Quy trình phân tích salmonella trong sản phẩm gia cầm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 5 LỚP DH11SH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Salmonella TRONG SẢN PHẨM GIA CẦM SEMINAR MÔN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT Khóa học: 2010 - 2014 An Giang, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 5 LỚP DH11SH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Salmonella TRONG SẢN PHẨM GIA CẦM SEMINAR MÔN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT Khóa học: 2010 - 2014 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ThS. Bằng Hồng Lam DANH SÁCH NHÓM 1. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh 2. Bung San Ny Thanh Hồng Anh 3. Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa 4. Nguyễn Viết Thanh 5. Lê Hoàng Yên 6. Nguyễn Ngọc Hồ 7. Nguyễn Phạm Toại Nguyện An Giang, 2013 i Mục lục Nội dung Trang Mục lục ................................................................................................................ i Danh sách hình ................................................................................................... ii Ch ng 1: Đ n ...................................................................................... 1 Ch ng 2: Nội dung ......................................................................................... 2 i i thiệu chung .......................................................................................... 2 2.1.1. Đặc điểm .................................................................................................. 2 T nh ch t h a sinh .................................................................................... 3 Ph n loại ................................................................................................... 3 Ph ng há h n t ch ................................................................................ 3 Nguyên t c ............................................................................................... 3 M i tr ng à h a ch t ............................................................................ 4 Ph ng há thực hiện ............................................................................... 4 Tăng sinh .................................................................................................. 4 Tăng sinh chọn lọc ................................................................................... 4 Ph n l à nh n iện .............................................................................. 4 h ng đ nh ............................................................................................... 5 uy trình ..................................................................................................... 5 Dụng cụ l y mẫu à bảo quản mẫu .......................................................... 5 2.4. uy trình h n t ch .................................................................................. 5 Ch ng : K u n i n ngh .................................................................. 11 ết lu n ..................................................................................................... 11 iến ngh ................................................................................................... 11 T i i u ham h ......................................................................................... 12 ii Danh sách hình Nội dung Trang Hình : Vi khuẩn Salmonella (Nhuộm gram) .................................................... 2 Hình : huẩn lạc Salmonella trên thạch XLD ................................................. 3 Hình : Thử nghiệm Salmonella trên m i tr ng TSI ....................................... 6 Hình : Thử nghiệm Salmonella trên m i tr ng canh urea ............................. 