Phương pháp phổ hồng ngoại và ứng dụng trong thục phẩm

không phải máy nào cũng đáp ứng được) nên trong thực tế, phương pháp này được sử dụng để phân tích các hợp chất hữu cơ là phổ biến hơn. Tần số hấp thu đặc trưng của các nhóm chức được trình bày trong các bảng có đơn vị là cm-1 (thật ra là số sóng, nhưng được quen gọi là tần số) với cường độ được viết tắt là m (mạnh), tb (trung bình), y (yếu) và bđ (biến đổi). 3.1 Tần số hấp thu của hydrocarbon: Tần số hấp thu hồng ngoại của hydrocarbon no, của alkene, arene một và nhiều nhân thơm, alkyne được tóm tắt trong các bảng 2, 3, 4 và 5. Bảng 2: Tần số hấp thu của hydrocarbon no (alkane và cyclane) Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 24 Nhóm Dao động Tần số (cm-1) Ghi chú –CH3 VC - H(bđx) VC - H(đx) δ CH3 (tmp) δ CH3 (nmp) 2975 – 2950 (m) 2885 – 2870 (m) 1465 – 1440 (tb) 1390 – 1375 (tb) DĐ hóa trị bất đối xứng DĐ hóa trị đối xứng DĐ biến dạng trong mặt phẳng DĐ biến dạng ngoài mặt phẳng >(CH3)2 – C(CH3)3 δ CH3 δ CH3 ≈ 1380 (tb) 1395 – 1385 (tb) 1365 (m) DĐ biến dạng trong mặt phẳng DĐ biến dạng trong mặt phẳng >CH2 thẳng VC - H(bđx) VC - H(đx) δ CH2 δ CH2 2940 – 2920 (m) 2870 – 2840 (m) 1480 – 1440 (tb) 745 – 720 (y): 745 – 735 735 – 725 725 - 720 DĐ hóa trị bất đối xứng DĐ hóa trị đối xứng DĐ biến dạng “lưỡi kéo” DĐ biến dạng “con lắc” của mạch carbon – (CH2)n _: n = 2 n = 3 n > 3 – CH2 – vòng δ CH2 1452 cm-1 DĐ biến dạng “lưỡi kéo” của cyclohexane (có tần số thường bé hơn alkane thẳng) – CH vòng (lớn hơn ba) VC - H 2890 – 2880 (y) CH vòng ba – CH2 - halogen VC - H ≈ 3050 (y) Trùng với vùng Ch alkene C – C VC - C δC - C 1260 – 700 (y) 600 - 500 Rất yếu – CO – CH3 VC – H 3100 – 2900 (y) Thường rất yếu Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 25 – CHO VC-H 2900 – 2700 (y) Thường gồm haivân (một ở ≈ 2720cm-1) – O CH3 – O – CH2 – O VC-H 2850 – 2810 (tb) 2790 – 2770 (tb) Aryl ether: số sóng cao Ankyl ether: số song thấp N – CH3 VC-H 2820 – 2780 (tb) – O – CO – CH3 δ CH3 1385 – 1365 (m) 1360 – 1355 (m) Cường độ rất mạnh Nhóm C – H không tham gia liên kết hydro nên vị trí các vân hấp thu của nó ít chịu ảnh hưởng của trạng thái mẫu đo và bản chất hoá học của môi trường đo. Nếu không thấy sự xuất hiện của các vân hấp thu do dao động hoá trị của CH no thì chắc chắn trong hợp chất nghiên cứu không có các nhóm CH, > CH2, – CH3. Liên kết C – C hấp thu ở vùng chỉ vân tay, thường yếu và có số sóng thay đổi do ảnh hưởng của tương tác dao động nên không có giá trị thực tế. Bảng 3: Tần số hấp thu của Alkene Nhóm Dao động Tần số (cm-1) Ghi chú >C=CH2 – CH=CH2 >C=CH – V=CH2 δ=CH2 V=CH2 δ=CH2 V=CH δ=CH 3095 – 3075 (tb) 895 – 885 (m) 3095 – 3075 (tb) 995 - 980 Và 915 - 905 3040 – 3010 (tb) 850 – 790 (m) Đôi khi bị che phủ bởi vân VC-H no RCH= CHR (trans) – RHC=CHR (cis) R – CH=CH2 R2C=CHR δCH(nmp) δCH δCH δCH 970 – 960 (m) 730 – 675 (tb) 995 – 985 (m) Và 940 – 900 (m) 840 – 790 (tb) DĐ biến dạng ngoài mặt phẳng (ở 990cm-1 nếu liên hợp với C=O ) Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 26 > C=C < > C=CH2 –CH=CH2 –RHC=CHR(cis) RCH=CHR(trans) >C=CH và C=C< Dien và Trien VC=C(klh) VC=C(lh) VC=C δC=C VC=C δC=C VC=C δC=C VC=C VC=C 1680 – 1620 (bđ) ≈1625 (tb) <1665 630cm-1 <1665 630 va 455 >1665 455 - 370 >1665 1650(m) và 1600(m) DĐ hoá trị C=C không liên hợp Liên hợp với nhân thơm (với hệ thống liên hợp, thường xuất hiện hai mũi hấp thu 1650 – 1600 cm-1) DĐ biến dạng do mạch carbon DĐ biến dạng do mạch carbon với hai mũi hấp thu DĐ biến dạng do mạch carbon với một mũi hấp thu Vân 1600 thường mạnh hơn và có thể xen lẫn với vân 1650 Bảng 4: Tần số hấp thu của Arene môt nhân thơm và nhiều nhân thơm Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú Aryl – H VCH thơm 3080 – 3010 (y) Thường bị che phủ, có thể có đến 5 mũi (số mũi giảm khi số nhóm thế tăng). Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 27 δCH(tmp) thơm δCH(nmp ) thơm 1290 – 1000 (y) 900 – 675 (bđ) 770 – 730 và 710 – 690 770 – 735 960 – 900, 880 – 830 Và 710 – 680 860 – 800 800 – 760 và 720 – 685 900 – 885 và 780 – 760 865 – 810 và 760 - 730 DĐ biến dạng trong mặt phẳng (rất yếu thường bỏ qua). DĐ biến dạng ngoài mặt phẳng(rất đặc trưng), tần số thay đổi theo vị trí và số nhóm thế: Một nhóm thế (2 mũi) Hai nhóm thế ortho (1mũi) Hai nhóm thế meta (3 mũi) Hai nhóm thế para (1 mũi) Ba nhóm thế – 1,2,3 Ba nhóm thế – 1,2,4 Ba nhóm thế – 1,3,5 C=C (một nhân thơm) VC=C Mạch carbon 1625 – 1430 1625– 1590, 1590 – 1575 1575 và 1525 - 1470 2 hay 3 mũi Nhiều nhân thơm δCH(nmp)thơm 900 – 675 (bđ) 671 770 – 730 (m) 770 – 735 (m) 820 – 760 (m) 860 – 800 (m) 900 – 830 (m) DĐ biến dạng ngoài mặt phẳng, tần số thay đổi theo số H, theo vị trí và số nhóm thế: 6 H liên tiếp (một mũi) 5H liên tiếp (một thế)(một mũi) 4H liên tiếp (hai thế ortho)(một mũi) 3H liên tiếp (hai thế meta hay – 1, 2, 3) 2H liên tiếp (hai thế para hay – 1,2,3,4) 1H cô lập(hai thế meta hay – 1,2,3,5,- 1,2,4,5) Nhóm CH không no và CH thơm có thể được phân biệt với CH no bởi vì vân hấp thu do dao động hoá trị của chúng thường xuất hiện ở số sóng lớn hơn 3000 cm-1 Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 28 (trong khi vân hấp thu do dao động hoá trị của CH no xuất hiện ở số sóng bé hơn 3000 cm-1). Tuy nhiên, do cường độ của các vân này khá yếu nên chúng thường bị che phủ bởi các vân CH no hoặc các vân NH, OH,... Nhìn chung, phổ hồng ngoại của các hợp chất thơm thể hiện ở năm vùng: vùng 3080 – 3010 cm-1(dao động hoá trị của liên kết CH), vùng có tần số từ 2000 – 1600 cm-1 xuất hiện các vân họa tần và vân kếp hợp của hợp chất thơm, vùng 1600 – 1500 cm-1 có thể có hai hay ba vân do dao động hoá trị của các liên kết C- C trong nhân gây nên (dao động khung), đặc trưng cho các nhân thơm loại sáu cạnh như nhân benzen, nhân pyridine, vùng 1225 – 950 cm-1 hầu như không cung cấp thông tin có giá trị cho việc giải đoán phổ, vùng dưới 900 cm-1có các vân dao động biến dạng ngoài mặt phẳng của các liên kết CH thơm có thể cung cấp các thông tin về