Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (wssv) trên tôm sú (penaeus monodon) bằng kỹ thuật real – time pcr

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số quốc gia trên thế giới đặc biệt các nước Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan,Việt Nam, In-đô-nê-xi-a, Ấn Độ. Hiện nay để tăng sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi thâm canh năng suất cao và tăng diện tích nuôi đã có nhiều tác động đến môi trường sinh thái các vùng nuôi. Vấn đề ô nhiễm môi trường, sự bùng phát dịch bệnh cũng thường xuyên diễn ra. Trong đó bệnh đốm trắng chiếm tỷ lệ rất cao. Bệnh này đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm sú từ những năm 1993 - 1994 và đã tác động mạnh đến nghề nuôi tôm công nghiệp của thế giới. Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh là gây nên tỷ lệ chết khá cao và có thể gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi trong thời gian ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh. Sự lan rộng của dịch bệnh đốm trắng đã làm sản lượng tôm nuôi ở Đài Loan từ 95.000 tấn vào năm 1987 giảm xuống chỉ còn 30.000 tấn vào năm 1988 (Liao và ctv., 1992; trích bởi Thuy Thi Ngoc Phan, 2001); ở Việt Nam sản lượng tôm nuôi từ 50.000 tấn vào năm 1995 giảm xuống còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). Hiện nay, việc nghiên cứu để tìm phương pháp điều trị bệnh này vẫn còn nhiều khó khăn và chưa có hiệu quả rõ ràng. Phương pháp để hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra vẫn là các biện pháp phòng bệnh trong quá trình nuôi. Trong đó, việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở giai đoạn tôm giống trước khi thả nuôi và việc chẩn đoán bệnh kịp thời trong giai đoạn nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp là một điều vô cùng cần thiết. Kỹ thuật PCR từ lâu đã được xem là cách tiếp cận hứa hẹn nhất đối với việc phát hiện mầm bệnh. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông qua những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị và hóa chất. Phương pháp Real - time PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ thuật PCR. Phương pháp Real - time PCR rút ngắn thời gian phân tích kết quả. Khả năng định lượng trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích. Với ưu điểm như vậy, phương pháp Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng virus gây bệnh tôm trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý 2 (Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004). Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp cho các chủ trại tôm có đủ thời gian đưa ra những giải pháp hợp lý để phòng ngừa và ngăn chặn dịch bệnh trước khi bệnh bùng phát. Ở Việt Nam, kỹ thuật PCR đang được dùng phổ biến trong chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. Hiện nay, đối với Real – time PCR, nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng kỹ thuật này trong phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi. Do đó, được sự đồng ý bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm, dưới sự hướng dẫn của ThS. Phan Thị Ngọc Thủy và ThS. Nguyễn Thái Thủy, tôi thực hiện đề tài “Phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” nhằm phát hiện nhanh, chính xác và định lượng virus gây bệnh đốm trắng; góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát dịch bệnh này. 1.2. Mục đích yêu cầu 1.2.1. Mục đích - Thử nghiệm kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi. - So sánh kỹ thuật mới: Real - time PCR và kỹ thuật đang được sử dụng: Nested PCR trong phát hiện WSSV trên tôm sú nuôi. - Ứng dụng kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng WSSV ở các giai đoạn tôm sú nuôi từ thực tiễn. 1.2.2. Yêu cầu - Nắm vững và hiểu rõ về kỹ thuật PCR và Real - time PCR. - Sử dụng thành thạo hệ thống PCR và Real - time PCR. - Bố trí thí nghiệm, xây dựng thành công quy trình phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú nuôi bằng kỹ thuật Real - time PCR. - Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở các giai đoạn nuôi qua các mẫu thu từ thực tế. - Theo dõi, ghi nhận được tình trạng thu hoạch của các ao thả nuôi tôm đã thu mẫu để xét nghiệm WSSV. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon) Tôm sú là loài có kích thước lớn nhất của họ tôm he (Penaeidae). Kích thước lớn nhất có thể đạt đến 290 – 305 mm (200 – 250 gram), trung bình đạt từ 190 – 195 mm, nặng 150 gram. Chúng ưa sống ở những nơi có đáy bùn cát, độ trong, độ mặn cao và ổn định. Tuy nhiên, tôm sú có khả năng thích ứng với độ mặn rộng ngay trong thời kỳ trưởng thành, vì vậy rất thuận lợi cho nghề nuôi tôm trong các đầm mặn, lợ ven biển. Mùa vụ sinh sản từ tháng 11 - 4 năm sau (Bộ Thủy Sản, 1996). 2.1.1. Phân loại Theo Phạm Văn Tình (2001), tôm sú được định loại như sau: Ngành: Arthropoda - Ngành chân khớp Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác Bộ: Decapoda - Bộ mười chân Họ chung: Penaeidae Họ: Penaeidae - Họ tôm he Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên địa phương: tôm sú, tôm cỏ, tôm he, tôm giang (Trần Minh Anh, 1989). Tiếng Anh: Black tiger shrimp, Tiger prawn, Giant tiger prawn, Grass shrimp, Tumbo prawn (Nguyễn Văn Chung, 2000). 2.1.2. Vùng phân bố Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam Châu Úc và phía Tây Châu Phi. Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 300E đến 1550E từ vĩ độ 350N tới 350S xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là In-đô-nê-xi-a, Mã Lai, Phi-líp-pin và Việt Nam (Phạm Văn Tình, 2001). Tôm giống (PL) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và vùng rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn (Phạm Văn Tình, 2001). 