Phuơng pháp ly trích,thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic trong mỡ cá basa pangasius bocourti sauvage

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC W X PHẠM THỊ ANH PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH,THU NHẬN VÀ LÀM GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC TRONG MỠ CÁ BASA PANGASIUS BOCOURTI SAUVAGE KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC ĐỘNG VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2006 2 Lời cảm ơn Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới cô Nguyễn Kim Phi Phụng, người cô đã cho em những ý tưởng khoa học, đã chỉ dạy, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện để em có thể làm việc tại phòng thực tập hóa hữu cơ. Cô đã truyền đạt kiến thức cũng như các phương pháp cần thiết để xử lý một vấn đề khoa học. Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy Phan Kim Ngọc. Thầy không những đã dìu dắt em suốt bốn năm qua, động viên trong những lúc em khó khăn mà còn cho em niềm đam mê và nhiệt huyết khoa học. Em cũng xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Sinh học người và động vật. Thầy cô đã cho em những kiến thức làm hành trang trong cuộc sống. Cuối cùng, cảm ơn các bạn, các anh làm việc trong phòng thực tập Hóa hữu cơ, anh Thiện làm việc tại Viện Khoa Học và Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ em giải quyết các vấn đề phát sinh trong suốt quá trình hoàn thành bài luận văn này. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 7 năm 2006 Phạm Thị Anh 3 MỤC LỤC Lời mở đầu ..................................................................................................................................................1 PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO.............................................................................................................2 1.1.1. Lipid - Chất béo ..............................................................................................................................2 1.1.1.1. Định nghĩa .....................................................................................................................................2 1.1.1.2. Phân loại ........................................................................................................................................2 1.1.1.3. Vai trò của lipid .............................................................................................................................3 1.1.1.4. Tính chất vật lý ..............................................................................................................................3 1.1.2. Acid béo ............................................................................................................................................5 1.1.2.1. Công thức cấu tạo .......................................................................................................................... 5 1.1.2.2. Tính chất vật lý ..............................................................................................................................5 1.1.2.3. Phân loại ........................................................................................................................................7 1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo ..............................................................................................................8 1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học .............................................................................................12 1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic ........................................................................................12 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học ..........................................................................................................................12 1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể ...............................................................................................13 a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh ..............................................................................................13 b) Tác dụng đối với thị giác và màng tế bào..............................................................................................13 c) Tác dụng đối với não .............................................................................................................................13 d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương ........................................................14 e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch .....................................................................................................14 f) Tác dụng đối với sự viêm .......................................................................................................................15 g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp ..........................................................................................................15 h) DHA và bệnh ung thư ............................................................................................................................16 i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn .....................................................................................................16 1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA ..........................................................................16 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP DHA........................................................................................18 1.2.1. Phương pháp chưng cất phân đoạn bằng li tâm phân tử ...........................................................18 1.2.2. Phương pháp sắc kí khí định lượng .............................................................................................19 1.2.3. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................................................19 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn .....................................................................................................21 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc ......................................21 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................22 1.3.1. Phương pháp transester hóa .........................................................................................................22 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid.....................................................................................................................22 4 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ ....................................................................................................................23 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym.................................................................................................................24 1.3.1.4. Xúc tác zeolit ................................................................................................................................25 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA ....................................................................................................26 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................................................26 1.3.2.2. Phương pháp tủa urê .....................................................................................................................27 1.3.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................29 1.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CÁ BASA Ở VIỆT NAM.....................................................................30 1.4.1. Phân loại .........................................................................................................................................30 1.4.2. Đặc điểm cá basa............................................................................................................................31 1.4.3. Những sản phẩm từ mỡ cá basa ...................................................................................................31 1.4.3.1. Tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá basa ................................................................................................32 1.4.3.2. Tinh luyện mỡ cá basa thành dầu mỡ thực phẩm..........................................................................34 PHẦN II: THỰC NGHIỆM 2.1. DỤNG CỤ - NGUYÊN LIỆU ........................................................................................................36 2.1.1. Dụng cụ...........................................................................................................................................36 2.1.2. Nguyên liệu .....................................................................................................................................36 2.2. PHƯƠNG PHÁP ............................................................................................................................37 2.2.1. Phương pháp transester hóa .........................................................................................................37 2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................38 2.2.3. Phương pháp tạo phức giữa urê và các ester béo .......................................................................41 PHẦN III: KẾT QUẢ 3.1. Kết quả phản ứng transester hóa ................................................................................................43 3.1.1.. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol methanol/mol dầu cá ................................................................43 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa .................................................................................................................................................44 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác ......................................................................................................45 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác ....................................................................................46 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng....................................................................................47 3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo với urê ........................................................................49 PHẦN IV: KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................................................54 4.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 5 LỜI MỞ ĐẦU Từ nhiều thập kỷ nay, vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu, đặc biệt là vấn đề chăm sóc trẻ em - nguồn nhân lực tương lai của đất nước. Hiện nay, cùng với những bước chuyển mình mạnh mẽ của thế giới thì các căn bệnh thời đại cũng có chiều hướng gia tăng. Chính vì vậy mà các sản phẩm trên thị trường đang được các nhà khoa học ra sức nghiên cứu để bổ sung thêm các thành phần quý, có tác dụng làm suy giảm và ngăn ngừa bệnh tật, đồng thời còn có ích cho việc phát triển trí não và tư duy của trẻ. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy nguồn acid béo bất bão hòa trong mỡ cá rất dồi dào trong đó có DHA, và ở Việt Nam đã được tìm thấy trong các loại cá da trơn hay còn được gọi là catfish như cá ba sa, cá tra… là các loại cá có nhiều mỡ được nuôi khá phổ biến ớ đồng bằng sông Cửu Long. Đặc biệt đối với cá basa, đây là một nguồn DHA khá triển vọng, có thể thu được một lượng lớn mỡ cá phế thải từ các nhà máy chế biến thủy hải sản xuất khẩu. Việc cần thiết là phải tìm ra một phương pháp thu nhận DHA từ mỡ cá sao cho có hiệu quả, tiết kiệm nhất, phù hợp với điều kiện kinh tế trong nước, đặc biệt là sản xuất ra được DHA chi phí thấp và giảm bớt nhập khẩu từ nước ngoài. Mặt khác, có nhiều công trình nghiên cứu phản ứng transester hóa mỡ cá basa thành nhiên liệu diesel sinh học, thay thế diesel truyền thống, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Từ những thực tế trên, em chọn cá basa làm nguyên liệu để tìm hiểu và ly trích DHA, đồng thời sử dụng phương pháp transester hóa với hy vọng có thể tận dụng được nguồn mỡ cá basa thừa trong nước để vừa ly trích được thành phần quý DHA vừa tạo ra được nguồn năng lượng sạch cho tương lai. Từ đó góp phần cải thiện chế độ dinh dưỡng cho người Việt Nam, đặc biệt là thế hệ trẻ. 1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO 1.1.1. Lipid - Chất béo 1.1.1.1. Định nghĩa [18] Chất béo là một nhóm gồm nhiều hợp chất hóa học khác nhau. Triacylglycerol còn gọi là triglycerid hay glycerid hoặc mỡ trung tính. Là một este của glycerol và acid béo, được cấu tạo bởi ba nguyên tố C, H và O. Công thức tổng quát: R1, R2, R3: là các gốc của acid béo Lipid có đặc tính chung là không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như chloroform, benzen, ether. Lipid gồm các acid béo, glycerid, glycerol, phospholipid, sterol. 1.1.1.2. Phân loại [8] a. Dựa vào phản ứng xà phòng hóa CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O 6 Lipid xà phòng hóa được. Nhóm này gồm các glycerid, glycerophospholipid và sáp nghĩa là những lipid mà trong phân tử có chứa este của acid béo cao phân tử. Lipid không xà phòng hóa được. Tức là những lipid trong phân tử không chứa chức este, nhóm này gồm các hydrocarbon, các chất màu và các sterol. b. Dựa vào độ hòa tan Lipid của acid béo (có từ bốn carbon trở lên) với một rượu. Nhóm này gồm: glycerolipid (este của glycerol), sphingolipid (amid của sphingozin), cerid (este của rượu cao phân tử), sterid (este của sterol), etoliteste tương hỗ của hợp chất đa chức acid rượu). Lipoid: Là những chất có độ hòa tan giống lipid. Nhóm này bao gồm: Các carotenoid và quinon, sterol tự do, các hydrocarbon. c. Dựa vào thành phần cấu tạo Lipid đơn giản: Là este của rượu và acid béo, thuộc nhóm này có: triacylglycerin, sáp (cerid), sterid. Lipid phức tạp: Trong phân tử của chúng ngoài acid béo và rượu còn có thành phần khác như acid phosphoric; bazơ nitơ; đường. 1.1.1.3. Vai trò của lipid [18] ™ Là thành phần cấu trúc màng sinh học (phospholipid, glycolipid). ™ Là cofactor của một số enzym. ™ Là các hormone và chất vận chuyển thông tin nội bào. ™ Là nguồn năng lượng dự trữ quan trọng cung cấp năng lượng cho cơ thể. Nếu oxi hóa hoàn toàn 1 g mỡ sẽ giải phóng 9 kcal lớn gấp 2 lần năng lượng thu được khi oxi hóa 1 g protein hoặc glucose. ™ Ngoài ra còn: giảm nhẹ chấn động cơ học đối với cơ thể (động vật chạy nhảy nhiều ở bàn chân có lớp đệm), vai trò trong sự vận chuyển hấp thu các chất hòa tan trong nó (hấp thu vitamin tan trong chất béo), lớp mỡ dưới da còn có vai trò cách nhiệt tốt giữ thân nhiệt ổn định nên có ý nghĩa đặc biệt đối với động vật ngủ đông ở các xứ lạnh. 1.1.1.4. Tính chất vật lý [18] ™ Chất béo có tỷ trọng thấp hơn nước (0,86 – 0,97). ™ Chất béo không tan trong nước, khi trộn với nước sẽ tạo thành hai lớp: nước ở dưới và chất béo ở trên, đầu COO- tiếp xúc với nước, đuôi kị nước nằm ở phía trên. Dưới tác động của các chất gây nhũ tương hóa như xà phòng (muối Na+ hay K+ của acid béo bậc cao) hoặc acid mật hay muối mật (do gan tiết ra), chất béo bị chia nhỏ trông như dạng sữa gọi là dạng nhũ tương bền. Nhờ vậy, xà phòng là chất tẩy rửa dầu mỡ sau các dung môi hữu cơ. Ngoài ra, điều đó cũng giải thích các bệnh nhân bị bệnh gan phải hạn chế thức ăn chứa chất dầu mỡ, mỡ, vì ở các cơ thể này, dầu mỡ trong thức ăn không được nhũ tương hóa, do đó lipase phân giải chậm. Lipid bao gồm các acid béo, các triglycerid, glycerol, các phospholipid và các sterol, trong đó acid béo là thành phần chính quan trọng nhất. ™ Tính chất của glycerid phụ thuộc vào thành phần acid béo của chúng, chiều dài mạch carbon và số lượng liên kết đôi trong phân tử. Ví dụ về điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid như bảng 1. 7 Bảng 1: Điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid Acid béo Điểm nóng chảy (oC) Triacylglycerol Điểm nóng chảy (oC) Palmitat 63,1 Tripalmitin ≈ 80 Stearat 69,6 Tristearin ≈ 80 Oleat 13,4 Triolein 0 Mỡ động vật chứa nhiều acid béo no, trong nhiệt độ bình thường ở trạng thái rắn, nhất là mỡ bò, mỡ cừu. Dầu thực vật cũng tùy theo tỷ lệ giữa acid béo no và không no, có điểm nóng chảy khác nhau. Ví dụ dầu ca cao chứa 35% palmitat và 40% stearat có điểm nóng chảy là 30 - 34oC. Ngược lại, dầu hướng dương chứa 85% acid béo không không no là oleat và linoleat, có điểm nóng chảy rất thấp: -21oC. Vì vậy, dầu thực vật luôn ở dạng lỏng. Nguyên nhân của trạng thái rắn hay lỏng của glycerid được giải thích là vì acid béo no, gồm một đầu phân cực (COO-) và đuôi kị nước (khung carbon của mạch) tạo nên cấu trúc ổn định và chặt, không bị phá vỡ. Acid béo không no có khung carbon bị gấp khúc, tạo sự sắp xếp lỏng lẻo dễ bị phá vỡ, do đó ở nhiệt độ bình thường chúng có trạng thái lỏng. 1.1.2. Acid béo 1.1.2.1. Công thức cấu tạo[18] Acid béo là thành chính của hầu hết các lipid. Cả lipid trong cơ thể lẫn thực phẩm. Công thức tổng quát: CH3 ─ (CH2)n ─COOH Số nguyên tử carbon trong acid béo thường là chẵn (14 - 22C). Các acid béo thường gặp có số carbon từ 16 - 18. Số thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch hydrocarbon của acid béo được tính từ nguyên tử carbon của nhóm carboxyl. H3Cω (CH2)n Cβ Cα 3 2 C OH O 1 Ký hiệu: α, β, γ, ω,….