Sản xuất phân vi sinh cố định đạm

buøn môùi ñöôïc hoaøn thieän. Naêm 1991 ñaõ coù hôn 10 doanh ñaõ tham gia nghieân cöùu lónh vöïc naøy. Vieät Nam vaø nöôùc ngoaøi cho thaáy, phaân boùn höõu cô vi sinh coù taùc duïng toát ñeán söï sinh tröôûng, phaùt trieån, naêng suaát caây troàng, giaûm giaù thaønh naâng cao hieäu quaû troàng troït vaø caûi taïo moâi tröôøng ñaát canh taùc. Chính phuû Vieät Nam ñaõ sôùm nhaän thaáy ñöôïc vai troø cuûa phaân boùn vi sinh, vì vaäy töø naêm 1994, Thuû töôùng Chính phuû ñaõ ra Chæ thò soá: 644/TTg ngaøy 05 thaùng 11 naêm 1994 chæ ñaïo vieäc quaûn lyù: saûn xuaát, kinh doanh vaø chaát löôïng phaân boùn vi sinh, trong ñoù ñaõ nhaán maïnh:” Ñeå tieán ñeán moät neàn noâng nghieäp saïch, giöõ cho ñaát maøu môõ caàn söû duïng hôïp lyù caùc loaïi phaân vaø thuoác tröø saâu hoùa hoïc döïa treân nguoàn taøi nguyeân doài giaøu veà than buøn vaø photphosrit ôû nöôùc ta caàn khuyeán khích söû duïng caùc nguyeân lieäu naøy laøm chaát neàn vaø chaát phuï gia ñeå saûn xuaát phaân boùn vi sinh, cheá phaåm vi sinh, duøng chuùng ñeå thay theá daàn caùc loaïi phaân hoùa hoïc trong noâng nghieäp theo xu höôùng chung cuûa theá giôùi…” 3.3 Thaønh phaàn caùc vi sinh vaät coá ñònh ñaïm: Vi sinh vaät coá ñònh ñaïm ñöôïc chia laøm 2 nhoùm: Vi khuaån coäng sinh: chuû yeáu thuoäc veà vi khuaån noát saàn Rhizobium Vi khuaån töï do: Azotobacter, Azospirillum… 3.3.1 Vi khuaån coäng sinh Rhizobium: v Ñaëc ñieåm: KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 19 Naêm 1886, Beijerinck ñaõ phaân laäp ñuôïc chuûng vi khuaån noát saàn reã ñaäu töø reã cuûa moät soá caây ñaäu. Thuoäc loaïi hieáu khí khoâng baøo töû. Hình daïng: laø gioáng vi khuaån noát saàn cuûa caây hoï ñaäu coù hình daïng vaø kích thöôùc thay ñoåi phuï thuoäc vaøo giai ñoaïn phaùt trieån. Khi vi khuaån coøn non, teá baøo coù daïng hình que ngaén , chuyeån ñoäng ñöôïc Khi vi khuaån giaø, teá baøo coù kích thöôùc lôùn, khoâng chuyeån ñoäng vaø phaân nhaùnh, ñöôïc goïi laø theå giaû khuaån. Giai ñoaïn naøy thöôøng truøng vôùi giai ñoaïn ra hoa cuûa thöïc vaät, luùc ñoù cöôøng ñoä coá ñònh ñaïm cuûa chuùng cuõng laø cöïc ñaïi. Coù loaïi ñôn mao, coù loaïi chu mao cuõng coù loaïi tieâm mao moïc thaønh chuøm ôû ñaàu Khuaån laïc: Treân moâi tröôøng ñaëc taïo khuaån laïc trôn boùng , nhaøy, voâ maøu. Chaát nhaøy laø moät polysaccharide caáu taïo bôûi hexose, pentose vaø acid uronic v Phaân loaïi Rhizobium coù nhöõng loaøi quan troïng nhö: - R. phaseoli (ôû ñaäu naønh, ñaäu taây, ñaäu ngöïa) - R. leguminosarum (ñaäu Haø Lan) - R. trifolli (coû ba laù) Trong ñoù coù moät soá chuûng moïc chaäm khoâng laøm acid hoaù moâi tröôøng nuoâi caáy ( nhö R. phaseoli) vaø caùc chuûng moïc nhanh laøm acid hoaù moâi tröôøng nuoâi caáy ( nhö R. leguminosarum). v Ñònh hoaït tính vaø khaû naêng coá ñònh ñaïm: Ta coù theå tính vaø ñònh löôïng Enzyme Nitrogenase thoâng qua saéc kyù vôùi enzyme chuaån coù haøm löôïng nhaát ñònh. Neáu thaáy xuaát hieän nhöõng vaïch töông ñöông vôùi enzyme chuaån thì xaùc ñònh chuùng coù Enzyme Nitrogenase hay coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 20 Nuoâi caáy Rhizobium treân moâi tröôøng Dobereiner vaø söû duïng ñeå ñònh ñaïm toång soá vôùi ñoái chöùng (moâi tröôøng khoâng nuoâi caáy) neáu coù söï gia taêng haøm löôïng ñaïm chöùng toû chuùng coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. 3.3.2 Vi khuaån töï do: Azotobacter, Azospirillum… 3.3.2.1 Vi khuaån töï do: Azotobacter: v Ñaëc ñieåm: Azotobacter laø vi khuaån hieáu khí baét buoäc, gram aâm nhaïy caûm vôùi ñoä aåm cuûa ñaát vaø haøm löôïng caùc nguyeân toá khoaùng trong ñaát; P, K, Mo, B. neáu ñaûm baûo ñieàu kieän hieáu khí toát thì chuûng Azotobacter coù theå coá ñònh ñaïm töø 10- 30mg N, khi söû duïng 4g ñöôøng, ôû nhieät ñoä, thích hôïp 25- 30oc, pH 7,2-8,2. Trong moâi tröôøng axit khoâng coù hoaëc coù ít Azotobacter. v Phaân loaïi: Azotobacter phoå bieán nhaát laø ba loaøi döôùi ñaây: Azo.chroococum: khi teá baøo coøn non coù hình que, chuyeån ñoäng ñöôïc, kích thöôùt teá baøo töø 3-7micromet. Khi teá baøo giaø thì coù hình caàu, teá baøo xeáp thaønh töøng ñoâi hay hình khoái coù voû nhaøy. Khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng ñaëc khuaån laïc nhaøy khoâng coù maøu hoaëc maøu naâu Azo.agile: daïng hình caàu hoaëc oval coù kích thöôùt töø 3- 5 micromet ñöùng rieâng leû hoaëc keát ñoâi, khuaån laïc nhaün, tieát saéc toá vaøng hay luïc vaøo moâi tröôøng Azo.vinelandii: trong moâi tröôøng môùi caáy coù hình que, kích thöôùt teá baøo töø 2-3 micromet. Khi teá baøo giaø thì coù hình caàu, baøo töông raát ñaäm khuaån laïc nhaün, trong suoát thöôøng khoâng coù maøng nhaøy. Chuùng thöôøng tieát saéc toá huyønh quang vaøo moâi tröôøng Do Azotobacter coù maøng lipoprotein beân ngoaøi laø nhöõng emzym hoâ haáp hoaït ñoäng söû duïng oxi ñeå hình thaønh ATP vaø laøm cho oxi khoâng thaám vaøo trong maøng, nôi coù nitrogennase tieán haønh coá ñònh ñaïm ôû ñieàu kieän kî khí NH3 ñöôïc hình thaønh ñeán moät möùc ñoä naøo ñoù seõ kieàm haõm nitrogenase, noù chính laø hoaït tính ñieàu hoøa nitrogenase. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 21 v Ñònh tính vaø khaû naêng coá ñònh ñaïm Ñònh tính: khuaån laïc Azotobacter loài, ñaøn hoài, hôi nhaøy, khi coøn non coù maøu traéng daàn veà giaø coù maøu naâu saãm. Quan saùt thaáy nhöõng khuaån laïc coù ñaëc tính nhö treân ñem nhuoäm nang baèng caùch nuoâi treân moâi tröôøng Ashby. Sau 2 tuaàn tieán haønh nhuoäm nang, nhuoäm ñôn ñeå quan saùt söï taïo nang. Sau khi xaùc ñònh ñöôïc sô boä nhöõng khuaån laïc Azotobacter ñem xaùc ñònh hoaït tính coá ñònh ñaïm. Xaùc ñònh khaû naêng coá ñònh ñaïm baèng phöông phaùp ñaïm toång soá. Caùc chuûng vi khuaån ñöôïc nuoâi caáy trong caùc bình chöùa 100 ml moâi tröôøng Ashby voâ ñaïm. Sau 7 ngaøy laáy 10 ml dòch nuoâi caáy ñem voâ cô hoaù vaø xaùc ñònh ñaïm toång -> xaùc ñònh ñöôïc löôïng ñaïm coá ñònh ñöôïc trong 7 ngaøy nuoâi caáy ôû Azotobacter. Choïn chuûng vi khuaån coù khaû naêng coá ñònh ñaïm maïnh meõ nhaát. 3.3.2.1 Vi khuaån töï do Azospirillum Hieän nay chuûng naøy ñang ñöôïc chuù yù nhieàu vì chuùng coù nhöõng ñaëc ñieåm sau: Ngoaøi khaû naêng coá ñònh ñaïm khi ôû traïng thaùi coäng sinh thì coøn toàn ôû traïng thaùi töï do Coù theå coäng sinh vôùi nhieàu loaøi thöïc vaät khaùc nhau khoâng chæ rieâng ôû caây hoï ñaäu. Kích thích haáp thu dinh döôõng khoaùng cuûa thöïc vaät nhö NO3-, PO43-, K, Fe… Saûn sinh moät soá hormone ngoaïi tieát coù khaû naêng ñieàu hoaø sinh tröôûng thöïc vaät nhö IAA (Indole-3-acetic acid), ILA (Indole-lactic acid)… v Ñaëc ñieåm: Azospirillum laø vi khuaån Gram aâm, thuoäc hoï Spirillaceae, di chuyeån maïnh. Teá baøo coù daïng xoaén töø nöõa voøng ñeán vaøi voøng. Khuaån laïc phaùt trieån moät loaïi KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 22 saéc toá maøu hoàng treân moâi tröôøng coù boå sung ñoû cong-go coøn caùc vi sinh vaät ñaát khaùc khoâng coù khaû naêng naøy. Beà maët khuaån laïc raén vaø khoâ sau vaøi ngaøy trong tuû aám Trong moâi tröôøng baùn loûng, Azospirillum hình thaønh moät lôùp vaùng moûng maøu traéng beân döôùi beà maët thoaùng cuûa moâi tröôøng 2-4mm (ñaây laø ñaëc ñieåm ñaëc tröng nhaát cuûa loaøi naøy). Teá baøo khuaån Azospirillum thuoäc loaïi ñôn mao vaø cuõng coù chuûng thuoäc ña mao. v Phaân loaïi: Ñeán nay chöa coù söï phaân loaïi naøo roõ raøng ñoái vôùi Azospirillum. Theo Sampaio vaø coäng söï cuûa oâng (1978), döïa theo caùc ñaëc ñieåm sinh lyù ñaõ chi thaønh 3 nhoùm: - Nhoùm 1: Coù khaû naêng khöû nitrat vaø taïo ra theå khí töø nitrat amon, khoâng caàn Biotin trong sinh tröôûng vaø coá ñònh ñaïm, khoâng söû duïng ñöôïc glucose. Hoaït tính Catalase döông. Chòu ñöôïc caùc loaïi khaùng sinh nhö: streptomicine, Tetraciline, Genlamicine, Cloramphenicol… - Nhoùm 2: Bao goàm nhöõng chuûng khoâng caàn nitrat nhöng caàn Biotin ñeå phaùt trieån treân moâi tröôøng coù N2 vaø NH4. Phaùt trieån treân moâi tröôøng coù Glucose. Hoaït tính Catalase döông. Maãn caûm vôùi caùc laïi khaùng sinh ôû nhoùm 1. - Nhoùm 3: Gioáng nhoùm 1 nhöng coù khaû naêng khöû Nitrat cao hôn vaø raát nhaïy vôùi Tetraciline. Theo baûng phaân loaïi cuûa Bergey, Azospirillum ñöôïc chia thaønh 5 nhoùm: · Azospirillum lipoferum: Ñöôïc moâ taû chi tieát ñaàu tieân bôûi Tarrand. Khuaån laïc maøu hoàng, goà cao, coù rìa. Khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng khoai taây, teá baøo coù kích thöôùc trung bình 1.3-5 KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 23 µm. Azospirillum lipoferum coù hình xoaén, di ñoäng baèng ñôn mao, coù khaû naêng söû duïng glucose, α-cetoglutamate, citrate laøm nguoàn C khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng voâ ñaïm, khoâng söû dung ñöôïc nguoàn C laø saccharose, caàn Biotin cho söï phaùt trieån. Teá baøo trôû neân daïng ña hình khi ôû moâi tröôøng kieàm. · Azospirillum brasilense: Coù ñaëc ñieåm hình thaùi gioáng Azospirillum lipoferum, khoâng coù khaû naêng söû duïng glucose, saccharose, α-cetoglutamate, coù khaû naêng söû duïng nguoàn C töø citrate treân moâi tröôøng voâ ñaïm. Teá baøo khoâng hình thaønh daïng ña hình treân moâi tröôøng kieàm. · Azospirillum irakense: Teá baøo coù chieàu roäng 