Phương pháp giải trình tự axit nucleic trên máy tự động

PAGE  PAGE 2 BÀI TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ GENE. PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ AXIT NUCLEIC TRÊN MÁY TỰ ĐỘNG. Giảng viên hướng dẫn: LÊ XUÂN ĐẮC Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ THOA Lớp: K33C Sinh – KTNN Trường: Đại học sư phạm Hà Nội II. Giải trình tự ADN tự động. - Nguyên lí: Giải trình tự ADN tự động dựa theo nguyên lí của phương pháp dideoxy của F.Sanger (1977) được cải tiến dựa vào các thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác hơn. Sự tự động hóa đã cải tiến tốc độ giải trình tự của mẫu, đặc biệt có ý nghĩa trong việc giải trình các nguồn mẫu lớn. Trong kĩ thuật này người ta đánh dấu bằng chất huỳnh quang (fluochrome), mỗi loại dideoxy nucleotit được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau (ví dụ như xanh da trời, da cam, xanh lục, và đen….). Như vậy các phân đoạn ADN được đánh dấu phân biệt bởi các màu khác nhau. Ưu điểm: Khi sử dụng 4 loại dideoxy (ddATP, ddTTP, ddCTP và ddGTP) có 4 màu khác nhau thì có thể giải trình tự mẫu nghiên cứu trong 1 phản ứng (1 giếng điện di) thay vì cho 4 phản ứng trong (4 giếng) riêng biệt như phương pháp dideoxy của F.Sanger. Phần mềm máy tính sẽ tự động giải trình tự giữ liệu từ gel điện di và cho hình ảnh kết quả giải trình ADN. Các bước tiến hành: +, Giải trình tự ADN tự động bao gồm các thành phần chủ yếu sau: ADN mẫu chứa khoảng 1010 phân tử, hoặc 1010 đoạn ADN dài khoảng 103 -104 bp. Các deoxynucleotit (dNTP). Bốn loại dideoxynucleotit (ddNTP) có gắn màu huỳnh quang khác nhau, mỗi loại gắn 1 màu riêng. Các enzim cần thiết: có thể dùng bộ hóa chất sinh chuẩn BigDyek Terminator v3.1 Cycle Sequencing của hãng Applid Biosystems bao gồm các dNTP, ddNTP, các enzim cần thiết cho phản ứng. Dung dịch đệm. Mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho đoạn cần nhân bản. Thể tích chung cho mỗi phản ứng là 20ml. +, Tiến hành chạy PCR theo 3 bước chính: Biến tính ADN ở 960C làm cho ADN kép thành mạch đơn. Gắn mồi ở 500C. Có thể dùng riêng hoặc dùng chung cả mồi xuôi và mồi ngược. Kéo dài chuỗi polynucleotit ở 600C. Thực hiện 3 bước trên khoảng 25 chu kì. Giữa phản ứng PCR ở 400C trong 10 phút, hoặc để qua đêm. Sản phẩm PCR được loại bỏ chất thừa. Kết tủa ADN bằng Ethanol/EDTA. Hòa tan kết tủa sạch bằng 15ml HiDiFormamide do các hãng sản xuất cung cấp. Sau khi hòa tan kết tủa thì tiến hành điện di trên gel polyacrylamid. Kết quả thu được nhờ máy đọc trình tự và được sử lí bằng các phần mềm chuyên dụng. Những phần mềm sẽ cung cấp dữ liệu in ra từ máy tính.