Phát hiện virus Gumboro bằng phương pháp kết tủa trên thạch

PHÁT HIỆN VIRUS GUMBORO BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRÊN THẠCH GVHD:TS.Nguyễn Ngọc Hải SVTH :Phan Thị Phương Thanh I.LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời,nó mở ra một cánh cửa hy vọng mới đầy tiềm năng cho các nhà khoa học nói riêng và cho toàn thế giới nói chung.Với thao tác trên các vật liệu ở mức độ phân tử như DNA,RNA,protein…các kỹ thuật sinh học phân tử có thể phát hiện ra các loại vi khuẩn,virus gây bệnh hiện diện trong cơ thể sinh vật. Ngành nông nghiệp trong đó chăn nuôi gia cầm đóng vai trò khá quan trọng trong tồng thu nhập của một quốc gia nhất là đối với các quốc gia đang phát triển.Thế nhưng,ngành chăn nuôi ngày nay phải đối mặt với rất nhiều vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe vật nuôi.Tình hình dịch bệnh đang ngày càng lan rộng với các chủng virus mới,các chủng virus đột biến gây khó khăn rất nhiêu cho việc chẩn đoán và chữa trị cho vật nuôi.Do vậy,sẽ khả thi hơn nếu chúng ta áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán và chữa trị . Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho chăn nuôi gà, kể cả gà nuôi công nghiệp và gà chăn thả vườn. .Tỷ lệ chết của gà khi bị nhiễm bệnh từ 3-20% nếu không ghép với các bệnh khác và từ 21-100% nếu nhiễm kèm với các bệnh khác gây ra bởi virút, vi khuẩn, ký sinh trùng.Việc áp dụng kỹ thuật phân tử vào việc phát hiện virus Gumboro trên gia cầm sẽ rút ngắn thời gian hơn do đó việc chữa trị và hạn chế sự lây lan mầm bệnh sẽ hiệu quả hơn. II.TỔNG QUAN II.1.Giới thiệu về bệnh Gumboro Gumboro là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà và gà tây được gây ra bởi Infectious bursal disease virus (IBDV),đặc trưng bởi sự phá huỷ túi Fabricius . Đây là nhóm virus gây bệnh thuộc nhóm không có vỏ bọc, có sức chịu đựng rất cao, thời gian nung bệnh ngắn, do đó khả năng truyền bệnh rất mạnh. Mầm bệnh có thể sống hàng tháng trong chuồng trại, hàng tuần trong nước uống, thức ăn, phân. Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là từ 3 - 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng, nhưng ảnh hưởng rất quan trọng vì nó làm ức chế miễn dịch, gà dễ mắc các bệnh nhiễm khuẩn khác. Mặt khác, nó trơ với việc chủng ngừa có hiệu quả. Trong những năm gần đây, nhiều dòng chủng IBDV (vvIBDV), nguyên nhân chính gây ra sự tử vong đồng loạt trên gà, đã xuất hiện ở châu Âu, Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi và Trung Đông. Theo các điều tra gần đây tại nước ta, gà công nghiệp có tỷ lệ mắc bệnh rất cao, Gumboro được coi là bệnh truyền nhiễm chính trên gà hiện nay. Gà ta nuôi theo phương thức bán công nghiệp cũng mắc bệnh, trên nhiều đàn tỷ lệ chết lên đến 20-25%. II.2.Lịch sử phát hiện Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius. Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau. Lúc ấy người ta gọi là bệnh hư thận trên gà do triệu chứng không tái hấp thu được nước tiểu, làm gà tiêu chảy rất nặng, gây mất nước. Về sau bệnh lan dần và hiện nay khắp các châu lục đều có bệnh. Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius. Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận). Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố. Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại Belgium và The Netherlands. Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). Ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1981 ở một số trại nuôi gà công nghiệp thuộc các tỉnh phía Bắc, nhưng lúc đó chưa được chú ý, vào các năm 1987-1993 bệnh phát triển rất mạnh gây chết rất nhiều gà, từ đó gây được sự chú ý cho các nhà chuyên môn. Nhiều biện pháp phòng bệnh đã được nghiên cứu, tuy nhiên ngày nay việc khống chế bệnh vẫn còn ở phía trước. II.3.Sơ lược về túi Fabicius Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn. Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô. Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài. ( Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn. Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào. ( Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B. II.4.Virus IBDV II.4.1.Về cấu trúc sinh học IBDV có dạng hình khối, nhiều gốc cạnh, khích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.10 6 Dalton (Nick, 1976). IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài. ( IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP). IBDV genome chứa hai mạch, A và B. Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987). Polipeptide này hiện diện dưới dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg). VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990). Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF). ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho quá trình sao chép virus in vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998). ORF lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110 kDa, tự xác tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) và VP4 (28 kDa). VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine- lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999). pVP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000). VP2 và VP3 là những protein cấu trúc. Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993). II.4.2.Về miễn dịch IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có loại serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm. Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà. Có ít nhất khoảng 6 loại kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm trung hòa trong ống nghiệm. Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100%. Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa các chủng cổ điển và biến thể. Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất nhỏ (Mc Ferran và Cs 1980) Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây. Về phương diện miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau. Tuy nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không phát bệnh. II.4.3.Về sức đề kháng IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý hóa và môi trường. Chịu đựng được pH từ 2-12 (Benton và cs, 1967). Ở 56 o C, IBDV tồn tại trong 5h, ở 70 o C thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50 o C trong 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf và cs, 1967). Trong chất thải, phân, nước tiểu,... IBDV vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày. IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5% và timerosal 1.125% ở 50 o C trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5% trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV. II.4.5.Chất chứa mầm bệnh Thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất. Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng... cũng chứa virus II.4.6.Đường xâm nhiễm và sự lây truyền của virus Gumboro Virus từ môi trường hoặc trong chuồng trại xâm nhập đường tiêu hóa vào cơ thể để gây bệnh, từ các gà bệnh virus được bài thải ra ngoài sẽ theo thức ăn, nước uống xâm nhập đường tiêu hóa gà còn khỏe và làm lan truyền bệnh trên cả đàn. Gà giống có thể mang virus trong cơ thể nhưng không truyền qua trứng, do đó trong phôi không có virus Gumboro. Gà con từ 1 ngày tuổi có thể nhiễm virus Gumboro do virus bám vào vỏ trứng hoặc qua các dụng cụ chăn nuôi, chuồng trại không được sát trùng đúng mức. Tuổi mẫn cảm của gà đối với virus Gumboro từ 1 ngày tuổi đến 6 tuần tuổi, thường gà trên 9 tuần tuổi ít khi mắc bệnh. II.4.7.Cơ chế xâm nhiễm Virus xâm nhập qua đường tiêu hóa của gà, xuyên qua màng ruột đến các đại thực bào và cơ quan Lympho của ống tiêu hóa, từ đây Virus theo tĩnh mạch cửa vào gan rồi lan tỏa khắp cơ thể, đến ngày thứ 4 virus có mặt ở các cơ quan sinh bạch cầu, tập trung nhiều nhất ở túi Fabricius. - Nếu gà nhiễm bệnh từ 1 ngày đến 2 tuần tuổi, do trong máu của gà chưa có các bổ thể virus không tấn công được hệ thống mạch máu và thận, chỉ phá hại túi Fabricius, làm túi này hư hại rồi teo nhỏ, quá trình nuôi