Rượu men lá, quy trình sản xuất

MỤC LỤC MỤC LỤC 1 PHẦN I: MỞ ĐẦU 4 1.1 Đặt vấn đề 4 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 5 1.3 Yêu cầu nghiên cứu 5 1.4 Ý nghĩa của đề tài 6 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 2.1 Khái quát về men lá. 7 2.2 Đặc điểm chung của nấm men 8 2.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm men 8 2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men. 9 2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men 12 2.4 Sự sinh sản của nấm men 16 2.5 Nhu cầu dinh dưỡng của nấm men 16 2.5.1 Dinh dưỡng cacbon (C) 16 2.5.2 Dinh dưỡng nitơ (N) 18 2.5.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ 19 2.5.4 Dinh dưỡng vitamin: 20 2.6 Sự trao đổi chất của nấm men [15]. 20 2.6.1 Sự dị hóa 21 2.6.2 Sự đồng hóa 21 2.7 Phân loại nấm men. 21 2.8 Vai trò của nấm men trong đời sống [23] 23 2.9 Ứng dụng của nấm men 23 2.10 Các loại lá trong bánh men 25 2.11 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 26 2.11.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ [15] 26 2.11.2 Ảnh hưởng của PH môi trường [15] 27 2.11.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch đường 27 2.11.4 Ảnh hưởng của oxy hòa tan- độ hiếu khí [15] 28 2.11.5 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới quá trình lên men 28 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Đối tượng nghiên cứu 30 3.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 30 3.2.1 Hóa chất: 30 3.2.2 Thiết bị: 30 3.2.3 Môi trường nuối cấy: 31 3.3 Phương pháp nghiên cứu 31 3.3.1 Phương pháp pha loãng [9] 31 3.3.2 phương pháp phân lập và thuần khiết [14] 32 3.3.3 Cấy truyền và giữ giống [3] 32 3.3.4 Quan sát đặc tính nuôi cấy [3] 33 3.3.5 Thử khả năng lên men của nấm men bằng phương pháp Engol- smith [12] 33 3.3.6 Quan sát đặc điểm hình thái tế bào nấm men [1], [5]: 34 3.3.7 Thử khả năng sử dụng đường glucoza của nấm men bằng phương pháp Engol- smith [3], [12] 34 3.3.8 Thử hoạt tính catalase [20] 34 3.3.9 xác định sinh khối nấm men bằng phương pháp đo mật độ quang [30] 35 3.3.10. phương pháp chiết malt [12] 35 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Phân lập và tuyển chọn chủng có hoạt lực sản xuất rượu cao nhất 36 4.2 Tiến hành các bước tuyển chọn chủng 40 4.2.1 Thử khả năng lên men bằng phương pháp engol- smith 40 4.2.2 Thử nghiệm catalase 43 4.2.3 Thử khả năng sử dụng đường glucoza của 5 chủng 8bk, 11bk1, 9bk1, 1bk2, 1cb. 44 4.3 Định tên sơ bộ bằng phương pháp quan sát đặc điểm hình thái tế bào 45 4.4 Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng của chủng Saccharomyces cerevisiae H8 46 4.4.1 Xác định hàm lượng glucoza tối thích cho sự sinh trưởng của chủng Saccharomyces cerevisiae H8 47 4.4.2 Xác định hàm lượng pepton tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng Saccharomyces cerevisiae H8 48 4.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới chủng Saccharomyces cerevisiae H8 50 4.4.4 khảo sát ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng của chủng Saccharomyces cerevisiae H8 52 V. KẾT LUẬN 54 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Uống rượu gắn liền với nét văn hóa ẩm thực của không chỉ người dân Việt Nam. Nếu như xứ Scotland tự hào về dòng wishky, người Pháp có cognac, Nga có vodka, Trung Quốc có Mao Đài, Nhật Bản có rượu Sake, Hàn Quốc có rượu Sochou thì Việt Nam chúng ta cũng rất tự hào về loại rượu nấu theo cách cổ truyền như: rượu nếp, rượu cần, rượu ngô, rượu sắn... Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu về văn hóa ẩm thực nói chung cũng như văn hóa dùng rượu nói riêng đòi hỏi chúng ta cần phải có sản phẩm rượu vừa thơm ngon mang tính đặc trưng của dân tộc lại đảm bảo được sức khỏe cho người tiêu dùng. Nhưng chúng ta chưa có dòng rượu sang trọng dùng để tiếp khách. Và như chúng ta thấy, người dân Việt Nam dùng rượu ngoại rất nhiều trong nhu cầu hàng ngày cũng như làm quà để biếu. Ở Việt Nam, nghề nấu rượu đã có từ lâu đời rong nhân dân. Ở miền núi, đồng bào dân tộc dùng gạo, ngô, khoai, sắn, nấu chín rồi lên men. Men giống được nuôi với một số lá rừng được gọi là men lá. Sau quá trình lên men và tiến hành cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng và nếu không qua chưng cất sản phẩm được gọi là rượu cần, một sản phẩm nổi tiếng ở vùng núi. Nghề nấu rượu ở nước ta từ trước đến nay vẫn dùng men giống ở dạng bánh men hoặc men lá. Trong các men này là một tập hợp vi sinh vật có khả năng đường hóa tinh bột và lên men đường thành rượu. Mãi đến cuối thế kỷ XIX, các nhà sinh vật học Pháp Calmette, Boidin đã phân lập được một loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Murcor rouxii. Loài nấm mốc này phát triển tốt trên môi trường có gluxit, nhất là gạo, tích lũy phức hệ enzyme tương đối hoàn chỉnh, nên không những có khả năng phân giải tinh bột đạ hiệu suất cao mà còn có khả năng lên men đường thành rượu. Đến năm 1898, một loạt nhà máy sản xuất rượu từ nguyên liệu tinh bột (chủ yếu là gạo) theo phương pháp amilomyces rouxii được xây dựng tại Hà Nội, Nam Định, Hải Dương, Sài Gòn... Tất cả các nhà máy này đặt dưới sự quản lý đặc quyền của công ty rượu Fontaine từ Pháp. Mặt khác, thực dân Pháp cho duy trì các cơ sở sản xuất rượu thủ công. Thời bấy giờ, nhân dân thường gọi rượu do nhà máy sản xuất là rượu “ Đế”, còn rượu do các cơ sở thủ công sản xuất là rượu “Ngang”, rượu “lậu”. Do mục đích thống trị thực dân nên thời đó rượu sản xuất ra không cần tinh chế, hàm lượng tạp chất cao, do đó rượu được liệt vào hàng thuốc phiện về phương diện độc hại. Sau ngày hòa bình lặp lại, năm 1955 đến nay, nhà nước Việt Nam đã có kế hoạch khôi phục, phát triển ngành sản xuất rượu theo các thời kỳ, tiến hành nghiên cứu cải tiến phương pháp công nghệ và thiết bị để nâng cao năng suất, hiệu suất và chất lượng rượu trong công nghệ sản xuất rượu. Ở nước ta rượu được sản xuất ra theo nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp lên men rượu truyền thống bằng bánh men hiện nay vẫn được dân gian sử dụng nhiều tuy nhiên hiệu suất lên men cũng như chất lượng ruợu ở nhiều vùng, nhiều địa phương còn chưa ổn định [8]. Một trong những nguyên nhân quan trọng gây lên sự không ổn định đó chính là chủng vi sinh vật lên men trong sản xuất rượu.Vì vậy cần thiết phải tuyển chọn những chủng vi sinh vật có hoạt lực đường hoá cao, hoạt lực lên men mạnh đồng thời bổ sung các loại lá với hàm lượng thích hợp để nâng cao hiệu suất lên men và chất lượng rượu thu được. Do vậy chúng tôi thực hiện đề tài này để “Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao trong sản xuất rượu đặc sản từ bánh men lá ở một số vùng miền núi phía Bắc”. Từ đó có cơ sở tạo ra loại rượu truỳên thống mang đậm hương vị Việt Nam và sanh tầm với các loại rượu truyền thống của các nước trên thế giới. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập được các chủng nấm men từ bánh men lá ở một số vùng núi phía Bắc. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lức cao nhất trong sản xuất rượu đặc sản từ các chủng đã phân lập được. 1.3 Yêu cầu nghiên cứu Phân lập được chủng nấm men có trong bánh men lá. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực cao nhất để sản xuất rượu đặc sản. Sơ bộ định danh chủng có hoạt lực cao nhất trong sản xuất rượu đặc sản. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng đã tuyển chọn. 1.4 Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học: Biết được trong men lá có chủng nấm men nào Và chủng có hoạt lực sản xuất rượu cao nhất. Ý nghĩa thực tiễn: Tạo ra được loại bánh men lá để sản xuất rượu ở quy mô công nghiệp mang hương sắc riêng của loại rượu đặc sản Việt Nam. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về men lá. Men lá loại bánh men có lá, vỏ, rễ cây rừng chứa tinh dầu, có tác dụng dược lý sát trùng. Ở một số vùng đồng bào Tây Nguyên, bà con dân tộc dùng một số loại lá có lượng tinh dầu cao để sát trùng và tạo hương sau này khi tiến hành lên men rượu. Tùy theo sở thích mà số lượng lá cho vào nhiều hay ít, vì thế có tên một lá hay hai lá, ba lá. Việc cho lá rừng vào còn có tác dụng giống như một nguồn vi sinh vật giống tự nhiên. Trong men lá có chứa vi sinh vật tổng hợp enzyme amylase, có khả năng lên men rượu và tạo hương thơm cho quá trình lên men, và sự xảy ra quá trình đồng thời một loạt các quá trình đường hóa, quá trình rượu hóa. Vì thế việc sản xuất bánh men có liên quan rất lớn đến khả năng phát triển hài hòa của các nhóm vi sinh vật trong bánh men ấy. Trong bánh men lá thường có hệ vi sinh vật sau: Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A. flavus, A. awamorii , A. Usami, A. Niger...( giống Aspergillus chiếm phần lớn). Nấm mốc sinh enzyme amylase đường hóa tinh bột [15]. Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. Ngoài ra còn thấy có Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida....Những nấm men này coi như nấm dại, men tạp có lẫn trong bánh men. Nấm men rượu chuyển hóa đường thành rượu [15]. Trong nấm men còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger, tương tự nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh glucoamylase và thủy phân tinh bột thành đường glucose [15]. Ngoài ra còn có vi khuẩn lactic. 2.2 Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có chung các đặc điểm sau: Nói chung có tồn tại trạng thái đơn bào. Đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi hình thức phân cắt tế bào. Nhiều loại có khả năng lên men đường Thành tế bào có chứa mannan Thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính axit cao. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ [6]. 2.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm men Nấm men loài vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Loại nấm men nhà máy rượu , nhà máy bia thường sử dụng là Saccharomyces cerevisiae, có kích thước thay đổi khoảng 2,5 - 10µm × 4,5 - 21µm do đó có thể thấy rõ được dưới kính hiển vi quang học [6]. Tế bào nấm men có dạng: hình cầu, hình ovan hoặc elíp, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi kéo dài ra thành sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh. Hình dạng của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường sinh dưỡng tiêu chuẩn. So với các sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn: Đường kính khoảng 1µm; chiều dài 8µm. Với kích thước này, ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm men trong 1 lít dịch lên men vào khoảng 10m2, và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. Với lượng nấm men là 500kg so với trâu bò cùng một khối lượng thì một ngày đêm nấm men tổng hợp được 50 tấn Protein, còn trâu bò chỉ tổng hợp được 0,5kg. Trọng lượng riêng của tế bào nấm men không khác mấy so với tế bào vi khuẩn (ở nấm men chỉ số này là 1,055 – 1,060, ở vi khuẩn: 1,050 – 1,112) [15]. 2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men. Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ...) ở cơ thể xuất hiện nhiều thể không thấy ở nhân sơ, như ti thể, lục lạp... Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào [15] Vỏ tế bào: bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vỏ tế bào nấm men mang điện. Nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào [15] Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm. (chiếm 25% khối lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan. Một số nấm men có thành tế bào chứa kitin và mannan. Trong thành tế bào còn có chứa 10% protein (tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là enzim. Trên thành tế bào còn thấy có cả một lượng nhỏ lipit [6]. Màng tế bào chất: Xung quanh màng tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày không quá 0,1nm dính chặt với tế bào chất. Có thể quan sát thấy lớp màng này dưới kính hiển vi trường tối: thấy màng là lớp viền sáng rất mỏng quanh tế bài chất. Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắc thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào; thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào); nơi khu trú một số enzym và cơ quan tử của tế bào (như riboxom). Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thấm của màng. Đặc tính này trước hết phụ thuộc vào các enzym phospholipaza và lipaza. Tế bào chất: còn gọi là nguyên sinh chất. Nó có cấu trúc không đồng nhất (heterogen) và ở thể keo, chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào: Ti thể, riboxom, mạng lưới nội chất, các chất dự trữ và các thể vùi của hợp chất lipolit và hydratcacbon tự nhiên trong nội bào. Nhờ kính hiển vi điện tử mà chúng ta biết được tế bào chất là hệ keo được cấu tạo từ protein (đặc tính keo dính là đặc tính của protein), hydrat, lipit, các chất khoáng, nước và các hợp chất khác nữa. Nước trong tế bào chất chiếm 90% ở dạng tự do để hòa tan các chất trước khi tham gia vào các phản ứng trao đổi và dạng liên kết. Tế bào chất có độ nhớt cao tương ứng với glyxerin hoặc xiro đặc. (Như vậy gấp 800 – 8000 lần so với nước). Khi tế bào già độ nhớt này giảm. Trong tế bào chất chứ đầy đủ các cơ quan tử của tế bào, như ti thể, nhân, các khoang không bào, các hạt chất dự trữ dạng tinh bột, dạng chất béo, cũng như mạng lưới nội chất và các thể vùi khác (trong đó có các hạt riboxom)... Cấu trúc của tế bào chất thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi sinh trưởng của tế bào. Sự thay đổi này có thể là thuận nghịch và không thuận nghịch là do mức độ tác động của các yếu tố bên ngoài. Các tế bào trẻ có chất nguyên sinh đồng nhất, khi già chất này xuất hiện không bào, các giọt chất béo, các hạt polyphosphat và lipoit. Như vậy tế bào trở nên dị nguyên (không đồng nhất). Ngoài các cơ quan tử của tế bào có trong tế bào chất ở dạng ti thể hay thể vùi (ti thể, microxom, không bào...), còn có chất xúc tác sinh học rất quan trọng là enzym tham gia vào tất cả các phản ứng hóa sinh. Microxom hay lipoxom: Đây là thể vùi có dạng hạt siêu hiển vi, được cấu tạo từ lipoit, protit và axit ribonucleic (ARN). Các thành phần này ta thấy hàm lượng protit và ARN hầu như bằng nhau còn lipit là rất nhỏ. Ở đây sẽ xảy ra các quy trình tổng hợp protein cho tế bào từ các axit amin đã được hoạt hóa ở hệ thống ti thể. Các axit amin này được nối với nhau theo lệnh của nhân được chuyển qua ARN đi vào các phản ứng sinh tổng hợp protein. Ti thể: Có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tế bào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào. Có thể thấy chúng ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của tế bào nấm men: Thời kỳ yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào tử... Chiều dài của sợi ti thể là 0,2 – 7,5µm. Hình dạng của nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết hợp thành chuối. Bình thường số lượng ti thể trong tế bào nấm men dao động rất lớn: Từ 1 - 50. Nếu trong tế bào chỉ có một ti thể thì thể tích của nó chiếm không nhỏ hơn 20% thể tích tế bào, ở S. cerevisiae có một ti thể chiếm tới 88% thể tích tế bào. Trong môi trường có nồng độ glucose thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ti thể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40. Mạng lưới nội chất: Trong tế bào của nấm men còn chứa một hệ thống màng 2 lớp, được gọi là mạng lưới nội chất bao gồm hằng dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng có kết hợp với riboxom. Đôi khi đầu màng chuốt thành các bọng tròn và rồi có thể từ đây tạo thành không bào. Mạng lưới này còn được gọi là thể golgi hay bộ máy golgi. Mặc dù mạng lưới nội chất của nấm men, cũng như các vi sinh vật khác, có tham gia vào các hoạt động của tế bào. Song, mối quan hệ mạng lưới này với các cơ quan nội bào khác vẫn chưa được biết rõ ràng. Có tác giả cho rằng, mạng lưới kép này điều hành chung quá trình sinh lý của tế bào. Nhân tế bào: Nhân là cấu tử bất biến của tế bào nấm men. Ta thấy rõ nhân tế bào nấm men trong trường hợp giữ tế bào trong nước vô trùng vài ngày. Lúc này tế bào chất trở thành đồng nhất và trong suốt do bị đói. Với kính hiển vi thông thường ta có thể quan sát rất rõ ràng nhân tế bào hoặc dưới kính hiển vi huỳnh quang hay kính hiển vi đối pha sau khi xử lý bằng dung dịch Fluorocrom. Nhân của tế bào nấm men có màng vỏ, hạch nhân (thể nhiễm sắc) và chất nhân. Vỏ nhân tham gia vào điều hòa cac quy trình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất. Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2µm. Phần lớn nhân có dạng hình cầu hoặc elip. Sự phân bố của chúng trong nội bào có thể thay đổi trong suốt quá trình sống của tế bào. Kích thước nhân của tế bào nấm men không đồng nhất không những ở các tế bào khác giống, mà ở tế bào cùng một giống trong trạng thái sinh lý khác nhau. Nhân to ở các giống Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes và dễ dàng nhìn thấy dưới kính hiển vi. Còn các giống lên men hoặc không lên men như Torulopsis pulcharrina, T.utilis... thường có nhân nhỏ. Ở tế bào nấm men đang sinh trưởng nhân rất giàu axit Nucleic và vùng sinh sản được hoạt hóa (nó sẽ mọc chồi hoặc phân cắt tế bào) [15]. 2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men Nấm men đặc biệt là chủng Saccharomyces cerevisiae là loại hiếu khí, nhưng khi thiếu 02 chúng lên men thành ethanol và CO2 qua con đường EM: pyruvat bị decacboxi hóa thành axetaldehyt và CO2 nhờ enzyme pyruvat – decacboxilase (phụ thuộc vào TPP), sau đó axetaldehyt bị khử thành etanol nhờ alcohol – dehydrogenase. Nếu thêm hydrosulfit vào dung dịch nấm men đang lên men glucose, axetaldehyt sẽ bị giảm: hiệu suất etanol và CO2 giảm, đồng thời glyxerin xuất hiện. Sự lên men etilic thông thường được gọi là: ”Dạng lên men Neuberg 1”. Nấm men là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi thiếu O2 chúng lên men mạnh nhưng không sinh trưởng, khi có O2 chúng hô hấp và lên men bị ức chế (hiệu quả Pasteur), sự tiêu thụ glucose sản lượng etanol và CO2 đều giảm sinh khối, trái lại tăng lên tế bào chỉ tạo thành 2mol ATP / mol 2 mol glucose khi lên men so với 38 ATP / mol glucose khi hô hấp. Hiện tượng trên chịu sự điều chỉnh của một số cơ chế trong đó cơ chế cạnh tranh ADP và Pi [17]. Đối với nấm men trong quá trình hoạt động sống, chúng đồng hóa các monosacarit trong điều kiện yếm khí, thải ra môi trường xung quanh sản phẩm dị hóa là rượu etylic và khí cacbonic nhờ tác dụng của một phức hệ enzyme. Đây là một trong nhứng đặc trưng quan trọng của nấm men đã được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu (rượu ngang, rượu nếp) [8]. Chúng ta đều biết, mọi quá trình muốn tiến hành được đòi hỏi phải có năng lượng. Để thực hiện được các hoạt đọng sống như sinh trưởng, phát triển và sinh sản của mình, nấm men đòi hỏi phải có năng lượng. Lên men là quá trình để cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào nấm men. Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng ở dạng hóa năng tàng trữ trong các mạch cacbon và được giải phóng ra trong các phản ứng enzyme do sự chuyển điện tử từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác. Các phản ứng hóa sinh trong quá trình lên men là phản ứng chuyển hydro. Các enzyme xúc tác quá trình tách hydro khỏi cơ chất được gọi là enzyme dehydrogenase. Như vậy lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học [8]. Lên men là quá trình để thu năng lượng qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ được khử rồi đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó. Trong quá trình lên men rượu, hợp chất hữu cơ được tích tụ chủ yếu là rượu etylic [8]. Quá trình lên men chuyển hóa đường thành rựơu là quá trình sinh hóa phức tạp, bao gồm một chuỗi các phản ứng theo con đường fructoza – 1,6 – diphotphat. Người ta nhận thấy rằng chu trình Embden – Meyerhof – parnas và chu trình Crep là trung tâm của các quá trình lên men. Vì lẽ những chu trình này đáp ứng được các yêu cầu về nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nguồn các chất khử là những yếu tố rất cần thiết để duy trì các hoạt động sống của tế bào [8]. Các chủng nấm men khác nhau có khả năng đồng hóa (lên men) các nguồn hydrocacbon khác nhau. Sự khác nhau này do tính chất đặc hiệu, chuyển hóa của các loại enzyme chứa trong tế bào nấm men quyết định. Nói chung đại bộ phận các chủng nấm men đều đồng hóa được các monosacarit glucoza, fructoza... Đối với quá trình lên men rượu, nguồn hydrocacbon có ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng rượu. Ví dụ chủng S.cerevisiae XII chỉ lên men được glucoza, fructoza, sacaroza, galactoza và rafinoza nhưng không lên men được lactoza. Còn đối với chủng S.cerevisiae lại lên men được glucoza, fructoza, sacaroza, mantoza và cả dextrin [8]. Dựa vào mối quan hệ với nhiệt độ người ta chia nấm men ra làm 2 loại: loại lên men ở nhiệt độ thấp (5 – 100C) và loại lên men ở nhiệt độ cao (28 – 320C). Trong công nghiệp sản xuất rượu người ta sử dụng những chủng nấm men lên men ở nhiệt độ cao, chủng có khả năng lên men nhanh và mạnh mẽ. Khi sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột thì trước hết cần phải chuyển tinh bột của nguyên liệu đó thành đường đơn giản. Thường thì tinh bột của nguyên liệu được thủy phân đến mantoza và glucoza nhờ enzyme amylase. Muốn có được sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men rượu là rượu etylic thì tác nhân cung cấp hệ enzyme đặc thù đó phải là giống nấm men Saccharomyces cerevisiae. Nhờ nấm men này, trong điều kiện sống yếm khí, chúng có khả năng chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO2 một cách hợp thức. Trong điều kiện yếm khí nấm men không có khả năng chuyển hóa tiếp các etanol đã được tạo thành. Có nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích lũy rượu etylic. Như vậy biện pháp kỹ thuật tương ứng là phải lên men trong thùng kín [22], [28]. Tế bào nấm men có đặc điểm nữa là có khả năng tạo ra các nội enzyme (endofecmen) nghĩa là nhừng enzyme tiến hành xúc tác ở bên trong tế bào. Như vậy sự phân li đường sẽ xảy ra ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 được tạo thành thì đi ra khỏi tế bào và tích tụ trong môi trường. Xét về mặt hóa học, sự lên men rượu bình thường có thể chia ra 2 thời kỳ: - Thời kỳ cảm ứng: Ở giai đoạn này, chất tiếp nhận hydro của enzyme ancoldehydrogenaza là axetandehyt được tạo thành chưa đủ, do đó enzyme sẽ chuyển hydro đến cho andehyt photphatglixerinic. Dưới tác dụng của enzyme photphatase, photphatglixerin bị thủy phân để tạo thành glyxerin. Như vậy trong môi trường sẽ hình thành glixerin và CO2: - Thời kỳ tĩnh: Đến lúc này lượng axetandehyt là cơ chất bình thường của enzyme ancoldehydrogenase được tạo thành đã có nhiều, nên enzyme sẽ chuyển hydro đến cho cơ chất của nó và rượu etylic được hình thành từ đây: Glyxerin chỉ được tạo nên trong thời kỳ cảm ứng nên no chỉ là sản phẩm phụ trong môi trường axit. Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men: C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O Thực tế cho thấy rằng, sự lên men rượu sẽ xảy ra một cách bình thường để cho ta sản phẩm chủ yếu là rượu và một số sản phẩm phụ khác như glyxerin, dầu fusel... Chỉ trong điều kiện pH của môi trường từ 4- 5 và môi trường thật yếm khí. Trong điều kiện yếm khí sự lên men xảy ra rất mạnh mẽ (nghĩa là rượu etylic tạo ra rất nhiều) nhưng sự phát triển của tế bào nấm men hầu như không có. Vì lẽ khi ấy nấm men không thu được năng lương để duy trì các hoạt động sống của mình chỉ bằng cách gây lên men glucoza. Khi có không khí thì sự lên men yếu đi vì nấm men sẽ thu năng lượng cần thiết cho sự phát triển của chúng bằng con đường hô hấp hiếu khí, nghĩa là bằng cách oxy hóa sinh học glucoza đến CO2 và H2O. Hiện tượng kìm hãm sự lên men rượu dưới ảnh hưởng của oxy gọi là hiệu ứng pauster. Trong điều kiện sản xuất, sự lên men rượu se tiến hành một cách thuận lợi khi ở nhiệt độ 29 -320C. Người ta thấy, nấm men có thể lên men được dung dich đường có nồng độ 25- 30% mặc dầu là chậm chạp. Tuy nhiên môi trường thuận lợi cho lên men là chứa từ 10 – 18% đường. Dung dịch đường có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài, sử dụng không triệt để hết đường, đồng thời lượng rượu tạo thành lớn sẽ ức chế hoạt động của nấm men. Môi trường lên men khi có nồng độ đường quá thấp sẽ không thuận lợi về kinh tế. Nồng độ rượu và khí cacbonic cũng có tác dụng kìm hãm đến sự sinh sản cũng như khả năng lên men của nấm men. Sự sinh sản của nấm men sẽ bị chậm lại khi nồng độ rượu có trong môi trường là 2% và sẽ bị ngừng lại khi nồng độ rượu là 5%. Khí cacbonic ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO2 sẽ làm cho môi trường lên men luôn luôn bị khuấy động, kéo dài được trạng thái lơ lửng của nấm men do đó làm tăng nhanh sự lên men. 2.4 Sự sinh sản của nấm men Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy chồi. Sinh sản bằng cách phân đôi. Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử. Tiếp hợp đẳng giao Tiếp hợp dị giao Sinh sản đơn tính Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh dưỡng chúng sẽ sinh sản cho đến cơ chất dinh dưỡng cần thiết ở trong môi trường giảm tới mức thấp nhất. khi đó sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần và ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự tăng sinh khối không đáng kể. Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung và của nấm men nói riêng thường được chia làm 4 pha: pha thích ứng (pha lag), pha chỉ số (logarit), pha ổn định và pha tử vong [15],[23]. 2.5 Nhu cầu dinh dưỡng của nấm men 2.5.1 Dinh dưỡng cacbon (C) Các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các rượu, axit hữu cơ, axit amin... có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men. Ở đây cũng cần phải lưu ý rằng, hầu hết các loài nấm men đều không có enzym polyhydrolase trong đó có enzym amylase và xenlulase. Vì vậy nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như xenlulose và hemixenlulose. Gần đây có một số công trình nghiên cứu cho biết một số chủng thuộc giống Candida có hoạt tính amylase ngoại bào, song vẫn chưa đưa các chủng này vào sản xuất công nghiệp cũng như trong thực tế. Các nguồn C dinh dưỡng trước hết phải kể đến các loại đường. Đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) được tất cả các loài nấm men sử dụng. Glucose được coi như nguồn C vạn năng đối với vi sinh vật. Nhiều loài nấm men, trong đó có giống Saccharomyces lên men rượu, không sử dụng được pentose. Tỷ số các đường được nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài. Qua đây ta có thể xây dựng được phương pháp chuẩn đoán các loài nấm men. Phần lớn các loài thuộc giống Saccharomyces khác nhau giữa chúng trước hết là quan hệ với các loại đường trong quá trình trao đổi chất hydratcacbon. Đối với nguồn cacbon khác như các loại rượu và axit hữu cơ thì mối quan hệ này là giống nhau ở tất cả các loài của cùng một giống. Axit acetic và glucose được sử dụng đồng thời. Như là một quy luật, trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn C thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được sử dụng trước. Trong nuôi cấy liên tục nấm men có tốc độ sinh trưởng cùng với tốc độ pha loãng của môi trường thì những hợp chất có nhiều C trong phân tử sẽ được sử dụng sau cùng. Những loài nấm men của cùng một giống không phải bao giờ cũng đồng hóa vật chất như nhau. Có thể nói, các loài khác nhau (dù là một giống) đồng hóa các nguồn dinh dưỡng là khác nhau. Thí dụ: các loài Candida natalensis và C. Parapsilosis và đồng hóa rất tốt galactose, nhưng C. Clausseni lại không đồng hóa được loại đường này. Saccharomyces cerevisiae chỉ bắt đầu sử dụng galactose từ ngày thứ hai sau khi nuôi cấy. Những disacarit (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phảo qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzym tương ứng của nấm men. Nấm men chuyển từ sống kỵ khí sang sống hiếu khí sẽ bị yếu khả năng sử dụng glucose và maltose, nhưng với saccharose hoạt tính sự dụng lại được tăng gấp 2,5 lần. Nấm men sử dụng maltose chỉ khi trong khi môi trường không có mặt glucose và fructose. Maltose được lên men hoàn toàn trong pha sinh trưởng ổn định của nấm men. Các axit hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men. Chúng cũng có thể là nguồn dinh dưỡng C và năng lượng duy nhất. Tất cả các sản phẩm trung gian trong trao đổi của vòng krebs đều là nguồn C dinh dưỡng cho nấm men. Song, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật này trong môi trường chỉ có axit acetic, xitric, sucinic, fumaric, malic hay oxalic đều thấp hơn so với môi trường chứa glucose. Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn C nuôi cấy nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây. Đặc biệt là thu sinh khối nấm men từ hydratcacbon làm nguồn protein – vitamin dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi rất có nhiều triển vọng. Cũng có ý kiến e ngại các chế phẩm này còn dư lượng những chất nào đó còn chưa rõ hoặc rất ít không thể xác định được có ảnh hưởng tới đời sống sức khỏe của con người và động vật. Ngày nay người ta đang hoàn thiện thực nghiệm về vai trò của CO2 trong trao đổi chất của nấm men. Thật vậy, giữa tất cả các nguồn C hữu cơ thì khí CO2 là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết với CO2 đều là các sản phẩm cần thiết cho nấm men [15]. 2.5.2 Dinh dưỡng nitơ (N) Nguồn N cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa N của tế bào là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chưa N của tế bào là các axit amin, các nucleotit purin và pyrimidin, protein và một số vitamin. Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các axit amin... thành phần protein trực tiếp từ các hợp chất vô cơ trong khi sử dụng nguồn C là các chất hữu cơ - sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa hydratcacbon trong hô hấp và lên men. Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat. Song, giống Hasenula và giống Pichia lại đồng hóa được chất này. Một số loài thuộc giống Brettanomyses cũng đồng hóa được nitrat. Nguồn N vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ. Đó là amoni sulfat, phosphat rồi đến các muối axetat, lactat, malat và sucxinat. Trong môi trường có muối amoni, đặc biệt là sulfat, thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc axit còn lại sẽ được sử dụng sau hoạc ít sử dụng sẽ làm cho môi trường axit hóa, giảm pH. Trong môi trường lỏng amoniac (NH3) ở dạng NH4+ gần với tiền chất của N hữu cơ và là nguồn N rất dễ cho nấm men sử dụng, chỉ xếp sau các axit amin. Nấm men còn sử dụng được ure và pepton. Trong môi trường lỏng ure sẽ bị urease của nấm men phân ly thành NH4+ và CO2. Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt trong môi trường nên có mặt cả nguôn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin (nấm men chỉ sử dụng được axit amin ở dạng tự nhiên), các peptit, các nucleotit... Trong thực tế ngừoi ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc...) làm nguồn N hữu cơ [15]. 