để chỉ thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch. Về cơ bản acid béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên tử hydrogen. Ở một đầu của phân tử được xác định là đầu alpha, gắn với một nhóm carboxyl (−COOH). Một đầu còn lại của mạch là đầu cuối (omega), là nhóm methyl (−CH3). (Trong bảng chữ cái Hy Lạp α là ký tự đầu tiên và ω là ký tự cuối). 1.1.2.2. Tính chất vật lý [18], [8] Các phân tử acid béo bão hòa có mạch thẳng, thường dễ gắn chặt với nhau. Ngược lại, các phân tử acid béo bất bão hòa có cấu tạo lệch, do đó chỉ gắn với nhau một cách lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ hơn hơn các acid béo bão hòa. Vì vậy các chất béo giàu acid béo bất bão hòa có nhiệt độ tan chảy thấp hơn các chất béo giàu acid béo bão hòa (đặc biệt các acid béo có chuỗi carbon dài hơn 12 carbon). Tóm lại, mỡ hoặc dầu được phân loại thành bão hòa, bất bão hòa đơn hay bất bão hòa đa dựa trên hàm lượng cao hoặc thấp của các loại acid béo hiện diện. Chiều dài của mạch carbon trong acid béo ảnh hưởng đến độ rắn chắc của triglycerid ở nhiệt độ thường. Cụ thể, các acid béo bão hòa chuỗi dài từ 12 carbon trở lên hiện diện ở những trạng thái rắn khác nhau ở nhiệt độ thường, trong 8 khi các acid béo bão hòa chuỗi vừa từ 6 đến 10 carbon (ví dụ dầu dừa) và chuỗi ngắn dưới 6 carbon hiện diện ở dạng lỏng ở nhiệt độ thường. Các triglycerid chứa các acid béo bất bão hòa đa và đơn cũng tồn tại ở dạng lỏng . Vị trí nối đôi C=C trong chuỗi carbon của các acid béo bất bão hòa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Nếu nối đôi đầu tiên nằm cách 3 carbon so với đầu methyl (omega) của acid béo, nó là acid béo omega-3 (ω-3). Nếu nối đôi đầu tiên nằm cách đầu methyl 6 carbon, nó là acid béo omega-6 (ω-6). Theo qui ước tương tự, một acid béo omega-9 (ω-9) có nối đôi đầu tiên cách đầu methyl của acid béo 9 carbon. Trong thực phẩm, acid α- linolenic (ALA, 18:3 n-3) là acid béo ω-3 chủ yếu; acid linoleic (18:2 n-6) là acid béo ω-6 chủ yếu; và acid oleic (18:1 n- 9) chủ yếu. Bảng 2: Cấu trúc hóa học của các acid béo bất bão hòa tiêu biểu thuộc các nhóm ω-3, ω-6, ω-9. Tên acid Ký hiệu Công thức hóa học α-linolenic 18:3 n-3 CH3CH2(CH=CH_CH2)3(CH2)6COOH Linoleic 18:2 n-6 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Oleic 18:1 n-9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH (Ghi chú: Trong cách viết ký hiệu của acid béo, số thứ nhất biểu thị số carbon, số thứ hai biểu thị số nối đôi và n- (hay ω- ) chỉ nhóm của acid béo bất bão hòa. Cũng có thể sử dụng những cách viết khác, ví dụ như acid oleic có thể được ký hiệu là C18:1 hoặc 18:1.) 1.1.2.3. Phân loại[18],[10] Dựa vào số liên kết đôi để phân loại thì có 3 loại. Liên kết đôi được ký hiệu là ∆ (denta). Vị trí của liên kết đôi trên mạch hydrocarbon ghi ở phía trên, góc phải. a) Acid béo bão hòa (saturated): acid không có nối đôi C=C trong cấu tạo của nó. Công thức cấu tạo: CnH2nO2 Ví dụ: acid palmitic: CH3(CH2)14COOH (C16) Acid stearic: CH3(CH2)16COOH (C18) b) Acid béo bất bão hòa ™ Acid béo bất bão hòa đơn (monounsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa một nối đôi trong cấu tạo của nó. Ví dụ: Acid oleic: C18 có một nối đôi ở C9 Ký hiệu: C18∆9 Công thức hóa học: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH ™ Acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa hai nối đôi trở lên. Ví dụ: Acid linolenic: C18 có ba nối đôi ở C9, C12, C15 Ký hiệu : C18∆9, 12, 15 9 Công thức hóa học: CH3(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2COOH Acid béo bất bão hòa thường có cấu hình cis C C HH CCH2 H2 Dạng cis (dạng thuyền) Dạng trans (dạng ghế) Đối xứng qua mặt phẳng Đối xứng qua tâm Khi đun nóng có mặt chất xúc tác thì dạng cis chuyển thành dạng trans. Mạch carbon của acid béo no thường ở dạng zic zắc, kéo thành chuỗi dài không cong. Các acid béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch carbon bị uốn cong 30o, càng có nhiều liên kết đôi, mạch carbon càng bị uốn cong nhiều hơn. Có giả thiết cho rằng mạch carbon của acid béo không no dạng cis có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh học. Theo Paul B.Kelter và cộng sự,[14] các nghiên cứu gần đây cho thấy các acid béo dạng trans- trong chế độ ăn có thể liên quan đến sự gia tăng nguy cơ xảy ra các cơn đau tim. Các phân tử không thể chuyển từ dạng cis- sang trans- hoặc ngược lại trong trường hợp bình thường. Khi có sự hydrogen hóa từng phần của acid béo được thực hiện, vài nối đôi còn lại kết thúc ở dạng trans- hơn là dạng cis- ban đầu. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau. Vị trí của các nối đôi trong chuỗi carbon của acid béo bất bão hòa đa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Các tế bào của cơ thể của con người chỉ có thể tạo nối đôi C=C trong acid béo kể từ carbon thứ 9 trở đi. Điều này có nghĩa là cơ thể con người không thể tự tổng hợp được acid béo Ω-3 và Ω-6. Do đó 2 loại acid béo nay chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn hàng ngày. 1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo[4] Triglycerid là lipid dự trữ có trong mỡ động vật và dầu thực vật. Trong thực vật: có nhiều ở nhiều cơ quan như củ, quả, hạt (như đã trình bày ở phần trên). Ví dụ: Dầu chiếm 65-70% ở hạt thầu dầu; 40-63% ở hạt vừng; 40-60% ở hạt lạc; 18% ở hạt đậu tương. Ở động vật: trong mô mỡ acid béo chiếm 70-97%; trong tủy sống 14-20% khối lượng tươi. Phần trăm acid béo chứa trong một số loại thức ăn điển hình, acid béo bất bão hòa thường gặp được trình bày trong bảng 3, 4, 