), töông ñoàng veà receptor, hoaït tính enzym, vaø taùc ñoäng cuûa noù treân thuù hay nuoâi caáy teá baøo. LT coù Download» Agriviet.com 12 2 serogroup chính laø LT-I vaø LT-II. LT-I vaø LT-II khoâng coù phaûn öùng cheùo veà maët mieãn dòch. LT-I ñöôïc tieát bôûi nhöõng doøng E. coli gaây beänh treân ngöôøi vaø thuù. Coøn LT- II ñöôïc tìm thaáy chuû yeáu ôû E. coli treân thuù vaø hieám khi ôû ngöôøi. Veà maët khaùi nieäm, tröø khi ñi keøm vôùi chöõ soá la maõ thì teân goïi LT duøng ñeå chæ LT-I (Nataro vaø Kaper, 1998). - LT-I: LT-I laø moät oligopeptide khoaûng 86 kDa, ñöôïc caáu taïo bôûi 1 tieåu ñôn vò A 28 kDa vaø 5 tieåu ñôn vò B 11,5 kDa. Tieåu ñôn vò A chòu traùch nhieäm trong hoaït tính enzym cuûa ñoäc toá goàm peptide A1 vaø peptide A2 lieân keát nhau bôûi caàu noái disulfur. Nhöõng tieåu ñôn vò B saép xeáp thaønh voøng nhaãn, lieân keát chaéc chaén vôùi ganglioside GM1 vaø lieân keát loûng leûo vôùi GD1b vaø vaøi glycoprotein ruoät – chuùng laø caùc receptor cuûa LT. Hai loaïi LT-I coù lieân heä gaàn nhau vaø coù theå phaûn öùng cheùo moät phaàn vôùi nhau laø LTp (LTp-I) ñaàu tieân ñöôïc phaân laäp töø heo vaø LTh (LTh-I) ñöôïc phaân laäp töø ngöôøi. Gen maõ hoùa cho LT laø elt hay lt-I naèm treân plasmid maø plasmid naøy coù theå chöùa caû gen maõ hoùa ST vaø/hoaëc gen maõ hoùa nhöõng khaùng nguyeân cuûa yeáu toá ñònh vò (colonization factor antigen - CFA). Sau khi ñoäc toá ñi vaøo noäi baøo, chuùng di chuyeån trong teá baøo nhôø heä thoáng vaän chuyeån cuûa Golgi (Golgi vaän chuyeån). Ñích cuûa LT trong teá baøo laø enzym adenylate cyclase naèm ôû lôùp maøng ngoaøi cuûa teá baøo bieåu moâ ruoät. Peptide A1 coù hoaït tính ADP-ribosyltransferase chuyeån phaàn ADP-ribosyl töø NAD ñeán cuûa protein lieân keát GTP (GTP-binding protein) laø GS, gaây hoaït hoùa enzyme adenylate cyclase, laøm gia taêng AMP voøng (cAMP) trong teá baøo. Vì vaäy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) ñöôïc hoïat hoùa daãn ñeán söï phosphoryl hoùa keânh chloride (Cl-) ôû maøng teá baøo bieåu moâ vöôït quaù möùc bình thöôøng. Keát quaû daây chuyeàn laø kích thích teá baøo beân döôùi tieát Cl- vaø ngaên caûn söï haáp thuï NaCl bôûi nhöõng teá baøo coù loâng nhung. Haøm löôïng ion trong loøng ruoät gia taêng Download» Agriviet.com 13 keùo theo söï di chuyeån thuï ñoäng cuûa nöôùc töø teá baøo vaøo loøng ruoät, gaây tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). Maëc duø söï kích thích cuûa Cl- do söï gia taêng löôïng cAMP trong teá baøo laø caùch giaûi thích coå ñieån veà cô cheá gaây tieâu chaûy cuûa LT vaø CT, ngaøy caøng coù nhieàu baèng chöùng cho thaáy raèng ñaùp öùng taêng tieát ñoái vôùi nhöõng ñoäc toá naøy coù cô cheá phöùc taïp hôn. Moät cô cheá taùc ñoäng khaùc cuûa ñoäc toá coù lieân quan ñeán nhöõng prostaglandin E (PGE1 vaø PGE2) vaø yeáu toá hoaït hoùa tieåu caàu. Söï toång hôïp vaø phoùng thích nhöõng chaát chuyeån hoùa cuûa acid arachidonic nhö prostaglandin vaø leukotriene coù theå kích thích söï vaän chuyeån caùc chaát ñieän giaûi vaø kích thích nhu ñoäng ruoät. Cô cheá taùc ñoäng khaùc thöù hai coù lieân quan ñeán heä thaàn kinh ruoät (enteric nervous system – ENS) ñieàu hoøa nhu ñoäng vaø söï tieát ion ôû ruoät. Cô cheá thöù ba laø CT vaø LT gaây ñaùp öùng vieâm ruoät daïng nheï. - LT-II: Nhoùm LT-II gioáng vôùi LT-I vaø CT khoaûng 55 - 57% ôû tieåu ñôn vò A, nhöng khoâng gioáng vôùi LT-I vaø CT ôû tieåu ñôn vò B. LT-II laøm gia taêng cAMP trong teá baøo qua cô cheá töông töï nhö LT-I, nhöng LT-II söû duïng GD1 laøm receptor thay vì GM1. Nhö ñaõ noùi ôû treân, LT-II khoâng coù lieân quan ñeán beänh treân ngöôøi vaø thuù. (2) Ñoäc toá chòu nhieät (Heat-stable toxin - ST): Ngöôïc vôùi LT, ST coù troïng löôïng phaân töû nhoû vaø nhöõng caàu noái disulfur cuûa noù giaûi thích cho khaû naêng chòu nhieät cuûa ñoäc toá naøy. ST ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm laø STa vaø STb, khaùc nhau veà caáu truùc vaø cô cheá hoaït ñoäng. Gen maõ hoùa cho caû 2 nhoùm ñöôïc tìm thaáy chuû yeáu treân plasmid vaø vaøi gen maõ hoùa ST cuõng ñöôïc tìm thaáy treân transposon. STa (hay coøn goïi laø ST-I) ñöôïc taïo bôûi ETEC vaø moät vaøi vi khuaån Gram aâm khaùc goàm Yersinia enterocolitica vaø V. cholerae khoâng phaûi O1. ST gioáng 50% trình töï acid amin vôùi ñoäc toá chòu nhieät EAST1 cuûa EAEC. Gaàn ñaây, coøn coù baùo caùo cho raèng moät vaøi doøng cuûa ETEC cuõng coù theå saûn sinh ñoäc toá EAST1 ngoaøi ñoäc toá STa. Coøn STb chæ ñöôïc tìm thaáy ôû ETEC. Download» Agriviet.com 14 - STa: STa laø moät peptide goàm 18 -19 amino acid vôùi troïng löôïng phaân töû khoaûng 2 kDa. STa ñöôïc chia thaønh 2 loaïi laø STp (ST porcine hay STIa) phaân laäp ñöôïc ñaàu tieân treân heo vaø STh (ST human hay STIb) phaân laäp treân ngöôøi. Caû 2 loaïi ñoäc toá coù theå ñöôïc tìm thaáy ôû doøng ETEC ngöôøi. Receptor chính cuûa STa laø enzyme xuyeân maøng guanylate cyclase C (GC- C) thuoäc hoï nhöõng enzyme receptor cyclase. Söï keát hôïp cuûa STa vaøo GC-C kích thích hoaït tính GC, daãn ñeán vieäc gia taêng löôïng cGMP noäi baøo. Hoaït ñoäng naøy cuoái cuøng daãn ñeán söï kích thích tieát Cl- vaø/hoaëc ngaên caûn söï haáp thuï NaCl, gaây ra söï tieát chaát loûng trong ruoät. - STb: STb chuû yeáu coù lieân quan ñeán doøng ETEC phaân laäp töø heo maëc duø cuõng coù baùo caùo veà vaøi chuûng ETEC ngöôøi cuõng saûn sinh STb. Khoâng nhö STa, STb gaây ra nhöõng toån thöông veà maët moâ hoïc treân lôùp bieåu moâ ruoät nhö maát teá baøo nhung mao cuûa bieåu moâ ruoät vaø teo nhung mao moät phaàn. Receptor cuûa STb chöa ñöôïc bieát roõ maëc duø gaàn ñaây ngöôøi ta cho raèng ñoäc toá coù theå keát hôïp khoâng ñaëc hieäu vôùi maøng teá baøo chaát tröôùc khi vaøo trong teá baøo. Khoâng taïo ra söï tieát Cl- nhö STa, STb kích thích teá baøo ruoät tieát bicarbonat (HCO3-). STb khoâng laøm taêng cAMP hay cGMP noäi baøo maëc duø noù kích thích taêng löôïng calci noäi baøo töø ngoaïi baøo. STb cuõng kích thích phoùng thích PGE2 vaø serotonin, töø ñoù ngöôøi ta cho raèng ENS coù theå cuõng coù lieân quan ñeán ñaùp öùng tieát gaây ra bôûi ñoäc toá naøy (Hitotsubashi, 1992). ™ Yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF): Cô cheá maø ETEC keát dính vaø cö truù treân lôùp maøng nhaày ruoät ñaõ ñöôïc nghieân cöùu kyõ. Ñeå gaây tieâu chaûy, ETEC ñaàu tieân phaûi keát dính vaøo teá baøo ruoät non nhôø vaøo loâng treân beà maët cuûa vi khuaån, goïi laø yeáu toá ñònh vò (CF). CFA coù theå ñöôïc phaân loaïi döïa treân ñaëc tính hình thaùi. Coù 3 loaïi chính goàm loaïi loâng hình que cöùng, loâng hình que meàm coù daïng boù, loâng coù caáu truùc maûnh meàm. Gen cuûa CFA thöôøng ñöôïc maõ hoùa treân plasmid, cuõng laø nôi maõ hoùa Download» Agriviet.com 15 cho ñoäc toá ST vaø/hoaëc LT. Tieåu ñôn vò caáu truùc loâng thöôøng taïo mieãn dòch vöôït troäi vaø do ñoù tieåu ñôn vò coù tính khaùng nguyeân maïnh nhaát. 