0.6-0.9µm coù khaû naêng söû duïng glucose, saccharose. Treân moâi tröôøng dòch theå khoâng söû duïng ñöôïc myo-inosytol, coù khaû naêng phaân giaûi pectin, phaùt trieån treân moâi tröôøng coù aùp suaát thaåm thaáu cao. · Azospirillum halopraeferense: Teá baøo coù chieàu roäng 0.7-1.4µm, coù khaû naêng söû duïng α-cetoglutamate laøm nguoàn C. Treân moâi tröôøng voâ ñaïm khoâng söû duïng ñöôïc glucose, saccharose, caàn biotin cho söï phaùt trieån treân moâi tröôøng coù aùp suaát thaåm thaáu cao. · Azospirillum amzonense: Khuaån laïc maøu traéng, lôùn 5µm, goà cao, nhaün. Teá baøo coù chieàu roäng 0.8- 1µm, coù khaû naêng söû duïng glucose saccharose treân moâi tröôøng voâ ñaïm. v Ñònh hoaït tính vaø khaû naêng coá ñònh ñaïm: Ta coù theå tính vaø ñònh löôïng Enzyme Nitrogenase thoâng qua saéc kyù vôùi enzyme chuaån coù haøm löôïng nhaát ñònh. Neáu thaáy xuaát hieän nhöõng vaïch töông ñöông vôùi enzyme chuaån thì xaùc ñònh chuùng coù Enzyme Nitrogenase hay coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 24 Nuoâi caáy Azospirillum treân moâi tröôøng Dobereiner vaø söû duïng ñeå ñònh ñaïm toång soá vôùi ñoái chöùng (moâi tröôøng khoâng nuoâi caáy) neáu coù söï gia taêng haøm löôïng ñaïm chöùng toû chuùng coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. CHÖÔNG 4: PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN LAÄP, GIÖÕ GIOÁNG VAØ NHAÂN SINH KHOÁI 4.1 Phaân laäp 4.1.1 Phaân laäp sô boä 4.1.1.1 Vi khuaån coäng sinh Rhizobium: Nguoàn phaân laäp: caùc caây hoï ñaäu nhö ñaäu naønh, ñaäu xanh, … Ñoái töôïng phaân laäp : Rhizobium Moâi tröôøng phaân laäp: Moâi tröôøng Fred: - Mannit 10g - K2HPO4 0.5g - NaCl 0.2g - MgSO4 0.2g - CaCO3 0.3g - Nöôùc naám men 10%/100ml - Tím keát tinh 0.01g - (coù theå duøng ñoû congo 1/400: 10ml) - Agar 20g - Nöôùc 900ml v Quaù trình tieán haønh: Choïn noát saàn lôùn, maøu hoàng, naèm treân reã chính cuûa caây hoï ñaäu vaøo giai ñoaïn baét ñaàu ra hoa, röûa saïch caû chuøm reã nhieàu laàn. Sau ñoù duøng dao caét laáy caùc noát saàn ra khoûi reã (Löu yù : Phaûi caùch noát saàn ra xa moät chuùt) Gaép noát saàn vaøo becher ñöïng HgCl 0.1% vaø ngaâm 1-5 phuùt, sau ñoù duøng coàn röûa saïch vaø röûa laïi nhieàu laàn vôùi nuôùc caát KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 25 Nghieàn naùt noát saàn trong coái Laáy phaàn dòch taùch ra töø noát saàn pha loaõng vôùi nöôùc caát voâ truøng Caáy dòch pha loaõng naøy vaøo moâi tröôøng Fred UÛ ôû 24 – 26oC trong 3 –4 ngaøy Choïn nhöõng khuaån laïc rieâng leõ, trôn boùng , khoâng maøu, khi quan saùt döôùi kính hieån vi coù caùc teá baøo phaân nhaùnh chöùa nhieàu glycogen vaø volutin Nhaân gioáng qua nhieàu giai ñoaïn trung gian ñeå thu ñöôïc sinh khoái , söû duïng ñeå boå sung vaøo caùc cheá phaåm nitragin 4.1.1.2 Vi khuaån Azotobacter: Moâi tröôøng phaân laäp: moâi tröôøng Ashby, trong moâi tröôøng naøy moät soá vi khuaån khaùc cuõng phaùt trieån ñöôïc nhö Baccillus oligonitrophilus, B. muciliginosus soáng kyù sinh treân khuaån laïc cuûa Azotobacter. Vì theá ta coù theå thay theá ñöôøng baèng Natri benzoate (0,15%) Moâi tröôøng Ashby: - Manit 20 g ( benzoate natri 0,15%) - K2HPO4 0,2 g - MgSO4 0,2 g - NaCl 0,2 g - K2SO4 0,2 g - CaCO3 5 g - Thaïch 20 g - Nöôùc voâ ñaïm 1000 ml Moâi tröôøng nhaân gioáng: nöôùc chieát ñaäu töông 10% coù boå sung theâm caùc chaát vi löôïng, ñöôøng 1%. v Quaù trình tieán haønh: Laáy moät muoãng caø pheâ ñaát nghieàn nhoû, pha loaõng ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau. Caáy caùc noàng ñoä khaùc nhau treân caùc ñóa petri coù chöùa moâi tröôøng rieâng reõ. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 26 Nuoâi chuùng trong tuû aám ôû nhieät ñoä 25-30oC töø 4-5 ngaøy. Laáy maãu ra quan saùt coù theå thaáy nhöõng khuaån laïc nhaày, ñoù laø Azotobacter ( thôøi gian uû coù theå laâu hôn caàn cho söï taïo baøo nang). 4.1.1.3 Vi khuaån töï do: Azospirillum Nguoàn phaân laäp: ñaát troàng hoaëc reã luùa baép, mía… Moâi tröôøng taêng sinh: Baùn raén NFb (Nitro free base, moâi tröôøng cô baûn khoâng chöùa N) Moâi tröôøng phaân laäp: trong quaù trình nuoâi caáy ta duøng caùc moâi tröôøng: NFb baùn raén vaø raén, moâi tröôøng thu sinh khoái (Dobereiner vaø coäng söï). Nguyeân taéc: döïa vaøo ñaëc tính khuaån laïc, khuaån laïc coù maøu hoàng khi boå sung maøu ñoû cong-go vaøo moâi tröôøng. v Quaù trình tieán haønh: Caân khoaûng 10g ñaát cho vaøo erlen chöùa 100 ml nöôùc caát, laéc 2h, ñeå laéng 15 phuùt, huùt 1ml dòch noãi beân treân cho vaøo 50 ml moâi tröôøng NFb baùn raén, uû khoaûng 5 – 7 ngaøy. Sau 5 – 7 ngaøy, laáy ra quan saùt thì thaáy coù