5. Bảng 3: Phần trăm acid béo chứa trong một số loại thức ăn điển hình [4] Acid béo không no Nguyên liệu Hàm lượng chất béo (%) Acid béo no (%) Loại một nối đôi (%) Loại nhiều nối đôi (%) Ghi chú Dầu mè 46,4 – 56 12,7 48,1 40 Từ hạt mè Dầu lạc 44,5 19,0 39,0 42 Từ hạt lạt Dầu đậu tương 18,4 15,0 25 60 Từ hạt đậu tương C C H2CH CH2 H 10 Dầu ngô 30 – 40 16,0 30 54 Từ phôi Dầu cám gạo 16 – 18 20,0 40 40 Từ cám gạo Dầu hướng dương 40 – 50 10,0 13 77 Từ hạt hướng dương Dầu dừa 47,6 94,0 5 1 Từ cơm dừa già Dầu cọ 44,63 50 40 10 Từ cơm dầu cọ Mỡ cá ba sa 25 36 35,0 14,7 Từ mỡ phần (mỡ trong) Bơ 83,5 66 30 4 Tách từ sữa Mỡ lợn 20 – 30 47 50 3 Từ con heo Mỡ bò 10 – 20 44 43 26 Từ con bò Bảng 4: Các acid béo thường gặp [28],[35] Tên thông thường Số nguyên tử C Số nối đôi Tên khoa học Nguồn hiện diện Acid butyric 4 0 Acid butanoic Bơ Acid caproic 6 0 Acid hexanoic Bơ Acid caprylic 8 0 Acid octanoic Dầu dừa Acid capric 10 0 Acid decanoic Dầu dừa Acid lauric 12 0 Acid dodecanoic Dầu dừa Acid myristic 14 0 Acid tetradecanoic Dầu cọ Acid palmitic 16 0 Acid hexadecanoic Dầu cọ Acid palmitoleic 16 1 Acid 9-hexadecenoic Mỡ động vật Acid stearic 18 0 Acid octadecanoic Mỡ động vật Acid oleic 18 1 Acid 9-octadecenoic Dầu olive Acid linoleic 18 2 Acid 9,12-octadecadienoic Dầu bắp Acid alpha-linolenic (ALA) 18 3 Acid 9,12,15-octadecatrienoic Dầu hạt lanh Acid arachidic 20 0 Acid eicosanoic Dầu phộng, dầu cá Acid gadoleic 20 1 Acid 9-eicosenoic Dầu cá 11 Acid arachidonic (AA) 20 4 Acid 5,8,11,14-eicosatetraenoic Mỡ gan Acid eicosapentaenoic (EPA) 20 5 Acid 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic Dầu cá Acid behenic 22 0 Acid docosanoic Hạt cải dầu Acid erucic 22 1 Acid 13-docosenoic Hạt cải dầu Acid docosahexaenoic (DHA) 22 6 Acid 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic Dầu cá Acid lignoceric 24 0 Acid tetracosanoic Mỡ các loại Bảng 5: Các acid béo bất bão hòa thường gặp [28] Tên hệ thống Tên thông thường Ký hiệu Trọng lượng phân tử Điểm nóng chảy (oC) Acid 9,12- octadecadienoic Acid linoleic 18:2 (n-6) 280,4 -5 Acid 6,9,12- octadecatrienoic Acid γ- linoleic 18:3 (n-6) 278,4 Acid 8,11,14- eicosatrienoic Acid dihomo-γ- linolenic 20:3 (n-6) 306,5 Acid 5,8,11,14- eicosatetraenoic Acid arachidonic 20:4 (n-6) 304,5 -50 Acid 7,10,13,16- docosatetraenoic - 22:4 (n-6) 332,6 Acid 4,7,10,13,16- docosapentaenoic - 22:5 (n-6) 330,6 Acid 9,12,15- octadecatrienoic Acid α-linolenic 18:3 (n-3) 278,4 -11 Acid 6,9,12,15- octadecatetraenoic Acid stearidonic 18:4 (n-3) 276,4 -57 Acid 8,11,14,17- eicosatetraenoic - 20:4 (n-3) 304,5 Acid 5,8,11,14,17- eicosapentaenoic EPA 20:5 (n-3) 302,5 -54 12 Acid 7,10,13,16,19- docosapentaenoic DPA 22:5 (n-3) 330,6 Acid 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic DHA 22:6 (n-3) 328,6 -44 Acid 6,9,12,15,18,21- tetracosenoic Acid nisinic 24:6 (n-3) 356,6 Acid 5,8,11- eicosatrienoic Acid mead 20:3 (n-9) 306,5 1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học [23] „ Thành phần cơ bản của lipid và chất béo „ Thành phần quan trọng trong cấu trúc màng tế bào. „ Giúp cho sự vận chuyển các chất dinh dưỡng hòa tan trong chất béo ngang qua màng tế bào cũng như trong máu. „ Quan trọng cho sự phát triển của não. „ Quan trọng cho sự sản sinh năng lượng, duy trì thân nhiệt. „ Hoạt động như những tiền chất của một số hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm prostaglandin, prostacyclin và leukotriene. „ Quan trọng cho sự tăng trưởng. „ Quan trọng trong việc duy trì một làn da khỏe mạnh. 1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học[10] Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là : CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2COOH Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -440C. DHA còn được kí hiệu là 22:6 n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. Hình 1: Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. [1] 1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh[25] 13 Trẻ sơ sinh không có khả năng chuyển tiền tố DHA từ dầu thực vật hay thức ăn thay thế sữa mẹ khác sang DHA nên người mẹ phải làm động tác trung chuyển đó, bằng cách sử dụng nhiều các sản phẩm có chứa DHA rồi cho con bú. Sự phụ thuộc vào DHA nhiều nhất là ở bào thai trong suốt 3 tháng cuối thai kỳ và trẻ sơ sinh trong suốt ba tháng đầu sau khi sinh. Trong sữa mẹ chứa: 12% acid linoleic, 0,5% acid alpha linolenic, 0,6% acid arachidonic, 0,3% DHA trong tổng số trong lượng acid béo. b) Tác dụng đối với thị giác [1] và màng tế bào [26] Sự cạn kiệt DHA ảnh hưởng đến các thụ thể nằm trên màng là rhodopsin và làm thay đổi chức năng của nó. Sự thiếu DHA làm giảm hoạt động thần kinh của võng mạc, làm giảm độ nhạy của thị giác, làm thay đổi những phản ứng hành vi và gây ra những cơn khát bất thường, và cả những phản ứng bất thường về thính giác và khứu giác. Những sự bất thường này có thể được gây ra do những receptor bề mặt bị ảnh hưởng do thiếu DHA. Khi được ester hóa vào trong những phospholipid màng, DHA làm thay đổi một cách đáng kể nhiều tính chất cơ bản của màng tế bào. Sự tương tác của DHA với những lipid khác trên màng, đặc biệt là cholesterol, có thể đóng một vai trò nổi bật trong việc điều hòa cấu trúc và chức năng cục bộ của màng. DHA giúp giảm 50% nguy cơ mắc bệnh cận thị khi lớn lên. c) Tác dụng đối với não[38],[27],[36] Não được tạo nên từ hàng tỷ tế bào thần kinh gọi là neuron. Cấu tạo gồm vỏ myelin phủ lên đầu axon của tế bào giống như một dây điện được cách ly bằng việc phủ lên nó chất cách điện. Nó gia tăng sự dẫn truyền dòng điện một chiều dọc theo axon. Thiếu chất dinh dưỡng để tạo nên myelin, như acid béo thiết yếu, sẽ làm trì hoãn việc dẫn truyền thần kinh. Chất dẫn truyền thần kinh như: serotonin, dopamin, và norepinephrine truyền thông tin từ một tế bào