4 2.1.3. Chu kỳ sống Trong thiên nhiên, ấu trùng tôm sú trải qua ba thời kỳ biến thái (Nauplius – Protozoea – Mysis). Ấu trùng sẽ theo sóng biển dạt vào cửa sông, đó là vùng nước lợ có độ mặn 15 - 30‰. Tại môi trường nước lợ, ấu trùng (larvae) phát triển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae. Sau đó Postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng và phát triển (Vũ Thế Trụ, 1993). Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ được 14 – 15 giờ, ở nhiệt độ 27 – 280 sẽ nở thành ấu trùng (Nauplius). Ấu trùng phát triển qua các giai đoạn sau: - Nauplius 6 giai đoạn: 36 – 51 giờ - Protozoea 3 giai đoạn: 105 – 120 giờ - Mysis 3 giai đoạn: 72 giờ Sau đó chuyển thành Postlarvae, Juvenile, Adult (giai đoạn trưởng thành). Tôm sú đẻ quanh năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3 – 4 và tháng 7 – 10. Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm; con cái khoảng 2 năm (Phạm Văn Tình, 2001). Hình 2.1 Vòng đời tôm sú Penaeus monodon (Nguồn: FAO và Multimedia Asia Co., Ltd., 1999) 5 2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot Syndrome Virus) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay. Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm và ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trong thời gian qua, bệnh đốm trắng đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á. Bệnh đốm trắng đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và Ấn Độ. Trong thời gian 1994 – 1995, virus gây bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi (P. monodon; P. indicus) dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Theo Nguyễn Văn Hảo (2004), bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh đốm trắng được phát hiện lần đầu tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc – 1993, Nhật Bản – 1994, sau đó là các nước In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Mã Lai, Ấn Độ, Băng-la-desh, bang Texas (Hoa Kỳ) – 1995 gây tổn thất nghiêm trọng về sản lượng tôm nuôi. Ở Thái Lan, dịch bệnh đốm trắng bùng nổ đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm 1995 xuống 160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Thực tế hiện nay ở các nước trong khu vực Đông Nam Á, bệnh đốm trắng được xem là phổ biến và nguy hiểm nhất vì vậy hầu hết các nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lan nhiễm và bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi (Nguyễn Văn Hảo, 2000). 2.2.2. Ở Việt Nam Theo Bùi Quang Tề (2003), từ năm 1993 – 1994 đến nay bệnh đốm trắng trên tôm thường xuất hiện ở các vùng nuôi tôm ven biển từ nuôi quảng canh đến nuôi thâm canh, bệnh đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm. 6 Ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994, hiện tượng tôm chết hàng loạt trên tôm sú nuôi được xác định do ba loại bệnh: bệnh MBV, bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Từ năm 1996 đến nay, tôm nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa và các địa phương khác trong cả nước chịu tác hại rất lớn của bệnh đốm trắng. Bệnh này xảy ra hàng năm, trên diện rộng, có những vụ nuôi 80% diện tích nuôi tôm ở một địa phương bị thất thu hay thu hoạch sớm ngoài dự kiến (Bộ Thuỷ Sản, 2003). Năm 2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3%) có tôm nuôi và tôm cua tự nhiên đã mang mầm bệnh đốm trắng và có 169 hộ (34,99%) có tôm chết vì bệnh đốm trắng. Năm 2003, Bùi Quang Tề và cộng sự phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và tôm chân trắng nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh) và tôm Postlarve (PL) đưa từ Quảng Nam và Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm (PL) đưa từ Đà Nẵng, Quảng Nam là 23,08%; tôm sú nuôi thương phẩm ở các tỉnh phía Bắc là 26,92%; tôm chân trắng là 13,33% (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm 2003 do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ 25 - 46,6%, trung bình 38,9%. Theo số liệu từ Trung Tâm Môi Trường và Dịch Bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I), Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh, trong đó phần lớn thường là bệnh đốm trắng. Bệnh này tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/ 110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm 7 có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Những ngày đầu năm 2004, tại nhiều tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đã xảy ra tình trạng tôm nuôi bị chết do virus gây bệnh đốm trắng gây nên và bệnh này lây lan nhanh ngay từ đầu vụ. Hiện nay, bệnh đốm trắng vẫn đang diễn ra và đã gây nhiều tổn thất cho nhiều hộ dân tại các tỉnh này (Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004). Nhìn chung, tình hình dịch bệnh đốm trắng diễn ra ở Việt Nam rất nghiêm trọng và đã ảnh hưởng mạnh đến ngành Thủy sản trong cả nước. 2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm 2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 2.3.1.1. Định danh và phân loại Định danh - Giống: Non Occuluded Baculovirus - Họ: Baculoviridae - Họ phụ: NudiBaculoviridae Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (2002), các nhà khoa học đã phân loại virus gây bệnh đốm trắng là một giống mới Whisspovirus thuộc họ mới Nimaviridae (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Tác nhân virus gây bệnh đốm trắng được gọi bởi nhiều tên do nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau (Wang Y. C et al., 1996): - WSSV: White Spot Syndrome Virus - WSBV: White Spot Baculovirus Virus - WSVD: White Spot Viral Disease - WSS: White Spot Syndrome - WSV: White Spot Virus - SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease - HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus Hiện nay, WSSV là tên thông dụng của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Lightner D. V, 1996). Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm: 8 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái Virus dạng hình que, kích thước 120 x 275 mm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 mm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kD. Vỏ bao có hai lớp protein VP28 và VP29; Nucleocapsid có ba lớp VP26, VP24, VP15. Nhân cấu trúc ADN mạch đôi (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). 2.3.1.3. Đặc tính sinh học Virus đốm trắng ký sinh ở các tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, cơ quan lymphoid và biểu bì dưới vỏ kitin. Virus xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử và sưng to. Virus sống và tồn tại trong nước có độ mặn từ 5 – 40‰, độ pH từ 4 – 10, có khả năng chịu đựng được nhiệt độ từ 0 – 800C (Trần Thị Việt Ngân, 2002). Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dƣới kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Virus nhuộm âm ở trong huyết tƣơng của tôm sú nhiễm bệnh WSSV, một số thể virus có đuôi. (vạch kẻ a = 240 nm (theo Graindorge & Flegel, 1999)) (Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm Virus tôm Nhật 1 (RVPJ–1) 84 x 226 nm Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 276 nm 89 x 201 nm Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70 – 150 x 350 – 380 nm 56 – 67 x 330 – 350 nm Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng (Nguồn: Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004) 9 2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV Virus gây bệnh đốm trắng phân bố rất rộng ở nhiều vật chủ, virus không chỉ nhiễm ở một số loài tôm he (Penaeus) nuôi ở Tây bán cầu mà còn xuất hiện rất rộng ở bộ mười chân (Decapoda) gồm các loài cua và giáp xác khác. Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự nhiên: tôm sú (P. mondon); tôm thẻ (P. indicus); tôm rảo (Metapenaeus ensis); tôm đất (M. lysianassa); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). 2.3.3. Các con đƣờng lây truyền WSSV Bệnh đốm trắng do virus WSSV lây lan rất nhanh qua hai đường chính: - Lây lan theo chiều dọc (Vertical transmission): từ bố mẹ nhiễm bệnh lây lan cho con. - Lây lan theo chiều ngang (Horizontal transmission): bị nhiễm virus từ nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang virus từ ao này sang ao kia, từ dùng cụ sản xuất còn mang mầm bệnh, từ tôm chết, do người hoặc chim, cò vô tình đưa vào ao,…(Trần Thị Việt Ngân, 2002). Trong đó, lây lan theo chiều ngang là đường lan truyền chủ yếu. Bệnh đốm trắng dễ bị bùng phát khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). 10 2.3.4. Cơ chế xâm nhập Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng thể virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và lại tiếp tục xâm nhập và tấn công (Trần Thị Việt Ngân, 2002). Ngoài ra, tôm ăn phải virus tự do tồn tại trong bùn ao và trong nước cũng dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV (Chou H. Y và ctv., 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). 2.3.5. Triệu chứng của bệnh Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: tôm bị bệnh giảm ăn rõ rệt, mệt mỏi, vỏ bì chùng lỏng với những đốm trắng từ 0,2 – 2 mm đường kính, biểu hiện ở bề mặt bên trong của vỏ. Trong nhiều trường hợp, tôm hấp hối do bệnh WSSV chuyển sang màu hồng đến màu (Nguồn: Trần Thị Việt Ngân, 2002) LÂY NHIỄM THEO CHIỀU DỌC LÂY NHIỄM THEO CHIỀU NGANG Hình 2.4 Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng WSSV trong ao nuôi (theo Passano L. M., 1960) 11 nâu đỏ – gọi là bệnh đỏ thân. Bệnh này tỷ lệ chết rất cao, có thể tới 100% (Trần Thị Minh Tâm và Đái Duy Ban, 1999). Những dấu hiệu khác: tôm ở tầng mặt dạt vào bờ, hoạt động kém, các phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám. Khi có dấu hiệu sức khỏe tôm yếu, đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh trong vòng từ 3 – 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết trong ao nuôi (Bùi Quang Tề, 2003). Tuy nhiên cũng cần phân biệt những trường hợp bệnh lý giống như bệnh đốm trắng. Trong trường hợp này, những đốm trắng xuất hiện loang lỗ trên thân tôm và tôm chỉ chết rải rác hoặc kéo dài, khi lột xác xong, các đốm trắng bong ra khỏi vỏ và tôm hoạt động trở lại bình thường. Dấu hiệu này là do pH cao hoặc do tôm bị nhiễm vi khuẩn ( benhdomtrang.htm). 2.3.6. Phƣơng pháp chẩn đoán Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã được mô tả ở Hình 2.5 và 2.6, mầm bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau (Trần Thị Minh Tâm, 1999): - Phương pháp mô học: dấu hiệu định bệnh là sự xuất hiện của những thể vùi trong nhân tế bào của các mô có nguồn gốc trung bì. - Phương pháp PCR: dấu hiệu định bệnh là phát hiện sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc hiệu của tác nhân gây bệnh. - Phương pháp lai tại chỗ ADN (In situ DNA hybridization): dấu hiệu định bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm ngặt. Hình 2.5 Tôm sú bị bệnh đốm trắng dạt vào bờ và chết Hình 2.6 Vỏ đầu ngực tôm bị bệnh đốm trắng (Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) 12 - Phương pháp Dot blot và Southern blot: được thực hiện với sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân. - Phương pháp miễn dịch huỳnh quang: dấu hiệu định bệnh là kết quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong đó kỹ thuật PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, và có tính đặc hiệu cao. Kỹ thuật này đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đưa ra các cải tiến mới như: Nested PCR, Semi – Nested PCR, Real - time PCR,…Với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao kết hợp với khả năng phát hiện và định lượng đồng thời, Real - time PCR được xem như một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc xác định chính xác mức độ nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng trên tôm. 2.4. Phƣơng pháp PCR và các cải tiến 2.4.1. Phƣơng pháp PCR Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. PCR cho phép một lượng rất nhỏ ADN (một phân tử) được khuếch đại đến mức mà ở đó người ta dễ dàng phát hiện bằng những phương pháp thông thường như điện di gel (Trần Thị Minh Tâm và Đái Duy Ban, 1999). PCR là một phương pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. PCR dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự ADN đích thông qua các chu kỳ gồm ba bước: biến tính, bắt cặp với primer và tổng hợp mạch mới nhờ ADN polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). 2.4.1.1. Nguyên tắc Trong phản ứng PCR, đoạn oligonucleotide ngắn đóng vai trò primer đặc hiệu gắn vào phân tử ADN đích. Dưới các điều kiện tối ưu, hai primer oligonucleotide bổ sung với hai mạch khuôn, sau đó bắt đầu tổng hợp ADN in vitro nhờ ADN polymerase chịu nhiệt. Sau giai đoạn primer bắt cặp, ADN polymerase kéo dài primer, tạo ra các bản sao mới của trình tự mạch khuôn nằm giữa hai primer. Sau khi kéo dài primer hoàn tất, mẫu (sample) được gia nhiệt để biến tính ADN mạch đôi, tạo ra hai mạch khuôn đơn để primer bắt cặp ở chu kỳ kế tiếp. Qua nhiều chu kỳ, kết quả tạo ra sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại giữa hai primer theo cấp số nhân (Too H. P., 2001). 13 2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR Theo Too H. P. (2001) các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm: - Khuôn mẫu (template): ADN đích - Primer - Bốn dNTP (2’– deoxynucleoside – 5’ – triphosphate): dATP, dTTP, dGTP, dCTP - Taq polymerase - Dung dịch đệm - Mg 2+ - Chất phụ trợ (additive): được sử dụng để tăng hiệu quả khuếch đại 2.4.1.3. Các bƣớc phản ứng Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), phản ứng PCR gồm các bước: Bước 1: trong dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 0 C - 95 0C trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation). Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C - 70 0C, tùy thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization). Bước 3: nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp ADN polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự ADN cần khuếch đại và đặc tính của Taq polymerase, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation). Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. 14 2.4.1.4. Ứng dụng PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khoa học đời sống như: chẩn đoán phân tử và công nghệ di truyền. Trong chẩn đoán phân tử, ứng dụng chủ yếu là phát hiện tác nhân gây bệnh (Too H. P., 2001). Đối với ngành Thủy sản, PCR đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán sớm mầm bệnh trước và trong lúc nuôi, đặc biệt là bệnh đốm trắng. 2.4.1.5. Ƣu và nhƣợc điểm PCR dễ sử dụng và đưa ra kết quả có độ tin cậy cao. Kỹ thuật này chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ để xác định mầm bệnh, ngay cả có thể lấy mẫu từ một con tôm nhỏ để phân tích mà không cần làm chết con tôm. Mặc dù kỹ thuật PCR phát hiện nhanh với độ nhạy cao nhưng vẫn cần 18 – 36 giờ cho một xét nghiệm. Kỹ thuật này không có khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra trong mẫu bệnh phẩm. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông qua những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị và hóa chất. Nested và Real - time PCR là hai cải tiến mới của kỹ thuật PCR. Nested PCR là phương pháp cải thiện độ nhạy của kỹ thuật PCR. Trong khi đó Real - time PCR cải thiện kỹ thuật PCR cả về độ nhạy và khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra (Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004). 1 Biến tính (950C) 2 Bắt cặp (40 -700C) 3 Kéo dài (720C) DNA đích Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bƣớc phản ứng chuỗi polymerase (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 15 2.4.2. Kỹ thuật Nested PCR Nested PCR là phương pháp phát hiện các sản phẩm PCR với tốc độ nhanh và độ chính xác cao. Trong phương pháp này, cặp primer được thiết kế nhằm khuếch đại đoạn ADN đích nằm bên trong sản phẩm PCR lần nhất. Sản phẩm PCR lần nhất làm khuôn ADN cho sản phẩm PCR lần hai được khuếch đại qua cặp primer bên trong. Do đó sản phẩm PCR lần hai sẽ ngắn hơn sản phẩm PCR lần nhất. Nested PCR có độ nhạy tăng gấp 104 lần khi phát hiện chính xác sản phẩm PCR mong đợi (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). 