vaùng traéng noãi leân saùt beà maët moâi tröôøng. Duøng que caáy laáy moät ít teá baøo töø vaùng naøy caáy leân ñóa Petri chöùa moâi tröôøng NFb coù boå sung 15% ñoû cong-go. UÛ caùc ñóa Petri naøy ôû 30 35oC, töø 3 – 5 ngaøy ñeå caùc khuaån laïc naøy moïc rieâng leû. Nhaän dieän sô boä caùc laïc khuaån Azospirillum. Sau khi uû 3 – 5 ngaøy, laáy caùc ñóa Petri quan saùt coù caùc khuaån laïc maøu traéng, coù soá maøu ñoû. Khuaån laïc Azospirillum thöôøng coù maøu ñoû. Nguoàn phaân laäp: ñaát troàng hay ñaát ôû ao hoà. Moâi tröôøng tích luõy: Augier Thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng Augier: Dung dòch Vinogradaski: 1000 ml Thaønh phaàn dung dòch Vinogradaski: KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 27 - K2HPO4 0,5 g - MgSO 0,5 g - FeSO4 0,05 g - MnSO4 0,05 g - Nöôùc caát 1000 ml - Manit: 10 g - Nöôùc chieát ñaát: 10 ml Laáy 500g ñaát ñaõ laøm khoâ + 100 ml NaCO3 0,1% haáp ôû 80oC /1h -> loïc baèng giaáy loïc -> laáy dòch vaø theâm nöôùc 1000 ml. Hoãn hôïp nguyeân toá vi löôïng: 1ml Hoãn hôïp naøy coù thaønh phaàn nhö sau: - K2HPO4 0,5 g - NaB4O4 0,2 g - CoSO4 0,1 g - CuSO4 0,1 g - CdSO4 0,1 g - KI 0,1 g - NaB2 0,1 g - ZnSO4 0,05 g - Nöôùc caát 1000 ml - Thaïch: 20 g 4.1.2. Phaân laäp thuaàn khieát: 4.1.2.1 Vi khuaån rhizobium v Laøm thuaàn: Taùch 1 teá baøo rieâng leõ pha loaõng trong nöôùc caát voâ truøng, traûi treân maët thaïch ñeán khi quan saùt ñöôïc dang khuaân laïc coù maøu saéc vaø kích thöôùc töông ñoái gioáng nhau KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 28 v Kieåm tra: Nhuoäm ñôn ñeå xem hình daïng Nhuoäm Gram 4.1.2.2 Vi khuaån azotobacter: Huyeàn phuø hoùa teá baøo vi khuaån vaøo nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng, sau ñoù pha loaõng dòch huyeàn phuø ñeán 104- 105 laàn vaø traûi treân caùc petri coù moâi tröôøng nuoâi caáy khoâ maët thaïch, gaït ñeàu, uû ôû 28-30oC trong 4-7 ngaøy. Sau khi uû choïn caùc ñóa petri coù ít hôn 10 khuaån laïc, thuaàn nhaát vaø ñem quan saùt döôùi kính hieån vi baèng caùch nhuoäm ñôn xem gioáng thuaàn chöa. Ta thöïc hieän theâm 2-3 laàn nöõa cho ñeán khi naøo ñöôïc gioáng thuaàn thì ngöng ( thoaû maõn nhöõng traïng thaùi ban ñaàu vaø ñoàng nhaát). 4.1.2.3 Vi khuaån azospirillum: Gioáng vi sinh vaät thuaàn khieát laø gioáng ñöôïc taïo thaønh töø moät teá baøo, moät baøo töû hay moät khuaån ty duy nhaát. Vì Azospirillum khoâng coù khaû naêng taïo baøo töû neân ñeå thuaàn khieát chuùng, baét ñaàu töø moät teá baøo, choïn khuaån laïc rieâng leû trong huyeàn phuø nöôùc caát voâ truøng, pha loaõng vôùi nhieàu noàng ñoä khaùc nhau. Moãi noàng ñoä quan saùt döôùi kính hieån vi coù soá teá baøo ít (khoaûng 10 teá baøo). Traõi treân ñóa Petri vaø quan saùt ñoä thuaàn nhaát cuûa laïc khuaån. v Kieåm tra ñoä thuaàn: Trích khuaån laïc ñaëc tröng ñaõ choïn, pha loaõng vaø traõi treân moâi tröôøng ñoû cong-go. Nhaän ñònh sô boä laø söï ñoàng nhaát veà hình daùng va maøu saéc laïc khuaån. Tieán haønh kieåm tra hieån vi baèng caùch quan saùt hình daïng vaø nhuoän Gram. Tieán haønh kieåm tra caùc ñaëc tính veà hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa gioáng. Neáu thoûa maõn moïi ñieàu kieän treân thì ta tieán haønh caáy chuyeàn ñeå giöõ gioáng. 4.2 Phöông phaùp giöõ gioáng: 4.2.1 Vi khuaån Rhizobium: KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 29 Do Rhizobium coù khaû naêng soáng trong ñieàu kieän thoaùng khí thaáp neân coù theå baûo quaûn chuùng trong thaïch döôùi lôùp daàu khoaùng. Döôùi lôùp daàu khoaùng, chuûng vaãn coù theå phaùt trieån ñöôïc ôû toác ñoä chaäm, do oxi vaãn khueách taùn ít qua lôùp daàu khoaùng. Khi caáy gioáng haây caáy chuyeàn, ta coù theå duøng que caáy caém xuyeân qua lôùp daàu khoaùng ñeå laáy sinh khoái maø khoâng laøm hö ñieàu kieän baûo quaûn. 4.2.2 Vi khuaån Azotobacter Vì chuûng khoâng taïo ñöôïc baøo töû neân khoâng theå söû duïng ñöôïc phöông phaùp caùt coøn phöông phaùp döôùi lôùp daàu khoaùng thì laâu vaø khoâng thuaän tieän neân phöông phaùp baûo quaûn toát nhaát laø ñoâng laïnh vaø ñoâng khoâ. Phöông phaùp naøy döïa treân cô sôû öùc cheá vi sinh vaät ñeå giöõ caùc chuûng trong thôøi gian daøi. Söï phaân chia teá baøo khoâng xaûy ra trong ñieàu kieän ñoâng laïnh hay toát hôn laø ñoâng laïnh keát hôïp vôùi saáy khoâ. v Phöông phaùp ñoâng laïnh: Nhuõ töông hoaù vi sinh vaät: caùc chaát nhuõ hoaù laø dung dòch glycerol 15% trong nöôùc + huyeát thanh ngöïa + dung dòch saccarose 10% vôùi gelatin 1%, pH 6,7-7,0 hoaëc caùc dung dòch chöùa glucose, lactose vaø 10-15% söõa. Cho 1-2% nhuõ dòch vaøo oáng nghieäm ñeå baûo quaûn laïnh, khi