Phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN KS. VƢƠNG HỒ VŨ KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Trước tiên con xin gởi ngàn lời cảm ơn đến ba mẹ kính yêu, ba mẹ đã luôn hy sinh để dành những gì tốt đẹp nhất cho con. Con xin cảm ơn tất cả người thân đã luôn yêu thương, quan tâm và luôn cổ vũ cho con học tập. Em xin chân thành cảm ơn:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt 4 năm học.  Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập Em xin trân trọng biết ơn cô Trần Thị Dân và thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn anh Vương Hồ Vũ, anh Lương Quý Phương đã luôn chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập. Em xin gởi lời cảm ơn đến:  Thầy Phát, anh Út, chị Hưng, chị Trang, cùng với các anh chị ở Trung tâm đã luôn giúp đỡ, động viên em trong những lúc khó khăn.  Các bạn lớp CNSH K29 thân yêu đã luôn cùng tôi chia xẻ, cổ vũ và giúp đỡ nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN Ngô Thị Thu Ngân, Đại học Nông Lâm TP. Hồ chí Minh, tháng 9/2007, “PHÁT HIỆN VIRUS DTH DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B”. Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Thị Dân KS. Vương Hồ Vũ KS. Lương Quý Phương Đề tài được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08 năm 2007 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá sinh trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH ngày càng được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH. Do đó, việc phát hiện virus DTH bằng phương pháp RT-PCR khuếch đại đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vào công tác chuẩn đoán bệnh và có thể được sử dụng để hình thành dữ liệu di truyền đánh dấu dịch tễ virus. Kết quả đạt được như sau: 1. Xác định được quy trình tách chiết RNA thích hợp từ mẫu lách. Nồng độ LiCl 2,5 M cho tủa RNA với độ tinh sạch và chất lượng sản phẩm khuếch đại cao. 2. Đưa ra được quy trình RT-PCR một bước phát hiện gen NS5B của virus DTH với nồng độ Taq giảm từ 2,5 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản phẩm khuếch đại không thay đổi. 3. Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tính cao. 4. Kết hợp được những đặc điểm bệnh tích thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH với nhau thông qua kết quả chẩn đoán RT-PCR dương tính. v SUMMARY Ngô Thị Thu Ngân, Department of Biotechnology, Nong Lam University, HCMC. September, 2007. The title of thesis: “DETECTION OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENE”. Thesis were carried out from 01/03/07 to 01/08/07 at Biochemical Analysis and Experimental Center, Nong Lam University. One of the genes of CSFV genome is NS5B gene, which is widely used for research on CSFV isolation and genetic typing. Therefore, CSFV detecting based on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic sequence data to be used for epidemiological tracing of virus. Results obtained from the study: (1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample. At LiCl 2,5 M concentration, we collected higher pure RNA precipitate which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product. (2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with Taq concentration decreased from 2,5 UI down 2 UI, but RT-PCR product quality was not different. (3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RT- PCR diagnostic. (4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive RT-PCR diagnostic result. vi MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa .............................................................................................................................. i Trang tựa ................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ................................................................................................................. iii Tóm tắt khóa luận ..................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................... v Mục lục ..................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii Danh sách các bảng .................................................................................................. ix Danh sách các hình và biểu đồ ................................................................................... x Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ........................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ........................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. Bệnh DTH .......................................................................................................... 3 2.2. Một số bệnh tích đặc trưng của bệnh DTH ........................................................ 5 2.2.1. DTH điển hình.................................................................................................. 5 2.2.2. DTH không điển hình ...................................................................................... 6 2.3. Cấu trúc bộ gen virus DTH ................................................................................ 6 2.4. Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm .................................. 9 2.5. Sơ lược các nghiên cứu liên quan .................................................................... 15 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................. 17 3.1. Thời gian và địa điểm ...................................................................................... 17 3.1.1. Thời gian ........................................................................................................ 17 vii 3.1.2. Địa điểm ......................................................................................................... 17 3.