số lượng và vị trí của các nhóm thế, nhưng phải hết sức thận trọng vì đây không phải là các vân duy nhất trong vùng này. Bảng 5: Tần số hấp thu của Alkyne Nhóm Dao động Tần số (cm-1) Ghi chú –C≡C–H V=CH δCH 3340 – 3300 (tb) 695 – 575 Có thể bị che bởi mũi NH hay OH Hai mũi – C≡C–H – C≡C–H VC≡C VC≡C 2140 – 2100 (y) 2260 – 2190 (y) Alkyne một nhóm thế Alkyne hai nhóm thế, mũi chẻ do cộng hưởng Femi, cường độ càng yếu khi tính đối xứng càng cao (không xuất hiện khi nối ba ở giữa mạch hoặc gần giữa mạch) Acetylene Alkyne thế δC≡C δC≡C 355 – 335 510 - 260 -–C–C≡C R–C≡Cme R–C≡CEt 960 – 900 520 – 495 495 - 480 DĐ hoá trị do mạch carbon DĐ biến dạng do mạch carbon DĐ biến dạng do mạch carbon 3.2 Tần số hấp thu của Alcohol và phenol: Các vân hấp thu đặc trưng của hai hợp chất này do dao động hoá trị của liên kết – O–H và – C – O – . Các vân hấp thu này chịu ảnh hưởng rất mạnh của liên kết hydrogen nội phân tử và liên phân tử. Tần số hấp thụ thay đổi càng mạnh khi dao động hoá trị C – O và dao động biến dạng O–H có sự kết hợp với những hydro liên tiếp (bảng 6 và 7). Bảng 6: Tần số hấp thu đặc trưng của alcohol Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 29 Nhóm Dao động Số sóng (cm-1) Ghi chú –OH tự do (khí hoặc DD thật loãng) VOH δOH(tmp) δOH(nmp) 3650 – 3590 (bđ) 3640 – 3630 3625 – 3620 3620 – 3610 3460 – 3450 1410 – 1260 (m) 700 - 600 * Mũi hấp thu thường nhọn,cường độ tăng dần theo Alcohol thơm<tam<nhị<nhất: - Alcohol nhất, thẳng - Alcohol nhị, thẳng - Alcohol tam, thẳng - Dạng R-O-H-O-C< * DĐ biến dạng trong mặt phẳng (nhọn) * DĐ biến dạng ngoài mặt phẳng(tù) –OH liên kết hydro (DD đậm đặc) VOH δOH(tmp) 3600 – 3200 (m) 3300 3580 – 3480 1500 - 1300 * Thường tù: liên kết hydro càng mạnh, số sóng càng giảm - Alcohol thẳng - Có liên kết hydrogen giữa nhóm O–H và hệ thống pi của nhân thơm * DĐ biến dạng trong mặt phẳng (tù) –OH liên kết hydro nội phân tử VOH 3200 – 2500 (bđ) VOH của phenol, acid cũng ở vùng này, bao trùm cả vùng hấp thu của vân VC–H. H2O kết tinh VOH 3600 – 3100 (y) 1640 – 1615 (y) H2O trong DD VOH 3710 H2O ẩm VOH 3500 – 3450 C–OH VC-O 1205 – 1030 (m): 1065 – 1030 1125 – 1085 1205 – 1125 Alcohol nhất, thẳng Alcohol nhị, thẳng Alcohol tam, thẳng (DĐ hoá trị C–O của ether,ester,acid và anhydric carboxylic hấp thu mạnh trong vùng từ 1300 – 1000 cm-1) Bảng 7: Tần số hấp thụ đặc trưng của phenol Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 30 Nhóm Dao động Số sóng(cm-1) Ghi chú –OH VOH δOH(nmp) 3620 – 3590 3650 – 3600 3400 – 3230 3200 – 2500 720 – 600  DD loãng, dung môi không phân cực  Có nhóm thế rút điện tử ở vị trí ortho ngăn cản tạo liên kết hydrogen  Mẫu lỏng, rắn hay DD đậm đặc và không có nhóm thế rút điện tử ở vị trí ortho  Liên kết hydrogen nội phân tử  Mẫu rắn hay DD có sự tạo liên kết hydrogen mạnh (tù) -C-OH VC-O 1205 – 1030(m): 1255 – 1240, 1175 – 1150, 835 – 745 1320 1185 1300 - 1200  Alkyl phenol (3mũi)  phenol thế ortho (1 mũi)  phenol thế meta (1 mũi)  phenol thế para (1 mũi) Dao động hoá trị của nhóm NH đôi khi cũng ở lẫn trong vùng của nhóm OH liên kết hydro, nhưng vân NH thưởng nhọn ( vì tạo liên kết hydro yếu) và có cường độ yếu hơn vân OH. 3.3 Tần số hấp thu của ether, epoxide và peroxide: Các hợp chất ether, epoxide có chứa nhóm chức C–O–C, trong đó liên kết C–O có lực liên kết và khối lượng thu gọn tương đương với liên kết C–C nên có các vân hấp thu xuất hiện ở tần số rất gần với tần số của liên kết C–C và dễ gây ảnh hưởng lên nhau. Tuy nhiên, cường độ của vân hấp thu C–O mạnh hơn nhiều so với cường độ của các vân hấp thu C–C. Các hợp chất peroxide và hydroperoxide gồm hai dạng liên kết chính là liên kết C–O và liên kết O–O.Các giá trị tần số hấp thu của các hợp chất trên được tóm tắt trong bảng 8. Bảng 8: Tần số hấp thu đặc trưng của ether, epoxide và peroxide Nhóm Dao động Số sóng (cm- 1) Ghi chú –C–O–C (ether) VC-O-C(đx) 1270- 1030(m): 1150 – 1060 1225 – 1200 DĐ hoá trị đối xứng: Ether thẳng, no Ether thẳng, không no Ether vòng Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 31 VC-O-C(bđx) 1270 – 1030 1270 – 1230 1090 1470 - 1230 Ether thơm Ether benzylic DĐ hoá trị bất đối xứng, chịu ảnh hưởng của nhóm gắn trực tiếp vào nguyên tử oxy –C–O–C (epoxide) Vvòng VC-O và VC-C(bđx) VC-H 1250 950 – 810 3060 – 2990 DĐ hoá trị bất đối xứng do sự ghép cặp của liên kết C-O và C-C Dao động hoá trị C-H của vòng C–O (peroxide và hydroperoxide) VC-O 1300 – 1000 O–O (peroxide và hydroperoxide) VC-O 900 – 830 Không xuất hiện ở peroxide đối xứng 3.4 Tần số hấp thu của hợp chất carbonyl: Vân hấp thu của nhóm carbonyl là một vân đặc trưng rất có ích khi nghiên cứu cấu trúc vì có cường độ rất mạnh và xuất hiện trong vùng có tần số xác định (mũi hấp thu do dao động hoá trị của C=O xuất hiện trong vùng từ 1870 – 1540 đối với andehyde, cetone, acid và ester chịu ảnh hưởng của những mũi hấp thu khác không đáng kể). Nói chung, các yếu tố làm tăng “liên kết đôi” của nhóm carbonyl sẽ làm tăng lực liên kết và do đó làm tăng tần số hấp thu và ngược lại: - Tăng một ít khi có một nhóm rút điện tử gắn vào nhóm carbonyl. - Giảm một ít (khoảng 15 – 40cm-1) khi carbon α của nhóm carbonyl không no (trừ amide). - Giảm một ít (khoảng 40 – 60 cm-1) khi có một liên kết hydrogen liên hay nội phân tử. - Giảm một ít khi nhóm carbonyl gắn vào vòng nhỏ(ví dụ cyclobutanone hay cyclopropanone) so với vòng lớn. Cường độ hấp thu của nhóm carbonyl ở acide mạnh hơn so với ester, ở ester mạnh hơn so với cetone và aldehyde. Cũng cần lưu ý rằng vân hấp thu do dao động hoá trị của liên kết C=O thường có một mũi họa tần cường độ yếu ở tần số khoảng 3500 – 3300 cm-1. Cetone: Tần số hấp thu đặc trưng của một số cetone được trình bày bảng 9. Bảng 9 Tần số hấp thu đặc trưng của cetone Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 32 Nhóm Dao động Tần số (cm-1) Ghi chú C=O (cetone thẳng no hoặc vòng lớn hơn 5 carbon) VC=O δC=O(tmp) 1765 – 1735 (m) 1745 – 1715 (m) 1725 – 1705 (m) 1700 – 1680 (m) 1700 – 1660 (m) 1750 – 1725 (m) 1765 – 1745 (m) 1660 1690 – 1655 1435 – 1355 1435 – 1405 1360 – 1355 630 – 629 540 - 510 Đo mẫu ở trạng thái hơi DD loãng Mẫu lỏng hay DD đậm đặc Cetone thơm(nhiều nhân liên hợp) Cetone α - ethylenic Cetone α - halogen Cetone α – dihalogen Orthoquinone Parequinon (một hay hai mũi hấp thu) Chịu ảnh hưởng của nhóm alkyl ở vị trí carbon α: Nhóm methylen (-CH2-CO-) Nhóm methyl (-CO-CH3) Dạng –C–CO–C Dạng –C–C=O C=C (β-dicetone) VC=C 1610 (m) Rất mạnh Aldehyde: Liên kết C=O có tần số dao động cùng nguyên tắc với cetone, nhưng cao hơn một ít. Ngoài liên kết C=O, aldehyde còn có liên kết C – H (bảng 10). Bảng 10: Tần số hấp thu đặc trưng của aldehyde. Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú C=O VC=O δC=O (nmp) 1740-1720 (m) 1715-1695 (m) 1705-1685 (m) 650-580 (m) Aldehyde no Aldehyde thơm Aldehyde α-ethylenic Aldehyde thơm C–H VC-H δC=O (tmp) 2900-2860 2830-2810 và 2745-2720 1390 Gồm hai mũi, tần số thay đổi theo mạch carbon và ảnh hưởng của nhân thơm: Benzaldehyde (một mũi), Aldehyde thơm (hai mũi) Có thể xuất hiện thêm mũi ở 2870-2830 do hiệu Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 33 ứng Fermi Anhydride acid: Ngoài hai mũi hấp thu đặc trưng do dao động hóa trị đối xứng và bất đối xứng của hai liên kết C=O ghép trong hệ thống –CO–O–CO– trong anhydride acid, còn có dao động hóa trị của nhóm chức C–O–C (bảng 11). Bảng 11: Tần số hấp thu đặc trưng của anhydride acid Nhóm Dao động Tần số (cm-1) Ghi chú –CO–O–CO– VC=O 1840-1800 và 1715-1695 (m) 1830-1780 và 1755-1710 (m) 1870-1820 và 1800-1750 (m) Anhydride acid thẳng, no (hai mũi) Anhydride thơm hay không no (hao mũi) Vòng năm cạnh no. C–O–C VC-O 1185-980 1050-1040 1300-1210 Anhydride thẳng, mạch ngắn. Anhydride thẳng, mạch dài. Anhydride vòng. Carboxylic acid: Do có khả năng tạo liên kết hydrogen mạnh, acid carboxylic thường hiện diện ở dạng nhị hợp (dimer) trong dung dịch đậm đặc. Phổ hồng ngoại của acid carboxylic có hai mũi hấp thu đặc trưng: một mũi mở rộngdo dao động hóa trị của liên kết O-H và một mũi của dao động hóa trị C=O, có cường độ mạnh hơn của cetone hay aldehyde (bảng 12). Bảng 12: Tần số hấp thu đặc trưng của carboxylic acid Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –CO– VC=O 1725-1700 (m) 1760 1715-1680 Dimer Monomer (giảm khi mạch carbon càng dài) Acid thơm hay acid α-ethylenic (acid thơm có sự kết hợp nội phân tử giữa nhóm COOH và nhóm OH ở vị trí ortho làm giảm khoảng 50cm-1 –O–H VOH 3300-2500 Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 34 –CO–O δ-CO-O 675-590 570-545 Acid thẳng, dài(n>3); mũi chẻ ba Acid thơm >C=CH–COOH Carboxylate – COO-: Ion carboxylate có hai vân hấp thu do dao động hóa trị đối xứng, bất đối xứng và một vân do dao động biến dạng (bảng 13). Bảng 13: Tần số hấp thu đặc trưng của ion Carboxylate Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –COO- VC=O(đx) VC=O(bđx) δ-CO-O 1610-1550(m) 1690 172-1700 1450 760-400 Mũi đặc trưng, khi muối không có nhóm rút điện tử. Khi muối có nhóm rút điện tử, ví dụ CF3. Mũi chẻ hai hay ba không có nhóm rút điện tử). Khi muối có nhóm rút điện tử. Eter và lactone: Tất cả các eter và lactone đều có mũi hấp thu đặc trưng bởi dao động C=O và O-C. Dao động C=O chịu ảnh hưởng của cấu trúc hợp chất giống như cetone (bảng 11.14). Những δ- lactone và lactone vòng lớn (>=6) có tần số hấp thu của C=O tương tự eter. Những lactone vòng nhỏ như γٕ- lactone có tần số dao động tăng một ít. Bảng 14: Tần số hấp thu đặc trưng của Eter và lactone Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –CO– VC=O 1750-1725(m) 1730-1705(m) 1800-1750 1770-1740 1780-1760 1820 Eter thẳng, no Eter thơm hay không no Aryl và vinyl ester Ester có nhóm rút điện tử gắn vào C- α Lactone năm cạnh Lactone bốn cạnh C–O–C VC-O 1275-1185 và 1160-1050 (m) 1310-1250 và 1200-1100 (m) Ester thẳng (hai mũi) Ester thơm hay không no Halogenur acid: có dao động hóa trị C=O phụ thuộc vào loại halogen (bảng 15). Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 35 Bảng 15: Tần số hấp thu đặc trưng của Halogenur acid Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –CO– VC=O 1865-1840(m) 1615-1790(m) 1805-1795 Acid thẳng no: Fluoride acid Chloride acid Bromide và iodide acid( Acid thơm hay không no giảm khoảng 25-45cm-1 so với acid no) Một số hợp chất carbonyl khác Ngoài các hợp chất đã kể trên, còn nhiều hợp chất khác cũng có chứa nhóm carbonyl như amide – CO-N<, imide –CO-N-CO-, urea –N-CO-N, Thioacid, Thioester… Bảng 16 cung cấp tần số hấp thu đặc trưng của một số hợp chất carbonyl thông dụng khác. Bảng 16: Tần số hấp thu đặc trưng của một số hợp chất carbonyl thông dụng khác Hợp chất Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –CO–NH2 (amide bậc 1) VC=O VN-H δNH δO=C-N Mạch carbon 1690 1650 3500-3400 3350-3200 1620-1590 1650-1625 700 1420-1400 DD Rắn DD loãng (hai mũi) DD đậm đặc (hai mũi) DD loãng (một mũi) DD đậm đặc (một mũi) Một hoặc nhiều mũi hấp thu Một mũi –CO–NH– (amide bậc 2) VC=O VN-H δNH δO=C-N Mạch carbon 1700-1670 1680-1630 3460-3300 3270-3100 1550-1510 1570-1515 700 1305-1200 và 700 DD Rắn DD loãng (một mũi) DD đậm đặc (hai mũi) DD loãng (một mũi);chỉ có ở amide mạch hở DD đậm đặc (một mũi) Một hoặc nhiều mũi hấp thu Một mũi –CO–N< (amide bậc 3) VC=O δO=C-N 1670-1630 700 DD và rắn Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 36 –CO–N–CO– (imide) VC=O 1710 và 1700 1770 và 1700 Vòng sáu cạnh Vòng năm cạnh N–CO–N (urea) VC=O 1660 1640 1720 RNH–CO–NHR Vòng sáu cạnh Vòng năm cạnh –CO–NH– (thioacid và thioester) VC=O 1720 3.5 Tần số hấp thu của hợp chất Nitrogen: Các hợp chất chứa nitrogen bao gồm các amine, muối của amine, imine, amidine, nitrile, isonitrile, cyanamine, diazo, muối diazinium bao gồm rất nhiều loại liên kết liên quan đến nitrogen như liên kết N–H, >C=N–, >N–C=N–, – CC  … có tần số hấp thu được tóm tắt trong các bàng 17 và 18 (một số hợp chất khác cũng có chứa nitrogen nhưng vì còn có liên kết C=O nên được xếp chung với nhóm hợp chất caebonyl và đã được giới thiệu