2.5.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh nói chung, trong đó có nấm men, phospho (P) được quan tâm trước hết, sau đó là kali (K) và magiê (Mg), lưu huỳnh (S)... Như chúng ta đã biết phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit... Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biêth là trao đổi chất hydrocacbon trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphat. Hợp chất này chuyển thành polyphosphat và sau khi hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. Khi không đủ P trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men thay đổi đáng kể liên quan tới sự phá vỡ nhu cầu và sử dụng hydratcacbon và nito. Nhu cầu sinh lý về P đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 – 13 mg P. Trong phòng thí nghiệm vi sinh người ta thường dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K. Dinh dưỡng lưu huỳnh (S): S là thành phần của một số axit amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số enzyme CoA. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2 SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. Hàm lượng S nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men,nhưng ở nồng độ 1mg/l S đã kìm hãm quá trình này [15] 2.5.4 Dinh dưỡng vitamin: Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzym và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, cải bắp, cà chua, cà rốt, khoai tây... làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường [15]. 2.6 Sự trao đổi chất của nấm men [15]. Trong quá trình hoạt động sống của tế bào nấm men, cũng như các vi sinh vật, cần tiêu hóa các chất dinh dưỡng từ môi trường để xây dựng tế bào mới phục vụ cho sinh trưởng đồng thời sản ra môi trường một số sản phẩm. Tất cả các quá trình này được gọi là trao đổi chất ở tế bào. Sự trao đổi chất được chia làm 3 giai đoạn: Phân cắt các đại phân tử ở ngoài tế bào để có thể qua màng vào nội bào. Phân giải các phân tử bé để tạo ra các chất trao đổi chất trung gian(pyruvat, axetyl, CoA) và năng lượng hữu ích (ATP). Sự phân giải triệt để các chất trao đổi chất trung gian thành CO2 và H2O với sự giải phóng ra nhiều năng lượng ở dạng ATP với hàng loạt các phản ứng oxy hóa khử các chất hữu cơ và vô cơ. Trao đổi chất ở tế bào nấm men cũng tương tự như ở hầu hết giới vi sinh vật. Chức năng cơ bản của trao đổi chất là tạo ra các vật liệu tế bào và nguồn năng lượng phục vụ cho hoạt động sống của tế bào. Trao đổi chất ở trong tế bào nấm men gồm 2 quá trình ngược chiều nhau (có khi xen kẽ với nhau): dị hóa và đồng hóa [15]. 2.6.1 Sự dị hóa Là quá trình phân giải các hợp chất dinh dưỡng có phân tử lớn để có thể qua màng vào nội bào, sau đó tiếp tục phân giải các chất có phân tử nhỏ thành các hợp chất trung gian, và thu nhận năng lượng. Tiếp tục phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ (kể cả các sản phẩm trung gian) thành sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O [15]. 2.6.2 Sự đồng hóa Là sử dụng các hợp chất trao đổi trung gian do quá trình dị hóa tạo thành hoặc có sẵn trong môi trường để thực hiện các quá trình sinh tổng hợp ra các chất cấu trúc tế bào, như các hợp chất cao phân tử polysaccarit, protein, axit nucleic, lipit... tạo ra tế bào mới từ các tiền chất đơn giản (axit amin, các bazo purin và pirimidin, axit hữu cơ, phosphat- đường). Sự tổng hợp gắn liền với nhu cầu về năng lượng tự do được giải phóng do khử phospho của ATP. Quá trình tổng hợp như vậy được gọi là trao đổi chất kiến tạo hay là cấu trúc xây dựng [15]. 2.7 Phân loại nấm men. J.Lodder (1970) đã xác định có 349 loài nấm men, thuộc 39 chi khác nhau. J.A.Barnett, R.W.Payne và D.Yarrow (1983) xác định có 483 loài nấm men, thuộc 66 chi khác nhau: Aciculoconidium: 1 loài; Ambrosiozyma: 3 loài; Arthrooascus: 1 loài; Botryoascus: 1 loài; Brettanomyces: 7 loài; Bullera: 6 loài; Candida: 155 loài; Citeromyces: 1 loài; Clavispora: 1 loài; Cryptococcus: 24 loài; Cyniclomyces: 1 loài; Debaryomyces: 11 loài; Debaryozyma: 1 loài; Dekkera: 2 loài; Eeniella: 1 loài; Endomyces: 1 loài; Endomycopsella: 2 loài; Filobasidiella: 1 loài; Filobasidium: 3 loài; Geotrichum: 10 loài; Guilliermindella: 1 loài; Hanseniaspora: 7 loài; Hansenula: 27 loài; Hormoascus: 1 loài; Hyphopichia: 1 loài; Issatchenkia: 4 loài; Kloeckera: 1 loài; Kluyveromyces: 11 loài; Leucosporidium: 6 loài; Lipomyces: 5 loài; Lodderomyces: 1 loài; Malassezia: 2 loài; Mastigomyces: 1 loài; Metschnikowia: 6 loài; Nadsonia: 3 loài; Nematospora: 1 loài; Oosporidium: 1 loài; Pachsolen: 1 loài; Pachytichospora: 1 loài; Phaffia: 1 loài; Pichia: 62 loài; Rhodosporidium: 9 loài; Rhodotorula: 18 loài; Saccharomyces: 7 loài; Saccharomycodes: 2 loài; Saccharomycopsis: 2 loài; Sarcinosporon: 1 loài; Shizoblastosporion: 1 loài; Shizosaccharomyces: 4 loài; Schwanniomyces: 1 loài; Sporidiobolus: 5 loài; Sporobolomyces: 6 loài; Sporopachydermia: 3 loài; Stephansascus: 1 loài; Sterigmatomyces: 6 loài; Sterigmatosporidium: 1 loài; Sympodiomces: 1 loài; Torulaspora: 3 loài; Trichosporo: 8 loài; Trigonopsis: 1 loài; Wickerhamia: 1 loài; Wickerhamiella: 1 loài; Williopsis: 5 loài; Wingea: 1 loài; Yarrowia: 1 loài; Zygosaccharomyces: 8 loài [6]. Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: Công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, và cao nấm men, lipit nấm men, các enzim như amilaza, invertaza, lactaza, unicaza, poligalacturonaza, sản xuất ergosterol, axit ribonucleic, riboflavin, (vitamin B2), các axit amin như lizin, xixtein, metionin. Loài Saccharomyces cerecisiae hiện đang được sử dụng như một công cụ đắc lực để mang các ADN tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của kỹ thuật di truyền. Tuy nhiên bên cạnh các nấm men có ích cũng không ít các nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc các thực phẩm chế biến. Có khoảng 13 – 15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người và động vật chăn nuôi. Đáng chú ý nhát là các loài Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Trichosporon cutaneum, T.capitatum...[6]. 