7 Hình 5: Thử nghiệm Salmonella trên m i tr ng Phenol re broth base .......... 7 Hình 6: Salmonella trong thử nghiệm LDC ....................................................... 8 Hình 7: Salmonella trong thử nghiệm sinh In ol ............................................... 9 Hình 8: Salmonella trong thử nghiệm Voges - Proskauer ................................. 9 Hình : uy trình t m t t h n t ch đ nh t nh Salmonella trong mẫu th t gia cầm ................................................................................................................... 10 1 Ch ng 1 Đ n Vì nhu cầu tiêu thụ l n nên iệc giết m gia cầm tràn lan kh ng h ệ sinh t qua tầm kiểm soát c a các c quan ch c năng nên g y ra hàng loạt các ụ ngộ độc thực hẩm. Do đ v n đ ngộ độc thực hẩm trong nh ng năm gần đ y ngày càng tr nên c thiết Các báo cáo cho th y hần l n các ụ ngộ độc thực hẩm là o i sinh t g y nên. C r t nhi u i sinh t g y ngộ độc thực hẩm nh Clostridium butolinum, E. coli, Listeria monocytogenes… Trong đ Salmonella là loài g y ngộ độc r t nguy hiểm Salmonella đ c hát hiện t cu i thế k 8 à đ c nghiên c u trên năm nay Tuy nhiên khoảng năm tr lại đ y ch ng r t đ c quan t m b i sự gia tăng các ụ ngộ độc thực hẩm mà trong đ gia cầm tr ng à các sản hẩm t ch ng là nguồn tàng tr mầm bệnh l n nh t Vi khuẩn này r t h n b rộng kh trong tự nhiên c thể g y bệnh cho động t máu n ng động t máu lạnh à cả cho con ng i h ng ch riêng Việt Nam mà c n là m i lo ngại cho các n c trên thế gi i. 2 Ch ng 2 Nội dung 2.1. Gi i hi u chung 2.1.1. Đ c iểm Salmonella là trực khuẩn Gram m k ch th c trung bình t 2 - 3 x 0,5 - 1 m i chuyển b ng tiên mao tr S. galimarum à S. pullorum kh ng tạo bào tử ch ng hát triển t t nhiệt độ 6 - 420C th ch h nh t 35 - 37 0C H t 6 - à th ch h nh t pH = 7,2. nhiệt độ 18 - 400C i khuẩn c thể s ng đến 5 ngày Hình 1: Vi huẩn Salmonella (Nhuộm gram) (Nguồn: Salmonella là i khuẩn k kh t y nghi hát triển đ c trên các m i tr ng nu i c y th ng th ng Trên m i tr ng th ch h i khuẩn s hát triển sau gi C thể mọc trên nh ng m i tr ng c ch t c chế chọn lọc nh DCA (deoxychlate citrate agar) à XLD ( ylose lysine eo ycholate) trong đ m i tr ng XLD t ch t c chế h n nên th ng c ng để h n l Salmonella huẩn lạc đặc tr ng trên m i tr ng này là tr n lồi trong su t c t m đen đ i khi t m đen l n bao tr m khuẩn lạc m i tr ng ung quanh chuyển sang màu đ 3 Hình 2: Khuẩn ạc Salmonella rên hạch XLD (Nguồn: 2.1.2. T nh ch hóa sinh Salmonella kh ng lên men lactose lên men đ ng glucose à sinh h i Th ng kh ng lên men sucrose salicin à inositol sử ụng đ c citrate m i tr ng Simmons. Tuy nhiên kh ng hải loài Salmonella nào c ng c nh ng t nh ch t trên các ngoại lệ đ c ác đ nh là S. typhi lên men đ ng glucose kh ng sinh h i kh ng sử ụng citrate trong m i tr ng Simmon h u hết ch ng S. paratyphi à S. cholerasuis kh ng sinh H2S khoảng 5 các ch ng Salmonella sinh độc t sinh bacteriocin ch ng lại E. coli, Shigella à ngay cả một s ch ng Salmonella khác 2.1.3. Ph n ại i i : Bacteria Ngành : Proteobacteria L : Gramma Proteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae i ng : Salmonella lignieres Dựa ào c u tr c kháng nguyên ch yếu là kháng nguyên th n à kháng nguyên l ng H, Salmonella đ c chia thành các nh m à các ty e huyết thanh Hiện nay đ c ác đ nh gồm trên 5 ty e huyết thanh Salmonella. 2.2. Ph ng há h n ch 2.2.1. Ngu ên c Salmonella c thể đ c hát hiện ( h n t ch đ nh t nh) b ng một quy trình gồm b c là tăng sinh tăng sinh chọn lọc h n l à kh ng đ nh Salmonella th ng c mặt trong mẫu i l ng nh b t n th ng à c ng 4 hiện iện chung i một s l ng l n i sinh t thuộc họ Enterobacteriaceae c t nh cạnh tranh mạnh à c chế sự tăng tr ng c a Salmonella. 