tần số hấp thu trong bảng 16). Bảng 17: Tần số hấp thu đặc trưng của amine và muối của amine Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –NH2 (amine bậc 1) VNH(bđx) VNH(đx) δNH 3500 (tb) 3400 (tb) 3400-3330 (tb) và 3330-3250 1650-1560 (tb) DD loãng DD đậm đặc (hai mũi;đối xứng và bất đối xứng) DD biến dạng “lưỡi kéo” >NH VNH δNH 3350-3310 3310-3300 1580-1490 (y) 1515 DD loãng (một mũi) DD đậm đặc (một mũi) Rất yếu Amine nhị thơm (một mũi) C–N VCN 1250-1020 1340-1250 1350-1280 1360-1310 Amine thẳng, không liên hợp Amine thơm, nhất Amine thơm, nhị Amine thơm, tam –NH3+ (muối amine nhất) VNH+ δNH+ 3000-2800 (tb) 1600-1575 (m) và 1550-1504 (m) Vân mở rộng DĐ biến dạng (hai mũi) –NH3+ (aminoacid) VNH+ δNH+ 3130-3030 (tb) 1600(m) và Đo ở thể rắn DĐ biến dạng(hai mũi) Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 37 1500(m) >NH2+ (muối amine nhị) VNH+ δNH+ 2700-2250 (tb) 1620-1560 (m) Vân mở rộng-đo ở thể rắn DĐ biến dạng (một mũi) -NH4+ (muối ammonium) VNH+ δNH+ 3300-3100 1435-1428 Vân mở rộng Một mũi Bảng 18: Tần số hấp thu đặc trưng của imine(>C=N–), amidine(>N–C=N), nitrile(– C=N), isonitrile(–NC)cyanamine (>N–CN), cyanide(CN), diazonium (ArN=N+, X-) Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú –NH (của imine) VNH 3400–3300 (tb) C=N(của imine) VCN 1690–1620 Mọi imine –C=N– (amidine) VCN 168–1580 1515 Mọi Amidine rắn DD –CN– (nitrile) VCN δCN 2260–2250(bđ) 2230–2220(bđ) 390-350 580-540 Và 430-380 Nitrile thẳng, no Nitrile không no, liên hợp hay thơm(cường độ biến đổi theo mạch carbon, theo hệ thống nối Pi liên hợp, tạo phức với kim loại dạng – MNC  ) Nitrile thẳng, no Nitrile thơm (hai mũi) –NC– (isonitrite) VCN 2175-2150 2150-2115 Isonitrile thẳng Isonitrile thơm(Isonitrile có mũi hấp thu đặc trưng để phân biệt với nitrile ở 1595 cm-1) >N–CN (cyanamine) VCN 2225-2210 CN– (của cyanide) VCN 2250-2000 2080-2070 Muối dạng rắn Muối trong DD –N=N– (hợp chất diazo) VCN 1575(y) Rất yếu hoặc không xuất hiện vì liên kết-N=N- không phân cực Ar–N=N+, X- (muối iazonium) VCN 2300-2230 (m) C–NO2 VN=O(bđx) 1560 (m) Khi liên hợp giảm khoảng 30cm-1 Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 38 (nitro) VN=O(đx) 1350 Khi liên hợp giảm khoảng 30cm-1 R–O–NO2 (nitrate) VN=O(bđx) VN=O(đx) 1650-1600(m) 1270-1250(m) N–NO2 (nitramine) VN=O(bđx) VN=O(đx) 1630-1550(m) 1300-1250(m) C–N=O VN=O(bđx) VN=O(đx) 1600(m) 1500(m) –N+–O– thơm 1300-1200(m) Rất mạnh –N+–O– béo VCN 970-950(m) Mạnh 3.6 Tần số hấp thu của hợp chất chứa phosphor: Bảng 19: Tần số hấp thu đặc trưng của hợp chất chứa phosphor Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú – P– H VP-H δP-H(nmp) δP-H(nmp) 2440-2350(m) 1090-1080 940-909 Nhọn P=O VP=O 1150 1190 1299-1250 Phorus oxide thẳng Phorus oxide thơm Phosphoric ester P– OH P– O– P P– O– C P– O– C VP=O 1040-910 1000-870 1050-970 1260-1160 Rộng P-O-C thẳng P-O-C thơm 3.7 Tần số hấp thu của hợp chất chứa lưu huỳnh: Bảng 20: Tần số hấp thu đặc trưng của hợp chất chứa chứa lưu huỳnh Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú – S– H (của imine) VS-H 2600-2550 (y) Yếu hơn VO-H và ít bị ảnh hưởng bởi liên kết hydrogen >C=S VC=S 1200-1050 – CS– NH– (Thioamide) VN-H VC=S δN-H 3400 1300-1100 (m) 1550-1460 (m) 3150 cm-1 khi ở thể rắn Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 39 >S=O VS=O 1060-1040 (m) >SO2 VS=O 1370-1310 (m) 1180-1120 (m) DĐ hóa trị bất đối xứng DĐ hóa trị đối xứng – SO2– O 1420-1330 (m) 1200-1145 (m) 3.8 Tần số hấp thu của hợp chất chứa nối đôi liền nhau: Bảng 21: Tần số hấp thu đặc trưng của một số hợp chất chứa nối đôi liền nhau Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú O=C=O Carbon dioxide 2349 (m) – N=C=O Isocyanate 2275-2250 (m) Rất mạnh; Vị trí không bị ảnh hưởng bởi liên hợp – N=N=N– Azit 2160-2120 (m) – N=C=N– Carbodilmide 2125-2130 (m) Rất mạnh >C=C=O Cetene 2150 (m) – N=C=S– Isothiocyanate 2140-1990 (m) Vân rộng và rất mạnh >C=C=N- Ceteneimine 2000 (m) C=C=C Allen 1950 (tb) Nhóm allen đầu mạch hoặc liên hợp với nhóm hút electron thường có hai vân 3.9 Tần số hấp thu của hợp chất chứa halogenur: Bảng 22: Tần số hấp thu đặc trưng của một số hợp chất chứa halogenur Nhóm Dao động Tần số(cm-1) Ghi chú C– F VC-F 1400-730: 1100-1000 Monofluoralkane CF2,CF3 VC-F 1350-1120 Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 40 – C– C– Cl VC-Cl VC-C δC-F 830-560: 726 649 760-505 (m) 450-250 Thay đổi theo vị trí không gian của halogenur trong phân tử Dạng trans ziczac C-C-C-Cl Dạng “Gốt” Rất mạnh; có mũi họa tần khoảng 1510-1450 cm-1. CCl3 VC-Cl 830-700 CH2– Cl δCH2 1230 (m) C– Br VC-Br δC-Br 650-485 (m) 300-140 C– I VC-I 600-200 610-485 Mạch thẳng CH2– I δCH2 1170 (m) CH2– CH2– I 594 và 503 Hai vân Aryl- halogen VC-F VC-Cl (para) VC-Cl (meta) VC-Cl (ortho) VC-Br (para) VC- Br (meta) VC- Br (ortho) VC-I (para) 1270-1100 1096-1089 1078-1074 1057-1034 1073-1068 1073-1065 1042-1028 1061-1057 IV. KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI: 4.1 Máy quang phổ IR: Phổ kế hồng ngoại thông dụng hiện nay là loại tự ghi, hoạt động theo nguyên tắc như sau: Chùm tia hồng ngoại phát ra từ nguồn được tách ra hai phần, một đi qua mẫu (2) và một đi qua môi trường đo (dung môi) (2’) rồi được bộ tạo đơn sắc (3) tách thành từng bức xạ có tần số khác nhau và chuyển đến detector (4). Detector sẽ so sánh cường độ hai chùm tia và chuyển thành tín hiệu điện có cường độ tỉ lệ với phần bức xạ đã bị hấp thu bởi mẫu. Dòng điện này có cường độ rất nhỏ nên phải nhờ bộ khuếch đại (5) tăng lên nhiều lần trước khi chuyển sang bộ phận tự ghi (6) vẽ lên bản phổ hoặc đưa vào máy tính xử lý số liệu rồi in ra phổ. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 41 Hình 6: Sơ đồ nguyên lý máy phổ hồng ngoại hai chùm tia Các máy phổ hồng ngoại thế hệ mới được chế tạo theo kiểu biến đổi Fourier (Fourier Transformation Infrared Spectrometer-FTIR Spectrometer). Trong các máy này, người ta dùng bộ giao thoa (giao thiết kế) Michelson thay cho bộ tạo đơn sắc. Giao thoa kế Michelson là thiết bị tách chùm bức xạ thành hai thành phần có cường độ bằng nhau rồi sau đó kết hợp trở lại thành bức xạ có cường độ thay đổi theo thời gian. Sự thay đổi cường độ bức xạ này là do quãng đường đi của hai bức xạ bị tách ra không giống nhau. Giá trị I(t) là hàm của hiệu số hai quãng đường đi nói trên. Giao thoa kế gồm một gương cố định Mı, gương di động M2 (có thể di chuyển tịnh tiến trên một đường thẳng nằm ngang) đặt vuông góc nhau và bộ phận chia chùm sáng S. Chùm bức xạ từ nguồn đi qua bộ phận tách S chia thành hai chùm bức xạ vuông góc, một chùm đi đến gương cố định Mı còn một chùm đi đến gương cố định M2. Khi gặp gương chúng phản xạ trở lại bộ phận tách S. Đến đây mỗi chùm lại chia thành đôi, một nửa đi về nguồn còn một nửa đi qua mẫu đo đến detector. Như vậy, chùm bức xạ đến mẫu đo gồm hai bức xạ nhập lại có thời gian trễ khác nhau nên cường độ bức xạ thay đổi theo thời gian, phụ thuộc vào quãng đường d của bức xạ đến gương di động M2 (H.7) Hình 11.7 Cấu tạo giao thoa kế Michelson Detector sẽ ghi nhận sự biến đổi cường độ bức xạ theo quãng đường d rồi chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu đầu tiên thu được dưới dạng hàm của điện thế V theo quãng đường V=f(d), được máy tính dùng phép biến đổi Fourier chuyển thành hàm của cường độ I theo nghịch đảo của quãng đường d ( tức d-1 hay số sóng v) : Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 42 V = f(d)→I = f(v) So với máy hồng ngoại thế hệ cũ, máy hồng ngoại biến đổi Fourier (H.11.8) có rất nhiều ưu điểm: việc sử dụng giao thoa kế cho phép khe sáng rộng hơn nên cường độ bức xạ vào detector sẽ lớn hơn; tỉ lệ S/N tăng lên nhờ giảm được nhiễu; nhờ sử dụng máy tính, việc đo phổ được tự động hoá ở mức cao và phổ có thể được lưu trữ và đối chiếu với phổ chuẩn có trong “thư viện” của máy. Hình 8: Sơ đồ nguyên lý máy phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Trong quá trình làm việc, khung số sóng của máy phổ hồng ngoại có thể bị lệch. Để kiểm tra, người ta thường sử dụng các chất chuẩn như polystirene, ammonia hoặc hơi nước. 4.2 Cách chuẩn bị mẫu: Người ta có thể đo phổ hồng ngoại của các chất ở thể rắn, thể lỏng tinh khiết, trong DD hoặc ở thể hơi. Mẫu ở thể rắn: Có ba cách đo khi mẫu ở thể rắn: Nghiền nhỏ vài mg chất nghiên cứu với một vài giọt parafin lỏng (nujol) và ép phần thu được giữa hai tấm NaCl. Để tránh các vân hấp thu mạnh của parafin ở 2950- 2850 cm -1 và 1450-1350 cm -1 khi khảo sát sự hấp thu của các nhóm C-H, người ta có thể thay parafin bằng hexachlor butadien. Trộn mẫu thật đồng đều với KBr theo tỉ lệ 1:10 hoặc 1:100 rồi ép thành các viên mỏng hầu như trong suốt bằng máy ép thuỷ lực. Do KBr có tính hút ẩm, trên phổ hồng ngoại thường xuất hiện các vân hấp thu của nước ở 3450 cm -1 . Dùng KBr cũng cầu lưu ý đến khả năng xảy ra phản ứng trao đổi cation hoặc anion trong trường hợp chất nghiên cứu là muối hoặc phức chất vô cơ. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 43 Đo phổ các chất rắn ở dạng màng lỏng bằng cách làm nóng chảy chất nghiên cứu hoặc làm bay hơi dung môi DD chất nghiên cứu đối với các chất có khả năng tạo được màng. Mẫu ở thể lỏng tinh khiết: Khi mẫu ở thể lỏng tinh khiết, người ta có thể chuẩn bị mẫu bằng cách ép một giọt nhỏ chất lỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01-0,1mm, gọi là màng lỏng. Mẫu trong DD: Hoà tan chất nghiên cứu bằng dung môi thành DD có nồng độ 1-5%. Cho DD và dung môi nguyên chất vào hai cuvet có bề dày 0,1-1mm và bằng việc so sánh hai chùm tia đi qua DD và dung môi có thể loại được vân hấp thu của dung môi. Dung môi không được phép hấp thu quá 65% bức xạ chiếu vào vì cường độ bức xạ còn lại sẽ quá yếu. Ngoài ảnh hưởng do bản chất của dung môi, cũng cần lưu ý đến bề dày của cuvet. Những dung môi thường được sử dụng là CCl4, CHCl3, CH2Cl2, Cl2C=CCl2… Mặc dù vùng không hấp thu của CHCl3 hẹp hơn CCl4 nhưng khả năng hoà tan các chất của CHCl3 tốt hơn nên thường được sử dụng nhiều hơn, đặc biệt là có thể đo DD đặc hơn trong các cuvet có bề dày nhỏ hơn. Các cuvet thường có cửa sổ bằng NaCl, CaF2 hoặc AgCl thì cửa sổ sẽ bị đen sau một thời gian sử dụng. Mẫu ở thể hơi: Khi mẫu ở thể hơi, hơi sẽ được đưa vào một ống đặc biệt có chiều dài khoảng 10 cm với hai đầu ống được bịt bằng các tấm NaCl. Trong thực tế để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoại được ghép với máy sắc kí khí. Trong hệ thống sắc kí khí-hồng ngoại (GC/IR), sau khi được tách bằng máy sắc kí khí, mỗi hợp phần đi ra từ cột sắc kí (tương ứng với mỗi peak trên sắc kí đồ) sẽ được ghi phổ hồng ngoại (thường dùng FTIR) và được lưu giữ trong bộ nhớ của máy tính. Máy có thể in ra những phổ đồ hồng ngoại của các hợp phần ứng với các peak trên sắc kí đồ mà ta quan tâm. Nhờ so sánh các phổ mẫu với thư viện phổ chuẩn lưu trong máy tính, máy có thể chỉ rõ cấu tạo của các hợp chuẩn hoặc cho biết các nhóm chức có mặt trong hợp phần đó. 4.3 Ứng dụng: Các số liệu ghi nhận được từ phổ hồng ngoại cung cấp rất nhiều thông tin về chất nghiên cứu. Dưới đây là một số ứng dụng của phương pháp quang phổ hồng ngoại 4.3.1 Đồng nhất các chất: Số liệu hồng ngoại là một đặc trưng có thể sử dụng cho quá trình đồng chất hết sức hữu hiệu. Từ sự đồng nhất về phổ hồng ngoại của hai mẫu hợp chất có thể kết luận sự đồng nhất về bản chất của hai mẫu hồng ngoại với mức độ chính xác khá cao. Để thực hiện quá trình đồng nhất, người ta thường so sánh phổ của chất nghiên cứu với phổ chuẩn được ghi trong cùng điều kiện xác định (hiện nay người ta đã thành lập Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 44 được bộ phổ chuẩn của hàng ngàn hợp chất hữu cơ khác nhau gọi là Atlas phổ hồng ngoại). Nếu chất nghiên cứu chưa có trong Atlas, người ta so sánh phổ của chất chuẩn theo ba giai đoạn sau đây: So sánh phổ hai chất ở cùng nồng độ trong hai môi trường khác nhau ở hai trạng thái khác nhau ( ví dụ, trong DD và trong các viên nén). Ghi phổ các chất ở nồng độ đủ lớn để so sánh các vân có cường độ thấp. So sánh cường độ các vân tương ứng với nhau. 4.3.2 Xác định cấu trúc phân tử: Từ tần số của các vân phổ hấp thu cho phép kết luận sự có mặt của các nhóm chức trong phân tử, nghĩa là số liệu hồng ngoại có thể giúp xác định cấu trúc phân tử của chất nghiên cứu. Mức độ chính xác của việc xác định cấu trúc phụ thuộc rất lớn vào độ tin cậy, chính xác của các tần số vân hấp thu trên phổ hồng ngoại (các máy hồng ngoại thường được hiệu chỉnh tần số bằng chất chuẩn polytyrol). Ngoài việc đề phòng các sai lệch vị trí vân phổ do máy, khi tiến hành định tính bằng phương pháp này cũng cần lưu ý đến các hiệu ứng khả năng làm dịch chuyển phổ về vùng khác cũng như phải loại trừ các vân hấp thu của dung môi…. 