đến các tế bào khác. Não chỉ chiếm 2% trọng lượng cơ thể nhưng dùng hết 20% lượng ôxy và 40% lượng gluxid ta hấp thụ được. Não được cấu tạo chủ yếu từ lipid. Khoảng 2/3 não bộ được tạo nên từ những acid béo. Chúng là thành phần cơ bản của màng tế bào, qua màng này sẽ diễn ra sự giao lưu, liên lạc với mọi tế bào thần kinh trong các vùng của não và cơ thể. Acid béo trong phosphatidylethanolamine của màng tế bào chất xám ở người khoảng 25% DHA, 25% stearic, 14% arachidonic, 12% oleic. d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương[3],[39] Trong máu, cholesterol được chất đạm protein chuyên chở và được gọi là lipoprotein. Tùy theo tỷ lệ protein nhiều ít, ta có lipoprotein tỷ lệ thấp LDL (Low density lipoprotein), hay tỷ lệ cao HDL (high density lipoprotein). HDL đưa cholesterol vào tích trữ trong gan để rồi được phế thải ra khỏi cơ thể, do đó làm bớt mỡ lưu thông trong máu, giảm nguy cơ đóng mỡ ở thành động mạch, giảm nguy cơ bệnh vữa xơ động mạch. Ngược lại LDL chuyển cholesterol vào các tế bào của cơ thể. Khi cholesterol trong máu lên cao, tế bào không đủ chỗ nhận cholesterol, hóa chất này sẽ lởn vởn trong máu và tăng gia sự đóng bựa ở thành động mạch. DHA hạ thấp lượng triglyceride, làm tăng độ lỏng của màng tế bào hồng cầu, từ đó làm tăng độ biến dạng, khả năng linh hoạt để chúng có thể di chuyển dễ dàng qua các mao mạch, dẫn đến việc giảm độ nhớt của máu và giảm huyết áp. DHA làm giảm huyết áp bằng cách giảm hàm lượng cortisol trong máu. e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch[10],[39] 14 Trong bệnh vữa xơ động mạch, thành động mạch có những bựa giống như cháo gồm có cholesterol và tế bào máu đóng vào, khiến nó trở nên gồ ghề, thu hẹp gây trở ngại cho sự vận chuyển của máu. Máu huyết tới tim giảm, tim kém được nuôi dưỡng, giảm hoạt động rồi một lúc nào đó đưa đến cơn kích tim. Những miếng bựa có thể bứt rời thành mạch máu, ngao du khắp cơ thể theo hệ tuần hoàn gây ra nghẽn mạch. Lên đến não nó tạo ra tai biến mạch máu não, tới tim nó gây ra nhồi máu cơ tim. DHA có tác dụng ngăn ngừa tiểu huyết cầu dính với nhau, và còn có tác dụng ngăn các mảng vụn bám vào vách mạch máu do đó giúp mạch máu khỏi bị nghẽn, tránh được nguy cơ nhồi máu cơ tim. DHA tinh khiết còn làm giảm độ nhớt của máu. DHA và EPA (acid eicosapenraenoic) trong màng tế bào tim được phóng thích khi có sự thiếu hụt của dòng máu đi đến một phần của tim. Hai loại acid này bảo vệ những tế bào tim khỏi việc tham gia vào hoạt động nhanh của tim, liên quan đến sự gia tăng nguy cơ đột tử. f) Tác dụng đối với sự viêm[22],[25] Dầu cá được sử dụng như là một chất chống viêm trong bệnh viêm khớp mãn tính. Mặc dù DHA dễ bị oxide hóa hơn acid arachidonic (AA), các sản phẩm phân hủy của AA (endoperoxide và eicosanoid) tạo ra nhiều gốc tự do hơn sản phẩm của DHA nhưng DHA cũng ức chế sự tổng hợp nitric oxide (làm giảm sự hình thành các gốc tự do peroxynitrite) và ức chế sự phiên mã yếu tố NF-κB (giảm sự hình thành các cytokine tiền phản ứng viêm). Các cytokine và các yếu tố điều hòa sự viêm khác như interleukin IL và yếu tố hoại tử khối u TNF có một hoạt động tế bào tiền phản ứng viêm. DHA cùng với acid eicosapentaenoic ức chế sự hình thành các cytokine IL-1β và TNF-α qua một cơ chế hiện vẫn chưa được biết đến. g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp [10] DHA có khả năng ngăn chặn phản ứng của hệ miễn dịch gây ra chứng viêm khớp, khiến khớp bớt cứng và sưng, làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh này. Một số công trình nghiên cứu khi cho bệnh nhân dùng những liều dầu cá từ 2-4g, thậm chí 5g/ngày, đã cho một số kết quả khá hứa hẹn: khớp bớt cứng và ít đau hơn. h) DHA và bệnh ung thư [3] Noding và các cộng sự đã quan sát được rằng sự nhạy cảm của các tế bào khối u in vitro đối với DHA và những sản phẩm oxid hóa của DHA phụ thuộc vào trạng thái chống khối u. Có bằng chứng đề nghị rằng các ω-3 LC PUFAS, đặc biệt là DHA, làm tăng sự nhạy cảm của các tế bào ung thư đối với các tác nhân chống ung thư vú và các tiền chất oxid hóa. Đề nghị này được ủng hộ bởi các kết quả nghiên cứu có uy tín của Bougnoux và các cộng sự, người đã theo dõi phản ứng được cải thiện đối với việc hóa trị liệu (chemotherapy) ở những bệnh nhân ung thư vú có hàm lượng DHA cao trong mô mỡ ở ngực. i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn[37] Các nghiên cứu đang chứng minh cho thấy, thiếu acid béo trong chế độ ăn sẽ làm cho chúng ta... dữ dằn hơn và kém thông minh hơn. Tiến sĩ Jackie Stordy, cựu trưởng khoa nghiên cứu dinh dưỡng đại học Surrey (Anh) cho biết sự hấp thu nhiều cá giàu acid béo có mối liên hệ tới khả năng làm dịu đi sự hằn học, cáu bẳn. Thực phẩm có tác động trực tiếp đến cảm xúc và tâm trạng. 1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA.[29] DHA được tìm thấy nhiều ở cá, đặc biệt là các loại cá béo, chứa nhiều mỡ và dầu như cá trích, cá thu, cá mòi, cá hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải cũng chứa tiền 15 chất của DHA là α-linolenic acid. Ngoài ra, DHA cũng là một trong những acid béo chính trong thành phần acid béo của một số loài vi nấm sống ở biển như Tharaustochytrium roseum, T. aureum và Schizochytrium aggeratum.[2] Hiện nay, dầu cá là nguồn thu nhận DHA chủ yếu, nhưng DHA cũng có thể được sản xuất bằng cách sử dụng vi sinh vật. Các vi sinh vật biển có thể chứa một lượng lớn DHA và được xem như là nguồn thu nhận hiệu quả của acid béo quan trọng này. Vài loài trong đó có thể tăng trưởng theo lối dị dưỡng trên những chất nền hữu cơ ở điều kiện không có ánh sáng (như vi tảo crypthecodinium cohnii). Gần đây đã có nhiều tiến bộ trong việc sản xuất DHA trong công nghệ sinh học từ các vi sinh vật biển.