Phát hiện vi khuẩn erwinia carotovora subsp carotovora trên cây địa lan (cymbidium) bằng phương pháp pcr

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭ 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭ 000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN THỊ THANH HÀ KS. DƢƠNG THÀNH LAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY. HO CHI MINH CITY DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** TO FIND BACTERIUM: Erwinia carotovora subsp. carotovora ON THE Cymbidium BY THE PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. LE DINH DON NGUYEN THI THANH HA BSc. DUONG THANH LAM Term:2002 – 2006 Ho Chi Minh City 8/2006 4 LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả thầy cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Dƣơng Thành Lam đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị làm việc tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học và làm đề tài tốt nghiệp. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Nguyễn Thị Thanh Hà 5 TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: Thầy Lê Đình Đôn Thầy Dƣơng Thành Lam Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên địa lan (Cymbidium). Hiện nay, các vƣờn địa lan tại thành phố Đà Lạt bị thiệt hại rất lớn do bệnh thối làm chết cây gây ra. Cho đến thời điểm này ngƣời ta vẫn chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Do đó, việc tìm hiểu phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây ra bệnh là hết sức cần thiết giúp xây dựng quy trình phòng trừ bệnh hiệu quả hơn. Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vƣờn trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. 2. Phân lập mẫu vi khuẩn và chủng bệnh lên củ khoai tây và lá địa lan. 3. Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 4. Khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng 16S/23S rDNA và vùng gen pel mã hóa pectate lyase của vi khuẩn bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả đạt đƣợc: 1. Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: - Bệnh do vi khuẩn: 20,17%. - Bệnh do virus: 9,5%. - Bệnh do nấm: 11,6%. 2. Phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 3. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan: 6 - Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh sau 48 giờ chủng bệnh (ở nhiệt độ phòng). - Trên lá địa lan: hầu nhƣ các dòng vi khuẩn đều không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày (ở 250C), duy nhất chỉ có một dòng EC06-8 gây bệnh. 4. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb nằm trong vùng 16S/23S rDNA của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 7 MỤC LỤC Phần Trang Trang tựa ................................................................................................................. ii Lời cảm tạ .............................................................................................................. iii Tóm tắt ................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... ix Danh sách các hình ................................................................................................. x Danh sách các bảng ............................................................................................... xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục đích – yêu cầu .......................................................................................... 1 1.2.1. Mục đích ....................................................................................................... 1 1.2.2. Yêu cầu ......................................................................................................... 1 1.2.3. Giới hạn ........................................................................................................ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium ..................................................................................... 3 2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium ........................................................................... 3 2.2.1. Phân loại – phân bố ...................................................................................... 3 2.2.2. Đặc điểm thực vật học .................................................................................. 4 2.2.3. Yêu cầu sinh thái .......................................................................................... 5 2.2.4. Sâu bệnh ....................................................................................................... 5 2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của Tp. Đà Lạt và trên thế giới ................................................................................................ 7 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó ................................................................................ 8 2.3.1. Phân loại ....................................................................................................... 8 2.3.2. Erwinia carotovora ...................................................................................... 8 2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora ....................................................... 9 2.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra ......................................... 13 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 17 8 3.1. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 17 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 17 3.1.2. Vật liệu ....................................................................................................... 