laøm laïnh ñeán aâm 20-25oC hoaëc thaáp hôn, phaûi giöõ toác ñoä laøm laïnh khoâng qua 1-2oC /phuùt. Giöõa caùc oáng ñoâng laïnh caàn phaûi qui ñònh thôøi gian caáy truyeàn. Baûng 4.1 Nhieät ñoä vaø thôøi gian giöõ gioáng Nhieät ñoä ( oC) Thôøi gian giöõ gioáng -30 6-9 thaùng -40 1 naêm KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 30 -50 ÷-60 3 naêm -70 ÷ -80 10 naêm Khi laøm tan baêng caàn thöïc hieän nhanh choùng baèng caùch ñaët moät oáng nghieäm vaøo noài caùch thuûy 37oC, khoâng neân thöïc hieän nhieàu laàn seõ laøm giaûm söùc soáng cuûa chuûng. v Phöông phaùp ñoâng khoâ: Laøm tan baêng phaàn nöôùc coù trong moâ tröôøng, nhuõ hoaù trong ñieàu kieän chaân khoâng. Nhöõng nguyeân lieäu ñoâng laïnh: gioáng ñoâng khoâ deã daøng caáy truyeàn trong khi baûo quaûn, söï bieán tính protein cuûa teá baøo sinh vaät vaø söï phaù huyû heä thoáng enzyme laø raát ít vì quaù trình laøm khoâ raát nhanh. Noàng ñoä muoái vaø caùc chaát hoaø tan khaùc ñöôïc nhuõ hoaù vaø sô boä laøm ñoâng khoâ caàn phaûi: Baûo ñaûm ñoâng laïnh cho moâi tröôøng khi ñoâng khoâ laø 1 khoái ñaëc Coù chaát baûo veä cho gioáng khoûi bò khoâ quaù möùc (< 1%) Coù chaát trung hoaø nhoùm -COOH Chaát nhuõ hoaù coù theå duøng moâi tröôøng Mist- Desscans huyeát thanh ngöïa 10%, saccarose vaø gelatin 1% hoaëc moâi tröôøng coù pepton, acid amin…cuõng nhö chaát baûo veä choáng khoâ quaù möùc saccharose, glucose. Chuûng ñoâng khoâ laø chuûng tröôûng thaønh nhöng khoâng giaø, nhieät ñoä laïnh töùc thì töø 10-20oC thôøi gian 1-3 phuùt, sau ñoù coù theå taêng ñeán 10oC /phuùt. Khi laøm khoâ caàn giöõ cuûa nguyeân nhieät ñoä aâm 30- 40oC. Chuù yù: khoâng theå tan baêng khi saáy khoâ. Phuïc hoài gioáng: gioáng baûo quaûn trong oáng ñoâng khoâ, moãi laàn ñaäp oáng phaûi giöõ hoaït tính, giöõ ôû tuû laïnh 1-5oC ñeå söû duïng daàn trong saûn xuaát. 4.2.3 Vi khuaån azospirillum: KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 31 Ñoái vôùi Azospirillum ta tieán haønh baûo quaûn nhö sau: Baûo quaûn treân thaïch döôùi lôùp daàu khoaùng, do Azospirillum coù khaû naêng sinh soáng trong ñieàu kieän khoâng khí thaáp, chuûng trong giai ñoaïn log phase deã baûo ñaûm ñaëc tính gioáng. Söû duïng moâi tröôøng phuø hôïp ñeå nuoâi caáy chuûng sau ñoù phuû leân beà maët moät lôùp daàu khoaùng, baûo quaûn ôû nhieät ñoä laïnh 4-70C Döôùi lôùp daàu khoaùng, chuûng vaãn coù theå phaùt trieån ñöôïc ôû toác ñoä chaäm, do oxi vaãn khueách taùn ít qua lôùp daàu khoaùng. Khi caáy gioáng haây caáy chuyeàn, ta coù theå duøng que caáy caém xuyeân qua lôùp daàu khoaùng ñeå laáy sinh khoái maø khoâng laøm hö ñieàu kieän baûo quaûn Caáy chuyeàn trong 12 thaùng 4.3 Cô cheá coá ñònh Nitô 4.3.1 Cô cheá coá ñònh Nitô phaân töû Quaù trình coá ñònh nit ô laø quaù trình khöû N2 thaønh NH3 nhôø enzyme nitrogennase vôùi söï coù maët cuûa ATP (adenozin triphotphat) N2+ AH2 + ATP -> NH3 + A + ADP + P (AH2 laø chất cho e) ADP: adenozin photphat. ATP caáu taïo thaønh 3 nhoùm base nitro adenine, ñöôøng ribose vaø 3 nhoùm phosphate Baèng phöông phaùp saéc kyù treân maùy ICC “120” BIP (Phaùp) vôùi coat saéc kyù poropak, ta nhaän ñöôïc vaø xaùc ñònh ñöôïc cöôøng ñoä coá ñònh nit ô phaân töû theo hoaït tính cuûa nitrogenase Sau moät thôøi gian nghieân cöùu caùc nhaø khoa hoïc daàn hoaøn thieän cô cheá coá ñònh nit ô phaân töû. Theo cô cheá môùi nhaát (1992) thì quaù trình coá ñònh nit ô phaân töû ñöôïc chia theo hai höôùng cô baûn: con ñöôøng khöû vaø con ñöôøng oxi hoùa. Con ñöôøng khöû theo chuoãi tieán hoùa: N2 → HN=NH → H2N - NH2 → NH3 → NH4OH N2 + 6e- +12ATP + 12H2O nitrogenase, Mg2+ 2NH4+ + 12ADP +12P + 4H+ KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 32 Nitrogenase laø moät phöùc goàm 2 protein chuû yeáu: moät protein MoFe(nitrogense, MW 220.000) lieân keát vôùi 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 64.000) Fe phaân töû coù khoái löôïng phaân töû khoaûng 6.104 Mo- Fe- protein coù khoái löôïng phaân töû khoaûng 2,2.105 Mo- Fe- protein chöùa 2 nguyeân töû Mo (molipden) vaø 28- 32 nguyeân töû Fe vaø 25- 30 nguyeân töû saét khoâng beàn vôùi axit Fe vaø Mo cuûa protein Mo-Fe ñöôïc chöùa beân trong coät cofactor goïi laø FeMo-co vaø söï khöû N2 dieãn ra cofactor naøy 4.3.2 Quaù trình khöû Tröôùc heát protein Fe ñöôïc khöû bôûi ferredoxin sau ñoù lieân keát vôùi ATP laøm thay doåi hình theå cuûa protein Fe vaø haï thaáp theá khöû cuûa protein naøy(töø 100mV- 400mV) taïo ñieàu kieän cho protein Fe khöû protein MoFe. ATP bò thuûy phaân khi dieãn ra söï chuyeån electron naøy. Cuoái cuøng protein MoFe khöû chuyeån caùc electron tôùi nitrogen nguyeân