4.3.3 Nghiên cứu động học phản ứng: Việc nghiên cứu động học phản ứng có thề được kiểm tra bằng phương pháp phổ hồng ngoại bằng cách ghi phổ hấp thu ứng với một miền phổ nào đó trong từng khoảng thời gian thích hợp, nghĩa là sẽ ghi được trực tiếp đường cong biểu diễn sự thay đổi cường độ hấp thu theo thời gian ở miền phổ đã chọn do sự tạo thành sản phẩm phản ứng hay mất đk tác chất ban đầu. 4.3.4 Nhận biết các chất: Trước khi ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta đã có thể có nhiều thông tin về hợp chất hoặc hỗn hợp cần nghiên cứu, như: trạng thái vật lý, dạng bên ngoài, độ tan, điểm nóng chảy, điểm cháy, đặc biệt là lịch sử của mẫu. Nếu có thể thì cần biết chắc mẫu là chất nguyên chất hay hỗn hợp. Sau khi ghi phổ hồng ngại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai. Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định có hay không có các nhóm chức. Trong nhiều trường hựp việc đọc phổ (giải phổ) và tìm các tần số đặc trưng không đủ để nhận biết một cách toàn diện về chất nghiên cứu, nhưng có lẽ là có thể suy đoán được kiểu hoặc loại hợp chất.Cũng cần tránh khuynh hướng cố gắng giải và gán cho mọi đám phổ quan sát thấy, nhất là những đám phổ vừa và yếu trong vùng phổ phức tạp. Mỗi khi phát hiện một loại chất, người ta so sánh phổ của chất nghiên cứu với phổ của Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 45 chất nguyên chất tương ứng để có thể nhận định đúng.Hiện nay người ta đã công bố một số tuyển tập phổ hồng ngoại của các chất và các tần số nhóm đặc trưng. 4.3.5 Xác định độ tinh khiết: Phổ hồng ngoại được dùng để xác định độ tinh khiết của các chất Khi thích hợp chất không tinh khiết thì thường độ rõ nét của đám phổ riêng biệt bị giảm, sự xuất hiện thêm các đám phổ sẽ làm "nhoè" phổ. Khi tạp chất có sự hấp thụ mạnh IR mà ở đó thành phần chính không hấp thụ hoặc hấp thụ yếu thì việc xác định rất thuân lợi. Ví dụ có thể nhận ra một lượng nhỏ xeton trong hidrocacbon vì hidrocacbon thực tế không hấp thụ vùng phổ - 1720cm-1 là số sóng đặc trưng cho nhóm C = O Phương pháp này thường được dùng để kiểm tra sản xuất rất nhiều loại hoá chất ở quy mô công nghiệp. 4.3.6 Suy đoán về tính đối xứng của phân tử: Ví dụ xét xem phân tử NO2 là phân tử gồm các nguyên tử thẳng hàng hay có cấu tạo uốn võng. Thực tế cho thấy phổ hấp thụ IR của NO2 có 3 đám ở 750, 1323, 1616cm-1 (không giống như CO2 chỉ có 2 đám phổ, nên phân tử NO2 phải có cấu tạo uốn võng. 4.3.7 Phân tích định lượng: Khả năng ứng dụng phổ hồng ngoại như là một ngành của phân tích định lượng phụ thuộc trang thiết bị và trình độ của các phòng thí nghiệm. Ngày nay, sự ra đời của các máy quang phổ hồng ngoại hiện đại, sự tăng tỷ lệ tín hiệu/nhiễu làm cho việc phân tích định lượng càng thêm chính xác và do đó mở rộng được phạm vi phân tích định lượng. Về nguyên tắc, việc phân tích định ượng theo phương pháp phổ hồng ngoại dựa vào định luật cơ bản của Lambert – Beer: A=lg(Io/I)=abc  A: Độ hấp thụ tia IR  Io: Cường độ bức xạ trước khi qua mẫu, I: cường độ bức xạ sau khi qua mẫu.  a: Hệ số hấp thụ, b: bề dày của mẫu.  c: Nồng độ chất nghiên cứu. Thực tế, người ta chỉ xác định nồng độ của một trong các nhóm chức của hợp chất cần phân tích. Ví dụ: có thể xác định nồng độ của hexanol theo độ hấp thụ của liên kiết O-H. Về thực nghiệm, có 2 cách xác định độ hấp thụ A. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 46 a. Phương pháp đường chuẩn: Ví dụ: Xác định một chất ở dạng dung dịch.Chọn số sóng thích hợp, cho dung dịch cần đo vào cuvét. Chỉ số độ đo trên máy tỷ lệ với I. Lại cho dung môi nguyên chất vào Cuvet. Lần này chỉ số đo được tỷ lệ với Io.Theo hệ thức trên, xác định được A tương ứng với nồng độ C. Ở những máy hiện đại, giá trị A được tính và ghi trực tiếp. Từ các nồng độ khác nhau đã biết, đo các giá trị A tương ứng, vẽ đồ thị A - C.Sau đó với nồng độ cần xác định, cũng đo A như trên rồi theo đồ thị chuẩn mà tìm C. b. Phương pháp đường nền: Có khi giá trị A cho trực tiếp trên máy.Nếu hỗn hợp có nhiều thành phần có các đám phổ xen phủ nhau thì để tìm nồng độ của từng thành phần phải giải hệ phương trình nhiêu ẩn (tương tự như ở phương pháp phổ điện tử). Kết quả thu được theo phương pháp phổ hồng ngoại bị những hạn chế sau: - Cuvet đựng mẫu thường làm bằng NaCl, KBr rất mềm, dễ bị biến dạng, do đó bề dày của mẫu (giá trị b) có thể thay đổi từ mẫu này sang mẫu khác. Cuvét cũng có thể bị tác động hoá học của dung môi. Do đó dẫn đến sai số trong phép đo. Sai số của phép đo cũng còn do những nguyên nhân khác. - Do hiệu ứng tập hợp của các phân tử chất hoà tan có thể dẫn đến sự thay đổi tần số hấp thụ, hình dáng, cường độ hấp thụ. - Do máy quang phổ hồng ngoại không đủ độ phân giải cần thiết nên không đủ khả năng đo được những đám phổ có tần số rất hẹp. Mặc dù phương pháp phổ dao động là một trong những phương pháp hữu hiệu nhất để xác định các chất về định tính cũng như định lượng, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học cũng như trong kiểm tra công nghiệp, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định: - Bằng phương pháp phổ hồng ngoại không cho biết phân tử lượng (trừ trường hợp đặc biệt). - Nói chung phổ hồng ngoại không cung cấp thông tin về các vị trí tương đối của các nhóm chức khác nhau trên một phân tử. - Chỉ riêng phổ hồng ngoại thì đôi khi chưa thể biết đó là chất nguyên chất hay chất hỗn hợp vì có trường hợp 2 chất có phổ hồng ngoại giống nhau. V. ỨNG DỤNG PHỔ HỒNG NGOẠI TRONG THỰC PHẨM: Quang phổ hồng ngoại (IR) đã được xem là kỹ thuật phân tích được ứng dụng nhiều trong phân tích thực phẩm. Kỹ thuật này được coi là sạch và tốt vì không sử dụng hoá chất, không có vấn đề về sức khoẻ và an toàn. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 47 IR phân tích dư lượng axit amin trong protein, đánh giá chất lượng của chất béo, protein thành phần của các sản phẩm sữa và hạt. Phân biệt giữa bột cá, bột thịt, bột đậu nành có trong mẫu. phân tích thành phần hóa học các sản phẩm thực phẩm như phomat, ngũ cốc, bánh kẹo, thịt bò. Phương pháp quang phổ IR dễ dàng thực hiện và rất hữu ích trong việc loại bỏ các nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm mà ta nghĩ ngờ không đạt chất lượng. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHÍNH Phần lớn các ứng dụng của IR bao gồm các phân tích các thành phần chính như nước, protein, chất béo hoặc đường. 5.1 Nước: Việc đo độ ẩm có thể là một trong những ứng dụng chính của pp NIR. Nước tinh khiết có dải hấp thụ mạnh tại 970, 1190, 1440 và 1940 nm . Sóng dao động mãnh liệt, cao nhất tại 1940 nm. Nó là sự kết hợp rung động của các sóng có tần số cao thấp khác nhau. Các sóng tại 970 và 760 nm tương ứng là những dao động thứ hai và thứ ba của các rung động kéo dài. Vị trí và hình dạng của các dải hấp thụ nước bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiệt độ, nồng độ chất tan và hạt kích thước của mẫu. Tính chất của liên kết hydro có một tác động đến hình dạng của quang phổ trong khu vực phổ 1400-1500 nm. Trong bột mì, lúa mì, hàm lượng nước tỷ lệ với sự khác biệt giữa hấp thụ ở 940 và tại 2310 nm (Osborne et al 1993). Tuy nhiên, nó thường cần thiết để áp dụng phương trình hiệu chỉnh phức tạp hơn dự đoán, lượng nước trong thực phẩm. Việc đo độ ẩm bằng phương pháp IR có thể chính xác như là phương pháp tham khảo. đối với hầu hết các sản phẩm đồng nhất, chẳng hạn như bột, nhưng có thể thay đổi tùy theo sản phẩm không đồng nhất được đem đi nghiên cứu. Các kết quả khi đo từng nguyên liệu riêng chính xác hơn so với hỗn hợp phức tạp. Độ ẩm đo được có thể bị sai lệch 0,15-0,8% tùy thuộc vào thực phẩm đem phân tích. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 48 5.2 Protein : Phổ IR của các protein là phức tạp và khó để giải thích. Người ta sử dụng phương pháp cận hồng ngoại (NIR) Các protein có đặc tính hấp thu các bước sóng đến 1523, 1600 nm, 2050 và 2180 nm. Các bứoc sóng tại 2180 nm thường được sử dụng trong phân tích protein. ( Osborne và cộng sự (1993)). Ví dụ : về phương trình dự đoán protein trong bột mì: %pr = 12,68 + 493,7*A2180 - 323,1*A2100 - 243,4*A1680 A2180 là độ hấp thụ tại 2180 nm. 323,1 * A2100 là yếu tố cần thiết cho phản ánh quang phổ của tinh bột, có thể bao gồm các dải hấp thụ của protein đến 2180 nm. Việc hấp thụ ở 1680 nm như một cơ sở tham chiếu của quang phổ. Phân tích các sản phẩm protein đơn giản như bột là rất chính xác. Tuy nhiên đối với các chất không đồng nhất và thức ăn với các thành phần hỗn hợp nó có sai lệch 0,16- 0,45%. 5.3 Lipid: Lipid cho quang phổ đơn giản trong đó chủ yếu là đại diện của hydrocarbon chuỗi axit béo. Các dải hấp thụ chính xuất hiện đến 1734, 1765, 2304 và 2348 nm. Các chất béo được phân tích bởi IR trong nhiều sản phẩm, với chi tiết khác nhau. Tùy sản phẩm có mức độ chất béo cao hay thấp hơn, nhiều sản phẩm thô có hàm lượng lipid thấp. Trong trường hợp này độ nhạy và độ chính xác của phương pháp có thể không đủ tin cậy. 5.4 Glucid: Glucid có tầm quan trọng lớn trong thức ăn động vật. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 49 Theo tính chất sinh hóa của nó, glucid có vai trò dinh dưỡng rất khác nhau. Các vùng quang phổ hấp thụ mạnh nhất là giữa 2070 và 2110 nm, nơi carbohydrate có dải hấp thụ mạnh do sóng kéo dài rung động của nhóm CO và OH Khu vực này có thể phân biệt các loại đường đơn giản trong các polyme của chúng. saccharose được phân tích trong nhiều loại thực phẩm dành cho con người và động vật, với sai số từ 0,2 đến 1%. Nó giúp xác định dễ dàng lượng saccharose thêm vào thực phẩm dựa vào kết quả phân tích đường ở dạng tự nhiên. 5.5 Chất xơ : Phương pháp Van Soest là một phương pháp nổi tiếng để xác định hàm lượng chất xơ. phương pháp đo lường NDF (Neutral Detergent Fibre) và ADF (Acid chất tẩy rửa chất xơ). NDF tổng hàm lượng hemixenluloza, cellulose và lignin, trong khi ADF chỉ xác định hàm lượng cellulose và lignin. Phương pháp này có thể phân tích các thông số trên với độ chính xác cao. 5.6 một số ứng dụng khác: - trong thực phẩm: + Xác định hàm lượng tro, béo, xơ, đạm, ẩm, phospho trong bột cá và thức ăn gia súc. + Xác định hàm lượng béo trong chocolate và kem, sữa chua. + Xác định hàm lượng béo, đạm, nước, acid béo bão hòa, acid béo không bão hòa trong sữa. + Xác định hàm lượng béo, đạm, ẩm trong thịt, thịt bò, thịt bê, thịt heo, thịt gà, ... + Xác định hàm lượng tro, béo, ẩm, đạm và thành phần amylose trong gạo. - Công nghiệp dược phẩm : + Xác định mức độ este hóa của acid acetic trong benzyl alcohol. + Xác định hàm lượng nước còn dư sau khi sấy khô lạnh Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 50 + Xác định hàm lượng nước trong dung môi + Xác định hàm lượng acid nitric trong dẫn xuất pyridine - Công nghiệp Hóa chất : + Xác định hàm lượng chất keo trong hỗn hợp dung môi (40-50%) + Xác định hàm lượng nước trong polymer phân tán + Xác định mức độ este hóa trong hóa chất công nghiệp + Xác định hàm lượng cyanamide trong dung môi (10-60%) Dinh dưỡng: phương pháp IR thường xác định được các giá trị dinh dưỡng tiêu chuẩn của thực phẩm như tiêu hóa chất hữu cơ hoặc năng lượng . Dự đoán các hàm lượng sử dụng là tuyến tính và được dựa trên phương trình có dạng: Giá trị dinh dưỡng = hằng số + α [protein] + β [lipid] + δ [carbohydrates] +.... Trong đó α, β, δ ... là các hệ số Từ IR để xác định các thành phần