2.1.7.2 Dòch teã Doøng ETEC lieân quan ñeán 2 hoäi chöùng laâm saøng chính: tieâu chaûy treân treû em thoâi buù ôû nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån vaø tieâu chaûy ôû du khaùch. Dòch teã cuûa beänh do ETEC ñöôïc quyeát ñònh bôûi nhieàu yeáu toá: (1) mieãn dòch taïi maøng nhaày ñoái vôùi söï nhieãm ETEC khaùc nhau ôû töøng caù theå, (2) nhöõng ngöôøi nhieãm khoâng coù bieåu hieän trieäu chöùng vaãn baøi thaûi moät löôïng lôùn vi khuaån qua phaân, vaø (3) vieäc nhieãm chæ ñaït ñöôïc khi lieàu gaây nhieãm khaù cao. Ba ñaëc tính naøy taïo neân tình traïng oâ nhieãm ETEC trong moâi tröôøng ôû nhöõng vuøng coù dòch vaø haàu heát treû em trong vuøng naøy seõ ñöông ñaàu vôùi ETEC ôû thôøi kyø thoâi buù. Treû em ñaõ ôû tuoåi ñeán tröôøng vaø ngöôøi lôùn coù nguy cô tieâu chaûy do ETEC raát thaáp. Doøng ETEC saûn sinh ST laø nguyeân nhaân cuûa haàu heát caùc tröôøng hôïp dòch beänh. Caùc nghieân cöùu dòch teã hoïc cho thaáy raèng thöùc aên vaø nöôùc bò oâ nhieãm laø nhöõng phöông tieän chuû yeáu gaây nhieãm ETEC (Black, 1981). Söï nhieãm ETEC ôû nhöõng vuøng dòch thöôøng taäp trung chuû yeáu vaøo nhöõng thaùng aám vaø aåm, khi ñoù thì söï nhaân leân cuûa ETEC trong thöïc phaåm vaø nöôùc laø lyù töôûng nhaát. Maëc duø söï nhieãm ETEC xaûy ra chuû yeáu treân treû em, nhöng nhöõng ngöôøi tröôûng thaønh chöa coù mieãn dòch cuõng coù theå nhieãm. Thöïc vaäy ETEC laø nguyeân nhaân chính gaây tieâu chaûy treân du khaùch tröôûng thaønh töø nhöõng nöôùc ñaõ phaùt trieån ñeán thaêm nhöõng vuøng nhieãm dòch ETEC. Nhieàu nghieân cöùu cho raèng 20 - 60% soá du khaùch naøy coù trieäu chöùng tieâu chaûy vaø 20 - 40% caùc tröôøng hôïp laø do ETEC. Vieäc tieâu chaûy treân du khaùch thöôøng xaûy ra ôû nhöõng du khaùch laàn ñaàu tieân ñeán thaêm nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Tieâu chaûy treân du khaùch thöôøng laø do thöùc aên vaø nöôùc uoáng bò oâ nhieãm. Download» Agriviet.com 16 2.1.7.3 Khía caïnh laâm saøng Trieäu chöùng beänh thöôøng xaûy ra ñoät ngoät vôùi thôøi gian nung beänh ngaén (14 – 50 giôø). Beänh nhaân tieâu chaûy nhö nöôùc, thöôøng khoâng coù maùu; moät vaøi beänh nhaân coù hieän töôïng soát vaø oùi möõa. Tieâu chaûy do ETEC coù theå nheï, ngaén vaø töï bôùt daàn nhöng cuõng coù theå gaây ra tieâu chaûy xoå nghieâm troïng gioáng nhö nhieãm Vibrio cholerae. Haàu heát caùc tröôøng hôïp nhieãm ETEC nguy hieåm ñeán tính maïng xaûy ra treân treû em thoâi buù ôû nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Maëc duø vieäc söû duïng khaùng sinh nhaïy caûm cuõng laøm giaûm thôøi gian vaø möùc ñoä tieâu chaûy, nhöng nhöõng thuoác trò coù hieäu quaû thì khoâng saün coù ôû nhöõng vuøng nguy cô cao; ngoaøi ra söï ñeà khaùng khaùng sinh cuûa doøng ETEC cuõng laø vaán ñeà ñaùng quan taâm. Do ñoù caàn phaûi löu yù raèng cô sôû cuûa vieäc chaêm soùc beänh nhaân nhieãm ETEC laø duy trì ñuû löôïng nöôùc trong cô theå neáu coù trieäu chöùng tieâu chaûy. 