2.8 Vai trò của nấm men trong đời sống [23] Nấm men là nhóm vi sinh vật được con người sử dụng sớm nhất trong chế biến thực phẩm, hàng nghìn năm trước công nguyên con người đã biết sử dụng quá trình lên men để sản xuất rượu, làm nở bột mì. Ngày nay rất nhiều nhà máy với qui mô lớn đã sử dụng vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng để sản xuất ra các sản phẩm quan trong như glyxerin, bia, rượu nho, các sản phẩm rượu chưng cất như rum, swuytky [ 27]. Nấm men cũng đã được sử dụng làm vật chủ trong công nghệ cấy chuyển gen để tạo ra những sản phẩm rất quí giá nhờ kỹ nghệ chuyển gen và tái tổ hợp [25], [29]. Có thể kể đến một số kết quả cụ thể sau: Năm 1985 hãng Suntory (Mỹ) đã tạo được giống nấm men mới bằng công nghệ gen có thể giết chết các vi khuẩn xuất hiện trong bia. Kimura. A (Nhật) năm 1980 đã tạo ra được các chủng nấm men có khả năng sản xuất Insulin và Interferon. Tháng 3-1981 các thành viên bộ môn di truyền học, đại học Oa – sinh – ton đã sử dụng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được tái tổ hợp để sản xuất Interferon đạt hiệu suất cao...[23]. 2.9 Ứng dụng của nấm men Hơn 6000 năm trước đây người Ai Cập đã biết làm tăng hương vị và độ nở của bột bánh mì bằng cách để bột mì đã nhào vài ngày trước khi đem nướng. Thậm chí trước đó nữa người Summarian đã khắc lên bia đá phương pháp lên men để làm cồn. Ngày nay chúng ta đều biết cả hai việc này dựa trên hoạt động sống của nấm men Saccharomyces cerevisiae và một vài loài gần gũi. Một khoa học hiện đại bắt nguồn từ kiến thức cổ điển đó đã chiếm vị trí đặc biệt trong cuộc sống loài người [8]. Ngoài tác dụng làm nở bột mì, làm cồn, nâm men từ lâu đã được dùng để sản xuất các loại đồ uống rất đa dạng như bia, vang, sâm banh, nước ngọt có ga; dùng để sản xuất sinh khối, giàu đạm và vitamin, nhiều dược phẩm quý đắt tiền, các chất sinh học dùng trong phòng thí nghiệm sinh học và y học hiện đại [8]. Theo tài liệu quốc tế năm 1984, các sản phẩm từ nấm men chiếm gần 70% tổng số các sản phẩm công nghệ sinh học toàn thế giới [10]. Trong những năm tới, số lượng và chủng loại các sản phẩm từ nấm men còn tăng lên nhanh chóng do việc sử dụng kỹ thuật di truyền đưa những gen xác định từ động vật, thực vật vào nấm men và dùng nấm men như những ”nhà máy tí hon” nhưng năng suất rất cao, để sản xuất hàng loạt chất mà trước đây chỉ tách chiết được với số lượng ít ỏi và rất khó khăn từ các bộ phận thực vật, động vật như các enzyme, hoocmon ... Ngoài ra chúng ta còn thấy một ứng dụng rất quan trọng của nấm men đó là sử dụng trong chăn nuôi. Bởi vì trong tế bào nấm men chứa đầy đủ các chất cần thiết cho sự sống với hàm lượng cao. So với khối lượng khô, protein chiếm 48- 52%, hydratcacbon 13- 16%, lipit 2- 3%, các chất trích ly và vitamin 23- 40%. Việc sản xuất nấm men gia súc được thực hiện đầu tiên ở Đức vào những năm 80 của thế kỷ trước và hiện nay đã trở thành một ngành công nghiệp phổ biến ở hầu hết các nước có nền chăn nuôi phát triển. Ngoài việc thu sinh khối nấm men ở các nhà máy bia, nhà máy rượu, ngay từ những năm 70 người ta đã xây dựng các nhà máy chuyên sản xuât nấm men gia súc đi từ các nguồn thức ăn là rỉ đường, dịch thủy phân xenlulose từ nước thải các nhà máy giấy, phế phẩm của nhà máy đồ hộp quả, nhà máy sản xuất phomat,... [26]. Những năm đầu thập kỷ trước, người ta đặc biệt chú ý đến khả năng sản xuất nấm men đi từ metan [19] và nhất là từ parafin của dầu mỏ [16]. Một số nghiên cứu đề cập tới việc sản xuất sinh khối nấm men trực tiếp từ nguồn thức ăn là tinh bột [7],[19]. Trong các nguồn protein sản xuất bằng công nghệ sinh tổng hợp thì nấm men là loại được nghiên cứu sớm hơn cả. Nấm men gia súc được sản xuất đầu tiên ở Đức là Saccharomyces cerevisiae và sau đó là loài Torula utilis. Từ lâu Liên Xô đã sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc trên cơ sở phụ phẩm nông nghiệp và phế liệu công nghiệp. Ở Mỹ cũng vậy, sản phẩm nấm men gia súc từ bã rượu đã được tiến hành từ những năm 40. Ở nước ta, vấn đề nghiên cứu và sử dụng nấm men trong chăn nuôi cũng đã tiến hành từ vài chục năm trước đây. Năm 1961, một số nông trường và hợp tác xã dùng men bia [19] S.cerevisiae có khi thêm Bac.subtilis để ủ thức ăn. Trong thời kỳ 1963- 1967 [19] Viện chăn nuôi đã tiến hành nghiên cứu men bia và xây dựng quy trình phổ biến cho nhiều hợp tác xã. Năm 1964 trường Đại học Nông nghiệp đã đúc kết kinh nghiệm quần chúng về men rượu và làm bánh men thuốc bắc đem ứng dụng ở các hợp tác xã. Năm 1965 trường Đại học Tổng hợp đã phân lập, nuôi cấy và hướng dẫn làm bánh men thuốc bắc đưa áp dụng và có kết quả ở nhiều địa phương [2] và trường Đại học Tổng hợp tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men và điều kiện sản xuất sinh khối để đưa ứng dụng [4]. 2.10 Các loại lá trong bánh men Ngoài gạo các loại lá (các vị thuốc nam) cũng là nguyên liệu chính không thể thiếu được cho vào bánh men cổ truyền. Với kinh nghiệm gia truyền, ở từng địa phương khác nhau thậm chí ở từng gia đình nhất định, số vị thuốc trong một bài thuốc làm bánh men là khác nhau. Với người Thái: Những thứ quả lá chủ yếu gồm có: bơ hinh ho, khi mắc cái, củ riềng, lá trầu không, quả ớt... Với người Tây Nguyên: Men rượu được người dân tộc chế từ vỏ cây hiam lấy trong rừng trộn với bột ớt, bột gừng, riềng, bột gạo, một số thứ lá và rễ cây khác. Các loại lá cho vào bánh men của các dân tộc là khác nhau, song vẫn có một số vị chung như: lá quế, lá mít, lá nhân trần, giềng, gừng, ớt. Theo công dụng thành phần hóa học của các vị thuốc có thể chia làm 3 nhóm: Nhóm chất có giá trị dinh dưỡng đối với các vi sinh vật gồm protein, gluxit (tinh bột, các chất đường), lipit, vitamin,chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng... Nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng bao gồm: Tinh dầu, chất nhựa, alcaloit và glucozit... Nhóm chất vô hại gồm chất xơ, chất màu... Đồng thời cũng chính các vị thuốc nam này, từ lâu nhân dân ta đã dùng để chữa bệnh. Trong đó có các bệnh viễm nhiễm đường ruột, đường hô hấp, tiết niệu, mụn nhọt...