dưỡng và thành thục của tế bào Lympho B bị đình trệ, dẫn đến hậu quả làm suy giảm việc tạo kháng thể của cơ thể gà, đây là nguyên nhân chính của việc gà không tạo được miễn dịch mặc dù đã tiêm phòng đầy đủ các bệnh. - Trường hợp nhiễm bệnh sau 2 tuần tuổi, lúc đó trong máu đã có đầy đủ lượng bổ thể virus sẽ phát huy tác dụng gây nên triệu chứng vỡ mạch máu gây xuất huyết nhiều nơi, virus đến thận phá hoại ống thận làm gà không thể tái hấp thu được nước, hậu quả nước từ thận tràn vào trực tràng, gà tiêu chảy rất nặng, gà chết chủ yếu là do mất nước. II.4.8.Triệu chứng Gà bị nhiễm virus sớm, trước 2 tuần tuổi sẽ mắc bệnh thể tiềm ẩn, nếu không có kháng thể hoặc kháng thể mẹ truyền dưới mức bảo hộ. Gà không có triệu chứng lâm sàng lộ ra ngoài nhưng túi Fabricius bị tổn thương nặng (viêm, phù, xuất huyết và sau đó bị teo) làm cho đáp ứng miễn dịch dịch thể bị ức chế. Gà mắc thể bệnh này sẽ giảm năng suất, khả năng miễn dịch yếu khi chủng ngừa các vaccin phòng bệnh khác, đồng thời tăng khả năng và mức độ trầm trọng khi mắc các bệnh khác như: Cầu trùng, E.coli, Newcastle... Gà nhiễm bệnh sau 2 - 3 tuần tuổi có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. Mức độ nghiêm trọng của bệnh tùy thuộc vào độc lực của chủng virus gây bệnh. Đối với gà thịt, bệnh Gumboro thường xảy ra ở lứa tuổi 3 - 6 tuần. Còn ở gà đẻ trứng bệnh có thể phát ra ở những lứa tuổi muộn hơn.Bệnh thường phát ra đột ngột với thời gian ủ bệnh ngắn (1 - 2 ngày), tiến triển bệnh rất nhanh trong vòng 1 - 2 ngày, gần như đồng loạt 100%, tỷ lệ chết cao nhất vào những ngày thứ 3, thứ 4, sau đó giảm dần, đến ngày thứ 7, 8 gà hồi phục. Tỷ lệ chết dao động trong khoảng 5 - 30%, đôi khi lên đến 60% tùy thuộc vào độc lực virus và trạng thái miễn dịch của đàn gà. -Triệu chứng chủ yếu là bỏ ăn, gục đầu vào cánh, hay mổ hậu môn lẫn nhau, uống nhiều nước, ỉa phân lỏng màu trắng hơi nhày, thường nằm úp, mệt mỏi. Gà gầy sút nhanh do bị mất nước. II.4.9.Bệnh tích II.4.9.1.Bệnh tích đại thể -Lách sưng. -Thận sưng, biến đổi màu, ống niệu quản đầy muối urat. -Xuất huyết từng đám ở cơ ngực, cơ đùi. -Da chân khô tóp lại (cơ thể bị mất nước do tiêu chảy). -Dịch niêm mạc tăng. -Túi Fabricius không ngừng bị biến đổi: Sau 3 ngày nhiễm túi Fabricius tăng kích thước và trọng lượng do thủy thủng các nang túi. Đến ngày thứ 4 trọng lượng tăng gấp 2-3 lần bình thường, các nang viêm không đều. Dịch nhày vàng lẫn hồng giữa các nang, có thể có từng đám xuất huyết trong các nang dẫn đến dịch này chuyển màu vàng đục sánh, đôi khi có kèm bã đậu (fibrin). Có trường hớp dịch nhày bao quanh cả bên ngoài túi. Đến ngày thứ 5 trọng lượng túi Fabricius bắt đầu giảm và teo dần, nhưng các nang túi vẫn không đồng đều. II.4.9.2.Bệnh tích vi thể Có hoại tử của các thành phần tế bào lympho như: ở túi Fabricius, ở van hồi manh tràng, lách. Các thành phần của tế bào lympho bị phá hủy, nhân tế bào bị teo rỗng. Trong trường hợp nhẹ: Trong nang có những đám thâm nhiễm lớn của tế bào viêm ở mô giữa các nang. Ở các nang có những tế bào rỗng tạo thành các không bào (Vacuolas) hoặc thấy hiện tượng hoại tử của các tế bào cùng những mảnh vụn của tế bào bị phá hủy, làm thành một khối. Phản ứng viêm nhiễm không phân biệt rõ. Việc các tế bào bị phá hủy sẽ dẫn đến việc biến mất hoàn toàn các nang lympho. Tại chỗ của chúng phát triển các tế bào biểu mô ít phân biệt. Trong trường hợp cấp tính: Ở tại các mô đệm của các nang thường thấy đầy hồng cầu trên bề mặt. Ở giữa lớp tế bào thấy xuất hiện những thành phần tế bào hoàn toàn bị lệch vị trí, do có những mảnh tế bào và dịch nhày màu hồng. Tóm lại: toàn bộ quá trình là sự nhiễm có mủ và hoại tử với sự xuất hiện của các không bào. III.Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch để phát hiện virus Gumboro III.1.Nguyên lý Sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên hòa tan và kháng thể tương ứng xảy ra hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, phức hợp kháng nguyên-kháng thể đạt được mức độ nhất định thì có sự bảo hòa, lúc này sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa. Nếu thiếu hoặc thừa 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra. Sự kết tủa này biểu hiện bằng chất cặn màu trắng xám trông rất rõ. Sự kết tủa này đòi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải. III.2.Các phản ứng kết tủa trong môi trường thạch agar III.2.1. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm Đây là phản ứng lợi dụng tính khuếch tán của kháng nguyên và kháng thể, để chúng gặp nhau và kết hợp với nhau, chổ nào có sự đồng đều tương ứng giữa kháng nguyên–kháng thể thì sẽ có sự kết tủa. -Ứng dụng: Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm chủ yếu để phát hiện kháng nguyên và định lượng kháng nguyên. - phương pháp thực hiện: +Phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch đơn giản của Oudin Cho thạch và kháng thể trộn lẩn với nha, rồi cho vào ông nghiệm. Sau đó cho kháng nguyên vào trên mặt thạch, kháng nguyên sẽ khuếch tán xuống dưới gặp kháng thể tương ứng, kết tủa sẽ xuất hiện ở vùng mà kháng nguyên-kháng thể có tỷ lệ tương ứng +Phương pháp kết tủa khuếch tán kép của Oúkeyfulthor Cho kháng thể vào ống nghiệm, rồi cho thạch vào, sau đó cho kháng nguyên lên trên thạch. Sẽ có sự khuếch tán lên của kháng thể và khuếch tán xuống của kháng nguyên, vùng kết tủa sẽ xuất hiện ở chổ kháng nguyên- kháng thể có tỷ lệ đồng đều tương ứng. Có thể làm ngược lài là cho kháng nguyên vào trước, rồi đến thạch và sau cùng là kháng thể. Kết quả tương tự như trên. + Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thach trên phiến kính (phương pháp Ouchterlony) (: www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi) Thực chất là phản ứng kết tủa khuếch tán kép, dễ làm, thông dụng. III.2.1.2Vật liệu để chẩn đoán bệnh Gumboro theo phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch: Kháng nguyên: Thận, lách, túi fabricius của những con gà có triệu chứng bệnh, bệnh tích đặc trưng đem nghiền nhỏ pha với dung dịch PBS với tỷ lệ ½, xử lý kháng sinh, đông tan 3 lần. Huyết thanh: Sử dụng huyết thanh dương tính tự chế. III.2.3.Ứng dụng +Khảo sát mối quan hệ kháng nguyên, kháng thể. +Định lượng sơ bộ hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của xúc vật được gây miển dịch. -Tiến hành: +Chuẩn bị vật liệu: * Agar Difco 1.5g. * NaCl 8.5g. * Phenol 0.5ml. * Nước cất vừa đủ 100ml. + Cách làm: Hòa muối và phenol trong nước cất, chỉnh pH=7.5, cho agar vào đun cách thủy cho tan, lọc qua vải gạc. Sau đó đổ thạch lên lam kính một lớp dày khoảng 3mm và để lam trong nhiệt độ 4-10 o C/10 phút cho thạch đông lại. Dùng ống sắt có dường kính 3mm đục lổ, mỗi cụm 7 lổ, một lổ ở giữa và 6 lổ xung quanh: * Lỗ giữa cho huyết thanh đã biết. * Các lỗ xung quanh thì 2 lỗ cho kháng nguyên chuẩn dương ứng với huyết thanh đã biết để làm đối chứng dương, 2 lỗ tiếp cho kháng nguyên âm tính để làm đối chứng âm, 2 lỗ còn lại cho kháng nguyên cần chẩn đoán. Sau đó cho vào tủ ấm 37 o C từ 6-24h, đem ra đọc kết quả. Nếu thấy giữa huyết thanh và kháng nguyên nghi xuất hiện vạch kết tủa giống như huyết thanh và kháng nguyên chuẩn thì kháng nguyên nghi tương ứng với kháng thể. Có thể làm ngựơc lại là cho kháng nguyên đã biết vào lỗ giữa, còn các lỗ còn lại cho huyết thanh. IV.KẾT LUẬN Bệnh Gumboro là một bệnh rất nguy hiểm ở gà và có khuynh hướng lây lan nhanh trong đàn gà công nghiệp gây thiệt hại về mặt kinh tế cho các hộ chăn nuôi. Phương pháp phát hiện virus Infectious bursal disease bằng kỹ thuật kết tủa trên thạch là phương pháp phù hợp để rút ngắn thời gian xét nghiệm.Do vậy việc chữa trị sẽ mang lại hiệu quả cao hơn,ít gây thiệt hại hơn về mặt kinh tế. Phương pháp kết tủa trên thạch là phương pháp đơn giản,nhanh chóng và tương đối rẻ tiền ,có thể áp dụng dễ dàng tại các phòng thí nghiệm. V.Tài liệu tham khảo 1.Nguyễn Ngọc Hải, 2007, Công Nghệ Sinh Học Trong Thú Y, NXB Nông Nghiệp 2. ouble_immuno_diffusion 3.Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử. ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K29 4. 5.