[5],[11] Như vậy, DHA có trong mỡ cá vùng biển sâu, vùng Green land Nhật Bản, hoặc đi theo con đường tổng hợp nhưng hiện nay đã xác định được trong thành phần mỡ cá basa Việt Nam (Pangasius baucourti) cá nước ngọt, nuôi bè trên dòng sông Mêkông không những có đủ thành phần acid béo không no – acid béo thiết yếu mà còn có thành phần DHA. Ở Việt Nam hiện nay phát hiện có 2 loại cá chứa DHA đó là cá tra và cá ba sa với thành phần chất béo như bảng 6. Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng của cá tra, cá basa [30] Thành phần dinh dưỡng trên 100g sản phẩm ăn được Tên Calo (cal) Calo từ chất béo Tổng lượng chất béo (g) Chất béo bão hòa (g) Cholesterol (mg) Natri (mg) Protein (g) Cá tra 124,52 30,84 3,42 1,64 25,2 70,6 23,42 Cá basa 170 60 7 2 22 70,6 28 Qua bảng 6 nhận thấy rằng nguồn dinh dưỡng của cá ba sa nhiều hơn đặc biệt là tổng lượng chất béo, đó là lý do hiện nay ở nước ta đang cố gắng làm giàu DHA, tiến tới tách DHA từ mỡ cá basa dần dần khỏi phải nhập ngoài, để bổ sung vào sản phẩm thực phẩm nhằm góp phần cho con em chúng ta sau này thông minh hơn, khỏe mạnh hơn. Hình 2: Cá tra Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878) 16 Hình 3: Cá basa Tên khoa học: Pangasius bocourti (Sauvage, 1880) 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP DHA 1.2.1. Phương pháp chưng cất phân đoạn bằng li tâm phân tử[19] Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa hàm lượng acid béo lần lượt là 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 45oC, làm lạnh trong 18 giờ ở 16oC, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 13oC qua đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, làm khan dung dịch ether với Na2SO4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. 1.2.2. Phương pháp sắc kí khí định lượng (preparative scale gas chromatography)[16] Dầu gan cá tuyết chứa 3 loại acid béo không bão hòa cần thiết (C18:4, C20:5, C22:6) được xà phòng hóa, và acid được tìm thấy có chỉ số iod là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và 0,07% nối ba liên hợp, những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng phương pháp urea – MeOH và hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iod 401. Hỗn hợp này được ester hóa với MeOH-H2SO4 và hỗn hợp ester qua sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4, 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6, trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách. Sắc kí định lượng được tiến hành trên cột cao 152,4 cm được nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là 150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp là 225oC. Phân đoạn thu được có thể được là tinh sạch hơn bằng sắc kí cột. 1.2.3. Phương pháp sắc kí cột (column chromatography)[12] Các acid béo bất bão hòa và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc kí cột sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc CO2 lỏng như là pha động và oxid nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Việc xử lý trước, tốt nhất là với NaOH trong dung môi nước hữu cơ, cho thấy những kết quả được cải thiện với acid béo bất bão hòa đa. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate và cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc kí cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0,5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng. 17 Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane. 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải li tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc kí cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng l3 với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải li cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) [20] CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33oC và áp suất thấp 17.7MPa để tránh sự oxid hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). Ba mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), ba mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 45oC) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 40oC và 300 phút. 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc (silver nitrate method) [8] Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc kí lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 100oC. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bản mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. 18 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.1. Phương pháp transester hóa [13] Trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật, một triglycerid sẽ phản ứng với một alcol có mặt chất xúc tác sẽ thu được sản phẩm là một hỗn hợp alkyl ester của acid béo và glycerin. Phương trình phản ứng : 3ROH C C C H2 H2 H OH OH OH R1COOR R2COOR R3COOR xuùc taùc CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O Triglycerid Rượu Glycerin Hỗn hợp akyl ester Để thực hiện phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật có thể sử dụng các loại xúc tác khác nhau như: 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid[33],[9] a) Ưu điểm: Là loại xúc tác cơ bản từ lâu đời. Dễ sử dụng, cho hiệu suất cao, rẻ tiền. b) Nhược điểm: Quá trình transester hóa được xúc tác bằng acid Bronsted như acid sulfuric cho một hiệu xuất rất cao nhưng lại xảy ra chậm, đòi hỏi nhiệt độ trên 100oC và 3giờ mới đạt độ chuyển hóa hoàn toàn. Ngoài ra, phản ứng trên phải được thực hiện trong môi trường không có nước để tránh có sự cạnh tranh tạo ra acid carboxilic làm giảm hiệu suất phản ứng. Thiết bị phản ứng mau hư do bị ăn mòn. Theo William W. Christie (Scotland) thông thường lipid được hòa tan trong chất phản ứng và hỗn hợp được đun nóng khoảng 2 giờ, nhưng nó có thể cũng được đun nóng trong ống kín ở nhiệt độ cao và thời gian ngắn hơn. Lượng xúc tác H2SO4 cho vào khoảng 1-2% trong dung môi là methanol. 