[13]. Tác dụng chữa bệnh của các vị thuốc nhờ vào tính kháng khuẩn của chúng. Mỗi vị thuốc có tính kháng khuẩn mạnh yếu khác nhau và khả năng kháng đối với các vi khuẩn cũng rất đa dạng. Các vị thuốc đều có tác dụng đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh. Tối đa ví dụ như tinh dầu quế, tinh dầu húng chanh có tác dụng với 11 loại vi khuẩn ở mức độ chúng bị tiêu diệt hoàn toàn (hoàn toàn không phát triển được). Dựa trên tác dụng của các vị thuốc mà nhân dân ta đã phát huy tác dụng tối ưu của môi trường đặc hiệu tự nhiên. Qua nhiều thế hệ từ năm này qua năm khác tạo ra những thích ứng tiến hóa cho hệ sinh vật có lợi cho quá trình sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột. Còn các vi sinh vật tạp (không có lợi cho quá trình sản xuất rượu) không phát triển được hoặc phát triển rất yếu, nhờ tính kháng khuẩn của các vi thuốc trong môi trường [8]. 2.11 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Các yếu tố ảnh hưởng ở đây là nhiệt độ, oxy hòa tan hay độ hiếu khí, pH môi trường, hàm lượng sản phẩm chính tạo ra, thành phần môi trường và các điều kiện khác của môi trường nuôi cấy 2.11.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ [15] Đối với sinh trưởng của đa số nấm men nhiệt độ tối thích vào khoảng: 28- 32oC Đối với lên men rượu etylic để sản xuất rượu trắng (cồn thực phẩm, rượu vodka, các loại rượu trắng truyền thống) thì nhiệt độ tối thích là: 30- 35 oC, với lên men rượu vang là 20-25 oC, lên men bia là 6-10 oC hoặc 8-12 oC... Nhiệt độ lên men cao ở khoảng 30-35 sự bắt đầu tích tụ rượu etylic càng sớm, tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm, nhưng không lên men được hết đường(đường sót lại với một lượng khá lớn) thì điều này có thể là nguy hiểm vì đường sót sẽ bị lên men bởi vi khuẩn lactic để tạo thành axit lactic, làm chua dịch lên men, làm ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm, kể cả rượu trắng, bia và rượu vang. Lên men ở nhiệt độ cao cũng làm cho các vi khuẩn tạp nhiễm phát triển nhanh làm biến đổi xấu về chất lượng sản phẩm. 2.11.2 Ảnh hưởng của PH môi trường [15] pH của môi trường lên men hay môi trường vi sinh vật nói chung với mỗi chủng hay mỗi nhóm vi sinh vật đều có khoảng pH tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển. Đối với nhóm nấm men, với các giống men rượu Saccharomyces cũng có những pH tối thích khác nhau Với men rượu và men bia thuộc giống Saccharomyces pH ban đầu thích hợp cho lên men là khoảng 5.5. trong quá trình lên men pH giảm xuống 4.4- 4.5 rồi lại tăng dần lên. Nguyên nhân giảm pH là do sự tạo thành CO2 và các axit hữu cơ trong quá trình lên men Với men rượu vang có thể lên men ở pH là : 2.8- 3.8, so với men rượu thì men rượu vang chịu được độ axit cao hơn. Nâng cao độ axit của môi trường sẽ làm cho nấm men thay đổi hình dáng: tế bào nhỏ hơn với dạng hình tròn nhiều hơn, trong tế bào chất tích tụ các chất béo. 2.11.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch đường Nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men Nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men, mặt khác sẽ tốn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.[21] Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16-18% tùy theo mức độ thuần khiết, tương đương 13-15% đường, để sau khi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8.5 đến 9.5% V. 2.11.4 Ảnh hưởng của oxy hòa tan- độ hiếu khí [15] Quá trình lên men rượu thường được thực hiện trong điều kiện kỵ khí nhưng khi nấm men mới được nhân giống thì nhất thiết phải có một lượng oxy nào đó để nấm men sử dụng. Trong thực tế sản xuất đây là thời điểm duy nhất trong quá trình lên men rượu oxy có ích cho nấm men. Thời gian đầu nấm men sinh trưởng mạnh nhờ có lượng oxy của không khí hòa tan vào dịch lên men. Nếu lượng giống tiếp vào lên men ít (còn xa mới tới lượng cần để cho lên men) người ta phải thổi khí sạch để cho giống nấm men sinh trưởng. Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Trong môi trường có khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn. Do đó tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn. Bình thường oxy hòa tan tối đa trong nước đến 9mg/l. Nồng độ giảm xuống còn 1mg/l nấm men sẽ ngừng sinh sản 2.11.5 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới quá trình lên men Nấm men sử dụng nitơ để tổng hợp tế bào mới và các enzyme protease trong quá trình sinh trưởng và sinh sản. Trong quá trình lên men, việc cung cấp đủ lượng nitơ mà nấm men có thể đồng hóa được là rất cần thiết. Nó ảnh hưởng tới tốc độ chuyển hóa đường thành rượu và khả năng chịu cồn của nấm men. Nếu không đủ nguồn nitơ trong dịch lên men, có thể dẫn tới sinh trưởng của nấm men chậm, kéo dài thời gian lên men hoặc lên men không triệt để, giảm năng suất. Thêm vào đó, số lượng các sản phẩm chuyển hóa có thể làm giảm chất lượng do acid amin và các peptide tạo thành H2S, các este không bình thường và thay đổi sự tạo thành diacetyl. Trong công nghiệp sản xuất nước uống có cồn, có thể khắc phục sự thiếu hụt nitơ trong môi trường lên men bằng cách thay đổi các điều kiện lên men, thêm enzyme protease để tăng quá trình thủy phân protein trong nguyên liệu hoặc bổ sung một lượng lớn nitơ để nấm men sử dụng [11], [21], [24]. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu vật: Bánh men ở một số vùng núi phía bắc Men lá: Thôn Bản Chằng - xã Yên cử - Huyện Chợ Mới – Bắc Kạn Men lá: Thôn Thái Lạo – Xã Yên Cử - huyện Chợ Mới – tỉnh Bắc Kạn Men lá: Bắc Kạn Men lá: Cao Bằng Men lá: Lạng Sơn 3.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 3.2.1 Hóa chất: Các hóa chất được sử dụng cho thí nghiệm làm đề tài thực tập tốt nghiệp: Đường glucoza xuất xứ Trung Quốc Pepton xuất xứ Trung Quốc KH2PO4, Trung Quốc MgSO4.7H2O, Trung Quốc Agar – agar, Trung Quốc 3.2.2 Thiết bị: Tủ ấm (Nhật Bản) : Nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp Tủ cấy (Nhật Bản) vô khuẩn có đèn UV Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản): Quan sát tế bào vi sinh vật Tủ sấy (Nhật Bản) : dùng để sấy khô, khử trùng dụng cụ chịu được nhiệt nóng khô Nồi thanh trùng (HIRAYAMA HV- Nhật Bản): Hấp khử trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm. Cân điện tử SARORIUS ( Nhật Bản): Cân hóa chấ