17 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 18 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây trên địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng ......................................................................... 18 3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn ............................................................................... 18 3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC .................................................................................... 19 3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan ............................................ 19 3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng ..................................... 21 3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn............................................................ 21 3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR ........................................................................... 22 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 25 4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng ......................... 25 4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan ............................................................... 25 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra ........................................................................ 27 4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn .................................................................................. 28 4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC ........................ 29 4.3.1. Trên môi trƣờng KB ................................................................................... 29 4.3.2. Trên môi trƣờng YDC ................................................................................ 30 4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan ...................................... 31 4.4.1. Trên củ khoai tây ........................................................................................ 31 4.4.2. Trên lá địa lan ............................................................................................. 32 4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn............................................................... 32 4.6. Phản ứng PCR ............................................................................................... 34 4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 .................................................................................. 34 9 4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 .............................................................................................. 35 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 37 5.1. Kết luận.......................................................................................................... 37 5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 38 10 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR : Polymerase chain reaction DNA : Deoxyribonucleotide acid RNAse : Ribonuclease TE : Tris EDTA SDS : Sodium dodecyl sulfate NaCl : Natri clorua TAE : Tris Acetate EDTA dNTP : Deoxynucleotide triphosphate Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet LB : Luria – Bertani KB : King et al. 's medium B agar CVP : Crystal violet - pectate PGA : Potato Glucose Agar EtBr : Ethidium bromide YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO3 Ecc : Erwinia carotovora subsp. carotovora CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide Tm : Melting temperature ELISA : Enzyme linked Immuno Sorbent Assay μl : micro lít μg : micro gam μM : micro mol / lít mM : mili mol / lít ctv : cộng tác viên ha : hecta ng : nano gam bp : base pair 11 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwina carotovora .................................................. 8 Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan ................................................. 25 Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành ...................................................... 26 Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa ...................................................... 26 Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA ............................................................................ 29 Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) .................. 30 Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) ............................................... 30 Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) .................................... 31 Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C).................................................. 32 Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA ...................... 32 Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ...................................... 33 Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560C) ....................................... 34 Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C) ....................................... 34 Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 ................................... 35 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ BẢNG TRANG Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra ................................................................. 27 ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra .................................................................... 