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 17 3.3. Vật liệu và hóa chất .......................................................................................... 17 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 17 3.3.2. Hóa chất ......................................................................................................... 17 3.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 19 3.5. Phương pháp tiến hành ..................................................................................... 21 3.5.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm ............................................................................... 21 3.5.2. Ly trích RNA tổng số ..................................................................................... 21 3.5.3. Phản ứng RT-PCR .......................................................................................... 24 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27 4.1. Kết tủa RNA ở các nồng độ LiCl khác nhau ................................................... 27 4.2. Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng. ............................................................ 28 4.3. So sánh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR .......................................... 30 4.4. Mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích .............................. 32 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 34 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 34 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 35 Tài liệu tiếng Việt ..................................................................................................... 35 Tài liệu tiếng Anh ..................................................................................................... 36 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 38 viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BDV : Border disease virus BVDV : Bovine viral diarrhoea virus cDNA : Complementary deoxyribonucleotide acid ctv : cộng tác viên DEPC : Diethyl pyrocarbonate DTH : Dịch tả heo EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate IRF-3 : IFN regulatory factor 3 IFN : Interferon M-MLV : Moloney murine leukemia virus MOPS : [N-morpholino] propanesulfonic acid 3’NTR : 3’ nontranslated NSP : Nonstructural protein PBS : Phosphate buffered saline OD : Optical density OIE : Office International des Epizooties RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcriptase – polymerase chain reaction SP : Structural protein Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet UI : Unit ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Thành phần phản ứng RT-PCR .............................................................. 25 Bảng 4. 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl ................................. 27 Bảng 4. 2: Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq. ........................................................ 29 Bảng 4. 3: Tỉ số OD của ELISA và kết quả RT-PCR .............................................. 30 Bảng 4. 4: So sánh các mức OD của ELISA và RT-PCR ........................................ 31 Bảng 4. 5: Đặc điểm bệnh tích các mẫu RT-PCR dương tính và âm tính ............... 32 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2. 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus ........................................................................ 7 Hình 2. 2: Phản ứng RT-PCR .................................................................................. 12 Hình 4. 1: Sản phẩm RT-PCR của mẫu kết tủa ở các nồng độ LiCl........................ 28 Hình 4. 2: Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq ...................................................... 29 Hình 4. 3: Kết quả sản phẩm RT-PCR các mẫu bệnh phẩm . .................................. 33 Biểu đồ 4. 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl. ............................ 27 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch tả heo (DTH) là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn nhất cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung. Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp châu Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó (Nguyễn Tiến Dũng, 1999) DTH là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân khác…Tác nhân gây bệnh là một virus thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có tính kháng nguyên chung với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và virus bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus). Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày càng khó kiểm soát. Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống. Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam. Để phân biệt chính xác virus gây bệnh DTH với những virus cùng chi Pestivirus như BVDV, BDV…, kĩ thuật RT-PCR trở nên hữu ích dựa trên các đoạn gen như E2 (Wirz, 1993; Harding, 1994; Rugg Li, 1996; Knepp, 2003; Risatt, 2002, 2004; Pereda, 2005). Paton và cộng sự (2000) phân tích ba đoạn gen (E2, 5’NTR, 2 NS5B) trong việc phân biệt chủng virus DTH và tổng kết sự phân biệt chủng virus DTH ở nhiều nơi trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các chủng ở một số nước. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về virus DTH của các tác giả như Bùi Nghĩa Vượng và ctv (2003), Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv (2001), Kim Văn Phúc và ctv (2004), Nguyễn Thế Vinh và ctv (2004), Hồ Thu Hương và ctv (2004)… tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những virus phân lập được từ các ổ dịch. Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus. Vì vậy việc thực hiện đề tài “Phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH sau này. 1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục tiêu Xác định quy trình RT-PCR phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B. 1.2.2. Yêu cầu Xác định triệu chứng và bệnh tích của heo bệnh, thu nhận mẫu bệnh phẩm. Ly trích RNA tổng số. Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton và cộng sự (2000) để nhân vùng gen NS5B. So sánh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm. 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. BỆNH DTH 2.1.1. Giới thiệu DTH là một bệnh quan trọng nằm trong danh sách loại A của OIE. Những bệnh thuộc trong danh sách A được định nghĩa như là những bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan rất nguy hiểm và nhanh chóng, bất chấp biên giới quốc gia, trở thành hậu quả nghiêm trọng đối với kinh tế xã hội và sức khoẻ cộng đồng, trở nên quan trọng chính trong việc kinh doanh thú và những sản phẩm từ chúng (OIE, 2001).  Tình hình nhiễm bệnh DTH trên thế giới DTH được mô tả đầu tiên vào năm 1833 ở Ohio – Hoa Kỳ. Những năm sau đó, một bệnh trên heo ở Châu Âu biết như là chứng sốt trên heo giống y hệt như bệnh mô tả ở Hoa Kỳ. Cuối thế kỷ 19, DTH phân tán khắp nơi trên thế giới. Với sự gia tăng hiểu biết về nguyên nhân và dịch tễ học bệnh DTH, nhiều quốc gia thành công trong việc tiệt trừ virus bằng cách đưa ra những biện pháp tương đối đơn giản như luật vận chuyển thú và sự ngăn cấm cho thú ăn thức ăn chưa xử lý như Đan Mạch (1933), Phần Lan (1956), Úc (1963), Canada (1964), Thụy Sỹ (1974) và Mỹ (1977). Năm 1997 đã in dấu đậm nét trong tâm trí các nhà dịch tễ học, virus học, những cán bộ thú y và những người hoạt động trong ngành chăn nuôi heo: bệnh DTH, một bệnh mà Liên hiệp châu Âu từng nghĩ là đã được thanh toán đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp (tính đến ngày 31/12/1997 có 424 ổ dịch tại Hà Lan). Năm nước khối EU (Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha và Bỉ) trở thành nạn nhân của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ. 4 Năm 2000, dịch bệnh xảy ra ở Anh. Năm 2001, dịch bệnh nổ ra ở Đức, Slovakia. Vào cuối năm 2003, dịch xuất hiện tại Nhật, Albania và Slovakia. Hiện nay, bệnh đã được ghi nhận khắp thế giới: Châu Âu, Trung Phi, Mexico, các nuớc Trung mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Á và Đông Nam Á: Hàn quốc, Indonesia, Philippine, Thái Lan, Việt Nam.  Tình hình bệnh DTH tại Việt Nam Tại Việt Nam, bệnh DTH được Houdemer phát hiện đầu tiên vào năm 1923- 1924. Từ đó, bệnh trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi heo nước ta. Năm 1949-1950, dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang các tỉnh Phú Yên, Yên Bái, Thái Nguyên, Hà Nội và Hải Phòng. Năm 1968-1969, dịch phát ra hơn 20 tỉnh miền Bắc, theo thống kê có 481 ổ dịch nổ ra. Theo báo cáo của Cục thú y (1986), tại các tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường bị bội nhiễm với bệnh phó thuơng hàn: An Giang, Long An (1984), Tiền Giang và Hậu Giang (1985). Năm 1985, tại Đồng Nai và TP. Hồ Chí Minh xuất hiện DTH bội nhiễm với bệnh tụ huyết trùng. Năm 2000, có 18106 trường hợp bệnh DTH được báo cáo tại Việt Nam. Hiện nay, bệnh DTH vẫn còn tồn tại ở các dạng bệnh không điển hình gây trở ngại cho việc chuẩn đoán. 2.1.2. Dạng bệnh DTH là một bệnh truyền nhiễm riêng của heo. Nguyên nhân gây ra bởi virus thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có quan hệ mật thiết với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (bovine viral diarrhoea-BVD) và virus gây bệnh biên giới ở cừu (Boder disease-BD). Bệnh DTH có thể xuất hiện ở nhiều dạng khác nhau. Tuy nhiên, người ta chia bệnh DTH ra làm 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng, 1999): 5  Dạng siêu cấp tính: xuất hiện đột ngột không có triệu chứng ban đầu, sốt cao kết hợp với trạng thái thương hàn. Heo bệnh tử vong trong vòng 24 đến 48 giờ, chưa kịp xuất hiện triệu chứng trên da nên gọi là DTH trắng.  Dạng cấp tính: gây sốt cao từ 41 - 420C, heo bệnh biểu hiện mệt điển hình như heo con nằm chất đống. Sau 24 - 48 giờ mắt sưng húp và viêm kết mạc với các triệu chứng ngoài da (như vết chàm tím, xuất huyết, tụ huyết màu đỏ tại các vùng da mỏng, tai, chân, bụng, bao dương vật…), viêm dạ dày ruột (tiêu chảy, nôn mửa…), triệu chứng hô hấp (ho, tụ huyết phổi) và có thể xuất hiện triệu chứng thần kinh (loạng choạng, liệt, liệt nhẹ các chi sau…), tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngày sau khi phát bệnh.  Dạng á cấp tính hoặc mãn tính diễn ra trong 3 giai đoạn: Giai đoạn đầu: kéo dài 10 - 15 ngày, toàn bộ đàn heo phát bệnh, các triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tính nhưng ở mức độ nhẹ. Giai đoạn hai là giai đoạn thuyên giảm. Giai đoạn ba: xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phát bệnh toàn thân với các triệu chứng cục bộ về hô hấp hoặc tiêu hoá hoặc cả hai (viêm phổi và ruột thông thường do Salmonella). Heo bệnh gầy mòn và tử vong trong vòng 1 đến 3 tháng.  Dạng không điển hình: biểu hiện dưới các dạng rất khác nhau như rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, thai chết, thai gỗ, dị dạng gây run rẩy bẩm sinh, rối loạn vận động, chết yểu…), chậm lớn, chết rải rác. Dưới dạng này, virus DTH có thể lưu hành một cách không rõ ràng, nhất là heo sinh sản với các trường hợp lâm sàng lẻ tẻ nổ ra khi có các điều kiện thuận lợi (như stress, chuyên chở…). 2.2. MỘT SỐ BỆNH TÍCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH 2.2.1. DTH điển hình (cấp tính, á cấp tính hoặc mãn tính) Biểu hiện bệnh tích sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ, biến đổi huyết học. 6 Trên da: xuất huyết lấm chấm hoặc từng đám, chàm xanh nhất là da tứ chi (tai, chân), xuất huyết vùng bụng và bao quy đầu ở heo đực. Hạch bạch huyết: dải hạch vùng xương chậu và hạch ruột sưng to, màu đá hoa văn, tụ huyết hoặc xuất huyết vùng vỏ hoặc toàn bộ. Thận: không sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột màng bao thận (thận trứng gà tây). Lách: không sưng, nhồi huyết bên rìa lách. Bàng quang: niêm mạc xuất huyết lấm chấm. Amiđan: sưng to và xuất huyết. Tim: xuất huyết cơ tim và trên vành tim. Hệ hô hấp: tụ huyết, xuất huyết phổi, tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm. Hệ tiêu hoá: tụ huyết và xuất huyết. Giảm bạch cầu. 2.2.2. DTH không điển hình Bệnh tích thay đổi không đặc hiệu: xuất huyết, viêm, dị dạng. Da: xuất huyết. Các hạch lâm ba: viêm hạch lâm ba có thể có xuất huyết lấm chấm. Trên não: xuất huyết. 2.3. CẤU TRÖC BỘ GEN VIRUS DTH Virus DTH thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có chung tính kháng nguyên với virus bệnh tiêu chảy ở bò và bệnh biên giới ở cừu. Virus DTH là một loại virus RNA chuỗi đơn dương có vỏ bọc đường kính 40 - 50 nm. RNA virus mã hoá 4 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc. Chỉ có một týp huyết thanh xác định. So với virus gây bệnh biên giới, những dòng virus DTH hình thành một nhóm kháng nguyên đồng dạng có quan hệ với nhau nhưng có một vài thay đổi tồn tại giữa những dòng phân lập. Những phản ứng chéo huyết thanh với virus BVD và BD có thể xảy ra và gây trở ngại trong chẩn đoán huyết thanh. 7 Bộ gen virus có chuỗi đơn RNA dài 12,3 kb. Bộ gen đã được biết trình tự gen hoàn toàn, chứa một khung đọc mở nằm ở bên sườn của 5’-UTR và 3’-UTR mã hoá một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid. Polyprotein này được cắt bởi protease được mã hoá bởi virus và tế bào vật chủ để tạo nên protein trưởng thành của virus gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1 và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (N pro, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B). Trình tự của sản phẩm gen dọc theo khung đọc mở là: Hình 2. 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus (Brett D. L., 2007) Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của virus sẽ được xử lý thành những protein virus riêng biệt. Protein đầu tiên mã hoá là Npro một protein không cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C. Peptidase ký chủ phân cắt những vị trí C/E rns , E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt không hoàn toàn ở vị trí E2/p7. NS2-3 được phân cắt bởi autoprotease NS2. Sự phân cắt của polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi enzyme protease serine NS3-4A.  Npro là autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein. Npro không cần thiết đối với sự sao chép virus. Npro cũng hoạt động như một chất đối NH2-(N pro -C-E rns -E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH 8 kháng của sự hoạt hoá IRF-3 và sự sản xuất ra IFN, ức chế sự phiên mã IRF-3 ở những tế bào nhiễm virus DTH. Những đột biến bỏ đi Npro của virus DTH đã được đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống.  Protein cấu trúc C (mã hoá protein p14): là protein của nucleocapsid. Đầu cuối C (C- terminus) của protein C ở virus DTH đã được xác định và được định vị ở phần kỵ nước của chuỗi peptide tín hiệu bên trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di chuyển của Erns vào trong khoang mạng lưới nội chất. E rns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): là các protein vỏ. E2 và E rns có tính kháng nguyên mạnh nhất. Erns có tác dụng hỗ trợ thải virus qua một màng đặc biệt, được tiết ra từ tế bào nhiễm, đặc điểm nổi bật của Erns là hoạt tính ribonuclease với tính chuyên biệt đối với gốc uridine. Những kháng thể ức chế hoạt tính ribonuclease có khuynh hướng trung hoà tính nhiễm virus, sự đột biến ở Erns phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng virus. Erns tái tổ hợp là một độc chất đối với tế bào bạch huyết trong ống nghiệm, có thể kết hợp với sự giảm bạch cầu ở nhiễm tự nhiên. Mặc dù độc tính tế bào là một đặc điểm nổi bật của những enzyme ribonuclease hoà tan khác nhưng người ta chưa rõ là hoạt tính ribonuclease của Erns có liên quan đến độc tính của nó hay không. Vùng đầu cuối C (C-terminal) của Erns có thể khởi động sự di chuyển của nó qua màng tế bào, có thể coi như là mục tiêu hoặc chức năng trong tế bào. Tuy nhiên, Erns tái tổ hợp cũng có thể nối một cách vững chắc với bề mặt tế bào qua sự tương tác với glycosaminoglycan và ức chế sự lây nhiễm. E1 và E2 là những protein màng không thể thiếu. E2 của virus DTH tái tổ hợp có thể kết hợp với các tế bào và ngăn chặn sự lây nhiễm của virus DTH và BVD. Mặc dù vai trò quan trọng của những glycoprotein ở virus là lắp rắp và tiếp nhận nhưng những kháng thể đối với Erns hoặc E2 có thể trung hoà tính lây nhiễm của virus và cả hai kháng nguyên này có thể tạo ra tính sinh miễn dịch bảo vệ. 9  Protein p7 theo sau những protein cấu trúc, gồm một vùng đảm đương nhiệm vụ trung tâm đối với việc tách đầu cuối kỵ nước và cần cho sự sản sinh của virus lây nhiễm nhưng không đòi hỏi trong quá trình sao chép RNA. P7 của pestivirus được phân cắt một cách không hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt. E2- p7 không phân cắt không cần thiết đối với sự sao chép trong nuôi cấy tế bào và cả hai E2-p7 và p7 giúp tế bào kết hợp với nhau. Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 là một protein cấu trúc hay không cấu trúc mặc dù nó không được phát hiện trong virus tinh sạch. Pestivirus có p7 thì có thể hình thành những kênh ion tham gia trong sự lắp ráp và tiếp nhận của virus.  Protein không cấu trúc Protein NS2 là một enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine đã được nhận diện. Sự phân cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao chép RNA của pestivirus và hiệu quả phân cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bào và có thể xác định tính gây bệnh tế bào. Vùng NS2-3 tham gia lắp ráp virus. NS3 chứa một vùng protease serine ở đầu cuối N và một helicase RNA ở đầu cuối C. Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A như là một yếu tố hỗ trợ. Protease serine NS3-4A phân cắt giữa leucine và những amino acid không phân cực nhỏ. Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến sự sao chép RNA virus,đóng vai trò thiết yếu trong khả năng tồn tại của virus. NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3. NS4A và NS4B không đóng vai trò thiết yếu trong sự sao chép RNA của virus. NS5A và NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phân cắt hoàn toàn cũng không khác gì NS5A-5B không phân cắt. Chức năng của NS5A chưa được biết rõ. NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA dependent RNA polymerase). 10 2.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DTH TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM (1) Phân lập virus (2) Đánh dấu miễn dịch phát hiện virus trong nuôi cấy tế bào (3) Phương pháp hoá mô (4) ELISA phát hiện kháng nguyên hoặc ELISA phát hiện kháng thể (5) Phản ứng trung hoà (6) Phương pháp reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) RT-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh và nhạy hơn so với phương pháp ELISA và phân lập virus, thích hợp trong chuẩn đoán bệnh sớm, tránh được sự nhiễm khuẩn từ môi trường bên ngoài 2.4.1. PCR (Polymerase chain reaction) Khái niệm: PCR là một tiến trình lặp đi lặp lại bao gồm 3 công đoạn: biến tính mẫu bởi nhiệt, bắt cặp những mồi nucleotide với trình tự đích mạch đơn, kéo dài mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Biến tính: mẫu DNA mạch đôi biến tính ở nhiệt độ được xác định bởi thành phần G+C. Thành phần G+C càng cao thì nhiệt độ đòi hỏi tách mạch càng cao. Những phân tử DNA càng dài thì thời gian cần ở nhiệt biến tính để tách hai mạch một cách hoàn toàn càng lớn. Nếu nhiệt độ biến tính quá thấp hoặc nếu thời gian quá ngắn thì chỉ có những vùng giàu AT sẽ bị biến tính. Khi nhiệt độ bị giảm trễ hơn trong chu trình PCR, DNA mẫu sẽ tái bắt cặp thành một tình trạng nguyên gốc. Trong những phản ứng PCR xúc tác bởi Taq DNA polymerase, sự biến tính được tiến hành ở 94 - 950C, là nhiệt độ cao nhất mà enzyme có thể chịu được khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn mà không chịu được tác hại quá mức. Trong chu kỳ đầu của PCR, sự biến tính thỉnh thoảng được tiến hành khoảng 5 phút để gia tăng khả năng những phân tử DNA mẫu được biến tính đầy đủ. Tuy nhiên, thời gian biến tính khoảng 45 giây ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thông thường có thành phần G+C là 55% hoặc thấp hơn. 11 Mẫu DNA giàu G+C (> 55%) thì nhiệt độ biến tính càng cao. DNA polymerase phân lập từ Archaea thì chịu nhiệt hơn Taq do đó nó thích hợp khuếch đại DNA giàu G+C. Bắt cặp mồi với DNA mẫu: nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, mồi oligonucleotide bắt cặp ít với mẫu, như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp việc bắt cặp của mồi không đặc hiệu có thể xảy ra, kết quả là tạo ra những đoạn DNA không mong muốn. Sự bắt cặp được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy 3 - 50C. Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp, nên tiến hành một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide. Kéo dài mồi: việc kéo dài mồi được tiến hành ở hoặc gần nhiệt độ thích hợp đối với sự tổng hợp DNA xúc tác bởi polymerase chịu nhiệt, trong trường hợp Taq polymerase nhiệt độ thích hợp là 72 - 780C. Số chu kì: phụ thuộc vào lượng DNA đưa vào phản ứng, hiệu quả của việc kéo dài mồi và sự khuếch đại. Thông thường sau 30 chu kì tạo được khoảng 105 bản sao. 2.4.2. RT-PCR Khái niệm: là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại RNA thành cDNA. Nhạy và đa năng, RT-PCR được sử dụng để hồi phục và nhân đầu cuối 5’và 3’ của mRNA và hình thành thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA. Thêm vào đó, RT-PCR dễ dàng xác định đột biến và những đa hình trong những trình tự được sao lại và đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế. Bước đầu tiên là chuyển RNA thành cDNA. Một mồi oligodeoxynucleotide được lai với RNA và sau đó kéo dài bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA- dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA. Kết thúc tiến trình tạo cDNA là chuyển qua tiến trình PCR để nhân lên một lượng lớn cDNA. 12 Hình 2. 2: Phản ứng RT-PCR . Khuôn RNA Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt cho gene). cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase. Sợi cDNA được tạo thành. Khuôn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA được sử dụng để thực hiện PCR. Sự gắn của primer với cDNA. Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ Taq polymerase. cDNA sợi đôi được hình thành. Ba bước biến tính, bắt cặp, kéo dài được lặp lại nhiều lần. 13 2.4.3. Các thành phần quan trọng trong phản ứng  Dung dịch đệm (buffer) Có tác dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Thành phần dung dịch đệm gồm KCl, MgCl2, Tris-HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng).  MgCl2 Tạo thành một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính của enzyme polymerase, tăng Tm (nhiệt độ nóng chảy) của DNA và tăng sự tác động hổ trợ của mồi và DNA mẫu. Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 0,5 – 5 mM với mức tối ưu là 1 – 2 mM, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998).  Mồi (primer) Mồi là một trong những thành phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng. Trình tự mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi và đặc trưng cho trình tự đoạn gen được khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên đoạn gen. Chiều dài mồi không được quá lớn thường trong khoảng 17- 25 nu, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001). Chiều dài mồi càng lớn sự tách các DNA mẫu để bắt cặp với mồi càng nhỏ. Chiều dài và thành phần G-C của mồi đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ Tm của mồi. Tm ( 0C) = [(số G + C) * 4 + (số A + T) * 2] Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng. Nồng độ mồi quá cao hình thành nên cấu trúc dimer (mồi gắn mồi).  Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Sự mất cân bằng trong thành phần dNTPs làm tăng các lỗi sao chép của 14 enzyme polymerase vì vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả các dNTP đều bằng nhau. Nồng độ dNTPs thường dùng trong khoảng 20 – 200 µM, dung dịch dNTPs gốc phải giữ trung tính pH7,0.  Taq polymerase Là một enzyme polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính trong phản ứng, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C. Nồng độ Taq sử dụng được khuyến cáo trong khoảng 1 - 2,5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng. Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt, nồng độ Taq quá thấp không đủ lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản phẩm theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999).  Số chu kỳ trong phản ứng Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vào lượng bản sao mẫu ban đầu. DNA mẫu là 105 tương ứng với 25 - 30 chu kỳ, 102 - 103 tương ứng với 35 - 40 chu kỳ. Không nên vượt quá 40 chu kỳ vì hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do: Sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001).  Mẫu Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg – 1 µg trên 25 µl dung dịch phản ứng. Nồng độ mẫu quá ít dẫn đến phản ứng không đặc hiệu, nồng độ quá cao tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn.  RNAsin Được dùng để ức chế enzyme phân huỷ RNA, giữ cho mẫu không bị mất trong quá trình thực hiện phản ứng. 15  Enzyme reverse transcriptase Trong phản ứng RT-PCR thành phần không thể thiếu là enzyme phiên mã ngược, MMLV hoạt động như là một enzyme polymerase giúp tổng hợp sợi cDNA từ RNA và với hoạt tính của enzyme RNAse H có độ nhạy cao giúp phân cắt sợi RNA trong mạch đôi RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng PCR. 2.5. SƠ LƢỢC CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 2.5.1. Trong nƣớc Từ năm 1996-1998, Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv khảo sát hội chứng sốt, táo bón, bỏ ăn đến chết và kháng nguyên virus DTH bằng miễn dịch huỳnh quang và ELISA ở đàn heo sinh sản và heo con tỉnh Khánh Hoà và Quảng Ngãi cho thấy virus DTH chiếm tỷ lệ không nhỏ trong các tác nhân gây hội chứng này. Từ năm 2002-2003, Akemi Kamakawa và ctv tiến hành khảo sát bệnh DTH giữa các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen 5’NTR. Nguyễn Thế Vinh và ctv, năm 2004 nghiên cứu phân tích di truyền virus DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH và so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới. Kết quả đưa ra là các chủng virus DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt Nam. Hồ Thu Hương và ctv, năm 2004 so sánh 4 phương pháp chẩn đoán virus DTH (phân lập virus, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RT- PCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau. Theo các tác giả, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu. Bùi Nghĩa Vượng và ctv, năm 2004 chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp RT-PCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng có thể phát hiện được virus DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng. 16 2.5.2. Trên thế giới Với sự thiệt hại kinh tế nghiêm trọng mà bệnh DTH gây ra ở các quốc gia có dịch bệnh thì DTH là một đối tượng ngày càng có nhiều nghiên cứu về dịch tễ lâm sàng, các phương pháp chẩn đoán, sự lây nhiễm và phân bố của các chủng virus DTH và đồng thời nghiên cứu vaccin trong phòng trị bệnh. Barbara và ctv, năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vào việc phát hiện và biệt hoá virus DTH từ các pestivirus khác. Nghiên cứu dấu hiệu lâm sàng và dịch tễ của bệnh DTH của các tác giả như Artois và ctv (2002), Moennig và ctv (2003). Nhiều tác giả nước ngoài dùng kỹ thuật RT-PCR để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh dựa trên đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B., 1993; Harding, 1994; Rugg li,1996; Knepp, 2003; Risatt I, 2002, 2004; Pereda, 2005). Paton và ctv (2000) phân tích các chủng virus DTH dựa vào đoạn gen E2, NS5B và 3’NTR ở nhiều nơi trên thế giới, kể cả vài nước châu Á kết quả cho thấy mối quan hệ gần giữa các chủng gây bệnh ở một số nước. 17 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Mẫu bệnh phẩm là lách của heo bệnh và các dữ liệu liên quan đến bệnh được gởi từ tỉnh Tiền Giang. Tiến hành thử nghiệm quy trình phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá sinh trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Chọn quy trình ly trích RNA thích hợp từ mẫu lách  Chọn quy trình RT-PCR có hiệu quả nhất trong việc phát hiện gen NS5B  So sánh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA  Khảo sát mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích. 3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu dùng trong ly trích RNA (lách đã được xét nghiệm ELISA dương tính với kháng nguyên E2 được gởi từ Chi cục Thú y Tiền Giang, các mẫu dương tính khi tỉ số OD từ 0,3 trở lên) và phản ứng RT-PCR phát hiện gen NS5B. 18 3.3.2. Hóa chất Hoá chất dùng trong ly trích RNA tổng số  Dung dịch D là dung dịch ly giải tế bào: 2 M guanidium thiocyanate 25 mM sodium citrate 0,5% sarkosyl (w/v)  100 mM -mercaptoethanol, pH7  2 M sodium acetate, pH4  Phenol  Chloroform  Isopropanol  Ethanol 75% Hoá chất dùng trong điện di gel biến tính  Dung dịch đệm: 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml), thành phần:  0,2 M MOPS (pH7)  20 mM sodium acetate  10 mM EDTA  Dung dịch nạp mẫu: 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml), thành phần:  50% glycerol  10mM EDTA  0,25% (w/v) bromophenol blue  0,25% (w/v) xylene cyanol Hoá chất và dụng cụ trong điện di gel TBE  Dung dịch đệm TBE 50X  Tris 242 g/l  Boric acid 57.1 ml/l  EDTA 0.5M pH 8.0 100 ml/l 19  Agarose (Biorad)  Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20% Ficoll 400; 0,1 M disodium EDTA, pH 8; 1% sodium dodecyl sulfate; 0,25% bromphenol blue; 0,25% cylene cyanol)  Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 0,5 mg/ml: 50 mg ethidium bromide, 100 ml H2O. Dung dịch sử dụng 0,5 µg/ml pha loãng 1:1000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm – bảo quản tránh ánh sáng).  