2.1.8 Enteroaggregative E. coli (EAEC hay EAggEC) EAEC hay EaggEC laø nhoùm E. coli khoâng sinh enterotoxin vaø baùm dính vaøo teá baøo Hep-2 theo kieåu baùm dính keát taäp (aggregative adhesion – A/A). Nhoùm EAEC goàm caû doøng E. coli gaây beänh vaø khoâng gaây beänh. Taát caû caùc EAEC ñeàu coù plasmid 60 MDa chöùa gen taïo toån thöông daïng A/A vaø gen maõ hoùa cho ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1 (EAEC heat-stable enterotoxin 1). Vai troø cuûa EAST1 trong tieâu chaûy chöa roõ raøng, nhöng gen maõ hoùa A/A treân plasmid laø caàn thieát cho quaù trình gaây beänh (Baudry 1990). Ngoaøi ra EAEC coøn coù nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc nhö haemolysin, caùc ñoäc toá vaø caùc yeáu toá coù lieân quan ñeán quaù trình baùm dính nhö loâng vaø nhöõng protein maøng ngoaøi. EAEC gaây tieâu chaûy keùo daøi (treân 14 ngaøy). Trong haàu heát caùc baùo caùo ñeàu moâ taû EAEC ôû caùc ca tieâu chaûy leû teû, nhöng EAEC cuõng coù theå laø taùc nhaân gaây thaønh oå dòch (daãn lieäu Keskimaki, 2001). Download» Agriviet.com 17 2.1.9 Enteroinvasive E. coli (EIEC) Nhöõng E. coli doøng EIEC thöôøng khoâng ñieån hình veà caùc ñaëc tính sinh hoùa vaø khoù xaùc ñònh. EIEC raát gioáng vôùi Shigella veà maët khaùng nguyeân, sinh hoùa vaø ñaëc tính gaây beänh. Trieäu chöùng laâm saøng cuûa beänh bao goàm soát, ñau buïng quaën, khoù chòu, nhieãm truøng maùu vaø tieâu chaûy nhö nöôùc hay beänh lî ñieån hình vôùi maùu, dòch nhaày vaø nhieàu baïch caàu trong phaân. Caû Shigella spp vaø EIEC ñeàu coù khaû naêng xaâm nhaäp vaøo teá baøo bieåu moâ keát traøng vaø chuùng ñeàu tieát moät hay nhieàu ñoäc toá ruoät lieân quan ñeán tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). EIEC cuõng coù theå gaây tieâu chaûy ôû khaùch du lòch vaø lieân quan ñeán nhöõng vuï ngoä ñoäc thöïc phaåm do aên phaûi thöùc aên bò oâ nhieãm. Toùm laïi, moät soá gen ñoäc löïc quan troïng cuûa nhöõng nhoùm E. coli goàm: STT Gen ñoäc löïc Nhoùm E. coli 1 eae EPEC, STEC 2 hly STEC 3 stx1 STEC 4 stx2 STEC 5 stx2e STEC 6 sta ETEC 7 stb ETEC 8 lt-I ETEC Vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli thöôøng ñöôïc thöïc hieän döïa treân nhöõng kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, ñaëc bieät laø kyõ thuaät PCR. 2.2 Kyõ thuaät PCR 2.2.1 Nguyeân taéc PCR (polymerase chain reaction – phaûn öùng toång hôïp daây chuyeàn nhôø polymerase) do Karl Mullis vaø coäng söï phaùt minh naêm 1985. Ñaây laø kyõ thuaät in vitro cho pheùp nhaân nhanh moät gen mong muoán leân haøng trieäu laàn trong thôøi gian ngaén (taïo doøng in vitro, khoâng caàn hieän dieän cuûa teá baøo). Download» Agriviet.com 18 Taát caû caùc DNA polymerase khi hoaït ñoäng toång hôïp moät maïch DNA môùi töø maïch khuoân ñeàu caàn söï hieän dieän cuûa nhöõng moài chuyeân bieät. Moài laø nhöõng ñoaïn DNA ngaén, coù khaû naêng baét caëp boå sung vôùi moät ñaàu cuûa maïch khuoân, vaø DNA polymerase seõ noái daøi moài ñeå hình thaønh maïch môùi. Caùc moài naøy goàm coù moài “xuoâi” (forward primer: moài taùc ñoäng leân sôïi 3’→ 5’) vaø moài “ngöôïc” (reverse primer: moài taùc ñoäng leân sôïi 5’→ 3’). 2.2.2 Caùc giai ñoaïn cuûa phaûn öùng PCR Phaûn öùng PCR laø moät chuoãi nhieàu chu kyø noái tieáp nhau. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc: Böôùc 1 (giai ñoaïn bieán tính - denaturation): hai maïch cuûa phaân töû DNA taùch rôøi nhau thaønh hai maïch ñôn. Phaân töû DNA ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao hôn nhieät ñoä noùng chaûy (Tm) cuûa phaân töû, thöôøng laø ôû 94 – 950 C trong voøng 30 giaây ñeán 1 phuùt. Böôùc 2 (giai ñoaïn uû baét caëp – anealing): Nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp (thaáp hôn Tm cuûa caùc moài) cho pheùp caùc moài baét caëp vôùi khuoân, trong thöïc nghieäm nhieät ñoä naøy dao ñoäng trong khoaûng 40 – 600C tuyø thuoäc Tm cuûa caùc moài söû duïng vaø keùo daøi töø 30 giaây ñeán 1 phuùt. Böôùc 3 (giai ñoaïn keùo daøi – elongation hay extension): nhieät ñoä ôû giai ñoaïn naøy ñöôïc taêng leân 720C giuùp DNA polymerase hoaït ñoäng toång hôïp DNA toát nhaát vôùi söï hieän dieän cuûa 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Ñoaïn DNA naèm giöõa hai moài ñöôïc toång hôïp taïo thaønh chuoãi DNA. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc treân seõ ñöôïc laëp ñi laëp laïi nhieàu laàn vaø moãi laàn laïi laøm taêng gaáp ñoâi löôïng DNA maãu cuûa laàn tröôùc. Toång DNA khueách ñaïi ñöôïc tính theo coâng thöùc: Toång DNA khuyeách ñaïi = m * 2n Vôùi n laø soá chu kyø, m laø soá baûn sao cuûa chuoãi maõ hoùa. Download» Agriviet.com 19 * Soá chu kyø cuûa phaûn öùng PCR Trong thöïc teá, khoâng vöôït quaù 40 chu kyø trong moät phaûn öùng, vì phaûn öùng PCR dieãn ra qua hai giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu, soá löôïng baûn sao taêng theo caáp soá nhaân, tyû leä vôùi löôïng maãu ban ñaàu. Giai ñoaïn sau ñoù, hieäu quaû khueách ñaïi giaûm haún do: + Phaân huûy vaø caïn kieät caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng. + Xuaát hieän caùc saûn phaåm phuï öùc cheá laïi phaûn öùng. + Caùc baûn sao vöøa toång hôïp khoâng keát hôïp vôùi moài maø laïi baét caëp vôùi nhau. Soá chu kyø cuûa phaûn öùng tuøy thuoäc soá löôïng maãu ban ñaàu. Soá baûn maãu 105 thì caàn khoaûng 25 – 30 chu kyø, soá baûn maãu 102 – 103 thì soá chu kyø phaûi laø 35 – 40. 2.2.3 Caùc thaønh phaàn cuûa moät phaûn öùng PCR - DNA maãu: laø thaønh phaàn caàn khueách ñaïi. - Moài (primer): Moài laø nhöõng ñoaïn oligonucleotide maïch ñôn, coù trình töï boå sung vôùi trình töï base cuûa hai ñaàu maïch khuoân ñeå khôûi ñaàu quaù trình toång hôïp DNA. Vieäc choïn moài laø giai ñoaïn quyeát ñònh cuûa phaûn öùng PCR. Caùc moài ñöôïc choïn phaûi ñaëc tröng cho trình töï DNA caàn khueách ñaïi, khoâng truøng vôùi caùc trình töï laëp laïi treân gen, khoâng coù söï baét caëp boå sung giöõa moài xuoâi vaø moài ngöôïc vaø cuõng khoâng coù nhöõng caáu truùc keïp toùc do söï baét caëp boå sung trong cuøng moät moài. Chieàu daøi caùc moài toái thieåu cho haàu heát caùc öùng duïng PCR laø 18 nucleotide (thöôøng laø 18 – 24 nucleotide). Trình töï naèm giöõa hai moài “xuoâi” vaø “ngöôïc” khoâng quaù lôùn, phaûn öùng PCR seõ toái öu treân nhöõng trình töï nhoû hôn 1Kb. - Taq polymerase: Taq polymerase laø moät DNA polymerase chòu nhieät, ñöôïc chieát taùch töø vi khuaån Thermus aquaticus ôû suoái nöôùc noùng. Taq DNA polymerase khoâng bò phaù huûy ôû nhieät ñoä cao vaø xuùc taùc söï toång hôïp töø ñaàu ñeán Download» Agriviet.com 20 cuoái quaù trình phaûn öùng döôùi söï hieän dieän cuûa Mg2+. Taq DNA polymerase toång hôïp DNA theo höôùng 5’ → 3’ vaø hoaït ñoäng toát nhaát ôû 70 - 720 C. - Caùc nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Laø hoãn hôïp 4 loaïi: dATP, dTTP, dCTP, dGTP laøm nguyeân lieäu cho phaûn öùng toång hôïp DNA. - Dung dòch ñeäm: Thaønh phaàn dung dòch ñeäm