28 13 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nói đến hoa Đà Lạt, chúng ta không thể nào không nói đến lan Cymbidium. Ngƣời dân Đà Lạt thƣờng gọi lan Cymbidium là địa lan. Địa lan Đà Lạt rất phong phú về chủng loại, đa dạng về cấu trúc và màu sắc. Loài hoa này từng là “sứ giả” của Đà Lạt ở Đông Âu những năm trƣớc 1990. Mặc dù có những biến động bất lợi về thị trƣờng tiêu thụ hoa cắt cành nhƣng gần đây, việc nuôi trồng hoa lan với quy mô lớn nhằm mục đích khai thác kinh doanh đã dần dần đƣợc khôi phục. Hoa địa lan Cymbidium đƣợc nhiều ngƣời quan tâm và đầu tƣ với quy mô lớn. Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây, ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt đang phải đối mặt với bệnh thối làm chết cây. Bệnh phát triển nhiều và lây lan nhanh chóng trong mùa mƣa. Hiện nay, tình trạng bệnh chết cây địa lan vẫn chƣa đƣợc khống chế do chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa tìm ra loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Thiệt hại về kinh tế do căn bệnh này gây ra là rất lớn. Đây là nỗi trở ngại, băn khoăn của đa số các hộ trồng địa lan trên địa bàn thành phố Đà Lạt. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh để từ đó xây dựng đƣợc quy trình phòng trừ bệnh hữu hiệu giúp giảm thiệt hại do căn bệnh này gây ra cho ngƣời trồng địa lan. Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phƣơng pháp PCR”. 1.2. Mục đích – yêu cầu 1.2.1. Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium). 1.2.2. Yêu cầu - Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. - Phân lập mẫu vi khuẩn. - Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora. - Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn. 14 - Khảo sát các yếu tố nhƣ chu kỳ nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích hợp để thiết lập quy trình PCR. 1.2.3. Giới hạn - Đề tài đƣợc thực hiện từ 15/02/2006 đến 30/07/2006. - Chỉ làm đƣợc trên một số mẫu. - Do thời gian và kinh phí có hạn nên không tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR. 15 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới châu Á với nhiều vùng tiểu khí hậu rất khác nhau, là một trong những nơi tập trung nhiều loài lan của thế giới, đặc biệt là từ các vùng cao nguyên Trung Bộ đến miền Đông Nam Bộ. Ở nƣớc ta vƣơng quốc thật sự của các loài lan là những vùng cao nguyên có độ cao từ 800 m đến 1.000 m nhƣng đáng kể nhất vẫn là ở Đà Lạt – Lâm Đồng. Thành phố Đà Lạt đƣợc đặt trọn trên cao nguyên Lâm Viên với độ cao trên dƣới 1.500 m, về phía Đông Bắc tỉnh Lâm Đồng. Phía Bắc giáp huyện Lạc Dƣơng, phía Nam giáp huyện Đức Trọng, phía Đông và Đông Nam giáp huyện Đơn Dƣơng, phía Tây và Tây Nam giáp huyện Lâm Hà. Nhiệt độ trung bình năm là 18,30C, biên độ nhiệt trong ngày 11 – 120C. Khí hậu Đà Lạt chia làm hai mùa rõ rệt, mùa mƣa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm, mùa khô từ tháng 10 năm trƣớc đến tháng 4 năm sau. Lƣợng mƣa bình quân hàng năm ở Đà Lạt đạt 1.800 mm.Cƣờng độ mƣa tập trung vào các tháng 8, 9 hàng năm. Mùa khô kiệt nƣớc là tháng 12, 1 và 2. Nhìn chung, Đà Lạt có khí hậu ôn hòa dịu mát quanh năm, mùa mƣa nhiều, mùa khô ngắn, không có bão. Đây là những điều kiện hết sức thuận lợi để phát triển nuôi trồng các loại hoa ôn đới trong đó địa lan Cymbidium là một trong những loại hoa ôn đới đặc thù của Đà Lạt. 2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium 2.2.1. Phân loại – Phân bố Phân loại: theo Otto Swartz (1799), chi Cymbidium thuộc: Giới (Kingdom) : Plantae Lớp (Class) : Liliopsida Bộ(Order) : Asparagales Họ (Family) : Orchidacaea Họ phụ (Subfamily) : Epidendroideae Tông (Tribe) : Cymbidiinae Tông phụ (Subtribe) : Cyrtopodiinae Giống (Genus) : Cymbidium ( 16 Phân bố: trên thế giới, các loài Cymbidium phân bố chủ yếu ở châu Á, từ dãy Hy Mã Lạp Sơn (Hymalaya) đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), các nƣớc Đông Dƣơng (Việt Nam, Malaysia, Mianma, Thái Lan) và một vài loài phân bố ở các châu lục khác. Phần lớn các loài trong chi này sống ở các vùng rừng núi khá cao, khô và lạnh, một vài loài khác chịu đƣợc điều kiện nóng ẩm của rừng nhiệt đới (Trƣơng Trỗ, 1988). 2.2.2. Đặc điểm thực vật học Về hình thái bên ngoài, lan Cymbidium là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hằng năm tạo thành những bụi nhỏ. Rễ: có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh). Rễ mới thƣờng chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ rễ củ. Thân (căn hành): thân ngầm của chúng (căn hành) thƣờng ngắn, nối những củ lan với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có thể mọc ra căn hành mới, từ đó mọc ra những cây con. Do đó mà ngƣời ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân. Củ lan (giả hành): thƣờng có dạng con quay hay dạng hột xoài, đƣờng kính từ 1 – 15 cm. Củ thƣờng tƣơi và đƣợc bọc trong các bẹ lá. Lá: thƣờng có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành. Lá thực thƣờng có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách. Khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành. Vài loài không có cuống lá. Tùy theo từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trong thịt lá. Một số loài ít chịu rợp có phiến lá màu xanh vàng còn lại thƣờng xanh đậm. Bản lá và độ dày của lá thay đổi theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ƣa bóng rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến. Đầu lá nhọn hay chia thành hai thùy. Kích thƣớc của bản lá biến động từ 0,5 – 6 cm. Chiều dài lá thay đổi từ 10 – 150 cm. Chồi hoa: thƣờng xuất hiện bên dƣới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già, đâm ra bên ngoài. Thông thƣờng mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thƣờng xuất hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn còn chồi thân hơi dẹp. 17 Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của phát hoa từ 10 cm đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đƣờng xoắn ốc. Hoa: hoa Cymbidium lƣỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ nhị - nhụy (hay trục hợp nhụy), hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín quả mở theo 3 đƣờng góc và gieo vào không khí những hạt nhƣ bụi phấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia hạt sẽ nảy mầm phát triển thành cây mới (Trƣơng Trỗ, 1988). 