2.2.2. M i r ng hóa ch Buffered Pepton Water (BPW) Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RV) Malachite Green Magnesium Chloride Tetrethionate Muller – Kauffmanm Xylose Lysine Deoxucholate (XLD) Hektoen Entric Agar (HE) Bismuth Sulphite Agar (BS) Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) Triple Sugar Iron (TSI) Urea Lysine Decarboxylase Ornithine Decarboxylase Mannitol Sucrose Sorbitol Tryptone Thu c khử o ac s háng huyết thanh Salmonella đa giá 2.3. Ph ng há h c hi n 2.3.1. Tăng sinh Đ i i th t gia cầm t i s ng: Đặt mẫu gia cầm ào một t i P l n cho thêm l t BP l c b ng máy l c gi y để m i tr ng th m ào toàn bộ mẫu 2.3.2. Tăng sinh chọn ọc L c để trộn đ u ung ch tăng sinh sau đ chuyển ml sang 10 ml m i tr ng tăng sinh chọn lọc V đ đ c m đến 0C 0C trong 18 - gi khi cần thiết c thể k o ài thêm gi 2.3.3. Ph n nh n di n D ng que c y ng thực hiện kĩ thu t c y h n l khuẩn lạc đ n i gi ng t ch tăng sinh chọn lọc trên đĩa m i tr ng h n l đặc tr ng cho Salmonella nh XLD H BS… C ng độ chọn lọc à m c độ h n biệt thể hiện hình thái c a khuẩn lac Salmonella trên t ng m i tr ng c ng khác nhau Để chọn lọc à nh n ạng t t cả các ng Salmonella cần sử ụng t nh t hai loại m i tr ng chọn lọc h n biệt khác nhau cho c ng một mẫu 5 2.3.4. Kh ng nh T m i m i tr ng h n l c y chuyển t nh t 5 khuẩn lạc đặc tr ng qua m i tr ng kh ng chọn lọc nh TSA 70C trong 18 - gi Các khuẩn lạc đặc tr ng trên m i tr ng này đ c sử ụng cho các test sinh h a à huyết thanh. Các thử nghiệm sinh h a ch nh cần thực hiện cho Salmonella là: Lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. 2.4. Qu rình 2.4.1. Dụng cụ l y mẫu b o qu n mẫu ăng tay ng một lần áo bảo hộ. T i nilon tr ng ựng mẫu thể t ch kg. Cồn à b ng th m n c. ẹ b ng th kh ng r . Dụng cụ bảo quản lạnh. 2.4.2. Qu rình h n ch 2.4.2.1. D ng k o khuẩn c t 5 g mẫu (kh ng l y m l y cả ch t l ng nếu c ) cho ào bao nilon khuẩn Thêm ào 5 ml m i tr ng BP đ h khử tr ng để nguội Tiến hành đồng nh t mẫu đ c độ ha lo ng -1 Đem nhiệt độ 37 0C trong gi 2.4.2.2 Tă g si : C y ml ch mẫu c nồng độ -1 ào ng nghiệm c ch a 10 ml m i tr ng tăng sinh chọn lọc V ± 50C trong gi : C y mẫu t m i tr ng V sang m i tr ng thạch đĩa XLD à nhiệt độ 70C trong gi Nh n ạng khuẩn lạc đặc tr ng c a Salmonella trên m i tr ng XLD: Tr n lồi trong su t c t m đen đ i khi t m đen quá l n bao tr m cả khuẩn lạc m i tr ng ung quanh chuyển sang màu đ (hồng)… Chọn 5 khuẩn lạc đặc tr ng c y chuyển sang m i tr ng thạch đĩa TSA tăng sinh kh ng chọn lọc à 7 ± 0,50C trong gi 2.4.2.3 T g i g L y khuẩn lạc t m i tr ng TSA c y sang các m i tr ng thử nghiệm sinh h a: a) T g i i g T H khử tr ng m i tr ng TSI 0C trong 5 h t à h n h i m i tr ng ào các ng tr ng để làm ng thạch nghiêng D ng que c y ng c y sinh kh i t khuẩn lạc c a gi ng thuần s u ào đáy c a ng thạch nghiêng 6 Sau khi c y ong thì 70C trong 24 - 8 gi Salmonella ch lên men đ c đ ng glucose trong m i tr ng TSI → Phần nghiêng c a m i tr ng TSI c màu đ hần sau c màu àng Salmonella c khả năng sinh H2S → Xu t hiện các ệt màu đen trong m i tr ng TSI C thể th y hiện t ng sinh h i qua hiện t ng sinh h i qua hiện t ng làm thạch m i tr ng hoặc m i tr ng b đẩy lên trên tạo ra một khoảng kh ng bên i ng nghiệm Hình 3: Thử nghi m Salmonella rên m i r ng TSI #1 - Đ i ch ng #4 - Ps. Aeruginosa ATCC 9027 #2 - S. enteritidis ATCC 13076 #5 - Proteus vulgaris ATCC 13315 #3 - E. coli ATCC 25922 #6 - Pseudomonas fluorescens (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) b) T g i C y i sinh t ào m i tr ng canh urea c ch a ch t ch th là bromocresol purple. 