coù theå thay ñoåi tuyø loaïi enzyme ñöôïc söû duïng, quan troïng nhaát laø ion Mg2+. Noù hình thaønh moät phöùp hôïp hoaø tan vôùi dNTP, raát caàn cho quaù trình lieân keát caùc dNTP, xuùc taùc cho emzyme polymerase, laøm taêng nhieät ñoä noùng chaûy (Tm) cuûa DNA maïch ñoâi. Noàng ñoä Mg2+ (thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng MgCl2) laø moät yeáu toá aûnh höôûng maïnh ñeán hieäu quaû vaø tính ñaëc hieäu cuûa phaûn öùng PCR. Ngoaøi ra noàng ñoä MgCl2 coù theå aûnh höôûng ñeán quaù trình baét caëp cuûa moài, nhieät ñoä ñeå bieán tính DNA thaønh daây ñôn, hoaït ñoäng cuûa enzyme vaø söï trung thöïc cuûa keát quaû. Noàng ñoä Mg2+ phaûi ñöôïc xaùc ñònh cho töøng phaûn öùng qua nhieàu thöû nghieäm. Noàng ñoä MgCl2 trong hoån hôïp phaûn öùng cuoái cuøng thöôøng bieán thieân töø 0,5 – 5mM (Hoà Huyønh Thuøy Döông, 1998). Download» Agriviet.com 21 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ A B C AND KHUOÂN MAÃU Laëp laïi n voøng Hình 2.1 Nguyeân lyù cuûa phaûn öùng PCR A : Bieán tính – taùch rôøi 2 maïch cuûa phaân töû DNA B : UÛ baét caëp – caëp moài chuyeân bieät baét caëp vôùi khuoân C : Keùo daøi – DNA polymerase toång hôïp maïch môùi keå töø moài ñaõ baét caëp döôùi söï hieän dieän cuûa 4 loaïi dNTP vaø chaát ñeäm thích hôïp Thôøi gian (phuùt) Nhieät ñoä (0C) 40 50 60 70 90 100 80 1 2 3 4 5 6 Laëp laïi n laàn 1 chu kyø A B C 94 – 95 0C 40 – 60 0C 72 0C Hình 2.2 Chu kyø nhieät ñoä cuûa phaûn öùng PCR Download» Agriviet.com 22 2.2.4 Phaân tích keát quaû PCR Saûn phaåm cuûa phaûn öùng PCR (ñoaïn DNA ñöôïc khueách ñaïi) seõ ñöôïc phaùt hieän baèng phöông phaùp ñieän di. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp ñieän di laø döïa vaøo ñaëc tính caáu truùc cuûa caùc DNA. DNA laø caùc ñaïi phaân töû tích ñieän aâm ñoàng ñeàu treân khaép beà maët neân khi chòu taùc ñoäng cuûa moät ñieän tröôøng, chuùng seõ di chuyeån veà cöïc döông cuûa ñieän tröôøng. Söï di chuyeån cuûa phaân töû trong baûn gel döôùi taùc ñoäng cuûa moät ñieän tröôøng phuï thuoäc vaøo khoái löôïng phaân töû (töùc laø soá nucleotide) vaø noàng ñoä caùc chaát caáu thaønh gel, ñieän theá. Ñieän di ñöôïc thöïc hieän theo phöông naèm ngang hoaëc ñöùng. Caùc DNA trong gel agarose ñöôïc hieän hình döôùi tia töû ngoaïi (UV) nhôø ethidium bromide, chaát naøy coù khaû naêng gaén xen giöõa caùc base cuûa acid nucleic vaø phaùt huyønh quang döôùi taùc duïng cuûa tia UV (böôùc soùng λ = 300 nm) thaønh vaïch maøu ñoû da cam. Ñeå öôùc löôïng kích thöôùc DNA baèng gel agarose, ngöôøi ta söû duïng moät “yeáu toá ñaùnh daáu troïng löôïng phaân töû” (molecular weight marker – MWM) laø moät taäp hôïp nhieàu trình töï DNA coù kích thöôùc ñaõ bieát (DNA ladder). 2.3 Multiplex – PCR Multiplex - PCR laø moät caûi tieán cuûa kyõ thuaät PCR maø trong ñoù coù theå nhaân leân ñoàng thôøi nhieàu ñoaïn DNA mong muoán baèng caùch söû duøng ñoàng thôøi nhieàu caëp moài trong moät phaûn öùng. Multiplex - PCR ñaàu tieân ñöôïc moâ taû bôûi Chamberlain naêm 1988 vaø keå töø ñoù multiplex - PCR ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong caùc lónh vöïc kieåm tra DNA (Protocol online). Download» Agriviet.com 23 Chöông 3 NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 3.1 Thôøi gian vaø ñòa ñieåm thöïc hieän ™ Thôøi gian Ñeà taøi ñöôïc thöïc hieän töø ngaøy 01/03/2004 ñeán ngaøy 