2.2.3. Yêu cầu sinh thái đối với Cymbidium Ánh sáng: nhu cầu ánh sáng từ 50 – 70% ánh sáng trực tiếp với độ chiếu sáng trên dƣới 20.000 lux (khoảng 1/5 độ chiếu sáng của mặt trời vùng Đà Lạt trong khoảng tháng 4 đến tháng 8, từ 11 – 14 giờ) (Trƣơng Trỗ, 1988). Nhiệt độ: loài lan môi trƣờng lạnh thƣờng đòi hỏi một chế độ nhiệt rất đặc biệt: khoảng 150C về mùa đông và 200C về mùa hè và chênh lệch ngày đêm khoảng 6 – 70C. Điều này rất cần cho việc ra hoa. Khi các giả hành đã phát triển cần có nhiệt độ về đêm từ 6 – 120C liên tục từ 3 – 4 tuần (Trần Văn Bảo, 1999). Ẩm độ: do là địa lan nên bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký sinh (epiphyte). Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm (Trần Văn Bảo, 1999). Theo Trƣơng Trỗ (1988), từ 60 – 70% độ ẩm tƣơng đối của không khí và khoảng 70 – 80% độ ẩm của giá thể là điều kiện tốt cho Cymbidium. 2.2.4. Sâu bệnh Trong nuôi trồng hoa lan thƣờng gặp những dạng dịch hại phổ biến sau: Bệnh do virus: bệnh do virus gây ra trên hoa lan thƣờng xuất hiện ở hai dạng sau: virus gây khảm lá và virus làm khằn cây. Virus gây khảm lá: gây hiện tƣợng biến vàng trên lá và hoa. Ở lá non có những sọc hay đốm màu xanh nhạt hay màu vàng xen kẽ với những vệt xanh đậm trên phiến lá. Trên những cây bị nhiễm nặng, cây không phát triển, bộ rễ còi cọc. Bệnh thƣờng xuất hiện trong những vƣờn lan kém chăm sóc hoặc trên những cây lan bị tách chiết nhiều lần mà 18 không khử trùng dụng cụ. Rầy rệp chích hút cũng là một trong những tác nhân làm lây lan dạng bệnh này. Virus làm khằn cây: làm cho cây không phát triển bình thƣờng, lá trở nên dày hơn, có màu xanh đậm, mặt lá gồ ghề, phiến lá cứng. Bệnh do virus không có thuốc đặc trị. Khi thấy trong vƣờn có những cây lan có biểu hiện trên, cần phải cách ly để chăm sóc riêng nếu cây bị nhiễm nhẹ. Trong trƣờng hợp cây bị nhiễm nặng cần phải đốt bỏ để tránh lây lan sang các cây khỏe mạnh. Phải khử trùng dụng cụ sau mỗi lần tách chiết một cây và quan tâm đến công tác phòng trừ rầy rệp, làm vệ sinh mặt chậu và vƣờn lan thƣờng xuyên. Bệnh do vi khuẩn Bệnh thối nâu: vết bệnh màu nâu nhạt, hình tròn, mọng nƣớc, về sau chuyển sang màu nâu đen. Bệnh gây hại trên lá, thân, mầm gây nên hiện tƣợng thối (có mùi khó chịu). Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra. Bệnh thối mềm: vết bệnh có dạng bất định, ủng nƣớc, màu trắng đục, thƣờng lan rộng theo chiều rộng của phiến lá. Trong điều kiện ẩm độ cao sẽ gây hiện tƣợng thối úng. Trong điều kiện khô ráo, mô bệnh khô, teo tóp và có màu trắng xám. Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Pseudomonas Glagioli gây ra. Bệnh do nấm Bệnh đen thân cây con: vết bệnh xuất hiện ở gốc thân hoặc cổ rễ, có màu nâu, sau đó lan dần làm khô đoạn thân gần gốc và cổ rễ, vết bệnh chuyển sang màu đen. Lá chuyển sang màu vàng, cong dị hình. Cây con bị bệnh sau 2- 3 tuần, trong căn hành thƣờng có vệt màu tím hay hồng nhạt. Nguyên nhân bệnh do nấm Fusarium oxysporum gây ra. Bệnh đốm lá: vết bệnh thƣờng có hình thoi hoặc hình tròn nhỏ màu xám nâu, xuất hiện ở mặt dƣới lá. Bệnh làm vàng lá, dễ rụng, cây sinh trƣởng kém. Nguyên nhân bệnh do nấm Cercospora sp. gây ra. Bệnh thán thƣ: vết bệnh thƣờng có hình tròn nhỏ, màu nâu vàng, xuất hiện từ mép lá, chóp lá hoặc giữa phiến lá, kích thƣớc trung bình 3- 6 mm. Giữa vết bệnh hơi lõm có màu trắng xám, xung quanh có gờ nhỏ màu nâu đỏ, trên mô bệnh có nhiều chấm nhỏ màu đen. Nguyên nhân bệnh do nấm Colletotrichium gloeosrioides gây ra. 19 Ngoài ra, trên cây hoa lan còn có một số dạng bệnh khác nhƣ bệnh tàn cánh hoa, bệnh thối trắng rễ, bệnh đốm vàng, bệnh thối đen ngọn, bệnh thối hạch, bệnh đốm vòng trên cánh hoa, bệnh đốm nâu trên cánh hoa… Côn trùng gây hại: chủ yếu có mấy loại bao gồm bọ trĩ (Thrips palmi và Dichromothrips Corbetti), nhện đỏ, rệp, sâu hại, ốc sên, nhớt. Côn trùng gây hại thƣờng phát sinh và phát triển trong suốt quá trình nuôi trồng. Vì vậy, ngƣời trồng lan phải luôn luôn theo dõi, phát hiện kịp thời và có biện pháp phòng trừ thì mới thu đƣợc sản lƣợng và chất lƣợng tốt (Nguyễn Văn Tới, 2003). 2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của TP. Đà Lạt và trên thế giới Tại Đà Lạt: Từ năm 1978, Cymbidium Đà Lạt bắt đầu tham gia xuất khẩu sang thị trƣờng Liên Xô, một ít qua Tiệp Khắc và Singapore, bƣớc đầu 3.000 cành (1978). Có những năm cao điểm lên trên 32.000 cành (1989 – 1990) trên tổng sản lƣợng 65.000 cành. Đến năm 1990, do tình hình biến động ở Đông Âu và Liên Xô, thị trƣờng hoa lan Đà Lạt bị chững lại, chỉ tiêu thụ nội địa và một ít xuất sang thị trƣờng châu Á. Từ năm 1992 – 1998, ngành trồng hoa ở Đà Lạt giảm dần. Số lƣợng hoa lan chỉ còn đủ để tiêu thụ trong nƣớc. Từ năm 1999 đến nay, ngành trồng lan Cymbidium của Đà Lạt mới dần dần hồi phục nhƣng vẫn chƣa đủ để đáp ứng nhu cầu xuất khẩu. Cuối năm 2004, những bông hoa cắt cành đầu tiên của Việt Nam đã bắt đầu xâm nhập thị trƣờng Mỹ thông qua một tập đoàn nhập khẩu hoa National Wide Wholesale, mỗi tuần từ 1.300 – 1.500 cành chủ yếu đến các siêu thị hoa cao cấp ở bang Massachusetts và Ohio. Tuy nhiên bên môi giới vẫn chƣa ký hợp đồng chính thức với công ty trên vì chƣa đánh giá đƣợc nguồn địa lan mà Đà Lạt có thể cung cấp ổn định so với yêu cầu rất lớn từ phía Mỹ. Trên thế giới: Nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng. Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành. Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu. Do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là Cymbidium. Italia là quốc gia nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, Italia nhập 75,3 triệu cành chủ yếu là từ các nƣớc: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành, Singapore 0,75 triệu cành. Đức và Pháp là 2 quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và 3 Châu Âu. Ở Châu Á, Nhật là quốc 20 gia nhập khẩu hoa lan đứng đầu. Theo thống kê tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành 600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật chủ yếu là Dendrobium, Cymbidium. Thái Lan là nƣớc xuất khẩu hoa lan đứng đầu thế giới, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới với giá từ 3 – 5 USD/cành, có khi tới 80 – 100 USD/ cành, những giống quý có thể lên tới hàng ngàn USD (Trích Lê Hữu Quang, 2005). 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora và tác hại của nó 2.3.1. Phân loại: Theo Winslow và ctv (1920), loài Erwinia thuộc: Giới (Kingdom) : Bacteria Ngành (Phylum) : Proteobacteria Lớp (Class) : - Proteobacteria Bộ (Order) : Enterobacteriales Họ (Family) : Enterobacteriaceae Giống (Genus) : Erwinia (Nguồn: ). (Nguồn: ) Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, đƣợc chia thành 2 nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora”. 2.3.2. Erwinia carotovora Erwinia carotovora là tác nhân gây ra bệnh thối mềm (soft rot), một bệnh rất nguy hiểm và tàn phá cây trồng. Nhiều loại thực phẩm có giá trị kinh tế nhƣ khoai tây, cà chua, cải thìa (Chinese cabbages) có thể bị ảnh hƣởng bởi bệnh này. Loài Erwinia carotovora là Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwinia carotovora. a. Vi khuẩn có dạng hình gậy. b. Lông roi bao quanh thân. a b 21 một đơn vị phân loại phức tạp mà những dòng này thì đa dạng ở những mức độ khác nhau (sinh lý, huyết thanh học, đặc tính di truyền và dãy kí chủ). Erwinia carotovora đƣợc chia thành 5 nhóm phụ (subspecies) gồm: E. c. atroseptica (Eca), E. c. carotovora (Ecc), E. c. betavasculorum (Ecb), E. c. wasabiae (Ecw), E. c. odorifera (Eco) (Seo và ctv, 2001). 2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora Phân bố địa lý: Erwinia carotovora subsp. carotovora là một loại vi khuẩn phân bố rộng khắp mà nó là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên các loại cây cảnh (ornamental) và cây nông nghiệp (horticultural) khác nhau. Erwinia carotovora subsp. carotovora phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới và ôn đới, có phổ kí chủ rộng hơn những nhóm phụ khác (Fiori và Schiaffino, 2003). Đặc điểm: hình thái tế bào vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử: vi khuẩn có dạng hình gậy, đơn lẻ hoặc thành từng cặp, có khả năng di động do có lông roi bao quanh và có kích thƣớc trung bình từ 0,6 – 0,7 2 – 2,5 μm. Bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa đã xác định đƣợc Erwinia carotovora subsp. carotovora: vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi (facultative anaerobe), catalase (+), oxidase (-), Indole (-), hóa lỏng pectate (liquefied pectate) trên môi trƣờng CVP, khử nitrate thành nitrite, không phát sáng trên môi trƣờng KB, phân giải esculine và gelatine nhƣng không phân giải tinh bột, tạo acetoin và H2S nhƣng không tạo urease, tạo phản ứng quỳ sữa (acidized litmus milk), không có khả năng thủy giải arginine hoặc khử sucrose, kháng erythromycin, lên men glucose, chịu đựng đƣợc 5% NaCl và có thể phát triển đƣợc ở 370C, tạo acid từ arabinose, cellobiose, galactose, lactose, mannose, melibiose, ramnose, salicin, threalose, xylose, inositol, manitol và sorbitol. Đối với maltose, - methyl glucoside và adonitol vi khuẩn không tạo acid, có khả năng sử dụng asparagine, acetate, citrate, fumarate, lactate và malate. Đối với alanine, arginine, threonine, valine, glycolate, gluconate, levulinate, nicotinate, adipate, caprate, citraconate, formate, glutarate, malonate và tartrate thì không (Fiori và Schiaffino, 2003). Đƣờng lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đƣờng tự nhiên nhƣ khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thƣơng gây ra bởi côn trùng, động vật ăn cỏ (herbivorus), gió…(Marcos Montesano, 2002). 22 Khả năng gây bệnh: Erwinia carotovora subsp. carotovora là tác nhân gây bệnh cơ hội mà tính độc của nó phụ thuộc vào sự tƣơng tác giữa nó với ký chủ và môi trƣờng. Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh cây biểu hiện những nhân tố độc nhƣ các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes). Sự sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào chính liên quan đến sự phát triển của bệnh. Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyases (Pnl), polygalacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ và sử dụng pectins, gây hƣ hại tế bào và làm mô suy yếu. Theo Darrasse và ctv (1994), một vài pel gen mã hóa pectate lyase đã biết trình tự. Có 3 họ đã đƣợc xác định và giữa chúng có tính tƣơng đồng cao: họ BC (BC family) chứa gen pel chung cho cả Erwinia carotovora và Erwinia chrysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ hiện diện trong Erwinia chrysanthemi, nhóm thứ ba tƣơng ứng với gen đƣợc tìm thấy trên một vài dòng Erwinia carotovora và trên vi khuẩn Yersinia pseudotuberculosis (Y family). Cellulases hoạt động trên thành tế bào cây bằng sự thủy phân trong (endohydrolysis) của liên kết 1,4-β-D- glucosidic trong cellulose, lichenin, β-D-glucan trong ngũ cốc. pH tối ƣu gần bằng 7, cellulases phối hợp với các enzyme ngoại bào khác tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ cấp của cây trồng. Tuy nhiên, ngoài các enzyme phân hủy thành tế bào, các nhân tố khác cũng ảnh hƣởng ở giai đoạn sớm, thành lập và xúc tiến sự lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ chế kháng của ký chủ. Các nhân tố này bao gồm tính di động (motility), LPS (lipopolysaccharides), kị sắt (siderophores), gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity), NLPs (Nep-1 like protein) (Nep: necrosis and ethylene inducing peptide) và những nhân tố chống lại sự phá hủy của oxy (oxygen damage) hoặc những peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides) (Heidi Hyytiainen, 2005). Triệu chứng: triệu chứng phổ biến rất đặc trƣng cho các loài vi khuẩn Erwinia carotovora là hiện tƣợng thối nhũn củ khoai tây, cà rốt, bắp cải, hành tây,…Hiện tƣợng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn. Toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khối nhão, có mùi (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). 23 Mức độ gây hại của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora: bệnh thối mềm là một bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng kí sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau. Hiện nay chƣa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại do vi khuẩn này gây ra là rất lớn. Năm 1995, tại Argentina, trái và cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill. hybrid Tommy) từ các nhà kính thƣơng mại (commercial greenhouses) gần La Plata và gần Chacabuco xuất hiện những triệu chứng bệnh gây ra bởi Erwinia carotovora subsp. carotovora. Tỉ lệ bệnh 2% là phổ biến và gần 10% cây ở vùng ẩm ƣớt trong nhà kính thì bị nhiễm bệnh. Năm 1994, tại Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh thối thân cây cà chua gây ra bởi Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong nhà kính ở vùng phía đông Địa Trung Hải (eastern Mediterrean region). Từ năm 1999, bệnh bùng phát nghiêm trọng trong nhiều nhà kính trồng cà chua ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ. Năm 2003, phạm vi tác động của bệnh hơn 25% ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ (Aysan và ctv). Vụ đông và đông xuân năm 2002, xuất hiện bệnh trong một vài nhà kính thƣơng mại (several commercial plastic- covered greenhouses) ở Mersin và Antakya, vùng phía đông Địa Trung Hải của Thổ Nhĩ Kỳ. Phạm vi tác động của bệnh này khoảng 20 – 25% và 80 – 90% nhà kính ở Mersin và Antakya. Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty acid methyl ester) ngƣời ta đã xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi (Aysan và ctv). Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra là 12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính trồng tiêu (Capsicum annuum) tại St. David ' s, Ontario. Bệnh cũng đƣợc quan sát trên cánh đồng trồng tiêu gần Harrow năm 1996 – 1997. Đây là báo cáo đầu tiên về vi khuẩn gây thối thân (bacterial stem canker) tại các nhà kính trồng tiêu ở Canada (Cerkauskas và Brown, 2001). 24 Ở New Zealand, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ những củ cala (Zantedeschia spp. ) bị nhiễm bệnh đƣợc xác định là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Báo cáo này cho thấy Erwinia carotovora subsp. carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên cây hoa kiểng quan trọng ở New Zealand (Wright, 1998). Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora Trên thế giới: trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau.Với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật. Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong khung đọc mở (open reading frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để khuếch đại đoạn 420 bp trong khung đọc mở của pectate lyase gen của Erwinia chrysanthemi. Kết quả chỉ có cặp primer Y1 và Y2 khuếch đại đƣợc đoạn gen mong muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc (Phokum và ctv). Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP trên gen pel (mã hóa pectate lyases) để xác định mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với bệnh trên cây khoai tây. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một đoạn 434 bp của những dòng Erwinia carotovora. Trong 89 dòng Erwinia carotovora đƣợc kiểm tra, chỉ những dòng Erwinia carotovora subsp. betavasculorum là không phát hiện thấy. RFLP đƣợc thực hiện trên đoạn đƣợc khuếch đại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII, HhaI, AluI, HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự đa hình giữa các dòng. Seo và ctv, (2001) đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP nghiên cứu về kiểu hình và đa dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp. carotovora (Ecc) phân lập từ các cây kí chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan. Thí nghiệm tiến 25 hành phân tích PCR – RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và rP2, 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 – 2R, gen pel mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2. Bằng phân tích RFLP trên sản phẩm khuếch đại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả cho thấy sự đa hình giữa các dòng nghiên cứu. Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP và RAPD để nghiên cứu về mặt kiểu hình và đặc tính di truyền của vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 9 dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ cây dâu tằm. Bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này đƣợc chia thành 2 loại: type 1 và type 2. Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt với Ecc. Bằng nghiên cứu qua nhiều giai đoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học (serological assay), PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), PCR – RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR – RAPD cho thấy những dòng vi khuẩn thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn là Ecc và Eca. Fiori và Schiaffino, (2003) cũng sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP để nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora subsp. carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia. Phản ứng PCR với cặp mồi Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một trình tự có kích thƣớc 434bp. Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR đƣợc tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì thấy có sự đa hình giữa các dòng. Tại Việt Nam: hiện tại, theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây bệnh trên địa lan (Cymbidium). 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra Hàng loạt các kỹ thuật truyền thống và hiện đại đƣợc sử dụng để phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh trong hạt giống, tàn dƣ cây trồng, trong đất, nƣớc và các vector truyền khác. Phần lớn vi khuẩn gây bệnh cây trồng đƣợc truyền thông qua hạt giống hoặc các vật liệu nhân giống bị nhiễm bệnh. Do đó, phát hiện tác nhân gây ra bệnh trên cây 26 trồng có tầm quan trọng sống còn để đảm bảo một nền nông nghiệp an toàn và bền vững (Yeshitila và ctv, 2006). Chẩn đoán theo triệu chứng: một loài vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn hại cây có thể gây ra những loại triệu chứng bệnh đặc trƣng. Tuy nhiên, dựa vào triệu chứng bệnh chỉ có thể xác định chẩn đoán đúng trong rất ít trƣờng hợp.Trên một loài cây, nhiều loài vi khuẩn khác nhau và nhiều loại vi sinh vật khác nhau có thể tạo ra các triệu chứng bệnh tƣơng tự giống nhau rất khó phân biệt nhƣ các loại bệnh héo rũ, bệnh thối hỏng…(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp vi sinh: để xác định bệnh do vi khuẩn gây ra, cần thiết phải khẳng định sự có mặt của vi khuẩn trong mô bệnh, phân lập từ mô bệnh để nuôi cấy vi khuẩn thuần khiết, sau đó lây bệnh nhân tạo để xác định tính gây bệnh của chúng trên cây kí chủ theo quy tắc Koch. Tiếp tục nghiên cứu xác định rõ đặc tính hình thái, sinh trƣởng (khuẩn lạc) và phản ứng sinh hóa để có cơ sở phân loại, giám định loại (giống) và loài vi khuẩn cần chẩn đoán (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh hóa: một số chỉ tiêu cần thiết để giám định loài vi khuẩn cần chẩn đoán phải đƣợc khảo sát nghiên cứu bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa riêng biệt. Các loại (giống) vi khuẩn khác nhau phân biệt về nhu cầu, khả năng sử dụng các chất dinh dƣỡng và về kiểu trao đổi chất (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp huyết thanh: là một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh vi khuẩn đƣợc ứng dụng trong bệnh cây nhất là trong việc kiểm tra, chọn lọc giống, vật liệu làm giống sạch bệnh và trong kiểm dịch thực vật. Phƣơng pháp huyết thanh chẩn đoán vi khuẩn dựa trên cơ sở phản ứng có tính đặc hiệu cao giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Tế bào vi khuẩn là những kháng nguyên, là một khảm kháng nguyên trong đó kháng nguyên O (ở tế bào) và kháng nguyên H (lông roi) có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng phƣơng pháp huyết thanh để chẩn đoán, xác định loài vi khuẩn gây bệnh một cách nhanh chóng và khá chính xác. Ngƣời ta đƣa kháng nguyên vi khuẩn vào trong cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh để thực hiện việc chẩn đoán. 27 Để tăng độ nhạy phản ứng của kháng huyết thanh nhất là trong trƣờng hợp số lƣợng tế bào vi khuẩn trong mô bệnh quá thấp, cần áp dụng các phƣơng pháp thử phản ứng theo phƣơng pháp miễn dịch khuếch tán trên gel hoặc phƣơng pháp miễn dịch liên kết men (ELISA) (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh học phân tử: Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống là nuôi cấy trên một vài môi trƣờng chọn lọc. Phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian và không đủ nhạy (sensitive) (So Young Yoo và ctv, 2002). Do đó, yêu cầu có một kỹ thuật chẩn đoán, phát hiện bệnh một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả. Các phƣơng pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn gây bệnh cây trồng nhƣ DNA probe, PCR, RFLP, RAPD,…Phƣơng pháp PCR là một trong những công cụ hữu hiệu trong việc xác định tác nhân gây bệnh cây trồng. Theo Kang và ctv ( 2003), kỹ thuật PCR cho phép phát hiện nhanh, nhạy, dễ dàng khi so sánh với lai probe (probe hybridization) và nó khuếch đại đặc hiệu một trình tự gen mục tiêu chỉ hiện diện trong genome của một loại vi khuẩn. Kỹ thuật PCR có thể đƣợc sử dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh hiện diện với mật độ thấp trên mô cây bị nhiễm bệnh. Trên vi khuẩn ngƣời ta thƣờng nghiên cứu vùng 16S ribosomal DNA (rDNA), 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs). Theo Subandiyah và ctv (2000), 16S rDNA là một công cụ hữu dụng để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài và sự tiến hóa giữa vi khuẩn và các sinh vật prokaryote khác, trình tự 16S rRNA và vùng hoạt động (intergenic region) giữa 16S rRNA và 23S rRNA đƣợc xem nhƣ có thể biến đổi giữa các dòng trong một loài. Theo Christopher và David (1999), khi xem xét mối quan hệ thân cận trong loài, 23S rDNA thƣờng cho phép