Quy trình phân lập vi khuẩn

Bài Báo Cáo Quy trình phân lập vi khuẩn Môn:Công nghệ lên men SVTH : Cao Thị Thùy Trang Lớp : 08sh2 Nội dung 1. Khái niệm 2. Quy trình phân lập vi khuẩn 2.1. Dụng cụ, thiết bị 2.2. Nguyên liệu và mẫu vật 2.3. Nguyên tắc phân lập 2.4 Quy trình phân lập 3. Kết luận Khái niệm Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp các vi khuẩn sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Chủng vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch) là thế hệ con, cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi khuẩn được thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được hình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng vi khuẩn thuần khiết. Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cưú, vi sinh vật thường tồn taị ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Dụng cụ, thiết bị Nguyên liệu và mẫu vật Bông không thấm nước, nước cất, cồn đốt, bông thấm nước, giấy thấm, giấy báo gói đĩa Petri, dây buộc bằng nilon. Môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng ống để nuôi cấy vi khuẩn. Chai tam giác loại 250 ml chứa môi trường. Đất vườn, đất đồi, mỗi loại 100-150g. Các ống giống vi khuẩn chuẩn. Chất ức khuẩn: streptomycin, penicillin, gentian violet v.v... Môi trường thạch - thịt – pepton có thành phần: Nước thịt 1000ml, pepton 10g, thạch (agar) 20g; pH=7,0; khử trùng 1 atm/30 phút. Môi trường nước mắm – pepton có thành phần: nước mắm 350 đạm 30ml, pepton 10g, thạch (agar) 20g; pH=7,0; khử trùng 1 atm/30 phút. Nguyên tắc phân lập Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch còn gọi agar). Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau. Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra). Quy trình phân lập Pha môi trường Thu mẫu Pha loãng mẫu Nuôi cấy Thu nhận chủng Kiểm tra Bảo quản Pha chế môi trường Cân, đong chính xác từng thành phần môi trường Hòa tan các chất vào nước, đun và khuấy cho tan Làm trong môi trường, kiểm tra thể tích và pH Rót môi trường vào dụng cụ. Làm nút bông, bao giấy họa báo Khử trùng ở nồi hấp áp lực hơi nước (0,8 – 1,0 atm/30 phút) tùy loại môi trường Chế môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa. Thu mẫu, nuôi tích lũy  Thu mẫu đất, nấm mốc và vi khuẩn được lấy từ bã mía, vi khuẩn lactic từ nước muối dưa cải hoặc các cơ chất có vi khuẩn từ 100-150g, trường hợp số vi khuẩn có mặt ít trong mẫu thì phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý, hóa cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật đi kèm. Pha loãng mẫu Cân lấy 1g mẫu có vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, khuấy bằng đũa thuỷ tinh cho tan hết mẫu. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần. Lấy 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần. Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý. Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân Phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết Quá trình phân lập vi khuẩn ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau: Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể ban đầu. Phân lập vi khuẩn thuần khiết. Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi khuẩn trên các môi trường phân lập Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách: Nghiền mẫu. Hoà tan mẫu trong nước cất vô trùng. Sau thực hiện như mẫu là dạng lỏng. + Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết + Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn Kỹ thuật hộp ria Kỹ thuật hộp trải Kỹ thuật hộp đổ Phân lập vi khuẩn hiếu khí Cấy dịch huyền phù lên môi trường đặc trong hộp Petri Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên bề mặt của môi trường trong hộp Petri. Dùng que trang dàn đều giọt dịch huyền phù trên toàn bộ bề mặt môi trường hộp thạch. Đậy hộp Petri, gói lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 48 - 72h Phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng Phân lập vi sinh vật kị khí Sử dụng que cấy hình kim Sau khi lấy giống, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ Cấy bằng que cấy hình kim Nuôi dưỡng vi khuẩn Nguyên tắc: Nuôi dưỡng là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và sinh sản của vi khuẩn. Tiến hành : Úp ngược các hộp Petri rồi đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 24 - 48h. Sau thời gian trên ở bề mặt thạch đĩa sẽ mọc các khuẩn lạc riêng biệt mắt thường quan sát được Thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết  Cấy vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc tách rời vào ống môi trường thạch nghiêng. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống có các chủng thuần khiết. Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết Kiểm tra vết cấy trên môi trường thạch đĩa. Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc Khuẩn lạc có màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu. Không có các màu sắc và sắc tố lạ. Làm tiêu bản soi tươi dưới kính hiển vi thấy có hình dạng đặc trưng như chủng mẫu. Tiến hành phân lập lại trong điều kiện vô trùng vẫn cho hình dạng khuẩn lạc tương tự. Làm một số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/1lần). Giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-50C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập Trộn vi khuẩn với glycerol vô trùng với tỉ lệ 1 : 20 và giữ ở nhiệt độ 3-50C. Bảo quản vi khuẩn trong cát sạch đối với những chủng có bào tử. Phương pháp đông khô Kết luận Hiện nay phần thực hành có liên quan đến đối tượng vi khuẩn khó thực hiện được vì thiếu các chủng vi khuẩn thuần khiết. Vì vậy đề xuất cách phân lập vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện khi có đầy đủ các thiết bị cần thiết Khi phân lập cần lưu ý: các hộp thạch môi trường phải vô trùng có bề mặt khô nước và có độ rắn chắc, không gồ ghề, giúp các khuẩn lạc vi khuẩn mọc rời nhau ra. Để phòng sự nhiễm tạp do không khí bẩn, các thao tác phải tuyệt đối vô trùng.        Các chủng sau khi làm sạch cần được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi cũng như xác định lại các hoạt tính đã biết. Việc tạo ra một chủng vi khuẩn thuần khiết cũng như bảo quản khỏi bị tạp nhiễm là việc làm có ý nghĩa rất lớn trong học tập, nghiên cứu cũng như sản xuất.