30/11/2004. ™ Ñòa ñieåm - Maãu khaûo saùt ñöôïc laáy töø caùc chôï leû, loø moå, hoä - traïi chaên nuoâi ôû TP. Hoà Chí Minh vaø Long An. - Vieäc nuoâi caáy, phaân laäp vi khuaån ñöôïc thöïc hieän taïi Phoøng thöïc haønh Kieåm nghieäm thuù saûn vaø moâi tröôøng, Khoa Chaên nuoâi - Thuù y, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. - Vieäc xaùc ñònh caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñöôïc thöïc hieän taïi Trung taâm Phaân tích thí nghieäm Hoùa sinh, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 3.2 Noäi dung - Phaân laäp vi khuaån E. coli trong phaân vaø thòt boø, heo baèng phöông phaùp ñònh löôïng. Töø ñoù ñaùnh giaù möùc ñoä veä sinh thöïc phaåm baèng caùch so saùnh vôùi tieâu chuaån Vieät Nam veà soá löôïng E. coli treân thòt töôi (TCVN 7046 - 2002). Söû duïng kyõ thuaät multiplex - PCR ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc baèng qui trình ñònh löôïng. - Phaân laäp ñònh tính vi khuaån E. coli trong phaân beâ tieâu chaûy, phaân heo con tieâu chaûy, thòt boø vaø thòt heo. Phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñaõ phaân laäp ñònh tính baèng kyõ thuaät multiplex - PCR. Download» Agriviet.com 24 3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu 3.3.1 Phaân laäp vi khuaån E. coli ™ Ñoái töôïng laáy maãu - Thòt boø, heo ñöôïc laáy töø caùc chôï leû (duøng cho qui trình ñònh löôïng). - Beà maët quaøy thòt boø, thòt heo ñöôïc laáy trong loø moå (duøng cho qui trình phaân laäp ñònh tính). - Phaân beâ vaø phaân heo con tieâu chaûy ñöôïc laáy töø moät soá traïi vaø hoä chaên nuoâi. - Phaân boø vaø phaân heo bình thöôøng ñöôïc laáy töø moät soá traïi vaø hoä chaên nuoâi. ™ Caùch laáy vaø baûo quaûn maãu - Maãu thòt: Choïn ngaãu nhieân mieáng thòt ñeå laáy maãu. Khoái löôïng maãu laø 50 g thòt. - Maãu beà maët quaøy thòt: Choïn ngaãu nhieân quaøy thòt ôû giöõa ca gieát moå. Duøng gaïc voâ truøng lau beà maët quaøy thòt vôùi toång dieän tích khoaûng 200 cm2. - Maãu phaân bình thöôøng: Duøng muoãng muùc khoaûng 25 g ôû phaàn giöõa cuïc phaân gia suùc môùi thaûi. - Maãu phaân tieâu chaûy: Phaân ñöôïc laáy töø tröïc traøng baèng taêm boâng (± 0,1 g) roài cho vaøo moâi tröôøng vaän chuyeån Carry Blair. Taát caû caùc loaïi maãu sau khi laáy ñeàu ñöôïc ñöïng trong duïng cuï voâ truøng vaø giöõ laïnh ôû 4 – 80C cho ñeán khi tieán haønh xeùt nghieäm (maãu ñöôïc giöõ toái ña 24 giôø). ™ Soá löôïng maãu Soá löôïng maãu khaûo saùt ñöôïc tính laø soá maãu ñaõ phaân laäp ñöôïc vi khuaån E. coli töø caùc maãu ñaõ laáy. Download» Agriviet.com 25 Soá löôïng maãu khaûo saùt STT Ñoái töôïng maãu Phaân laäp ñònh tính Phaân laäp qua ñònh löôïng 1 Thòt heo 49 23 2 Thòt boø 34 8 Bình thöôøng 25 10 3 Phaân heo Tieâu chaûy 22 - Bình thöôøng 21 10 4 Phaân boø Tieâu chaûy 10 - Toång coäng 161 51 ™ Qui trình phaân laäp vi khuaån E. coli - Töø maãu thòt vaø maãu phaân bình thöôøng, vi khuaån E. coli ñöôïc phaân laäp, ñònh löôïng theo qui trình FAO (1992). - Maãu phaân beâ vaø heo con tieâu chaûy ñöôïc caáy ria tröïc tieáp treân moâi tröôøng EMB hoaëc MAC, uû ôû 37oC trong 24 giôø. Khuaån laïc E. coli ñieån hình treân moâi tröôøng EMB seõ deïp, coù maøu tím aùnh kim vôùi taâm saäm maøu, vaø treân moâi tröôøng MAC coù maøu hoàng, troøn, loài. - Maãu beà maët quaøy thòt (200 cm2) ñöôïc laøm ñoàng ñeàu trong 180 ml pepton ñeäm