töû Electron cuûa caùc chaát khöû (ferredoxin,ditionit) ñi vaøo trung taâm coù chöùa Fe cuûa thaønh phaàn II(protein- Fe) vaø tieáp tuïc chuyeån thaønh phaàn enzyme (protein- Mo- Fe) Electron ñaõ hoaït hoùa seõ ñi theo maïch nguyeân töû Fe ñeå ñeán Mo, ôû beân trong “haït”, Mo seõ bò khöû, nhôø ñoù coù khaû naêng phaûn öùng nhanh vôùi N2 Phaân töû N2 ñi qua khe coù kích thöôùt khoaûng 4- 5Ao, töùc laø töông ñöông vôùi chieàu daøi phaân töû N2 vaøo beân trong enzyme vaø ñöôïc hoaït hoùa ôû ñaây Keát quaû cuûa quaù trình nitrogenase hoaït hoùa vaø haáp thuï hoùa hoïc nit ô seõ laøm ñöùt hai daây noái trong soá day noái cöïc phaân töû N2 naêng löôïng tieâu phí laø 7,8.105 J/mol. Day noái thöù 3 seõ bò caét ñöùt khi tieáp xuùc vôùi hydro ñaõ ñöôïc hoaït hoùa nhôø caùc enzyme dihydrogenase vaø heä thoáng hydrogenase. Sau ñoù NH3 hoaëc saûn phaåm khöû sinh ra seõ lieân keát axit ñeå taïo thaønh axit amin v Con ñöôøng oxi hoùa: KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 33 N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH Qua hai höôùng ñoù ngöôøi ta thu ñöôïc keát quaû sau: Neáu noàng ñoä oxi nhieàu seõ öùc cheá quaù trình taïo nit ô phaân töû Hieäu suaát coá ñònh nitô phaân töû cuûa nhöõng vi sinh vaät kî khí thöôøng cao hôn vi sinh vaät hieáu khí Tìm thaáy hôïp chaát loaïi khöû khi nuoâi caùc vi sinh vaät coá ñònh nit ô phaân töû Qua ñoù cho ta thaáy con ñöôøng khöû coù nhieàu khaû naêng hôn Cô cheá coá ñònh nito nhôø vi khuaån noát saàn Vi khuaån noát saàn khi gaëp caây hoï ñaäu thích hôïp noù seõ xaâm nhaäp vaøo teá baøo reã, kích thích reã taïo thaønh noát reã, noát reã thöôøng baèng haït gaïo, trong noát reã chöùa ñaày vi khuaån sau khi laøm thaønh moät theå coäng sinh coù lôïi cho hai beân. Ngoaøi caùc caây hoï ñaäu caùc caây khaùc cuõng coù theå coäng sinh vôùi vi khuaån coá ñònh nit ô Vi khuaån noát saàn xaâm nhaäp vaøo reã caây hoï ñaäu thoâng qua loâng huùt ñoâi khi thoâng qua veát thöông. Moät soá caây hoï ñaäu tieát ra xung quanh reã nhöõng chaát coù taùc duïng kích thích nhöõng vi khuaån töông öùng vôùi mình phaùt trieån maïnh hôn (ñeå coù theå nhieãm vaøo thöïc vaät, vi khuaån phaûi ñaït maät ñoä teá baøo 104/gram ñaát). Döôùi aûnh höôûng cuûa vi khuaån noát saàn, caây hoï ñaäu tieát ra enzyme polygalacturonase laøm phaù vôõ thaønh loâng huùt,giuùp cho vi khuaån noát saàn xaâm nhaäp vaøo reã. Ôû trong loâng huùt, vi khuaån noát saàn seõ taïo thaønh ”daây xaâm nhaäp” ñoù laø moät khoái chaát nhaøy daïng sôïi beân trong chöùa ñaày vi khuaån hình que,”daây xaâm nhaäp” tieáp tuïc ñi vaøo beân trong vôùi toác ñoä 5- 8 micromet/s. Söï vaän ñoäng cuûa” daây xaâm nhaäp” ñöôïc thöïc hieän vôùi aùp löïc sinh ra do söï phaùt trieån cuûa vi khuaån noát saàn beân trong. Vi khuaån sau khi tieáp xuùc vôùi thöïc vaät taïo thaønh daây xaâm nhaäp ñi daàn vaøo beân trong cuûa reã vaø xaâm nhaäp vaøo nhu caàu kích thích cuûa teá baøo thöïc vaät bò phaân chia chuyeån thaønh theå giaû khuaån. Giaû khuaån khoâng phaân chia ñöôïc nhöng phaùt maïnh taêng nhieàu ribosome, noát saàn xuaát hieän. 4.4 Phaân loaïi phaân vi sinh coá ñònh ñaïm KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 34 Phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm ñöôïc chia thaønh nhieàu loaïi khaùc nhau, tuøy theo coâng ngheä saûn xuaát, tính naêng, taùc duïng cuûa vi sinh vaät chöùa trong phaân boùn hoaëc thaønh phaàn caùc chaát taïo ra phaân boùn. Moät soá caùch phaân loaïi phaân boùn vi sinh nhö sau: phaân loaïi theo coâng ngheä saûn xuaát Tuøy theo coâng ngheä saûn xuaát ngöôøi ta chia phaân vi sinh thaønh hai loaïi khaùc nhau: + Phaân vi sinh treân neàn chaát mang khöû truøng coù maät ñoä vi sinh vaät höõu ích >109 vi sinh vaät/g(ml) vaø maät ñoä vi sinh taïp nhieãm thaáp hôn 1/1000 so vôùi vi sinh höõu ích. Phaân boùn loaïi naøy ñöôïc taïo thaønh baèng caùch taãm nhieãm sinh khoái vi sinh vaät soáng ñaõ qua tuyeån choïn vaøo caùc cô chaát ñaõ xöû lyù voâ truøng baèng caùc phöông phaùp khaùc nhau. Phaân boùn vi sinh treân neàn chaát mang ñaõ khöû truøng ñöôïc söû duïng döôùi daïng nhieãm haït hoà reã hoaëc töôùi phuû vôùi lieàu löôïng 1-1,5 kg(lít)/ha canh taùc +Phaân vi sinh vaät khoâng söû duïng neàn chaát mang voâ truøng ñöôïc saûn xuaát baèng caùch taãm nhieãm tröïc tieáp sinh khoái vi sinh vaät soáng ñaõ qua tuyeån choïn vaøo cô chaát khoâng caàn thoâng qua coâng ñoaïn khöû truøng cô chaát. Phaân boùn daïng naøy coù maät ñoä vi sinh vaät höõu ích laø 106 vi sinh vaät/g(ml) ñöôïc söû duïng vôùi soá löôïng lôùn töø vaøi traêm ñeán vaøi nghìn kg(lít)/ha. Ñoái vôùi phaân boùn vi sinh treân neàn chaát mang khoâng khöû truøng tuøy theo thaønh phaàn caùc chaát chöùa trong chaát mang maø phaân boùn vi sinh ñöôïc phaân bieät vôùi caùc loaïi: - Phaân höõu cô chöùa caùc loaïi vi sinh vaät soáng theo söï tuyeån choïn ñuùng tieâu chuaån hieän haønh. - Phaân höõu cô khoaùng vi sinh vaät laø moät daïng cuûa phaân boùn höõu cô vi sinh vaät, trong ñoù coù chöùa moät löôïng nhaát ñònh dinh döôõng khoaùng. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 35 Phaân loaïi theo traïng thaùi vaät lyù: caên cöù vaøo traïng thaùi phaân boùn, coù theå chia caùc loaïi phaân thaønh caùc loaïi sau. · Daïng boät laø loaïi phaân boùn vi sinh, trong ñoù sinh khoái cuûa vi sinh vaät ñöôïc tuyeån choïn trong ñoù chaát mang chuyeån thaønh daïng boat. · Daïng vieân ñöôïc taïo thaønh khi sinh khoái vi sinh vaät ñöôïc phoái troän vaø xöû lyù chaát mang ñeå taïo thaønh daïng phaân boùn coù chöùa vi sinh vaät soáng ñaõ ñöôïc tuyeån choïn · Daïng loûng laø loaïi phaân boùn vi sinh trong ñoù sinh khoái caùc vi sinh vaät tuyeån choïn ñöôïc cheá bieán thaønh dung dòch coù chöùa caùc teá baøo soáng cuûa chuùng. 4.5 Nhaân sinh khoái Töø caùc chuûng vi sinh vaät ñöôïc löïa choïn (chuûng goác) ngöôøi ta tieán haønh nhaân sinh khoái vi sinh vaät baèng phöông phaùp leân men chìm hoaëc leân men xoáp. Sinh khoái vi sinh vaät coá ñònh nit ô ñöôïc nhaân qua caáp 1, 2, 3 trong caùc ñieàu kieän phuø hôïp vôùi töøng chuûng vi sinh vaät vaø muïc ñích saûn xuaát. Caùc saûn phaåm phaân vi sinh saûn xuaát töø vi khuaån ñöôïc taïo ra chuû yeáu baèng phöông phaùp leân men chìm (Submerged culture). v Caùc cheá phaåm phaân vi sinh Trong cheá phaåm phaân vi sinh, ngoaøi nguyeân lieäu laø vi sinh vaät coù khaû naêng coá ñònh ñaïm, ngöôøi ta coøn söû duïng chaát mang. Chaát mang laø vaät lieäu coá ñònh vi sinh vaät taïo neân hình daïng cho cheá phaåm ñeå deã nhaän thaáy vaø baûo quaûn. Thöôøng khi laøm cheá phaåm phaân vi sinh, ngöôøi ta söû duïng chaát mang laø than buøn. Vì phaân boùn saûn xuaát töø than buøn coù nhieàu öu ñieåm vaø coù taùc duïng toát vôùi ñaát ñai, caây troàng. Ñaët bieät coù hieäu quaû toát ñoái vôùi ñaát xaùm baïc maøu, caùc loaïi ñaát coù thaønh phaân cô giôùi nheï (tæ leä caùt cao). Tính chaát naøy laø do than buøn coù chöùa acid höõu cô (chuû yeáu laø acid humic) khi keát hôïp vôùi nguyeân toá vi löôïng taïo KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 36 thaønh humate. Chính caùc thaønh phaân humate naøy ñaõ taïo ñieàu kieän cho caây troàng haáp thu dinh döôõng toát. Traùnh hieän töôïng röûa troâi cuûa caùc nguyeân toá dinh döôõng. Ngoaøi ra humate cuõng coù taùc duïng kích thích boä reã cuûa thöïc vaät phaùt trieån toát. Ñaëc bieät ôû Vieät Nam coù tröõ löôïng than buøn cao vaø chaát löôïng toát. Caùc böôùc thöïc hieän chaát mang: Than buøn phôi khoâ, nghieàn nhoû, ñeàu. Chænh pH trung tính baèng CaCO3 hay NH4OH Cho vaøo loï thuûy tinh haáp khöû truøng ôû 0,5 atm trong 2 giôø Boå sung dinh döôõng vaøo moâi tröôøng loaõng Dobereneir vôùi tæ leä 1ml/10g chaát mang Caáy vaø kieåm tra soá löôïng vi sinh vaät treân than buøn. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 37 4.6 Quy trình saûn xuaát: Quy trình chung trong saûn xuaát phaân vi sinh coá ñònh ñaïm: v Thuyeát minh quy trình: Phaân laäp vaø tuyeån choïn vi sinh vaät Tuøy theo muïc ñích saûn xuaát cuûa töøng loaïi phaân maø ta phaân laäp caùc chuûng vi sinh cho phuø hôïp GIOÁNG GOÁC CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG LEÂN MEN CAÁP 2 CAÁY GIOÁNG LEÂN MEN CAÁP 2 SINH KHOÁI VSV CHAÁT MANG PHOÁI TROÄN CHEÁ PHAÅM DAÏNG LOÛNG XÖÛ LYÙ KIEÅM TRA CHUAÅN BÒ MOÂI TRÖÔØNG LEÂN MEN CAÁP 1 CHEÁ PHAÅM TREÂN NEÀN CHAÁT MANG KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 38 Muoán coù cheá phaåm phaân vi sinh coá ñinh ñaïm toát nhaát phaûi coù chuûng vi sinh vaät coù cöôøng ñoä coá ñònh ñaïm cao, söùc caïnh tranh lôùn, thích öùng ôû pH roäng, phaùt huy ñöôïc nhieàu vuøng sinh thaùi khaùc nhau. Vì vaäy coâng taùc phaân laäp tuyeån choïn chuûng vi sinh coá ñònh ñaïm vaø ñaùnh giaù ñaëc tính sinh hoïc cuûa caùc chuûng vi khuaån laø vieäc laøm khoâng theå thieáu ñöôïc trong quy trình saûn xuaát phaân vi sinh coá ñònh ñaïm Thoâng thöôøng ñaùnh giaù moät soá chæ tieâu: thôøi gian moïc, kích thöôùt khuaån laïc vaø kích thöôùt teá baøo vi sinh vaät, ñieàu kieän sinh tröôûng vaø phaùt trieån (nhu caàu dinh döôõng, nhu caàu oxi, pH vaø nhieät ñoä thích hôïp) khaû naêng caïnh tranh vaø cöôøng ñoä coá ñònh nitô phaân töû. Chuûng vi sinh vaät sau khi tuyeån choïn ñöôïc baûo quaûn phuø hôïp vôùi yeâu caàu cuûa töøng loaøi vaø söû