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ [9],[31] Xúc tác bazơ thường được sử dụng trong công nghiệp như: NaOH, KOH, Carbonat kim loại kiềm, CH3ONa,… Trong đó, CH3ONa được xem là xúc tác hoạt động tốt nhất (cho hiệu suất trên 98% trong 30 phút với một lượng nhỏ 0,5%). a) Ưu điểm: - Xúc tác bazơ ít có tính ăn mòn đồng thời cũng thúc đẩy tiến trình xảy ra nhanh hơn khi so sánh với xúc tác acid. - Giá thành rẻ (KOH, NaOH). Việc tăng nồng độ xúc tác lên khoảng 1% hoặc 2% là có hiệu suất cao không kém gì alkoxid kim loại. - K2CO3 được dùng với nồng độ 2% hoặc 3% cũng cho hiệu suất cao đồng thời tránh được sự thủy phân ester do bicarbonat được tạo thành thay vì nước ở xúc tác hydroxyd. 19 b) Nhược điểm: - KOH và NaOH với giá thành rẻ nhưng kém hoạt động hơn K2CO3, CH3ONa. Tuy nhiên, với loại xúc tác hyroxyd này sẽ làm sản sinh ra một lượng nước ngay cả trong môi trường khan nước ban đầu (do phản ứng với rượu), điều này sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng (do có nước sẽ thúc đẩy quá trình thủy phân ester tạo thành). - Việc sử dụng xúc tác bazơ mạnh trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật rất dễ xảy ra quá trình xà phòng hóa, điều đó dẫn đến làm giảm hiệu suất phản ứng và việc tách loại ester và glycerin tạo thành cũng gặp khó khăn. Theo nghiên cứu của trường đại học Idaho [31], quá trình transester hóa dầu cải chịu tác động của nhiều yếu tố: 1) nhiệt độ, 2) xúc tác, 3) tốc độ khuấy trộn, 4) nước trong alcol được sử dụng, 5) lượng alcol dư được sử dụng. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là: 1) nhiệt độ phòng, 2) xúc tác NaOCH3 0,5% hoặc KOH 1% so với trọng lượng dầu cải, 3) tốc độ khuấy trộn nhanh, mãnh liệt trong những giai đoạn đầu của phản ứng và không quan trọng lắm sau khi đã trở thành hỗn hợp đồng nhất, 4) ethanol tuyệt đối thì cho tốc độ chuyển hóa nhanh, 5) lượng alcol dư là hơn 50% đối với NaOCH3 và hơn 100% đối với KOH. Theo cuộc nghiên cứu đó thì quá trình transester hóa trải qua ba giai đoạn: 1) phản ứng transester hóa, 2) sự phân lớp, 3) quá trình rửa. 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym[41],[42] Sự tạo thành acid docosahexaenoic (DHA) đã được nghiên cứu trong dầu cây anh thảo (Oenothera biennis L) và dầu cây borage (Borago officinalis L.) (một loại cây mà hoa và lá được dùng làm món sà lát và tạo hương vị cho thức uống) bằng con đường transester hoá với xúc tác lipase.[41] Có 6 loại lipase: Novozym 435 từ Candida antarctica, Lipozyme IM từ Mucor miehei, PS-30 từ Pseudomonas sp., AP-12 từ Aspergillus niger, AY-30 từ Candida rugosa, và Novozym-677BG từ Thermomycelanuginosus được kiểm tra cho khả năng hợp thành DHA (22:6 ω-3) trong dầu cây anh thảo. Trong số các enzym đã ví dụ thì Novozym 435 từ Candida antarctica được chọn làm xúc tác cho phản ứng transester hóa vì lý do hợp thành DHA cao. Khi có sự tập trung của enzym cao, tỷ lệ chất nền, và thời gian ủ tăng thì sự hợp thành DHA cũng tăng. Trong một tiến trình phản ứng sự hợp thành DHA tăng lên 25,2% sau 24giờ. Cao nhất là 37,4% khi tỷ lệ dầu cây anh thảo/DHA là 1/3. Cây anh thảo[42] (Oenothera biennis L.) là cây hai năm thuộc họ dừa nước (Onagraceae) là một loại cây thông thường sống ở Bắc Mỹ. Điều thú vị là dầu anh thảo có chứa γ-linolenic acid (GLA; 18:3 ω-6) (Senanayake và Shahidi, 1999a). Ưu điểm:[14] Đa số các enzym làm xúc tác đều được thực hiện ở điều kiện bình thường (nhiệt độ phản ứng là 20-40oC), không tốn năng lượng và không đòi hỏi thiết bị phức tạp. Các chất thải enzym dễ bị phân hủy nên không gây ô nhiễm môi trường. Hiệu lực xúc tác của enzym lại rất lớn (vận tốc phản ứng gấp 108-1011 lần) so với những phản ứng dùng xúc tác hóa học thông thường. Nhược điểm:[14] Mỗi loại enzym chỉ xúc tác nên một số chất nền và kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử. Ngoài ra, việc sử dụng xúc tác enzym có mặt hạn chế là thời gian phản ứng rất lâu (20 giờ). Đồng thời phải tìm được loại enzym phù hợp với đối tượng nghiên cứu. 20 1.3.1.4. Xúc tác zeolit[9] Trong những năm gần đây, người ta thường ứng dụng xúc tác acid, bazơ rắn,… đặc biệt là zeolit đang được xem là một chất xúc tác hiệu quả cho phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật do có một số ưu điểm nổi bật sau: • Có tính chọn lọc cao • Việc tách các sản phẩm sau phản ứng dễ dàng. • Xúc tác zeolit sau khi thu hồi có thể sử dụng lại. • Hiệu suất phản ứng cao • Phản ứng không sinh ra sản phẩm phụ (do không có hiện tượng xà phòng hóa so với các xúc tác bazơ cổ điển). Ngoài ra người ta còn thường sử dụng các chất xúc tác khác cho hiệu quả cao nhưng qui trình thực hiện lại khá phức tạp. Ví dụ như sử dụng chất xúc tác calicined Mg-Al hydrotalcites[43]. Xúc tác này gồm: 187ml dung dịch chứa Mg/Al theo tỷ lệ Mg(NO3)2.6H2O và Al(NO3)3.9H2O (tổng metal nitrat, 0,375mol), thêm từ từ 187ml dung dịch thứ hai chứa NaOH (0,4375 mol) và Na2CO3 (0,1125 mol), pH = 8-10. Trong phần thực nghiệm này chúng tôi không sử dụng xúc tác là Zeolit vì qui trình tổng hợp hơi phức tạp. Chúng tôi sử dụng loại xúc tác có sẵn là bazơ (KOH, NaOH) rẻ tiền và kinh tế với hàm lượng nhỏ khoảng 1-2%. 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột[12] Theo Teshima, S. et al [40], mô tả về phương pháp cô lập của EPA và DHA từ dầu cá bằng xà phòng hóa với ethanol xúc tác KOH. Phần metyl ester của acid béo thô được làm tinh bằng sắc kí cột trên silica gel và sau đó EPA được phân chia ra khỏi DHA bằng sắc kí cột trong hỗn hợp bạc nitrat và silica gel. Sắc ký pha lỏng trên cột (Sắc ký cột hở) là tên gọi chung cho một số hệ thống vật lý trong đó một cột được nạp chặt chẽ bởi chất hấp thu và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Sắc ký cột nhanh khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc giải ly của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký được rú