Thang DNA chuẩn  Bộ dụng cụ điện di nằm  Bộ nguồn điện một chiều  Lược gel  Khuôn đổ gel  Micropipette các loại. Hoá chất dùng trong phản ứng RT-PCR  Rnase-free water  Buffer PCR  MgCl2  dNTPs  Mồi xuôi  Mồi ngược  Taq polymerase  Rnasin  MMLV reverse trancriptase  Triton X–100 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM  Thí nghiệm 1: Kết tủa RNA ly trích ở các nồng độ LiCl khác nhau LiCl là một tác nhân khử nước mạnh, với đặc tính hoà tan RNA thấp hơn DNA do đó muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook và 20 Russell, 2001). Để khảo sát hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA, trong quá trình ly trích mẫu chúng tôi thực hiện thu tủa RNA với các nồng độ muối LiCl khác nhau. Từ đó chọn nồng độ muối LiCl thích hợp nhất trong thu tủa RNA, đưa ra quy trình tách chiết RNA thích hợp. Thí nghiệm này được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Gồm 4 nghiệm thức (LiCl 1,0 M; LiCl 1,5 M; LiCl 2,0 M; LiCl 2,5 M), mỗi nghiệm thức được lặp lại trên 5 mẫu. Chỉ tiêu khảo sát là tỉ số OD, hàm lượng RNA thu được và sản phẩm RT- PCR thu được từ các mẫu. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức, chọn ra nghiệm thức thích hợp nhất.  Thí nghiệm 2: Thử nghiệm hàm lƣợng Taq khác nhau trong phản ứng RT-PCR Hàm lượng Taq được khuyến cáo trong khoảng 1 – 2,5 UI trên 100 µl dung dịch phản ứng. Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt (Bùi Chí Bửu, 1999). Vì vậy, bước đầu chúng tôi thực hiện thí nghiệm thay đổi lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng. Thí nghiệm được thực hiện trên 5 mẫu khác nhau, mỗi mẫu được chạy phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khác nhau là 2,0 UI và 2,5 UI. Chỉ tiêu khảo sát thí nghiệm này là tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thành công và băng sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel 2%.  Khảo sát 3: So sánh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR Nhằm khảo sát có hay không sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD của ELISA Với 23 mẫu bệnh phẩm có kết quả OD của ELISA phát hiện kháng nguyên E2 được gởi từ Chi cục Thú y Tiền Giang so sánh với kết quả RT-PCR chúng tôi thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm. 21  Khảo sát 4: Khảo sát mối liên hệ giữa đặc điểm bệnh tích của những heo chẩn đoán dƣơng tính với bệnh DTH bằng phƣơng pháp RT-PCR Bệnh DTH với các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích không đều nhau và có nhiều biến đổi không điển hình. Vì vậy, chúng tôi xem xét những mẫu dương tính trong phương pháp chẩn đoán RT-PCR có những đặc điểm bệnh tích như thế nào. Khảo sát được thực hiện dựa trên kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở 23 mẫu lách với những đặc điểm bệnh tích nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được gởi từ Chi cục Thú Y Tiền Giang). 3.5. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu khi heo có một số bệnh tích nghi ngờ của DTH như sau: Da xuất huyết Gan xuất huyết, hoại tử Lách xuất huyết, nhồi huyết hoặc hoại tử ở rìa lách Thận xuất huyết, xung huyết Phổi xuất huyết, tụ huyết, hoại tử hoặc phổi hoá gan (màu sắc giống gan, thả vào nước bị chìm) Tim xuất huyết Dạ dày xuất huyết Ruột xuất huyết hình cúc áo Mẫu bệnh phẩm là lách đã được xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên E2 dương tính. Lấy khoảng 100 g mẫu cho vào túi nilông vô trùng được bảo quản trong bình đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cho đến khi xét nghiệm. 22 3.5.2. Ly trích RNA tổng số  Mẫu có thể đƣợc xử lý theo 2 cách:  Mẫu bệnh phẩm lách được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bào (tỉ lệ mẫu so với dịch PBS là 20%) Các bước tiến hành: Bước 1: Cắt một phần lách cho vào cối, dùng kéo cắt nhỏ, cho một lượng dịch PBS tương ứng vào, dùng chày nghiền nhuyễn cho đến khi không còn cặn. Bước 2: Thu dịch nghiền vào eppendorf lớn, giải đông 3 lần. Bước 3: Ly tâm 5000 vòng/10 phút ở 40C Bước 4: Thu dịch tế bào, bỏ cặn. Dịch tế bào thu được bảo quản ở -700C cho đến khi tiến hành ly trích mẫu.  Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn. Các bước tiến hành: Bước 1: Cối chày được làm lạnh với nitơ lỏng -1960C, cắt một lượng mẫu cho vào cối chày, đổ vào một lượng nhỏ nitơ, dùng chày nghiền nhuyễn. Bước 2: Khi mẫu đã ở dạng bột nhuyễn, thu mẫu với lượng khoảng 30 mg cho vào mỗi eppendorf. Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng.  Tiến hành ly trích RNA tổng số Nguyên tắc ly trích RNA từ mẫu dịch tế bào dựa theo quy trình của Chomezynski và Sacchi (1987): Dịch tế bào được đồng nhất chung với dung dịch D và -mercaptoethanol nhằm phá vỡ màng tế bào phóng thích ra các thành phần nội bào (DNA, RNA, protein…). Đồng thời guanidium thiocyanate có trong dung dịch D làm biến tính protein mạnh và ức chế hoạt động của Rnase. Phenol, chloroform cho vào tiếp sau đó nhằm kết tủa protein và pH4,0 của phenol có tác dụng kéo DNA vào pha phenol. Ly tâm tốc độ cao nhằm thu được dịch trong bên trên chứa RNA, nhiệt độ lạnh hạn chế sự phân huỷ RNA. 23 Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA. LiCl là một tác nhân khử nước mạnh, với đặc tính hoà tan RNA thấp hơn DNA do đó được dùng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook và Russell, 2001). Tủa RNA được rửa với ethanol 75% từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl, giảm nồng độ ethanol ban đầu. Tủa RNA sau khi được làm khô thì hoà tan trong nước đã được khử với DEPC và bảo quản ở -700C nhằm tránh sự phân huỷ của Rnase. Các bước tiến hành ly trích:  Hút khoảng 350 µl dịch tế bào vào ống eppendorf.  Cho vào 500 µl dung dịch D và 3,6 µl -mercaptoethanol.  Đồng nhất mẫu, vortex trong 10 giây.  Sau đó cho thêm 50 µl sodium acetate 2 M, pH 4,0; 500 µl phenol bão hoà pH4,0; 100 µl chloroform.  Dùng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu, vortex 10 giây.  Làm lạnh trên đá khoảng 15 phút.  Li tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C.  Hút khoảng 400 µl dịch nổi, thêm 400 µl ethanol + LiCl và giữ ở -200C trong 1 giờ.  Li tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa.  Rửa tủa bằng ethanol 75%, votex nhẹ, li tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu tủa (rửa 2 lần).  Hút bỏ dịch nổi, tủa làm khô tự nhiên trong không khí khoảng 45 phút. Hoà tan với 30 µl nước đã khử DEPC. Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế Đo độ tinh sạch và hàm lượng RNA sau khi ly trích bằng quang phổ kế (model HP 8453) ở bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm Cách tiến hành: Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đã khử DEPC. Hút 995 µl nước đã khử DEPC cho vào curvet, sau đó thêm 5µl mẫu → trộn đều → độ pha loãng 200 lần. Cuối cùng là đặt curvet vào máy để đo OD. 24 Độ tinh sạch của RNA được tính bằng tỉ số OD260nm /OD280nm và tỉ số OD260nm /OD230nm . Tỉ số OD260nm/OD280nm đạt 1,8-2,0 thì xem như RNA ly trích tương đối sạch. Tỉ số này sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol. Tỉ số OD260nm/OD230nm đạt 1,5-2,0 coi như RNA ít tạp nhiễm, tỉ số này thấp hơn khi bị nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa. Hàm lượng RNA được tính theo công thức: Hàm lƣợng RNA (ng/µl) = WL1 (OD260nm)* 40 ng/µl* Độ pha loãng Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ng/µl cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998) RNA ly trích có thể dùng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Kiểm tra RNA bằng điện di biến tính: Xem kết quả có xuất hiện 2 band chuẩn 18S, 28S. Nếu kết quả có xuất hiện 2 band 18S và 28S thì quá trình ly trích RNA thành công.  Tiến hành điện di:  Chuẩn bị gel 1,5%:  Cân 0,3 g agarose, thêm vào 14,4 ml nước đã khử DEPC.  Nấu trong 2 phút ở 650W  Để nguội đến 550C, cho thêm vào:  2 ml MOPS 10X  3,6 ml formaldehyde  Lắc đều, đổ gel và chờ gel nguội khoảng 45 phút.  Chuẩn bị RNA:  Mỗi phản ứng cần: 10X MOPS 2 µl Formaldehyde 4 µl Formamide 10 µl RNA 10 µl  Ủ ở 650C trong 15 phút.  Ủ đá 15 phút. 25  Cho thêm 2 µl loadingdye trộn đều và bơm vào giếng trên gel.  Điện di 30V trong 180 phút hoặc 50V trong 90 phút.  Sau đó lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phút, chụp Cuối cùng là chụp gel và đọc kết quả. 3.5.3. Phản ứng RT-PCR Quy trình RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton và ctv (2000). Cặp mồi của gen NS5B: Forward: 5’-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3’ (11138-11157) Reverse: 5’-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3’ (11586-11567) → Kích thước đoạn gen là 449 bp. Cặp mồi này sử dụng phát hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phân lập (Paton, 2000). Những thử nghiệm dựa trên sự khuếch đại gen NS5B được sử dụng rộng rãi trong việc phân loại di truyền, do đó phương pháp RT-PCR dựa trên đoạn gen NS5B thích hợp là phương pháp chẩn đoán tiêu chuẩn hoá để đi sâu xác định chính xác chủng virus DTH. Quy trình RT-PCR: chuẩn bị 50 µl hổn hợp phản ứng RT-PCR với các thành phần phản ứng như sau: Bảng 3. 1: Thành phần phản ứng RT-PCR Tên hoá chất Nồng độ cuối Rnase- free water Buffer PCR 1X MgCl2 6 mM dNTPs 0,4 mM Mồi xuôi 0,1 µM Mồi ngược 0,1 µM Triton X-100 0,2% Taq polymerase 2,5 UI Rnasin 10UI MMLreverse trancriptase 100 UI RNA mẫu Tổng thể tích 50µl 26 Buffer 10X gồm: 500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl (pH 8,3 ở nhiệt độ phòng), 15 mM MgCl2 Quy trình nhiệt đối với gen NS5B: Giai đoạn RT: 500C/30 phút, 950C/3phút. Giai đoạn PCR: 35 chu kì (940C/1phút, 520C/1phút,720C/1phút) Bước kéo dài chuỗi: 720C/10phút Điện di trên gel Cách tiến hành: Pha loãng dung dịch TBE 50X để có dung dịch TBE 0,5X. Pha gel agarose với nồng độ 2%: Cân 0,25 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TBE 0,5X. Đun sôi bằng lò viba cho agarose tan thật đều. Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lược vào. Chờ 30 phút để agarose đông. Gở lược ra rồi đặt bảng gel vào buồn điện di cho đúng chiều. Cho dung dịch TBE ngập gel. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 6 μl mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA trong 20 phút hoặc 60 V, 250 mA, thời gian khoảng 60 phút nếu chạy chung với thang chuẩn. Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phút. Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có sản phẩm thì băng sản phẩm sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT- PCR thu được. Đọc kết quả điện di Gen NS5B với sản phẩm thu được là băng điện di có kích thước khoảng 449 bp. 3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu dạng liên tục được phân tích bằng trắc nghiệm F. So sánh tỉ lệ bằng Chi bình phương. 27 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT TỦA RNA Ở CÁC NỒNG ĐỘ LICL KHÁC NHAU Chúng tôi thực hiện ly trích RNA từ mẫu lách dựa theo quy trình của Chomeszynski và Sacchi (1987) và thu tủa