phân tích tốt hơn 16S rDNA bởi vì nó lớn hơn (khoảng 2,5 kb trong khi 16S rDNA khoảng 1,5 kb) và nó chứa trình tự biến đổi ở mức độ cao hơn. Ngoài ra, nhiều gen mục tiêu khác cũng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu xác định mối quan hệ phát sinh loài và phân loại tác nhân lây nhiễm nhƣ gen mã hóa protein heat- shock 65 (hsp65) trên loài Mycobacterial, trình tự 23S rDNA và gen mã hóa protein bề mặt A (ospA) và gen flagellin (fla) trên loài Borrelia. So Young Yoo và ctv, (2002) đã đề 28 xuất một hƣớng mới trong nghiên cứu xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA. Vùng ITS (Internal transcribed spacer) là một đoạn (stretch) DNA nằm giữa tiểu đơn vị ribosom nhỏ (16S) và tiểu đơn vị ribosom lớn (23S). Việc thiết kế probe dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA mà nó thích hợp với kỹ thuật microarray để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra. Kết quả là đã tạo ra chip DNA chứa những probe đặc hiệu cho việc phát hiện nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh với tên thƣơng mại là Pathochip. 29 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm 3.1.1. Thời gian - địa điểm nghiên cứu Thời gian: đề tài đƣợc tiến hành từ 15/02/2006 đến 30/07/2006. Địa điểm nghiên cứu: - Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 3.1.2. Vật liệu Chủng vi sinh vật: các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây hại trên địa lan. Môi trƣờng Môi trƣờng PGA Môi trƣờng LB Khoai tây 200 g Bacto - tryptone 10 g Glucose 20 g Bacto – yeast extract 5 g Agar 20 g NaCl 10 g H2O 1.000 ml H2O 1.000 ml Môi trƣờng KB Môi trƣờng YDC Proteose peptone 20 g Yeast extract 10 g K2HPO4 1,5g Dextrose (Glucose) 20 g MgSO4.7H2O 1,5 g Calcium carbonate 20 g Glycerol 15 ml Agar 15 g Agar 15 g H2O 1.000 ml H2O 1.000ml 30 Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng Các thiết bị Dụng cụ Máy Vortex Ống nghiệm Lò Viba Micropipette các loại Máy điện di (Bio-Rad) Đầu típ các loại Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Eppendoft 0,2 ml, 1,5 ml Máy ly tâm (Sigma) Máy PCR (Thermus cycle) (Eppendoft) Các hóa chất sử dụng Hóa chất để ly trích DNA Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR TE 1X 10X buffer PCR (Bio-Rad) SDS 10% MgCl2 50 mM (Bio-Rad) NaCl dNTP's mix 25 mM (Bio-Rad) CTAB/NaCl Primer Xan1330, Xan322 và Erw1, Erw2 Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) Taq DNA polymerase Isopropanol Ethanol 70% Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số hộ trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt từ đó xác định đƣợc tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi, trò chuyện với từng hộ sản xuất. 3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn địa lan bị bệnh tại thành phố Đà Lạt. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng PGA. Cách phân lập mẫu: mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Cắt lấy mảnh nhỏ có kích thƣớc 3 – 5 mm 3 – 5 mm tại vị trí giữa mô bệnh và mô khỏe. Rửa mẫu bằng nƣớc cất 2 – 3 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó 31 rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên môi trƣờng PGA, để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc cấy chuyền sang đĩa khác để tạo dòng thuần. Cách đặt tên mẫu: EC06 – 1 là mẫu vi khuẩn đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh trên cây địa lan tại Đà Lạt năm 2006, mẫu 1. (E: Erwinia carotovora subsp. carotovora, C: Cymbidium). Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng các dòng vi khuẩn vừa phân lập đƣợc. Kiểm tra nhanh bằng cách sử dụng KOH 3%. Nhỏ một giọt KOH lên phiến kính, sau đó dùng tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc huyền phù trong giọt KOH đó khoảng 2 – 3 phút, nếu nhớt là gram âm ngƣợc lại là gram dƣơng. 3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC Trên môi trƣờng KB: dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy chấm điểm lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ đem chiếu dƣới tia UV và quan sát sự phát sáng của vi khuẩn. Trên môi trƣờng YDC: tƣơng tự nhƣ cấy lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ quan sát sự tạo sắc tố và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. 3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan với 17 mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc: EC06-1, EC06-3, EC06-5, EC06-6, EC06-7, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06- 17, EC06-18, EC06-19. Mỗi mẫu phân lập là một công thức, mỗi công thức tiến hành trên một mẩu củ khoai tây và một lá địa lan, bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại. Các mẩu củ khoai tây và lá địa lan không để vi khuẩn vào dùng làm đối chứng. Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn trên củ khoai tây Vật liệu - Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC. - Củ khoai tây bi không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 8 cm. - Giấy thấm đã sấy khử trùng, nƣớc cất, cồn 700. 32 Phƣơng pháp - Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm. - Củ khoai tây đƣợc rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Để khô tự nhiên sau đó dùng dao đã đƣợc khử trùng cắt thành từng miếng nhỏ và đặt vào hộp. Lấy một miếng thạch có chứa khuẩn lạc vi khuẩn và đặt vào chính giữa mẩu khoai tây. Sau đó, tất cả các hộp đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng. Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh vi khuẩn bao nhiêu ngày thì củ khoai tây bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên lá địa lan Vật liệu - Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC. - Lá địa lan cùng tu