2.4.2.1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR Nested, trước tiên khuếch đại một đoạn ADN trên bộ gen của vi sinh vật đích, sau đó khuếch đại một đoạn ADN bên trong sản phẩm khuếch đại đầu tiên này để có sản phẩm khuếch đại cuối cùng phát hiện được nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại ban đầu (Phạm Hùng Vân, 2002). Nested PCR được thực hiện qua hai bước hay một bước: - Hai bước: hai cặp primer ở bên ngoài và bên trong được cho vào hỗn hợp PCR ở từng bước riêng lẻ. Bước 1 nhằm khuếch đại đoạn ADN đích để cho sản phẩm PCR lần nhất. Bước 2 để khuếch đại đoạn ADN bên trong sản phẩm PCR lần nhất. - Một bước: hai cặp primer ở bên ngoài và bên trong được cho vào hỗn hợp PCR cùng lúc để khuếch đại đoạn ADN đích mong muốn. Trong đề tài này, kỹ thuật Nested PCR một bước được ứng dụng trong chẩn đoán mầm bệnh WSSV. PCR lần nhất PCR lần hai Hình 2.7 Nguyên tắc của Nested PCR (Nguồn: Too H. P., 2001) 16 2.4.2.2. Ƣu và nhƣợc điểm Theo Phạm Hùng Vân (2002), ưu điểm của phương pháp này là: - Nested PCR có độ nhạy phát hiện vi sinh vật đích rất cao. - Đối với Nested PCR một bước: sản phẩm PCR lần nhất đã được tính toán có một lượng vừa đủ để tham gia ngay trực tiếp vào PCR lần hai mà không cần phải mở ống eppendorf lấy sản phẩm PCR lần nhất cho vào hỗn hợp PCR mới để chạy PCR lần hai, chính nhờ vậy tránh được nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy phương pháp này giúp gia tăng độ nhạy của PCR, nhưng Nested PCR vẫn đòi hỏi nhiều thời gian thực hiện, không có khả năng định lượng chính xác số bảo sao của sinh vật đích và không thể theo dõi tiến trình phản ứng đang diễn ra theo từng chu kỳ khuếch đại. 2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR Một cải tiến nổi bật hơn so với Nested PCR đó là khả năng định lượng chính xác số bản sao ban đầu: Real - time PCR. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích. Khả năng định lượng được kết hợp trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích. Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng mầm bệnh ở mức độ một phân tử (copy) trên một mẫu. Với độ nhạy cao như vậy phương pháp Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng virus gây bệnh tôm trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý. 2.4.3.1. Lịch sử phát triển Vào năm 1992 – 1993, Higuchi và cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic (PCR động) bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các sản phẩm này được tích lũy. Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD (charge coupled device) camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi hỗn hợp phản ứng Real - time PCR. Khi có sự khuếch đại, số lượng ADN sợi đôi ngày càng tăng, ethidium bromide xen vào ADN mạch đôi, do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên (Weighardt F., 2004). Ngày nay, các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật Real - time PCR, đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang: SYBR Green I, FAM, HEX, Texas Red ® , Cy TM5,… 17 2.4.3.2. Khái niệm Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp (Newton C. R. and Graham A., 1997). Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo thành. (Nguyễn Thái Thủy, 2003). 2.4.3.3. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu. Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu. Mẫu xét nghiệm chứa nhiều ADN đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít ADN đích. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ ADN chuẩn. Nồng độ ADN trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn. 2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR Hệ thống Real - time PCR gồm máy luân nhiệt được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Máy vi tính Quang phổ huỳnh quang Máy luân nhiệt Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 18 Hệ thống này hoạt động theo nguyên tắc sau: nguồn sáng chiếu sáng qua kính lọc kích thích và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích này giúp chất chỉ thị huỳnh quang tương ứng với số ADN đích trong ống phản ứng phát ra ánh sáng. Ánh sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng. Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh sáng có bước sóng thích hợp. Sau đó, ánh sáng này sẽ qua bộ phận khuếch đại tín hiệu (intensifier), cuối cùng phát hiện nhờ đầu đọc CCD camera. 2.4.3.5. Phƣơng pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu. Các hóa chất khác nhau dùng trong mục đích này (Weighardt F., 2004): - Phẩm nhuộm chèn vào ADN sợi đôi sẽ phát huỳnh quang: ethidium bromide, SYBR Green I. - Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang: TaqMan probe, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe, Molecular Beacons probe, Scorpions và TaqMan Minor Groove Binder (MGB) probe. Các hóa chất được dùng phổ biến hiện nay trong Real - time PCR như sau: Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR KÍNH LOÏC KÍCH THÍCH KÍNH LOÏC PHAÙT SAÙNG TIA SAÙNG LEÄCH (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 19 SYBR Green I SYBR Green I gắn vào ADN mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng 530 nm khi được kích thích bằng ánh sáng có bước sóng 490 nm. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN mạch đôi trong phản ứng (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). Đối với SYBR Green I dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn kéo dài. SYBR Green I gắn vào ADN mạch đôi và phát huỳnh quang sáng gấp 50 đến 100 lần so với khi không gắn kết vào ADN (Bio-Rad, 2004). Hạn chế của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm PCR khuếch đại là sự phát hiện ADN không đặc hiệu. Do mọi phân tử ADN đôi hiện diện trong phản ứng đều được định lượng, bao gồm các sản phẩm PCR không đặc hiệu và primer – dimer (Weighardt F., 2004). Molecular Beacons probe Molecular Beacons probe được đánh dấu fluorophore (chất chỉ thị huỳnh quang) ở cuối đầu 5’và một phân tử quencher (chất hấp thụ) ở cuối đầu 3’. Molecular Beacons probe gồm: trình tự probe bổ sung với ADN đích (loop) và hai trình tự bên thân probe (stem) với khoảng 5 nucleotide hay nhiều hơn. Trình tự hai bên thân probe (stem) không bổ sung với ADN đích mà bổ sung lẫn nhau. Khi trình tự hai bên thân probe bắt cặp với nhau, Molecular Beacons probe có dạng cấu trúc kẹp tóc. Ở dạng này, Molecular Beacons probe mang fluorophore và quencher ở khoảng cách gần, giúp quencher hấp thụ huỳnh quang từ fluorophore. Khi Molecular Beacons probe gắn vào ADN đích, đầu 5’ và 3’ tách riêng biệt, tín hiệu huỳnh quang được phát ra tương ứng với số ADN đích tạo thành (Bio-Rad, 2004). Ở bước biến tính (950C), Molecular Beacons probe tách nhau hoàn toàn, mở vòng kẹp tóc, tín hiệu huỳnh quang tăng cao. Khi nhiệt độ giảm xuống ở giai đoạn bắt cặp, Molecular Beacons probe gắn kết với trình tự ADN đích. Các Molecular Beacons probe không gắn bổ sung lên trình tự ADN đích sẽ tự bắt cặp lại trở về cấu trúc kẹp tóc Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đôi (Nguồn: Weighardt F., 2004) 20 ban đầu. Do vậy, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được ở giai đoạn này hoàn toàn tương ứng với lượng ADN đích. Đối với Molecular Beacons probe, dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn bắt cặp (Bio-Rad, 2004). Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe FRET dựa vào sự truyền năng lượng từ fluorophore cho sang fluorophore nhận. Các điều kiện đối với FRET (Weighardt F., 2004): - Các phân tử cho và nhận phải ở gần nhau (cụ thể 10 – 100 A0). - Phổ hấp thụ của vật nhận phải bao phủ phổ phát quang của vật cho. - Hướng chuyển đổi giữa vật cho và vật nhận phải đối diện nhau. Hệ thống FRET dựa vào hai chất chỉ thị huỳnh quang, hai chất này khi ở gần nhau sẽ tạo ra tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Một chất đánh dấu huỳnh quang được kích thích bởi nguồn sáng và chuyển năng lượng cho chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai. Chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai này sẽ phát ra ánh sáng ở bước sóng khác để phát hiện. Probe lai được thiết kế ở dạng một cặp – một probe đánh dấu với màu cho (3’ – Fluorescine), probe còn lại được đánh dấu với màu nhận (5’ – Red 640 hay 5’ – Red 705). Khi hai probe bắt cặp với đoạn ADN đích thường chúng được tách riêng ra và bắt cặp vào ở vị trí cách nhau 1 - 5 nucleotide, kết quả sẽ có hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) giữa hai chất chỉ thị huỳnh quang. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang giữa đầu 3’ đánh dấu của probe thứ nhất và đầu 5’ của probe thứ hai nằm kế cận tạo ra tín hiệu huỳnh quang. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận tương ứng với số sản phẩm đích. Tín hiệu này được đo bởi thiết bị đo huỳnh quang (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). Hình 2. 11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe (Nguồn: Weighardt F., 2004) 21 TaqMan probe TaqMan probe được dùng phổ biến nhất trong các tài liệu về Real - time PCR. Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong ADN đích. Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi ADN đích tích lũy, probe gắn vào ADN đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài, Taq ADN polymerase tiến tới đầu 5’ của probe. Hoạt tính 5’3’ exonuclease của Taq ADN polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN chuyên biệt mong đợi. Khác với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm ADN khuếch đại không đặc hiệu sẽ không cho tín hiệu huỳnh quang (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần. Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo (Nguyễn Thái Thủy, 2003): - Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát sáng tách biệt với quencher. - Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher. - Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả. Trong đề tài này, tôi dùng TaqMan probe để bắt cặp với đoạn đặc hiệu 100 bp cần khuếch đại nhằm phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. TaqMan probe được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất chỉ thị huỳnh quang FAM (đóng vai trò reporter) và 3’ TAMRA (đóng vai trò quencher). Hình 2. 12 Nguyên tắc của FRET probe (Nguồn: Weighardt F., 2004) 22 TaqMan probe hoạt động theo nguyên tắc cụ thể ở Hình 2.13 như sau: 2.4.3.6. Nguyên lý định lƣợng của kỹ thuật Real - time PCR Để định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao Hình 2.13 Nguyên tắc của TaqMan probe (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 23 ban đầu. Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được (pha log hay pha cấp số). Tại thời điểm này, đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) phải cắt tất cả các đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang đo được và số chu kỳ. Tại vị trí cắt này, tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị trí đó. Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định ở trên) và nồng độ bản sao của các chuẩn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được đối chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đối chiếu này sẽ cho giá trị log số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.X + b (trục Y: chu kỳ ngưỡng, trục X: log số bản sao ban đầu). Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ quy đổi ra số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm. 2.4.3.7. Ƣu và nhƣợc điểm Ưu điểm của kỹ thuật này là khả năng định lượng chính xác số ADN tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng Real - time PCR xảy ra (Bio – Rad, 2004). Ngoài ra, Real - time PCR còn thể hiện một số ưu điểm nổi bật (Nguyễn Thái Thủy, 2003): - Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR. - Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả. - Độ nhạy cao. - Độ đặc hiệu cao. - Ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao. 2.4.3.8. Ứng dụng Real - time PCR cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền thống. Nhờ khả năng thu nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số ADN đích ở pha cấp số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống (Applied Biosystems, 2004): 24 - Định lượng hàm lượng virus. - Định lượng mức độ biểu hiện gen. - Phát hiện tác nhân gây bệnh. - Xác định kiểu gen (genotyping). - Ứng dụng hiệu quả trong trị liệu thuốc. Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng vai trò rất quan trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này. Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi đang là mối quan tâm chung của ngành Thủy sản. Một trong những ứng dụng đáng được quan tâm hiện nay đó là sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi. 25 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05. 3.1.2. Địa điểm thu mẫu Mẫu tôm giống, mẫu tôm nuôi thương phẩm, mẫu tôm bố mẹ được thu từ các hộ nuôi tôm, các trại tôm giống ở các tỉnh Bến Tre và Bạc Liêu, các chi cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Bến Tre và Bạc Liêu, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu Đề tài được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu - Thu nhận mẫu tôm đã qua xét nghiệm dương tính, âm tính với virus gây bệnh đốm trắng ở các chi cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Bến Tre và Bạc Liêu, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II và mẫu tôm thu từ thực tế ở các ao nuôi tôm ở các tỉnh Bến Tre và Bạc Liêu. - Thử nghiệm hai quy trình ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix. - Kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV thông qua thử nghiệm bằng phương pháp Real - time PCR. - Khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR. - Khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real – time PCR và Non Stop Nested PCR. - Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế. - Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra. 3.3. Nguyên vật liệu 3.3.1. Mẫu xét nghiệm - Mẫu tôm giống - Mang, chân bò, chân bơi của tôm nuôi thương phẩm và tôm bố mẹ. 26 3.3.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ -Hệ thống Real - time PCR của Bio - Rad (Hình 2.8) -Tủ cấy vô trùng -Tủ lạnh lưu mẫu -Máy khuấy từ -Máy nhiệt khô (hoặc bể điều nhiệt) -Máy ly tâm -Vortex mixer (máy trộn mẫu) -Các loại eppendorf 0,2; 0,5; 1,5 ml -Micropipette với các loại thể tích từ 0,5 µl đến 1000 µl -Cân phân tích -Bếp điện -Kéo, đèn cồn và panh -Bộ điện di nằm ngang và bộ nguồn -Máy đọc kết quả điện di GelDoc iQ của Bio - Rad -Máy iCycler của Bio - Rad Hình 3.3 Máy iCycler Hình 3.1 Máy ly tâm và vortex ixer Hình 3.2 Máy nhiệt khô (dry heat block) 27 3.3.2.2. Hoá chất Bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm” của công ty Nam Khoa do Bio - Rad tài trợ. Các thành phần của bộ kit gồm có: - Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm gồm có các thành phần để pha dung dịch tách chiết: nước cất (50 ml), NaOH (350 µl), SDS (150 µl), ống eppendorf 1,5 ml: 50 ống, chày nhựa (dụng cụ nghiền mẫu dùng cho ống eppendorf): 10 cái/ gói x 5 gói - 50 ống eppendorf, mỗi ống có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR gồm các thành phần: primer, dNTP, Taq polymerase, TaqMan probe, Mg2+, dung dịch đệm PCR. - Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV - 5 chuẩn (standard (std)): 50 µl mỗi chuẩn có chứa ADN của WSSV với hàm lượng lần lượt là: 105 bản sao/ 2 µl, 104 bản sao/ 2 µl, 103 bản sao/ 2 µl, 102 bản sao/ 2 µl, 101 bản sao/ 2 µl. Bộ kit “Nested PCR phát hiện WSSV trên tôm” gồm có: - Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm với các thành phần tương tự như bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm đi kèm trong bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm” - 50 ống eppendorf, mỗi ống có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR, Taq polymerase, dNTP, primer, Mg2+, UNG và dUTP. Hình 3.4 Bộ kit Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm 28 - Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV - Hóa chất dùng cho điện di: bộ thuốc thử điện di do công ty Nam Khoa sản xuất từ các hoá chất của Bio - Rad, Merck và Sigma gồm có dung dịch TBE 10X (Tris - Boric acid - EDTA), agarose, dung dịch nạp mẫu 5X (bromophenol blue và glycerol), dung dịch ethidium bromide (10 mg/ ml), thang ADN chuẩn 100 – 1000 bp có khoảng cách 100 bp của Bio - Rad. Bộ ly trích Instagene Matrix của công ty Bio – Rad: gồm có 20 ml dung dịch Instagene Matrix có các hạt nhỏ lơ lửng tích điện âm và các protein kinase. Các hạt nhỏ này sẽ gắn kết với ion hóa trị hai (các ion này hỗ trợ enzyme phân giải ADN mẫu) trong dịch tách chiết ADN, nhờ đó các ion hóa trị hai được loại bỏ. Các protein kinase có tác dụng biến tính các thành phần protein trong phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu Mẫu tôm giống: lấy mẫu nguyên 50 – 70 con. Tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng lượng mẫu không quá 1 gram. Mẫu tôm thu còn sống hay cố định trong cồn 95 0 . Mẫu tôm nuôi thương phẩm: lấy một phần nhỏ mang, chân bơi, chân bò của từ 10 – 15 con với tổng lượng mẫu không quá 1 gram. Mẫu tôm thu còn sống hay cố định trong cồn 950. Mẫu tôm bố mẹ: thu mẫu tôm bố mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống để tham gia sinh sản. Do vậy, ưu tiên thu mẫu chân bơi 2 hoặc một phần mang, thu mẫu còn sống hoặc cố định trong cồn 950. Lượng mẫu không quá 1 gram. Các mẫu tôm thu tại nơi lấy mẫu được cố định ngay bằng cồn 950 theo tỷ lệ t ôm :cồn = 1 : 3. Mẫu sau khi cố định trong cồn có thể được lưu giữ ở nhiệt độ thường. Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn phải thay cồn mới và nếu cần có thể bảo quản mẫu trong tủ âm ở – 200C. 3.4.2. Ly trích mẫu 3.4.2.1. Pha dung dịch tách chiết Dùng micropipette hút 125 µl NaOH vào lọ có chứa nước cất (50 ml), lắc trộn đều. Sau đó hút 62,5 µl SDS cho tiếp vào lọ chứa nước cất này, lắc trộn đều. Dung 29 dịch tách chiết pha xong bảo quản trong bình tối, nắp vặn chặt, có thể lưu trữ trên 3 tháng. 3.4.2.2. Tiến hành ly trích Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt Nguyên tắc của việc ly trích này là dựa trên sự phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH, SDS) và sốc nhiệt để tách chiết ADN virus ra dịch chiết. Quy trình tách chiết bao gồm các bước sau: - Cho mẫu tôm vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm vào 100 µl dung dịch tách chiết, rồi dùng chày nhỏ nghiền nhuyễn. Sau đó tiếp tục thêm 500 – 700 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi thấy mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn (có thể gắn chày vào một đầu khoan điện để nghiền cho nhanh). Nếu thao tác nhiều mẫu thì nên giữ lạnh trên đá cho đến khi chuyển qua bước tiếp theo. - Chuyển các ống nghiệm này sang bếp cách thủy đang sôi, hay lên một bếp nhiệt khô ở 960C, giữ yên 5 – 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trên đá trong vài phút. - Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích Real - t ime PCR hoặc bảo quản lạnh ở – 200C trong vòng một tuần (khi mẫu chưa được phân tích ngay). Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt. Tiến hành sử dụng bộ ly trích Instagene Matrix để tinh sạch và thu nhận nhiều ADN. Quy trình như sau: - Hút 20 µl phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó thêm 200 µl dung dịch Instagene Matrix (đã được khuấy từ trước đó 15 phút) vào trong ống. - Tiến hành ủ ở nhiệt độ 56oC trong vòng 15 - 30 phút, lấy ra vortex (đảo) mạnh 10 giây. - Tiếp tục ủ 100oC trong 8 - 10 phút, lấy ra vortex mạnh 10 giây. - Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Sử dụng phần dịch nổi để phân tích Real - time PCR hay bảo quản lạnh - 20 oC trong vòng một tuần. 30 3.4.3. Tiến hành thực hiện Real - time PCR 3.4.3.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR - Cho 2 µl dịch ly trích ADN cần phân tích vào các ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l. - Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. - Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. - Đối với chuẩn: sử dụng 5 chuẩn có hàm lượng bản sao WSSV theo thứ tự lần lượt từ 105 bản sao/ 2 µl; 104 bản sao/ 2 µl; 103 bản sao/ 2 µl; 102 bản sao/ 2 µl; 101 bản sao/ 2 µl. Đối với mỗi chuẩn, dùng micropipette hút 2 µl từng chuẩn cho vào mỗi ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. 3.4.3.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Real - time PCR trên phần mềm máy iCycler iQ Thiết lập chương trình luân nhiệt: chương trình luân nhiệt được thiết lập dựa trên các thanh công cụ trên phần mềm iQ version 3.1 như sau: Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần Bước 1: 95oC 3 phút 30 giây Chu kỳ 2: lặp lại 45 lần Bước 1: 95oC 15 giây Bước 2: 60oC 1 phút Thiết lập vị trí đặt mẫu: chọn tên mẫu cần thiết lập: mẫu cần xét nghiệm (unknown), chuẩn (standard), đối chứng (-) và (+). Sau đó chọn vị trí đặt mẫu trên buồng đĩa 96 giếng qua màn hình vi tính. Định tên mẫu: mẫu được định tên tương ứng với số thứ tự mẫu hay nguồn gốc mẫu để thuận tiện cho phân tích kết quả. Chọn chất chỉ thị màu huỳnh quang: chọn FAM và màu hiển thị cho FAM. Định nồng độ các chuẩn: định tên và nồng độ 105 bản sao/ 2 µl đến 101 bản sao/ 2 µl tương ứng với vị trí 5 chuẩn đã được thiết lập trên buồng đĩa. 31 3.4.3.3. Chạy Real - time PCR Kiểm tra lại tất cả các thông số đã thiết lập trên máy iCyler iQ, sau đó thực hiện Real - time PCR . 3.4.3.4. Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính Phân tích kết quả dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu (chi tiết ở mục 3.4.5.1). Quy trình thực hiện Real - time PCR được tóm tắt qua Sơ đồ 3.1. 32 Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt Tinh sạch bằng Instagene Matrix Chuẩn bị hỗn hợp Real - time PCR Mẫu tôm Sơ đồ 3.1 Quy trình thực hiện Real - time PCR Chạy Real - time PCR iQ Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Phân tích kết quả 33 3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR 3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop PCR - Sử dụng micropipette hút 2 µl dung dịch tách chiết ADN của mẫu cần phân tích cho vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l. - Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR. - Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR. 3.4.4.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Non Stop Nested PCR trên phần mềm của máy iCycler Chương trình luân nhiệt như sau: Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần Bước 1: 40oC 10 phút Chu kỳ 2: lặp lại 1 lần Bước 1: 95oC 5 phút Chu kỳ 3: lặp lại 20 lần Bước 1: 94oC 30 giây Bước 2: 58oC 30 giây Bước 3: 72oC 1 phút Chu kỳ 4: lặp lại 40 lần Bước 1: 94oC 30 giây Bước 2: 51oC 30 giây Bước 3: 72oC 1 phút Chu kỳ 5: lặp lại 1 lần Bước 1: 72oC 7 phút Giữ ở 4oC cho đến khi phân tích 3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR Kiểm tra lại các thông số đã thiết lập trên máy iCycler, sau đó thực hiện Non Stop Nested PCR. 34 3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả