Sản xuất biodiesel từ vi tảo - Kỹ thuật nuôi cấy vi tảo thu lipid

mức độ chiếu sáng tăng, đƣợc thể hiện qua đồ thị sau: 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 33 Hình 3. 3: Ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng trên sự sinh trƣởng của tế bào và hàm lƣợng chlorophyll a [S8] Mức độ sinh trƣởng của tế bào và hàm lƣợng chlorophyll a đƣợc xác định trong phase sinh trƣởng hàm số mũ, thành phần acid béo đƣợc xác định khi bắt đầu phase cân bằng. Hàm lƣợng chlorophyll a trong tế bào giảm hơn 85% khi mức độ chiếu sáng tăng 20 lần từ 30 tới 600 µmol/m2s. Những thay đổi về sắc tố nội bào có mối liên hệ với thành phần acid béo. Hình 3. 4: Sự phân phối các acid béo chính trong Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy theo mẻ dƣới ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng [77] 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 34 Tuy nhiên, để xác định ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng trên sự hình thành các hợp chất hóa học nội bào, thiết bị nuôi cấy turbidostat cần đƣợc điều chỉnh sao cho chế độ chiếu sáng (bao gồm thời gian chiếu sáng, góc độ chiếu sáng) không gây ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng của tế bào. Khi đƣợc nuôi cấy dƣới mức độ chiếu sáng GLL (35µmol /m2s), môi trƣờng nuôi cấy Nannochloropsis bị giới hạn về ánh sáng, và mức độ nhân đôi tế bào chỉ đạt 57% so với khi nuôi ở điều kiện ánh sáng bão hòa (GSL, 290 µmol /m 2s). Điều kiện ánh sáng PIL (550µmol /m2s) lại có tác dụng ức chế, gây giảm mức độ nhân đôi của tế bào một phần. Khi mức độ chiếu sáng tăng lên đến 850µmol /m2s, mức độ nhân đôi tế bào giảm nghiêm trọng. Điều đó cho thấy, Nannochloropsis sp. khá nhạy cảm với dòng photon có mật độ cao. Nồng độ các sắc tố quang hợp giảm đi khi cƣờng độ ánh sáng tăng. Hàm lƣợng carotenoid giảm không tƣơng xứng với lƣợng chlorophyll a. Kết quả là tỷ lệ giữa carotenoid:chlorophyll a tăng lên khi mức độ chiếu sáng tăng. Nồng độ protein vẫn duy trì không đổi, trong khi đó carbohydrate, lipid và các acid béo tăng khi tăng mức độ chiếu sáng. Tỷ lệ khối lƣợng acid béo trong tổng lƣợng lipid tăng khi tế bào đƣợc nuôi ở GSL, điều này cho thấy có sự tăng tƣơng ứng về triacylglycerol. Nhƣng khi nuôi cấy ở chế độ PIL thì hàm lƣợng lipid và các acid béo nội bào không gia tăng thêm nữa so với chế độ GSL. - Thành phần acid béo Thành phần acid béo trong Nannochloropsis sp. chủ yếu là C20:5, tiếp theo là C16:1, nhƣ đã nêu ở phần trên. Các kết quả nghiên cứu khi nuôi cấy theo mẻ cho thấy rằng mức độ chiếu sáng thực sự ảnh hƣởng nhiều đến thành phần acid béo trong tế bào vi tảo. Khi tăng cƣờng độ chiếu sáng, hàm lƣợng các PUFA nhƣ C20:4 và C20:5 giảm theo hàm số mũ, đồng thời hàm lƣợng C16:0 và C16:1 tăng lên. Những kết quả này đã đƣợc kiểm tra thông qua nuôi cấy điều kiện ổn định liên tục ở các mức độ chiếu sáng khác nhau. Khi nuôi ở điều kiện ánh sáng GLL, hàm lƣợng acid béo C20:4 và C20:5 đạt khá cao, lần lƣợt là 7.8 và 37.6%, hàm lƣợng C16:0 và C16:1 thấp. Khi nuôi ở điều kiện ánh sáng GSL và PIL thì hàm lƣợng C16:0 và C16:1 cao hơn, trong khi phần trăm C20:4 và C20:5 giảm mạnh. - Sự tổng hợp lipid Quá trình đồng hóa CO2 tạo thành các loại lipid trong tế bào vi tảo cũng phụ thuộc nhiều vào mức độ chiếu sáng. Dƣới điều kiện ánh sáng yếu, chỉ có 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 35 26% là triacylglycerol và tới 40% là các galactolipid, trong đó 26% là monogalactosyl diacylglycerol và 14% là digalactosyl diacylglycerol. Dƣới điều kiện ánh sáng bão hòa (GSL), sự tổng hợp triacylglycerol tăng lên và hàm lƣợng tổng galactolipid giảm xuống. Xu hƣớng này vẫn tiếp tục khi tăng mức độ chiếu sáng đến mức ức chế (PIL), cụ thể là chiếu sáng ở 550µmol /m2s thì Nannochloropsis sp. sẽ tổng hợp 50% triacylglycerol và chỉ có 24% là galactolipid, trong đó hàm lƣợng digalactosyl diacylglycerol chỉ giảm nhẹ, còn hàm lƣợng monogalactosyl diacylglycerol giảm mạnh. Phần carbon lipid còn lại chiếm khoảng 24-36% hàm lƣợng carbon lipid chính là các phospholipid, sắc tố và một số loại lipid khác chƣa xác định. Hình 3. 5: Thành phần acid béo của Nannochloropsis sp. khi nuôi cấy trong điều kiện ổn định liên tục tại ba mức độ chiếu sáng: GLL 35µmol /m2s, GSL 290µmol /m 2 s và PIL 550µmol /m 2 s [S8] - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Chất lƣợng của biodiesel có liên quan mật thiết với tính chất nguồn cung cấp lipid. Nhƣ đã nêu ở phần trên, nguồn lipid phù hợp để sản xuất biodiesel là nguồn lipid có thành phần lipid chủ yếu là các triacylglycerol với hàm lƣợng các acid béo C16:1 và C18:1 càng cao càng lý tƣởng, hàm lƣợng các acid béo chƣa no mang nhiều nối đôi nhƣ C20:4 và C20:5 nằm trong một tỷ lệ giới hạn nhất định, thành phần acid béo lại phụ thuộc vào mức độ chiếu sáng. Do đó, khi nuôi cấy Nannochloropsis oculata nhằm mục đích cung cấp lipid sản xuất biodiesel cần phải thiết lâp chế độ chiếu sáng sao cho ánh sáng tối thiểu 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 36 đạt mức bão hòa sinh trƣởng (GSL). Tại mức độ chiếu sáng GSL (290 µmol /m 2 s), sinh khối thu đƣợc là hiệu quả nhất, hàm lƣợng C16:1 và C18:1 cao, tuy nhiên triacylglycerol chƣa cao lắm. Nhƣng nếu chiếu sáng ở mức PIL (550 µmol /m 2 s), ta thấy hàm lƣợng C16:1 và C18:1 có xu hƣớng giảm còn C20:5 lại bắt đầu tăng trở lại mặc dù lƣợng triacylglycerol đƣợc tổng hợp nhiều hơn. Chính vì vậy, để đạt hiệu quả tối ƣu trong nuôi cấy Nannnochloropsis oculata, hƣớng chiếu sáng đƣợc đề nghị sử dụng là trong khoảng ánh sáng bão hòa cao, gần đạt đến mức ức chế, nghĩa là vào khoảng 400 - 500 µmol /m2s. 3.2.3. Yếu tố độ mặn Hanhua Hu và Kunshan Gao khảo sát sự ảnh hƣởng của độ mặn môi trƣờng lên sự sinh trƣởng và thành phần các acid béo của Nannochloropsis sp. Thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ sau: Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng f/2AW, nhiệt độ 220C, mức độ sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 cao (2800µL/L), mức độ chiếu sáng 50µmol/m2s, thu mẫu vào ngày thứ 10 sau khi cấy giống. Điều chỉnh độ mặn của nƣớc biển nhân tạo bằng NaCl ở các nồng độ nhƣ sau: 0.20, 0.36, 0.72, 1 hoặc 1.5M. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần [31]. - Sự sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid trong tế bào Nannochloropsis sp. phát triển tốt nhất trong môi trƣờng có độ mặn là 31g/L (0.36M NaCl). Qua các nồng độ muối khảo sát, loài vi tảo này thể hiện khả năng duy trì tốt sự sinh trƣởng trong khoảng độ mặn 22 – 49g/L (0.2-0.72M NaCl) [31]. Hàm lƣợng lipid trong Nannochloropsis sp. khi đƣợc nuôi cấy ở khoảng độ mặn từ 22 – 49g/L xấp xỉ khoảng 11%. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng lên đến 64g/L thì hàm lƣợng lipid tăng lên 18%, nghĩa là tăng hơn 50% so với các độ mặn thấp hơn [31]. Bảng 3. 4: Sản lƣợng sinh khối và hàm lƣợng lipid của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau [31] NaCl (M)/Độ mặn (g/L) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) 0.20/22 275 ± 13.9 12 ± 0.4 0.36/31 308 ± 15.4 11 ± 0.3 0.72/49 237 ± 10.3 11 ± 0.4 1.00/64 36 ± 5.1 18 ± 0.6 1.50/88 10 ± 2.3 - 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 37 - Thành phần các acid béo Các acid béo chiếm ƣu thế trong tế bào Nannochloropsis sp. là acid palmitic (C16:0), acid palmitoleic (C16:1) và EPA (C20:5ω3), bất kể là sinh trƣởng trong môi trƣờng nào. Tỷ lệ phần trăm acid oleic (C18:1) có xu hƣớng tăng khi tăng độ mặn môi trƣờng nuôi cấy. Trong khi đó, TFA lại có xu hƣớng giảm [31]. Tỷ lệ % của PUFAs giảm khi tăng nồng độ muối, cụ thể đạt giá trị là 39%, 36%, 35%, và 17% tƣơng ứng với các độ mặn 22, 31, 49 và 64g/L. Bảng 3. 5: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau [31] NaCl (M)/Độ mặn (g/L) 0.20/22 0.36/31 0.72/49 1.00/64 TFA (mg/g DW) 90 ± 3.3 78 ± 2.5 46 ± 0.9 11 ± 0.7 Acid béo C14:0 3.1 ± 0.3 3.3 ± 0.1 4.1 ± 0.2 9.0 ± 0.3 C16:0 25.3 ± 1.1 24.9 ± 1.5 22.1 ± 1.0 29.8 ± 1.9 C16:1 24.0 ± 0.7 26.0 ± 1.2 27.8 ± 0.9 23.6 ± 0.8 C18:0 Tr Tr Tr Tr C18:1 4.5 ± 0.2 4.6 ± 0.3 6.2 ± 0.5 17.8 ± 1.1 C18:2 6.7 ± 0.3 7.8 ± 0.8 6.3 ± 0.1 4.7 ± 0.2 C20:1 2.6 ± 0.3 3.5 ± 0.2 3.2 ± 0.1 Tr C20:4 4.1 ± 0.1 4.0 ± 0.1 4.9 ± 0.2 3.9 ± 0.4 C20:5 27.0 ± 0.5 23.6 ± 0.9 23.7 ± 1.1 8.4 ± 0.4 C22:6 Tr Tr Tr Tr Các loại khác 1.7 ± 0.3 1.5 ± 0.5 1.5 ±0.6 1.7 ± 0.1 Tr: trace, giá trị vết, dƣới 1%. - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Mục tiêu sản xuất biodiesel gắn liền với năng suất lipid trong quá trình nuôi cấy vi tảo. Vì vậy, mặc dù tại nồng độ muối cao (64g/L), hàm lƣợng C18:1 tăng cao đáng kể và C20:5 giảm mạnh, hàm lƣợng C16:0 và C16:1 không có sự biến đổi mạnh, nhƣng sản lƣợng sinh khối khô Nannochloropsis sp. lại quá thấp (36mg/L) nên không thể đáp ứng nhu cầu lipid trong sản xuất. Tế bào sinh trƣởng trong môi trƣờng có độ mặn 31 và 49g/L khi so với độ mặn 22g/L thì hàm lƣợng C20:5 có xu hƣớng giảm nhẹ, C18:1 và C16:1 lại 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 38 tăng. Mức độ sinh trƣởng trong môi trƣờng độ mặn 31g/L là cao nhất (sinh khối khô đạt 308mg/L). Mức độ sinh trƣởng của tế bào trong môi trƣờng độ mặn 49g/L cũng khá cao (237mg/L). Do đó có thể lựa chọn hai mức độ mặn này để nuôi cấy Nannochloropsis oculata nhằm thu lipid. Để có thể chọn đƣợc nồng độ muối phù hợp nhất, môi trƣờng nuôi cấy cần đƣợc khảo sát hai nồng độ muối trên kết hợp với các yếu tố khác nhƣ nồng độ nitrogen, phosphorus và CO2, nhiệt độ và mức độ chiếu sáng. 3.2.4. Yếu tố thành phần môi trƣờng 3.2.4.1. Thành phần carbon Các loài vi tảo sống trong đại dƣơng có khả năng quang hợp cao và dễ dàng đƣợc nuối cấy trong môi trƣờng nƣớc biển vốn hòa tan một lƣợng lớn CO2 [72]. Sự cố định CO2 nhờ vào quá trình quang hợp của vi tảo đồng thời chuyển hóa sinh khối thành dạng nhiện liệu lỏng đƣợc xem là một quá trình đơn giản và rất có giá trị đối với sự luân chuyển CO2 hiện nay, tạo nên một giải pháp an toàn cho môi trƣờng [79]. Nannochloropsis oculata là một loài vi sinh vật đáng đƣợc quan tâm trong lĩnh vực công nghệ sinh học về các đối tƣợng thuộc đại dƣơng vì N. oculata có hàm lƣợng lipid cao. Sheng – Yi Chiu và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ CO2 trong dòng khí bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy lên sản lƣợng sinh khối và sự tích lũy lipid ở N. oculata, qua đó đánh giá hiệu quả năng suất lipid khi nuôi cấy theo mẻ và bán liên tục N. oculata [72]. Vi tảo N. oculata đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng f/2 [72], thiết bị quang phản ứng hình trụ bằng thủy tinh, nhiệt độ 26 ± 10C, dƣới ánh sáng 300µmol/m 2 s liên tục từ các đèn huỳnh quang ít tỏa nhiệt. Khí cung cấp vào (đƣợc lọc qua màng lọc 0.22µm) có các nồng độ CO2 khác nhau: 2%, 5%, 10% và 15%. Khí đƣợc sục từ đáy thiết bị với tốc độ sục là 200mL/phút (tƣơng đƣơng 0.25vvm) [72]. Sau đó, Sheng – Yi Chiu và các cộng sự đã rút ra đƣợc một số kết luận sau: - Sinh trƣởng của N. oculata dƣới các nồng độ CO2 khác nhau khi nuôi cấy theo mẻ [72] Dịch nuôi cấy theo mẻ đƣợc đặt ở 26 ± 10C, chiếu sáng liên tục 300µmol/m 2 s, sục khí bởi không khí (nồng độ CO2 xấp xỉ 0.03%), 2%, 5%, 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 39 10% và 15% CO2. Môi trƣờng đƣợc lấy mẫu sau mỗi 8h. Đƣờng cong sinh trƣởng của mỗi thí nghiệm đƣợc thể hiện trong đồ thị sau: Hình 3. 6: Ảnh hƣởng của nồng độ sục khí CO2 lên sự sinh trƣởng của N. oculata Mức độ sinh trƣởng đặc trƣng khi sục không khí và 2% CO2 lần lƣợt là 0.194/ngày và 0.571/ngày. Qua đồ thị ta thấy mức độ sục khí 2% CO2 kích thích sự sinh trƣởng của N. oculata cao nhất. Không chỉ có sinh khối, mà mức độ sinh trƣởng đặc trƣng khi nuôi cấy ở 2% CO2 cũng cao hơn khi nuôi N. oculata bằng không khí. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hu và Gao [33]. N. oculata sinh trƣởng tốt nhất trong môi trƣờng giàu CO2 hơn trong không khí, có lẽ là nhờ nguồn carbon cung cấp cho vi tảo không bị hạn chế. Tuy nhiên, khi hàm lƣợng CO2 quá cao, 5 – 15%, sẽ gây ra sự ức chế đáng kể [72]. - Hàm lƣợng lipid của vi tảo tại các phase sinh trƣởng khác nhau [72] Hàm lƣợng lipid trong vi tảo đƣợc đo ở phase sinh trƣởng, phase cân bằng sớm và phase cân bằng. Các kết quả cho thấy hàm lƣợng lipid có mối liên hệ chặt chẽ với phase sinh trƣởng. Cụ thể là hàm lƣợng lipid trong N. oculata tại phase sinh trƣởng, phase cân bằng sớm và phase cân bằng lần lƣợt là 30.8, 39.7 và 50.4%. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng lipid tích lũy trong tế bào tăng lên khi N. oculata bƣớc vào phase cân bằng. Liên hệ với nồng độ nitrate trong dịch nuôi cấy, các mẫu đƣợc đem xác định sự giảm hàm lƣợng nitrate tại các phase khác nhau, trong đó hàm lƣợng nitrate giảm dần từ phase sinh trƣởng trở đi, điều này ám chỉ rằng lƣợng nitrate bị thiếu hụt khi dịch nuôi cấy bƣớc vào phase cân bằng. Sự thiếu hụt chất dinh dƣỡng, cụ thể là thiếu hụt nitrogen đã làm gia tăng mức độ tổng hợp lipid. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 40 - Ảnh hƣởng của nồng độ CO2 lên sự sinh trƣởng tế bào trong nuôi cấy bán liên tục [72] Trƣớc khi nuôi cấy trong môi trƣờng sục khí với nồng độ CO2 cao, N. oculata đƣợc trải qua giai đoạn thích nghi trong môi trƣờng 2% CO2 trƣớc khi cấy vào thiết bị nuôi cấy bán liên tục. Thêm vào đó, lƣợng giống cấy vào môi trƣờng có mật độ tế bào cao (xấp xỉ 0.4g/L). Hệ thống bán liên tục đƣợc vận hành trong 8 ngày và sự sinh trƣởng của tế bào đƣợc giữ ổn định bằng cách thay ½ lƣợng môi trƣờng mỗi ngày, duy trì dịch nuôi cấy luôn ở phase sinh trƣởng. Kết quả là mức độ sinh trƣởng của N. oculata khi sục khí với nồng độ CO2 2%, 5%, 10% và 15% là tƣơng đƣơng nhau. Mức độ sinh trƣởng đặc trƣng trung bình và mật độ tế bào tối đa (nồng độ sinh khối) lần lƣợt đạt từ 0.683 đến 0.733/ngày và 0.745 và 0.928g/L tại các nồng độ CO2 khác nhau. Khi sục khí với hàm lƣợng CO2 cao (5 – 15%) có thể gây ảnh hƣởng không tốt lên sự sinh trƣởng tế bào nhƣ thể hiện trong đồ thị nêu ở trên. Nhƣng khi tăng mật độ tế bào dịch cấy và trải qua quá trình thích nghi trƣớc với nồng độ CO2 2% thì có thể cải thiện đƣợc khả năng sinh trƣởng của vi tảo trong môi trƣờng sục khí với hàm lƣợng CO2 cao. Hình 3. 7: Sự sinh trƣởng của N. oculata khi nuôi cấy bán liên tục trong môi trƣờng sục khí có chứa 2%, 5%, 10%, 15% CO2 [72] 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 41 Kết quả này chứng tỏ rằng khi gia tăng mật độ tế bào trong dịch cấy và tạo điều kiện cho tế bào thích nghi trong môi trƣờng có nồng độ CO2 lý tƣởng thì quá trình nuôi cấy với nồng độ CO2 cao sau đó sẽ không gặp phải những tác dụng tiêu cực lên sự sinh trƣởng của tế bào vi tảo. - Sinh khối và năng suất lipid trong nuôi cấy bán liên tục Trong hệ thống nuôi cấy bán liên tục, N. oculata đƣợc thu mẫu vào thời gian trƣớc khi dịch nuôi cấy đƣợc thay ½ môi trƣờng mỗi ngày để xác định sinh khối và năng suất lipid. Bảng 3. 6: Năng suất sinh khối và lipid của N. oculata trong hệ thống nuôi cấy bán liên tục với các hàm lƣợng CO2 khác nhau [72] Nồng độ CO2 Tổng năng suất sinh khối (khối lƣợng tế bào khô, g/L.ngày) Tổng năng suất lipid (g/L.ngày) Phần trăm hàm lƣợng lipid (%) 2% 0.480 ± 0.029 0.142 ± 0.049 29.7 ± 2.0 5% 0.441 ± 0.044 0.113 ± 0.035 26.2 ± 1.9 10% 0.398 ± 0.069 0.097 ± 0.026 24.6 ± 1.7 15% 0.372 ± 0.022 0.084 ± 0.021 22.7 ± 1.9 (Hệ thống nuôi cấy bán liên tục thực hiện trong 8 ngày, ½ môi trƣờng mới đƣợc thay mỗi ngày. Thể tích thiết bị quang phản ứng là 800mL, thể tích dịch thải mỗi ngày là 400mL. Số liệu ±SD đƣợc đo mỗi ngày từ ngày 1 tới ngày 8). Khi tăng nồng độ CO2 từ 2 tới 15%, cả sinh khối lẫn năng suất lipid đều có xu hƣớng giảm. Khi nồng độ CO2 là 2%, 5%, 10%, 15% thì pH của môi trƣờng lần lƣợt tƣơng ứng là 7.8, 7.7, 7.3 và 7.0. Quá trình đồng hóa carbon để tổng hợp lipid sẽ giảm khi pH môi trƣờng giảm [90]. Điều này có thể là do khi môi trƣờng có pH càng cao thì lƣợng bicarbonate có thể dùng đƣợc cho sự tổng hợp mạch carbon trong lipid càng nhiều. Điều này nói lên rằng sự tích lũy lipid trong N. oculata có thể chủ yếu bị ảnh hƣởng bởi pH và hàm lƣợng lipid trong tế bào vi tảo sẽ giảm khi pH giảm [72]. - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Nannochloropsis oculata nhạy cảm với nồng độ CO2 sục vào môi trƣờng nuôi cấy. Môi trƣờng giàu CO2 (2%) so với sục không khí sẽ làm tăng sự sinh trƣởng của N. oculata, nhƣng khi môi trƣờng chứa nhiều CO2 hơn nữa 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 42 (5-15%) thì loài vi tảo này lại bị ức chế mạnh. Tuy nhiên, khi nuôi cấy bán liên tục lại cho thấy rằng sự ức chế này hoàn toàn có thể khắc phục đƣợc nếu cho N. oculata trải qua quá trình thích nghi với nồng độ CO2 2% trƣớc khi sục khí ở các chế độ từ 5-15%. Vì vậy, để nuôi cấy N. oculata nhằm thu năng suất lipid lớn, tối ƣu nhất nên nuôi cấy ở nồng độ CO2 2%, lƣợng sinh khối và lipid đều đạt giá trị cực đại so với các nồng độ khác. Tuy nhiên, nếu muốn kết hợp nuôi cấy N. oculata vừa phục vụ mục đích sản xuất biodiesel vừa lợi dụng đặc tính quang hợp cao của loài này để cố định CO2, điều chỉnh chu trình tuần hoàn CO2 nhằm cải thiện tình trạng ô nhiễm môi trƣờng, N. oculata có thể đƣợc nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao khi đã qua quá trình thích nghi với môi trƣờng giàu CO2 so với không khí. 3.2.4.2. Thành phần nitrogen - Thí nghiệm của Attilio và các cộng sự [5] Nannochloropsis oculata đƣợc nuôi trong môi trƣờng Guillard f/2, nguồn cung cấp carbon là CO2 trong không khí (khoảng 300ppm), nguồn cung cấp nitrogen là NaNO3, nuôi trong 14 ngày, dƣới điều kiện ánh sáng liên tục 70.0µE/m2s, nhiệt độ môi trƣờng là 200C. Nồng độ nitrogen thích hợp để nuôi N. oculata theo Guillard là 0.300g/L. Do đó, để khảo sát ảnh hƣởng của sự thiếu hụt nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy lên sự sinh trƣởng và thành phần lipid trong tế bào vi tảo, Attilio và các cộng sự đã thí nghiệm với các nồng độ NaNO3 là 0.300, 0.150, và 0.075g/L [5]. Bảng 3. 7: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của N. oculata ở các nồng độ NaNO3 khác nhau [5] NaNO3(g/L) µ-Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 0.300 0.13±0.00 7.88±0.21 10.01±0.16 0.150 0.10±0.00 13.01±0.39 13.61±1.10 0.075 0.10±0.00 15.86±0.59 16.41±0.11 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 43 Hình 3. 8: Phần trăm các loại acid béo methyl ester trên tổng lƣợng acid béo methyl ester (g/100gFAME) của N. oculata tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [5] (FAME: fatty acid methyl ester) - Thí nghiệm của Hanhua Hu và Kunshan Gao Một thí nghiệm khác của Hanhua Hu và Kunshan Gao nhằm khảo sát nồng độ nitrate đối với sự sinh trƣởng, tích lũy lipid, và thành phần lipid trong tế bào cũng cho thấy rằng sự thiếu hụt nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng đáng kể lên các đặc điểm hóa sinh của loài vi tảo này. Thí nghiệm của Hu và Gao đƣợc thiết lập ở các chế độ nhƣ sau: tế bào vi tảo Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng 220C, sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 là 2800µL/L, mức độ chiếu sáng 50µmol/m 2s, hàm lƣợng nitrate đƣợc điều chỉnh dựa theo môi trƣờng f/2AW cơ bản: 150 (hàm lƣợng N thấp), 600 (hàm lƣợng N trung bình) và 3000µM NO3 - (hàm lƣợng N cao) với 36µM PO4 3- . Dùng NaNO3 để điều chỉnh hàm lƣợng N. Mỗi thí nghiệm đƣợc lập lại 3 lần [31]. Khi tăng nồng độ nitrate từ 150µM đến 600µM, sản lƣợng sinh khối của dịch nuôi cấy tăng 39%. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ này lên cao 3000µM thì lƣợng sinh khối lại có xu hƣớng giảm nhẹ [31]. Hàm lƣợng lipid trong vi tảo tăng cao khi nồng độ nitrate giảm mạnh. Lƣợng acid béo tổng tăng đáng kể với nồng độ nitrate thấp. Trong đó, hàm lƣợng C18:1, C16:1 và C16:0 có xu hƣớng tăng khi nồng độ nitrate giảm, còn acid C20:5 thì lại giảm khi nồng độ nitrate trong môi trƣờng thấp. Hàm lƣợng của PUFAs lần lƣợt đạt 12%., 23%, 41% tƣơng ứng với các nồng độ N thấp, trung bình và cao [31]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 44 Tuy nhiên, hàm lƣợng C18:1 trong kết quả của Hu và Gao có chút khác biệt so với trong thí nghiệm của Attilio và các cộng sự (C18:1 giảm khi giảm nồng độ nitrate). Sự khác biệt này có thể là do hai nghiên cứu thiết lập tại điều kiện nuôi cấy khác nhau (ánh sáng và nhiệt độ). Thêm vào đó có thể do Nannochloropsis sp. có vài điểm không tƣơng đồng với Nannochloropsis oculata. Thực tế, C18:1 chỉ là thành phần thứ yếu trong thành phần lipid của loài vi tảo này. Vì vậy, sự khác biệt này đƣợc xem là ảnh hƣởng không đáng kể trong quá trình nghiên cứu. Bảng 3. 8: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [31] NaNO3 (µM) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) 150 220 ± 10.4 62 ± 2.8 600 305 ± 20.5 23 ± 0.9 3000 296 ± 15.6 13 ± 0.6 Bảng 3. 9: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [31] NaNO3 (µM) 150 600 3000 TFA (mg/g DW) 403 ± 8.5 136 ± 5.7 105 ± 5.3 Acid béo C14:0 3.3 ± 0.2 3.7 ± 0.2 3.6 ± 0.3 C16:0 38.2 ± 1.2 33.9 ± 0.8 22.7 ± 1.4 C16:1 28.3 ± 0.9 23.7 ± 0.6 22.7 ± 1.1 C18:0 Tr Tr Tr C18:1 16.4 ± 0.8 13.4 ± 0.6 4.1 ± 0.1 C18:2 2.7 ± 0.5 4.2 ± 0.1 7.0 ± 0.8 C20:1 Tr Tr 3.3 ± 0.5 C20:4 1.1 ± 0.1 2.5 ± 0.2 3.6 ± 0.1 C20:5 7.9 ± 0.3 15.7 ± 0.8 29.9 ± 0.9 C22:6 Tr Tr Tr Các loại khác Tr 1.1 ± 0.2 2.3 ± 0.3 Tr: trace, giá trị vết, dƣới 1%. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 45 - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Qua số liệu thu đƣợc ta thấy rằng, N. oculata có mức sinh trƣởng giảm khi giảm nồng độ NaNO3 và hàm lƣợng lipid thì gần nhƣ tăng gấp đôi. Kết quả này chứng tỏ rằng đây là một loài vi tảo phù hợp với mục tiêu nuôi cấy để sản xuất biodiesel, nhiệm vụ của các nhà nghiên cứu chính là tìm ra điều kiện môi trƣờng tối ƣu sao cho mức sinh trƣởng của vi tảo chỉ giảm nhẹ song hàm lƣợng lipid trong tế bào lại gia tăng cách đáng kể [5]. Thành phần lipid trong tế bào N. oculata có tỷ lệ các acid béo chƣa no mang nhiều nối đôi khá cao, vì vậy để biodiesel sản xuất từ loài vi tảo này đạt tiêu chuẩn sử dụng cho các phƣơng tiện động cơ thì biodiesel cần phải trải qua quá trình xử lý bổ sung nhƣ quá trình hydro hóa hoặc sử dụng dƣới dạng hỗn hợp với biodiesel giàu các acid béo bão hòa. Mặt khác cũng có thể khắc phục bằng cách áp dụng sự giảm nồng độ nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy kết hợp với các yếu tố khác có tác dụng tác động làm thay đổi thành phần lipid trong tế bào vi tảo nhƣ yếu tố ánh sáng bão hòa và yếu tố nhiệt độ môi trƣờng. Khi đó hàm lƣợng các acid béo bão hòa và acid béo chƣa bão hòa mang một nối đôi nhƣ C16:1 sẽ tăng lên rõ rệt, và biodiesel sản xuất từ vi tảo N. oculata sẽ đạt chất lƣợng nhƣ tiêu chuẩn. Trong thí nghiệm của Hu và Gao, hàm lƣợng nitrate trong môi trƣờng nuôi cấy đƣợc khảo sát ở mức độ thấp hơn trong thí nghiệm của Attilio. Mức thấp nhất là 150µM, tƣơng đƣơng 0.013g/L. Trong khi mức thấp nhất theo khảo sát của Attilio là 0.075g/L. Và kết quả của Hu và Gao cho thấy hàm lƣợng lipid trong tế bào vi tảo tăng cao hơn rất nhiều so với thí nghiệm của Attilio, vào ngày thứ 10 nuôi cấy, năng suất lipid đạt tƣơng đƣơng khoảng 136.6mg/L. Thành phần lipid trong trƣờng hợp nồng độ nitrate đạt 150µM cũng khá phù hợp với yêu cầu sản xuất biodiesel (hàm lƣợng C16:1, C18:1 cao, hàm lƣợng C20:5 giảm mạnh). 3.2.4.3. Thành phần phosphorus Thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hƣởng của yếu tố dinh dƣỡng phosphorus trong môi trƣờng nuôi cấy Nannochloropsis sp. đƣợc Hanhua Hu và Kunshan Gao thiết kế nhƣ sau: tế bào vi tảo Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng ở 220C, sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 là 2800µL/L, mức độ chiếu sáng 50µmol/m2s, hàm lƣợng phosphate đƣợc điều chỉnh dựa 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 46 theo môi trƣờng f/2AW cơ bản: 6 (hàm lƣợng P thấp), 25 (hàm lƣợng P trung bình) và 120µM PO4 3- (hàm lƣợng P cao) với 882µM NO3 - . Dùng NaH2PO4 để điều chỉnh hàm lƣợng P. Mỗi thí nghiệm đƣợc lập lại 3 lần [31]. - Sự sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid trong tế bào Khi tăng nồng độ phosphate trong môi trƣờng nuôi cấy từ 6µM đến 25µM thì sản lƣợng sinh khối tăng 34%. Tuy nhiên nếu tăng nồng độ phosphate lên cao hơn nữa, 120µM thì sản lƣợng sinh khối có sự giảm nhẹ [31]. Hàm lƣợng lipid tăng khi giảm nồng độ phosphate trong môi trƣờng nuôi cấy [H4]. Khi nồng độ phosphate cao (120µM), hàm lƣợng lipid giảm mạnh, chỉ còn 11% w/w sinh khối khô. Hàm lƣợng lipid giảm 24% khi tăng nồng độ phosphate từ 6µM đến 25µM. Bảng 3. 10: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaH2PO4 khác nhau [31] NaH2PO4 (µM) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) 6 238 ± 15.3 25 ± 3.1 25 318 ± 17.2 19 ± 0.8 120 308 ± 19.7 11 ± 0.3 - Thành phần acid béo Khi môi trƣờng nuôi cấy có nồng độ phosphate cao, lƣợng acid béo tổng có xu hƣớng giảm mạnh. Khi hàm lƣợng phosphate tăng từ 6µM đến 25µM, lƣợng acid oleic (C18:1) giảm đáng kể, từ 21.6% giảm còn 4.4%. Khi tăng hàm lƣợng phosphate lên 120µM, C18:1 lại có xu hƣớng tăng, nhƣng tăng rất ít không đáng kể. Điều này cho thấy sự tăng C18:1 trong hỗn hợp acid béo bằng cách tăng nồng độ phosphate trong môi trƣờng nuôi cấy là không hiệu quả. Hàm lƣợng acid palmitic và acid palmitoleic (C16:0 và C16:1) không có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ phosphate trong môi trƣờng. Trong khi đó, hàm lƣợng EPA (C20:5) gia tăng nhiều khi nồng độ phosphate tăng từ 6µM đến 25µM, cụ thể là từ 12.8% tăng lên 27.9%. Nhƣng khi nồng độ phosphate tiếp tục tăng từ 25µM đến 120µM thì hàm lƣợng EPA vẫn giữ nguyên gần nhƣ không đổi. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 47 Bảng 3. 11: Thành phần acid béo (%w/w acid béo tổng) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaH2PO4 khác nhau [31] NaH2PO4 (µM) 6 25 120 TFA (mg/g DW) 148 ± 6.0 88 ± 3.5 29 ± 2.1 Acid béo C14:0 3.8 ± 0.1 4.3 ± 0.4 3.3 ± 0.1 C16:0 29.8 ± 1.5 25.3 ± 0.5 23.1 ± 0.7 C16:1 23.2 ± 0.2 24.0 ± 0.8 23.0 ± 0.9 C18:0 1.2 ± 0.1 Tr Tr C18:1 21.6 ± 1.3 4.4 ± 0.5 6.3 ± 0.7 C18:2 3.2 ± 0.4 5.1 ± 0.2 7.6 ± 0.6 C20:1 Tr 3.3 ± 0.2 1.9 ± 0.1 C20:4 2.5 ± 0.4 3.5 ± 0.2 4.4 ± 0.2 C20:5 12.8 ± 1.0 27.9 ± 1.3 27.4 ± 0.5 C22:6 Tr Tr Tr Các loại khác 1.1 ± 0.1 0.7 ± 0.3 1.7 ± 0.1 - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Kết quả trên cho thấy rằng tại nồng độ phosphorus 6µM, sự sinh trƣởng của Nannochloropsis sp. thấp hơn khi nuôi cấy trong môi trƣờng chứa nhiều phosphorus nhƣng hàm lƣợng lipid trong tế bào lại cao hơn (25%), do đó năng suất lipid không bị ảnh hƣởng đáng kể. Mặt khác, tại nồng độ phosphorus thấp, thành phần lipid trong tế bào vi tảo là phù hợp nhất với mục tiêu sản xuất biodiesel: hàm lƣợng C20:5 thấp, hàm lƣợng C16:0, C16:1 và C18:1 ở mức cao và ổn định. Sự giới hạn nồng độ phosphorus trong môi trƣờng cũng giúp giảm bớt chi phí dinh dƣỡng trong quá trình nuôi cấy. Vì vậy, việc nuôi cấy Nannochloropsis oculata nhằm sản xuất biodiesel sẽ đạt hiệu quả cao khi vi tảo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng hạn chế hàm lƣợng phosphorus, nồng độ khoảng 6µM NaH2PO4. 4. KẾT LUẬN 48 4. KẾT LUẬN Vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và sự thiếu hụt nguồn năng lƣợng trên toàn cầu đang là vấn đề thu hút rất nhiều sự quan tâm. Nguồn nhiên liệu hóa thạch sử dụng cho giao thông vận tải và các phƣơng tiện cơ khí theo dự tính sẽ cạn kiệt trong vòng 50 năm tới. Trong các loại nhiên liệu xăng dầu, diesel có một vai trò quan trọng và ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi. Chính vì vậy nhiệm vụ tìm ra một nguồn nhiên liệu mới có khả năng tái sinh và thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch là một nhiệm vụ cấp bách mang tính thời sự và lịch sử đối với các nhà khoa học. Và biodiesel đƣợc xem là một giải pháp khả thi, đáp ứng đƣợc các yêu cầu hiện tại. Biodiesel có thể đƣợc sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu nhƣ thực vật, động vật hay nguồn dầu phế thải. Nhƣng để đáp ứng đƣợc nhu cầu sử dụng, chi phí giá thành và không ảnh hƣởng tới sự đa dạng sinh học cũng nhƣ các hoạt động khác của con ngƣời (sự xâm lấn rừng và sự phân bố lại đất trồng), chỉ có vi tảo cho thấy có khả năng trở thành nguồn cung cấp lipid tối ƣu cho việc sản xuất biodiesel. Trong số các loài vi tảo đƣợc khảo sát cho mục đích nuôi cấy thu lipid phục vụ cho biodiesel của nhiều nhà khoa học, cũng nhƣ tham khảo qua nhiều tài liệu về đặc tính của các loài vi tảo, có thể dự đoán rằng Nannochloropsis oculata là một đối tƣợng rất có tiềm năng nhờ vào khả năng sinh trƣởng mạnh trong môi trƣờng quang tự dƣỡng, sự tích lũy lipid có thể tăng cao đáng kể dƣới các điều kiện stress môi trƣờng và thành phần lipid dễ dàng điều khiển thông qua điều kiện nuôi cấy. Hàm lƣợng carbon cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy vi tảo là rất quan trọng. Đối với điều kiện sục khí là không khí thì Nannochloropsis oculata sẽ bị thiếu hụt lƣợng carbon nên mức độ sinh trƣởng không tốt. Khi hàm lƣợng CO2 trong không khí đạt 2% thì mức độ sinh trƣởng của Nannochloropsis oculata đạt giá trị rất cao. Trong suốt các khoảng nồng độ CO2 khảo sát (5-15%), nồng độ 2% CO2 chính là nồng độ tối ƣu để nuôi cấy N. oculata. Tuy nhiên, khi loài vi tảo này đƣợc trải qua quá trình huấn luyện thích nghi với nồng độ CO2 2% trƣớc, sau đó nuôi cấy trong môi trƣờng có hàm lƣợng CO2 cao thì vẫn có thể duy trì mức sinh trƣởng khá tốt. Vì vậy có thể kết hợp việc nuôi cấy N. oculata vừa thu lipid sản xuất biodiesel vừa có tác dụng cố định CO2 cải thiện sự ô nhiễm môi trƣờng. Khi đƣợc nuôi dƣỡng trong môi trƣờng sục khí liên tục với hàm lƣợng CO2 thích hợp, sự sinh trƣởng của Nannochloropsis oculata không bị giới hạn bởi nguồn cung cấp carbon. Lúc này, chính hàm lƣợng nitrogen và phosphorus là yếu tố 4. KẾT LUẬN 49 quan trọng mang tích chất quyết định đến mức độ sinh trƣởng của vi tảo. Sự gia tăng nồng độ nitrogen và phosphorus trong môi trƣờng nuôi cấy kích thích sự tăng trƣởng mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy. Tuy nhiên, qua kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học đi trƣớc, có thể dự đoán rằng mức độ sinh trƣởng của Nannochloropsis oculata tăng đáng kể khi điều kiện dinh dƣỡng (N và P) tăng từ nồng độ thấp đến trung bình, nhƣng khi nồng độ này tăng cao hơn nữa, môi trƣờng nuôi cấy trở thành môi trƣờng giàu dinh dƣỡng thì mức độ sinh trƣởng của vi tảo gần nhƣ không tăng thêm mà lại có xu hƣớng giảm nhẹ. Điều này cho thấy rằng, Nannochloropsis oculata phù hợp khi sống trong môi trƣờng có hàm lƣợng nitrogen và phosphorus ở mức trung bình. Gia tăng hàm lƣợng một trong hai hoặc cả hai nguyên tố này đều gây ảnh hƣởng đến sự cân bằng của tỷ lệ C:N hoặc N:P, do đó tác động đến sự sinh trƣởng của tế bào. Khi hàm lƣợng nitrogen hoặc phosphorus trong môi trƣờng nuôi cấy bị hạn chế, vi tảo Nannochloropsis sp. có xu hƣớng gia tăng sự tích lũy lipid trong tế bào. Xu hƣớng này không đúng đối với tất cả các loài vi tảo, nhƣng theo nghiên cứu của Shifrin and Chisholm các loài tảo xanh thƣờng cho thấy khả năng gia tăng sự tích lũy lipid trong điều kiện nuôi cấy thiếu hụt nitrogen [S11]. Hàm lƣợng lipid trong tế bào Nannochloropsis sp. tăng gần gấp 4 lần khi nuôi trong môi trƣờng có mức độ N thấp so với nuôi trong môi trƣờng có mức độ N cao [H4]. Tuy nhiên chƣa tìm thấy tài liệu nào khảo sát đồng thời sự thiếu hụt của cả hai yếu tố dinh dƣỡng N và P lên quá trình sinh trƣởng và tích lũy lipid đối với vi tảo. Nannochloropsis oculata là loài vi tảo có thể sống trong một khoảng độ mặn rộng vì loài tảo này có thể sinh sống trong môi trƣờng nƣớc mặn, nƣớc lợ hoặc thậm chí nƣớc ngọt. Tuy nhiên, qua kết quả khảo sát của Hu và Gao đối với Nannochloropsis sp. có thể dự đoán rằng, Nannochloropsis oculata sẽ bị ức chế sinh trƣởng đáng kể trong môi trƣờng có độ mặn quá cao (trên 60g NaCl/L), sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng có độ mặn từ 20-50g/L, sinh trƣởng tối ƣu khi độ mặn khoảng 30g/L. Trong khoảng độ mặn phù hợp cho Nannocloropsis oculata phát triển sinh khối nhiều thì dƣờng nhƣ không ảnh hƣởng đáng kể tới sự tích lũy lipid trong tế bào vi tảo, dao động trong khoảng 11-12%w/w. Theo nghiên cứu của Renaud và các cộng sự đối với một số loài vi tảo [R7] thì nhiệt độ không thể hiện bất kỳ sự ảnh hƣởng nào lên sự tổng hợp lipid trong tế bào. Trong nghiên cứu của Zhu và các cộng sự [Z1], sự tổng hợp lipid trong vài loài vi tảo sẽ tăng khi tăng nhiệt độ, đối với loài Nitzschia paleacea [R7]. Tuy nhiên, 4. KẾT LUẬN 50 Nannochloropsis sp. lại cho thấy rất nhạy cảm với nhiệt độ môi trƣờng: ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu, lipid tích lũy trong tế bào đều có xu hƣớng tăng cao đáng kể, gần nhƣ hàm lƣợng lipid tăng gấp đôi trong tế bào vi tảo. Vì vậy, có thể dự đoán rằng khi Nannochloropsis oculata đƣợc nuôi trong môi trƣờng có nhiệt độ 25-270C thì mức độ sinh trƣởng của tế bào vẫn duy trì tốt và hàm lƣợng lipid trong tế bào cao hơn ở mức nhiệt độ tối ƣu. Điều kiện ánh sáng trong quá trình nuôi cấy đặc biệt có vai trò quan trọng trong mục tiêu nuôi cấy Nannochloropsis oculata nhằm sản xuất biodiesel. Chế độ chiếu sáng ảnh hƣởng sâu sắc đến thành phần lipid nội bào. Tế bào N. oculata trong điều kiện ánh sáng bình thƣờng (50µmol/m2s) rất giàu acid EPA (C20:5). Acid EPA về mặt dinh dƣỡng có giá trị cao nhƣng lại không phù hợp để sản xuất biodiesel. Tuy nhiên, thành phần lipid của N. oculata lại dễ dàng biến đổi tùy thuộc vào mức độ chiếu sáng. Qua nghiên cứu của Assaf Sukenik và Yael Carmeli, chế độ chiếu sáng đƣợc xác định là phù hợp với mục tiêu sản xuất biodiesel chính là chiếu sáng ở cƣờng độ cao, tối thiểu là ở mức ánh sáng bão hòa sự sinh trƣởng, tối đa là khi dịch nuôi cấy bắt đầu có dấu hiệu bị ức chế sinh trƣởng. Vì vậy, mật độ dòng photon nên nằm trong khoảng giá trị 400-500µmol/m2s. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Quang Khải. Những vấn đề phát triển năng lƣợng sinh khối của Việt Nam. Báo cáo tại Hội thảo Phát triển năng lượng bền vững ở Việt Nam. 2. Al-Widyan MI, Al-Shyoukh AO, 2002. Experimental evaluation of the transesterification of waste palm oil into biodiesel. Bioresour Technol, 85: 253–256. 3. Antia N. J., Bisalputra T., Cheng J.Y & Kalley, J.P., 1975. Pigment and cytological evidence for reclassification of Nannochloris oculata and Monallantis salina in the Eustigmatophyceae. Journal of Phycology, 11: 339- 343. 4. Antolin G, Tinaut FV, Briceno Y, 2002. Optimisation of biodiesel production by sunflower oil transesterification. Bioresour Technol, 83: 111–4. 5. Attilio Converti, Alessandro A. Casazza, Erika Y. Ortiz, Patrizia Perego, Marco Del Borghi, 2009. Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 48: 1146-1151. 6. Benemann JR, 1997. CO2 mitigation with microalgae systems. J Energy Convers Manage, 38: S475–9. 7. Bozbas K, 2008. Biodiesel as an alternative motorfuel: production and policies in the European Union. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 12: 542– 52. 8. Bouaid A, Martinez M, Aracil J, 2007. Long storage stability of biodiesel from vegetable and used frying oils. Fuel, 86: 2596–602. 9. Bunyakiat K, Makmee S, Sawangkeaw R, Ngamprasertsith S, 2006. Continuous production of biodiesel via transesterification from vegetable oil supercritical methanol. Energy Fuels, 20:812–7. 10. Cadenas A, Cabezndo S, 1998. Biofuels as sustainable technologies: perspectives for less developed countries. Technol Forecast Social Change, 58:83–103. 11. Canakci M, Sanli H, 2008. Biodiesel production from various feedstocks and their effects on the fuel properties. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnolog, 35: 431–441. 52 12. Chan Yoo, So-Young Jun, Jae-Yon Lee, Chi-Yong Ahn, Hee-Mock Oh, 2009. Selection of microalgae for lipid production under high levels carbon dioxide. Bioresource Technology. 13. Cheng-Wu Z, Zmora O, Kopel R, Richmond A, 2001. An industrial-size flat plate glass reactor for mass production of Nannochloropsis sp. (Eustigmatophyceae). Aquaculture , 195:35–49. 14. Chih-Hung Hsieh, Wen-Teng Wu, 2009. Cultivation of microalgae for oil production with a cultivation strategy of ure limitation. Bioresource Technology, 100: 3921-3926. 15. Chisti Y, 2007. Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv, 25: 294–306. 16. Danesi E. D. G., Rangel-Yagui C. O., Carvalho J. C. M., Sato S., 2002. An investigation of effect of replacing nitrate by urea in the growth and production of chlorophyll by Spirulina platensis. Biomass Bioenergy, 23: 261–269. 17. Demirbas A, 2003. Biodiesel fuels from vegetable oils via catalytic and non- catalytic super critical alcohol transesterifications and other methods: a survey. Energy Convers Manage, 44: 2093–109. 18. Demirbas A, 2002. Biodiesel from vegetable oils via transesterification in supercritical methanol. Energy Convers Manag, 43: 2349–56. 19. Dewulf J, Van Langenhove H, 2006. Renewables-based technology: sustainability assessment. John Wiley & Sons, Ltd . 20. European Environmental Agency (EEA), 2004. Greenhouse gas emission trends and projections in Europe 2004: progress by the EU and its Member States towards achieving their Kyoto Protocol targets, Roport N 0 5. Copenhagen, Denmark. 21. European Environmental Agency (EEA), 2007. Greenhouse gas emission trends and projections om Europe 2007: tracking progress towards Kyoto targets. European Environmental Agency (EEA) Report N 0 5. Copenhagen, Denmark. 22. Fabregas J., Garcia D., Morales E., Dominguez A., Otero A., 1998. Renewal rate of semi continuous cultures of the microalga Porphyridium cruentum modifies phycoerythrin, exopolysaccharide and fatty acid productivity. J. Ferment. Bioeng, 86: 477–481. 23. Falkowski, P.G, 1980. Primary Productivity in the sea. Plenum Press, New York, 99-119. 53 24. Fischer G, Schrattenholzer L, 2001. Global bioenergy potential through 2050. Biomass Bioenergy, 20: 151–9. 25. Fukuda H, Kondo A, Noda H, 2001. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J Biosci Bioeng, 92: 405–16. 26. Gerhard Knothe, 2008. “Designer” Biodiesel: Optimizing Fatty Ester Composition To Improve Fuel Properties. Energy and Fuels. 27. Gilbert R, Perl A, 2008. Transport revolutions: moving people and frieght without oil. Earthscan. 28. Guan Hua Huang, Feng Chen, Dong Wei, XueWu Zhang, Gu Chen, 2009. Biodiesel production by microalgal biotechnology. Applied Energy. 29. Guillard R. R. L., Ryther J.H, 1962. Studies of marine planktonic diatoms, I. Cyclotella nana (Hustedt) and Detonula confervacea (Cleve). Can. J. Microbiol, 8: 229-239. 30. Haas MJ, 2005. Improving the economics of biodiesel production through the use of low value lipids as feed stocks: vegetable oil soapstock. Fuel Process Technol,86: 1087–96. 31. Hanhua Hu, Kunshan Gao, 2006. Response of growth and fatty acid compositions of Nannochloropsis sp. to invironmental factors under elevated CO2 concentration. Biotechnol Lett, 28: 987 – 992. 32. Hibberd, D.J., 1980. Notes on the taxonomy and nomenclature of the algal classes Eustigmatophyceae and Tribophyceae (synonym Xanthophyceae). Botanical Journal of the Linnean Society (1981), 82: 93-119. 33. Hu H., Gao K., 2003. Optimization of growth and fatty acid composition of a unicellular marine picoplankton, Nannochloropsis sp., with enriched carbon sources. Biotechnol. Lett, 25: 421–425. 34. Illman A.M., Scragg A.H., Shales S.W., 2000. Increase in Chlorella strains calorific values when grown in low nitrogen medium. Enzyme Microb. Technol, 27: 631-635. 35. International Energy Agency (IEA), 2007. World Energy Outlook 2007. China and India Insights, Paris, France 36. Karen P. Fawley, Marvin W. Fawley, 2007. Observations on the Diversity and Ecology of Freshwater Nannochloropsis (Eustigmatophyceae), with Descriptions of New Taxa. Protist, 158: 325-336. 54 37. Khotimchenko S.V., Yakovleva I.M, 2005. Lipid composition of the red alga Tichocarpus crinitus exposed to different levels of photon irradiance. Phytochemistry, 66: 73-79. 38. Knothe G., 2006. Analyzing biodiesel: standards and other methods, J.Am. Oil Chem. Soc, 8: 823–833. 39. Krawczyk T, 1996. Biodiesel–alternative fuel makes inroads but hurdles remain. Inform, 7: 801–29. 40. Laherrere J, 2005. Forecasting production from discoverry. ASPO. 41. Lee J.S, Kim D.K, Lee J.P, Park S.C, Koh J.H, Cho H.S., Kim S.W., 2002. Effect of SO2 and NO on growth of Chlorella sp. KR-1. Biores. Technol, 82: 1- 4. 42. Li Y., Horsman M., Wang B., Wu N., Lan C.Q., 2008. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans. Appl. Microbiol. Biotechnol, 81: 629-636. 43. Liliana Rodolfi, Graziella Chini Zittelli và các cộng sự, 2008. Microalgae for Oil: Strain Selection, Induction of Lipid Synthesis and Outdoor Mass Cultivation in a Low-Cost Photobioreactor. Biotechnology and bioengineering. 44. Liu Z.Y., Wang G.C., Zhou B.C., 2008. Effect of iron of growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris. Biores. Technol, 99: 4717-4722. 45. Ma F, Hanna MA, 1999. Biodiesel production: a review. Bioresour Technol, 70: 1–15. 46. Maruyama I., Nakamura T., Matsubayashi T., Ando Y., Naeda T., 1986. Identification of the alga known as “marine chlorella” as a member of Eustigmatophyceae. Jap. J. Phycol, 34: 319-325. 47. Milne TA, Evans RJ, Nagle N, 1990. Catalytic conversion of microalgae and vegetable oil stop remium gasoline, with shape-selective zeolites. Biomass, 21: 219–32. 48. Minowa T, Yokoyama S, Kishimoto M, Okakurat T, 1995. Oil production from algal cells of Dunaliella tertiolecta by direct thermochemicall iquefaction. J Fuel, 74: 1735–8. 49. Minowa T, Yokoya SY, Kishimoto M, Okakura T, 1995. Oil production from algae cells of Dunaliella Tereiolata by direct thermochemical liquefaction. Fuel, 74: 1731–8. 55 50. Morais M.G.D, Costa J.A.V, 2007. Biofixation of carbon dioxide by Spirulina sp. and Scenedesmus obliquus cultivated in a three-stage serial tubular photobioreactor. J. Biotechnol, 129, 439-445. 51. Morais M.G.D, Costa J.A.V, 2007. Isolation and selection of microalgae from coal fired thermoelectric power plant for biofixation of carbon dioxide. Energy Convers. Manage, 48: 2169-2173. 52. Myers J., 1980. Primary Productivity in the Sea. Plenum Press, New York. 53. Naumann, E., 1921. Notizen sur Systematik der Süsswasseralgen. Arkiv for Botanik, 16(2): 1-19. 54. Oliveira M.A.S., Monteiro M.P., Robbs P.G., Leite S.G., 1999. Growth and chemical composition of Spirulina maxima and Spirulina platensis biomass at different temperatures. Aquacult. Int, 7:261–275. 55. Ormerod WG, Freund P, Smith A, Davison J, 2002. Ocean storage of CO2. IEA greenhouse gas R&D programme. UK: International Energy Agency. 56. Otero A., Garcia D., Morales E.D., Aran J., Fabregas J., 1997. Manipulation of the biochemical composition of eicosapentaenoic acid-rich microalga Isochrysis galbana in semi continuous cultures. Biotechnol. Appl. Bioc, 26: 171–177. 57. Pauline Spolaore, Claire Joannis-Cassan, Elie Duran, Arsène Isambert, 2006. Optimization of Nannochloropsis oculata growth using the response surface method. J Chem Technol Biotechnol, 81: 1049–1056. 58. Peterson CL, Reece DL, Thompson JC, Beck SM, Chase C, 1996. Ethyl ester of rapeseed used as a biodiesel fuel–a case study. BiomassBioenergy, 10: 331– 6. 59. Post A.F., Dubinsky Z., Wyman K., Falkowski P.G, 1985. Physiological responses of a marine planktonic diatom to transition in growth irradiance. Mar, Ecol, Prog. Ser, 25: 141-149. 60. Ranga Rao A., Sarada T.R., Ravishankar G.A., 2007. Influence of CO2 on growth and hydrocarbon production in Botryococcus braunii. J. Microbiol. Biotechnol, 17: 414-419. 61. Reinhardt G, Rettenmaier N, Koppen S, 2008. How sustainable are biofuels for transportation? Bioenergy: challenges and opportunities. International conference and exhibition on bioenergy. 62. Renaud S.M., Thinh L.V., Lambrinidis G., Parry D.L., 2002. Effect of temperature on growth, chemical composition and fatty acid composition of 56 tropical Australian microalgae grown in batch cultures. Aquaculture, 211: 195– 214. 63. Renaud S.M., Zhou H.C., Parry D.L., Thinh L.V., Woo K.C., 1995. Effect of temperature on the growth, total lipid content and fatty acid composition of recently isolated tropical microalgae Isochrysis sp., Nitzschia closterium, Nitzschia paleacea, and commercial species Isochrysis sp., (cloneT.ISO). J. Appl. Phycol, 7: 595–602. 64. Renewable Fuel Agency (RFA), 2008. The Gallagher review of the indirect effects of biofuels production. 65. Richardson K., Beardall J., Raven J.A, 1983. Adaptation of unicellular algae to irradiance: an analysis of strategies. New Phytol, 93: 157-91. 66. Rodolfi L., Zittelli G.C., Bassi N., Padovani G., Biondi N., Bonin G., Tredici, M.R., 2009. Microalgae for oil: strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor. Biotechnol. Bioeng, 102: 100-112. 67. Sarmidi Amin, 2009. Review on biofuel oil and gas production processes from microalgae. Energy Conversion and Management, 50: 1834–1840. 68. Scarlat N, Dallemand JF, Pinilla FG, 2008. Impact on agricultural land resources of biofuels production and use in the European Union. Bioenergy: challenges and opportunities. International conference and exhibition on bioenergy. 69. Sharp CA, 1996. Emissions and lubricity evaluation of rapeseed derived biodiesel fuels [R]. Final Report for Montana Department of Environmental Quality. Southwest Research Institute. 70. Sheehan J, Cambreco, Duffield J, Graboski M, Shapouri H, 1998. An overview of biodiesel and petroleum diesel life cycles. US Department of agriculture and Energy Report, 1–35. 71. Sheehan J, Dunahay T, Benemann J, Roessler P, 1998. A look back at the U.S. Department of Energy’s aquatic species program: biodiesel from algae. NREL/TP-580-24190, National Renewable Energy Laboratory, USA. 72. Sheng – Yi Chiu, Chien – Ya Kao, Ming – Ta Tsai, Seow – Chin Ong, Chiun – Hsun Chen, Chih – Sheng Lin, 2009. Lipid accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2 aeration. Bioresource Technology, 100: 833 – 838. 57 73. Shifrin NS, Chisholm SW, 1981. Phytoplankton lipids: interspecific differences and effects of nitrate, silicate and light-dark cycles. J Phycol, 17: 374–384. 74. Soletto D., Binaghi L., Lodi A., Carvalho J. C. M., Converti A., 2005. Batch and fed-batch cultivation of Spirulina platensis using ammonium sulphate and urea as nitrogen sources. Aquaculture, 243: 217–224. 75. Srivastava A, Prasad R ,2000. Triglycerides-based diesel fuels. Renew Sustain Energy Rev, 4: 111–133. 76. Sukenik A., Bennett J., Falkowski P.G, 1987. Light saturated photosynthesis limitation by electron transport or carbon fixation? Biochim. Biophys. Acta, 891: 205-15. 77. Sukenik A., Carmeli Y., 1989. Regulation of fatty acid composition by irradiance level in the Eutigmatophyte Nannochloropsis sp. J. Phycol, 25: 686- 692. 78. Takagi M., Karseno, Yoshida T., 2006. Effect of salt concentration on intra cellular accumulation of lipids and triacylglyceride in marine microalgae Dunaliella cells. J. Biosci. Bioeng, 101: 223–226. 79. Takagi M., Watanabe K., Yamaberi K., Yoshida T., 2000. Limited feeding of potassium nitrate for intracellular lipid and triglyceride accumulation of Nannochloris sp. UTEX LB1999. Appl. Microbiol. Biotechnol, 54: 112-117. 80. Teresa M.Mata, António A.Martins, Nidia. S., 2009. Caetano, Microalgae for biodiesel production and other application: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 757. 81. Thompson P.A., Guo M., Harrison P.J., 1992a. Effects of variation of temperature: I. On the biochemical composition of eight species of marine phytoplankton. J. Phycol, 28: 481-488. 82. Vicente G, Martinez M, Aracil J, 2004. Integrated biodiesel production: a comparison of different homogeneous catalysts systems. Bioresour Technol, 92: 297–305. 83. Vonshak A, 1990. Recent advances in microalgal biotechnology. Biotech Adv, 8: 709–27. 84. Warabi Y, Kusdiana D, Saka S, 2004. Reactivity of triglycerides and fatty acids of rapeseed oil in supercritical alcohols. Bioresource Technology, 91 (3): 283–7. 58 85. Watanabe Y, Hall DO, 1996. Photosynthetic CO2 conversion technologies using a photobioreactor in corporating microalgae-energy and material balances. J Energy Convers Manage, 37(6–8): 1321–6. 86. Wen ZY, Chen F, 2000. Optimization of nitrogen sources for heterotrophic production of eicosapentaenoic acid by the diatom Nitzschialaevis. Enzyme Microbiol Techno, 29: 341–7. 87. Xu H, Miao XL, Wu QY, 2006. High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. J Biotechnol, 126: 499–507. 88. Xu N., Zhang X., Fan X., Han L., Zeng C., 2001. Effects of nitrogen source and concentration on growth rate and fatty acid composition of Ellipsoidion sp. (Eustigmatophyta). J. Appl. Phycol, 13: 463–469. 89. Yang C, Hua Q, Shimizu K, 2000. Energetics and carbon metabolism during growth of microalgal cells under photoautotrophic, mixotrophic and cyclic light-autotrophic/dark-heterotrophic conditions. Biochem Eng J, 6:87–102. 90. Yung K.H., Mudd J.B., 1966. Lipid synthesis in the presence of nitrogenous Compounds in Chlorella pyrenoidosa. Plant Physiol, 41: 506–509. 91. Zhu CJ, Lee YK, Chao TM, 1997. Effect of temperature and growth phase on lipid and biochemical composition of Isochrysis galbana TK1. J. Appl. Phycol, 9: 451–457. 92. Oilgae. Algal oil yields. . ww1