370C trong khoảng - 8 gi Thử nghiệm ( ): M i tr ng chuyển sang màu àng Thử nghiệm (-): M i tr ng kh ng đ i màu  Salmonella kh ng h n giải urea nên kh ng làm thay đ i H m i tr ng Sau khi nu i c y m i tr ng gi nguyên màu àng. 7 Hình 4: Thử nghi m Salmonella rên m i r ng canh urea #1 - Đ i ch ng #2 - Proteus vulgaris ATCC 8427 #3 - Salmonella (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) c) Lê men mannitol M i tr ng sử ụng là m i tr ng henol re broth base c H 7 4; ch th m i tr ng này là henol re c màu đ s chuyển thành màu àng khi pH < 6,8. Tiến hành c y ào các ng m i tr ng các ch ng i sinh t cần kh ng đ nh 70C trong 18 - gi hả năng lên mên c a ch ng đ c đánh giá ựa ào sự sinh aci à sinh h i Sinh acid (+): M i tr ng màu cam chuyển sang màu àng Sinh h i (-): C bọt kh trong ng Durnham  M i tr ng sau khi nu i c y Salmonella b aci h a à chuyển thành màu àng Hình 5: Thử nghi m Salmonella rên m i r ng Phen red broth base (Nguồn: packet-ii-review) 8 d) T g i L L si s Sử ụng m i tr ng alko Tiến hành c y ào các ng m i tr ng các ch ng i sinh t cần kh ng đ nh Ch t ch th màu trong m i tr ng là Bromocresol ur le Phản ng ( ): M i tr ng gi nguyên màu t m ban đầu canh khuẩn đục Phản ng (-): M i tr ng t t m chuyển sang àng  Sau khi nu i c y Salmonella m i tr ng chuyển thành ki m m i tr ng gi nguyên màu t m ban đầu Hình 6: Salmonella r ng hử nghi m LDC #1 - Đ i ch ng #2 - Control #3 - Salmonella #4 - Klebsiella #5 - Citrobacter freudii ATCC 8090 (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) e) T g i ă g si i C y i sinh t thử nghiệm qua m i tr ng canh try ton khoảng gi 37 0 C. Nh ài giọt ether để k o in ol lên b mặt m i tr ng thêm ài giọt thu c thử o ac s uan sát sau ài h t Thử nghiệm ( ): Trên b mặt m i tr ng u t hiện ng màu đ cánh sen Thử nghiệm (-): Kh ng u t hiện ng đ  Salmonella: Indol (-). 9 Hình 7: Salmonella r ng hử nghi m sinh Ind #1 - Đ i ch ng #2 - E. coli ATCC 25922 #3 - Salmonella (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) T g i g s - Proskauer C y i sinh t ào m i tr ng glucose hos hate (M - VP broth). nhiệt độ 70C trong ng - 5 ngày Thêm ào canh khuẩn ung ch thu c thử al ha - na htol 5 trong cồn à ung ch H hay Na H i t lệ : . uan sát hản ng ảy ra trong 5 h t Thử nghiệm ( ): Xu t hiện màu đ hay hồng sáng trên mặt m i tr ng Thử nghiệm (-): M i tr ng kh ng đ i màu  Salmonella: VP (-). Hình 8: Salmonella r ng hử nghi m Voges - Proskauer #1 - Đ i ch ng #2 - Klebsiellapnemoniae ATCC10031 #3 - Salmonella (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) 10 Hình 9: Qu rình óm h n ch nh nh Salmonella r ng mẫu h gia cầm 25 gam th t gà 5 ml BP đồng nh t mẫu trong gi y độ ha lo ng -1 Đem 70C trong gi C y chuy n trên m i tr ng XLD à nhiệt độ 37 0C trong gi 0C ± 5 trong gi L y ml canh tr ng cho ào m i tr ng V Chọn các khuẩn lạc đặc tr ng cho Salmonella c y chuy n ào m i tr ng test sinh h a: TSI Mannitol, phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP. Thử nghiệm ng ng kết kháng huyết thanh K u n Salmonella m nh/d ng nh r ng 25 gam mẫu 11 Ch ng K u n i n ngh 3.1. K u n Salmonella là một loại i khuẩn nguy hiểm. Ch ng g y bệnh cho nhi u đ i t ng động thực t à cả con ng i Loài này th ng tạ nhiễm trong thực phẩm nên r t nguy hiểm à theo TCVN kh ng đ c để Salmonella c mặt trong thực hẩm 3.2. Ki n ngh Các c quan t ch c c thẩm quy n th ng uyên giám sát à kiểm tra hoạt động c a các c s giết m Nhà n c à các t ch c qu c gia à qu c tế quan t m h n n a n đ ệ sinh an toàn thực hẩm nên c nh ng biện há kh ng chế hiện trạng nhiễm i khuẩn Salmonella l m Tiế tục c nh ng nghiên c u s u rộng h n tình trạng nhiễm Salmonella th t gà à đ a ra giải há kh c hục hiệu quả Tăng c ng giáo ục cộng đồng m c độ nguy hại o i khuẩn Salmonella g y ra 12 T i i u ham h Trần Linh Ph c ( ) g i si g , Thành h Hà Nội: Nhà u t bản iáo ục Nguyễn Văn Chiến ( 7) Đi u tra t lệ nhiễm h n l ác đ nh t lệ nhiễm Salmonella trên gà c ng nghiệ một s đ a điểm tại t nh B c Ninh à biện há h ng tr , Lu n ăn thạc sĩ khoa học N ng nghiệ Đại học N ng L m Thái Nguyên Rene S. Hendriksen (2003), Global Salm-Surv - A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health organization, Geneva: World Health Organization.