phosphate vaø daäp maãu trong 60 giaây. Boå sung khaùng sinh cefixime vôùi noàng ñoä 0,0125 mg/l (FDA, 2002). UÛ ôû 37oC trong 24 giôø. Pha loaõng canh taêng sinh 10 laàn vôùi nöôùc sinh lyù voâ truøng. Huùt 100 μl canh taêng sinh ôû noàng ñoä 10-1 daøn ñeàu leân beà maët ñóa thaïch CT-SMAC. UÛ ôû 37oC trong 24 giôø. Vi khuaån E. coli O157:H7 ñieån hình thöôøng phaùt trieån treân moâi tröôøng CT-SMAC taïo khuaån laïc khoâng maøu hoaëc maøu xaùm vôùi taâm ñuïc. Download» Agriviet.com 26 Maãu (thòt, phaân bình thöôøng) Laøm ñoàng ñeàu maãu Pha loaõng LTB (350C / 24h) EC (44,50C / 24 - 48h) EMB (350C / 24h) Thöû IMVC (350C / 24h) Keát quaû toång soá E. coli MAC (370C / 24h) Choïn khuaån laïc Caáy NA (350C / 24h) LY TRÍCH DNA QUI TRÌNH ÑÒNH LÖÔÏNG QUI TRÌNH ÑÒNH TÍNH Maãu phaân Maãu thòt Peptone + Cefixime (370C / 24h) CT - SMAC (370C / 24h) Choïn khuaån laïc ñieån hình Choïn khuaån laïc ñieån hình Laøm ñoàng ñeàu maãu MULTIPLEX - PCR Sô ñoà 3.1 Qui trình phaân laäp vi khuaån E. coli Download» Agriviet.com 27 Ghi nhaän keát quaû toång soá vi khuaån E. coli coù trong 1 g phaân vaø 1 g thòt töôi. Ñoái vôùi maãu thòt, so saùnh keát quaû toång soá vi khuaån E. coli vôùi chæ tieâu cuûa tieâu chuaån thòt töôi (TCVN 7046 - 2002) do Boä Khoa hoïc vaø Coâng ngheä ban haønh theo quyeát ñònh soá 22/2002/QÑ-BKHCN. TCVN qui ñònh saûn phaåm thòt töôi ñaït TCVN coù soá löôïng E. coli khoâng quaù 100 vi khuaån / gam. 3.3.2 Ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc Theo Cebula vaø ctv (1995), keát hôïp vôùi phöông phaùp ly trích DNA töø E. coli cuûa Cerna (2003) vaø Botteldoorn (2003), chuùng toâi tieán haønh ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc baèng phöông phaùp nhieät nhö sau: - Choïn khoaûng 20 khuaån laïc E. coli treân moâi tröôøng thaïch cho vaøo eppendorf ñöïng saün 1 ml nöôùc caát 2 laàn voâ truøng. - Ñun soâi trong 10 phuùt. - Chuyeån ngay vaøo tuû –70 oC, giöõ trong 10 phuùt. - Raõ ñoâng hoaøn toaøn. - Ly taâm vôùi toác ñoä 10.000 rpm trong 3 phuùt. - Thu phaàn noåi laøm DNA khuoân maãu. 3.3.3 Xaùc ñònh gen ñoäc löïc eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø thòt vaø phaân Vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñöôïc thöïc hieän baèng 2 phaûn öùng multiplex – PCR vôùi maùy luaân nhieät (thermal cycler): - Multiplex – PCR1: phaùt hieän caùc gen eaeA, hlyA, stx1, stx2. - Multiplex – PCR2: phaùt hieän caùc gen stx2e, sta, stb, lt-I Trong quaù trình thöïc hieän phaûn öùng multiplex – PCR, maãu ñoái chöùng döông (EDL933 hoaëc H44) ñöôïc thöïc hieän ñoàng thôøi vôùi nhöõng maãu khaûo saùt. + EDL933 laø ñoái chöùng döông vôùi caùc gen eaeA, hlyA, stx1, stx2. + H44 laø ñoái chöùng döông vôùi caùc gen stx2e, stb, lt-I. Download» Agriviet.com 28 Hai maãu ñoái chöùng döông naøy ñöôïc cung caáp töø Phoøng thí nghieäm Tröôøng Ñaïi hoïc Thuù y Toulouse (Phaùp). ™ Soá maãu xeùt nghieäm caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli Maãu E. coli phaân laäp ñöôïc Soá maãu thöïc hieän PCR Phöông phaùp phaân laäp Ñoái töôïng maãu Multiplex – PCR1 Multiplex – PCR2 Phaân boø 10 10 Phaân bình thöôøng Phaân heo 10 10 Thòt boø 8 8 ÑÒNH LÖÔÏNG Thòt Thòt heo 23 23 Phaân beâ 10 10 Phaân tieâu chaûy Phaân heo con 22 22 Phaân boø 21 21 Phaân bình thöôøng Phaân heo 25 25 Thòt boø 34 34 ÑÒNH TÍNH Thòt Thòt heo 49 49 TOÅNG COÄNG 212