riêng lẻ, có thể sử dụng phương pháp phân tích để đánh giá giá trị dinh dưỡng của nguyên vật liệu hoặc hỗn hợp nghiên cứu. Một số nghiên cứu công bố đã được thực hiện đầu tiên để dự đoán mỗi thành phần sau đó áp dụng một mô hình tuyến tính mới để xác định giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Một cách khác là dự đoán trực tiếp giá trị dinh dưỡng từ pp NIR. Tuy nhiên, phương pháp, tài liệu tham khảo để đo lường giá trị dinh dưỡng thực phẩm là rất dài để thực hiện và rất tốn kém. Các vấn đề chính là phải có đủ số lượng mẫu phân tích hiệu chỉnh quang phổ IR. VI. NHỮNG LOẠI MÁY QUANG PHỔ TRÊN THỊ TRƯỜNG HIỆN NAY: 6.1 Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier: Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 51 Thông tin chi tiết Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Model: Nicolet 6700 - ThermoNicolet (Mỹ) Đặt tính kỹ thuật: - Độ phân giải quang học : 0.09 cm 1 - Độ chính xác số sóng: 0.01 cm-1 - Độ tuyến tính theo tieue chuẩn: ASTM: <0.07%T - Độ nhiễu giữa các đỉnh: (quét 1 phút) <8.68 x10-6 AU (50000:1) - Độ nhiễu RMS: (quét 1 phút): <1.95 x 10-6 AU - Dải phổ (thang dò): tiêu chuẩn 7800 - 350cm-1 sử dụng bộ tách tia KBr - Tốc đọ quét chậm nhất: 0.158cm/giấy - Tốc độ quét nhanh nhất: 6.33cm/giây - Số tốc độ quét: 15 - Tốc độ quét nhanh (phổ/giấy @16cm-1, 32cm-1): 65.95 - Khả năng tăng công suất trong chế độ Turbo: 25% - Bước sóng: 12500 - 350cm-1 - Độ khe sáng: có thể điều chỉnh độ khe phù hợp theo yêu cầu: 0.8, 1, 2, 4,8, 16cm-1 - Tỉ số S/N: <8.68 x 10-6 AU (50000: 1) - Độ chính xác bước sóng: 0.01 cm-1 - Độ lệch chuẩn: 0.07%T - Điện áp: 220 - 240V/50Hz - Kích thước: 69.2 x 65.5 x 25.4cm (Rộng x sâu x cao) - Khối lượng: 69 kg Các tiêu chuẩn áp dụng: CE và ISO 9001 6.2 Máy quang phổ hồng ngoại gần (FT-NIR): Máy quang phổ hồng ngoại gần (FT-NIR) được sử dụng rộng rãi trong phân tích hóa học ướt. Đây là một công cụ nhanh và chính xác để phân tích mẫu lỏng, rắn và vật liệu keo mà không làm phá hủy mẫu, tiết kiệm chi phí bằng cách giảm thời gian thực hiện và hóa chất sử dụng. Hệ thống được tích hợp gương cầu (integrating sphere), để dùng cho phân tích các vật liệu không đồng nhất dưới dạng phản xạ khuếch tán mà không cần chuẩn bị mẫu. Phân tích hiệu quả, tốn ít chi phí nhờ sử dụng các dụng cụ dễ rửa như cốc mẫu, Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 52 beaker, đĩa Petri thậm chí bọc nhựa. Hệ thống cho phép thực hiện cả hai phương pháp đo truyền qua hoặc phản xạ. Các lĩnh vực ứng dụng chính trong thực phẩm và thức ăn gia súc bao gồm: sản xuất bơ sữa và thịt, thức uống, thành phần bánh mì và đồ gia vị cũng như hạt, giống, thức ăn gia súc. Ở đây, các tham số như protein, chất béo, tinh bột, độ ẩm, độ khô được phân tích, cũng có thể phân tích các tham số chuyên sâu hơn như hàm lượng cồn, nitơ. Model MPA là sự lựa chọn hoàn hảo cho yêu cầu về quản lý chất lượng. Xác định và đánh giá vật liệu thô và phân tích số lượng sản phẩm cũng thực hiện được để bảo đảm chất lượng sản phẩm cao nhất và an toàn cho người tiêu dùng. Tất cả những điều trên được trông đợi nhiều hơn ở máy quang phổ hồng ngoại MPA FT-NIR. Đặc tính kỹ thuật:  Độ phân giải: 2 cm-1  Khả năng lặp lại số sóng: Tốt hơn 0.04 cm-1  Độ chính xác số sóng: tốt hơn 0.1 cm-1  Độ chính xác trắc quang: tốt hơn 0.1% T  Bộ giao thoa kế: RockSolidTM, được căn chỉnh cố định vĩnh viễn, ổn định cao.  Nguồn hồng ngoại: Nguồn NIR được làm lạnh bằng không khí năng lượng cao.  Laser loại 1: an toàn tối đa cho người sử dụng.  Bộ tách tách tia bằng thạch anh (Beamsplitter Quartz): chất nền với lớp phủ ngoài đã được cấp bản quyền.  Bộ quét: cơ cấu đỡ không mòn (không ma sát) (không cần không khí nén), 4 tốc độ gương có thể lựa chọn được.  Bộ chuyển đổi A/D: 24-bit.  Chuẩn dữ liệu (Validation): Bộ chuẩn trong (Internal Validation Unit - IVU).  Kích thước máy quang phổ: 40.0(W) x 58.9(D) x 26.2(H) cm (dạng cơ bản) 54.9(W) x 58.9(D) x 39.1(H) cm (dạng hoàn chỉnh)  Khối lượng: 30 - 40 kg (phụ thuộc vào cấu hình máy)  Nguồn: 100 - 240 VAC, 50, tối đa 180 W  Giao thức máy tính: kết nối Ethernet. Phổ Hồng Ngoại và Ứng Dụng Trong Thực Phẩm 53 C. KT LUN Việc tìm hiểu phương pháp phổ hồng ngoại cho ta thấy đây là phương pháp phân tích rất hiệu quả, phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Khả năng ứng dụng phổ hồng ngoại như là một ngành của phân tích định lượng phụ thuộc trang thiết bị và trình độ của các phòng thí nghiệm. Ngày nay, sự ra đời của các máy quang phổ hồng ngoại hiện đại, sự tăng tỷ lệ tín hiệu nhiễu làm cho việc phân tích định lượng càng thêm chính xác và do đó mở rộng được phạm vi phân tích định lượng. Phổ hồng ngoại được dùng để xác định độ tinh khiết của các chất, phân tích được các mẫu ở thể rắn, mẫu ở thể lỏng tinh khiết, mẫu trong dung dịch, mẫu ở thể hơi. Các số liệu ghi nhận được từ phổ hồng ngoại cung cấp rất nhiều thông tin về chất nghiên cứu và có nhiều ứng dụng như việc đồng nhất các chất, xác định cấu trúc phân tử, nghiên cứu động học phản ứng. D. TÀI LIU THAM KHO 1. Nguyễn Thị Thu Vân, Phân tích định lượng, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, 2004. 2. GT phân tích thực phẩm, Trường DH Công Nghiệp TP. HCM 3. PGS, TSKH. Nguyễn Đình Triệu, Các phương pháp phân tích Vật lý và Hóa lý – Tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2001. 4. Dương Ái Phương, Quang phổ phân tử và ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, 2002. 5. Ths. Lê Vũ Tuấn Hùng, trường ĐHKH Tự nhiên – TS.Nguyễn Anh Tuấn, Viện ITMS, ĐH Bách khoa Hà Nội, Ứng dụng vật lý vào phát triển, sản xuất và đời sống, TP.HCM, 2004. 6. Nguyễn Thị Hoa, Báo cáo tốt nghiệp với đề tài Xác định các axít béo bằng phương pháp phổ dao động FT – RAMAN, Phổ hồng ngoại IR kết hợp với tính toán lượng tử, Khóa luận tốt nghiệp – Khoa Vật lý Trường ĐHKHTN. 7. – Diễn đàn công nghệ hóa học. 8. Francis Rouessac and Annick Rouesssac, Chemical Analysis – Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2007 by John Wiley & Sons Ltd.