duïng cho saûn xuaát cheá phaåm ôû daïng chuûng gioáng goác. 4.7 Caùc loaïi phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm: 4.7.1 Saûn xuaát nitragin töø vi khuaån noát saàn rhizobium: Cheá phaåm vi khuaån noát saàn reã ñaäu coù teân laø nitragin ñaõ ñöôïc saûn xuaát vaø söû duïng roäng raõi ôû Lieân Xoâ cuõ, Trung Quoác , Ba Lan, Phaùp, Bæ. Nitragin coù hieäu quaû khaù roõ reät vaø phoå bieán Tuyø töøng nhaø maùy, töøng nuôùc maø nitragin ñöôïc saûn xuaát vôùi nhieàu hình thöùc khaùc nhau: treân thaïch, trong dòch theå, haáp thuï vaøo than buøn, vaøo ñaát vöôøn… Khoù khaên lôùn nhaát hieän nay laø vieäc ñaûm baûo chaát löôïng töø khi saûn xuaát cho ñeán khi söû duïng do Rhizobium laø loaïi khoâng coù baøo töû neân deã daøng bò cheát ñi. Ñeå khaéc phuïc khoù khaên naøy ta coù theå saûn xuaát cheá phaåm ñoâng khoâ nhöng raát toán keùm vaø khoù khaên trong vieäc môû roäng saûn xuaát Khi söû duïng Nitragin boùn caây ñaäu caàn chuù yù ñeán ñieàu kieän moâi tröôøng . Ñeå ñaûm baûo cho vi khuaån noát saàn sau khi vaøo ñaât phaùt huy taùc duïng thì phaûi ñaûm baûo moät haøm löông nitô roäng khoaûng nhaát ñònh nhaát laø nitô deã tieâu. Khi haøm löôïng nitô ñaït ñeán möùc nhaát ñònh seõ kìm haõm quaù trình coá ñònh nitô cuûa Rhizobium. Vì theá ngöôøi ta chæ boùn ít phaân ñaïm trong giai ñoaïn ñaàu ñeå kích thích giai ñoaïn phaùt trieån. Haøm löôïng P vaø K deã tieâu trong ñaát cuõng raát quan troïng ñoái KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 39 vôùi hoaït ñoäng cuûa vi khuaån noát saàn. Neáu thieáu P vaø K, Rhizobium seõ phaùt trieån yeáu. Ngoaøi ra coøn caàn chuù yù ñeán nhieät ñoä vaø pH cuûa ñaát khi söû duïng Nitragin Trong hoaøn caûnh nöôùc ta hieän nay, nghieân cöùu cho bieát hình thöùc ñôn giaûn nhaát laø röôùc muøa gieo moät loaïi ñaäu naøo ñoù thì caùc phoøng thí nghieäm nhoû ôû caùc tænh leû saûn xuaát ra caùc gioáng thaïch nghieân caáy vi khuaån noát saàn vaø chuyeån tröïc tieáp xuoáng hôïp taùc xaõ, noâng tröôøng. Sau ñoù, gioáng ñöôïc nhaân leân trong moâi tröôøng ñôn giaûn vaø sau 72 giôø nuoâi caáy coù theå ñaït ñöôïc maät ñoä 3800.1016 teá baøo Söû duïng nitragin khoâng nhöõng laøm naâng cao roõ reät saûn löôïng caây troàng thuoäc boä ñaäu maø coøn coù theå laøm taêng phaåm chaát cuûa saûn phaåm thu hoaïch. 4.7.2 Phaân vi sinh cuûa Azotobacter Nhaân gioáng chuûng Azotobacter thuaàn khieát qua nhieàu giai ñoaïn trung gian, thu ñöôïc sinh khoái caáy vi khuaån vaøo chaát mang vöøa laøm moâi tröôøng soáng cuûa gioáng: thöôøng laø than buøn ñaõ khöû truøng. Caàn taïo ñoä aåm thích hôïp treân gioáng vaø löôïng teá baøo treân than buøn sao cho löôïng teá baøo cheát khoâng cao (7%) vaø sinh khoái ñaït khoaûng 30% so vôùi moâi tröôøng. Sau ñoù, giöõ ñoä aåm moâi tröôøng khoaûng 10% ñoùng goùi caàn kieåm tra hoaït tính chaát löôïng saûn phaåm tröôùc khi söû duïng. Azotobacter coù taùc duïng taêng cöôøng nguoàn thöùc aên N cho caây troàng, trung bình khi tieâu thuï 1g caùc chaát sinh naêng löôïng, Azotobacter coù khaû naêng ñoàng hoaù ñöôïc khoaûng 10-15 mg N phaân töû. Boùn rôm raï, hay phaân xanh vaøo ruoäng laø cung caáp nguoàn naêng löôïng cho Azotobacter vaø hoaït ñoäng cuûa Azotobacter seõ laøm giaøu N cho ñaát. Caùc bieän phaùp kyõ thuaät nhö boùn voâi ñeå trung hoaø ñaát, boùn laân töôùi nöôùc laøm tôi xoáp ñaát, phôi ñaát…ñeàu laøm taêng cöôøng roõ reät söï phaùt trieån vaø coá ñònh N cuûa Azotobacter trong ñaát. Taùc ñoäng cuûa Azotobacter ñoái vôùi caây troàng coøn ñöôïc chöùng minh ôû khaû naêng kích thích sinh tröôûng cuûa chuùng. Nhöõng thí nghieäm nhieãm dòch nuoâi caáy Azotobacter leân haït cho thaáy coù khaû naêng laøm naâng cao roõ reät tyû leä naûy maàm cuõng nhö toác ñoä phaùt trieån cuûa haït. Ngöôøi ta cho raèng Azotobacter coù khaû naêng laøm tích luyõ trong moâi tröôøng nuoâi caáy nhieàu loaïi chaát hoaït tính sinh hoïc coù giaù KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 40 trò . Trong nghieân cöùu cho thaáy 1g teá baøo Azotobacter thì tích luyõ ñöôïc 50-100 mi tiamim, 240-600 mi acid nicotine. Azotobacter coøn coù khaû naêng toån hôïp caùc chaát sinh tröôûng giberellin. Azotobacter coøn coù khaû naêng tieát ra chaát choáng naám -> taùc duïng coù lôïi cuûa Azotobacter ñöôïc giaûi thích chuû yeáu laø khaû naêng öùc cheá naám hoaëc taïo haøng loaït chaát sinh tröôûng, vitamin (B1, B2, B6, B12),auxin, nicotic acid,… 4.7.3 Phaân vi sinh azospirillum: v Cheá phaåm Rizolu: Quy trình saûn xuaát cheá phaåm naøy nhö sau: caáy dòch nuoâi vi khuaån azospillum vaøo moâi tröôøng xoáp than buøn vôùi tæ leä 1ml : 80g. Sau 7 ngaøy uû, cheá phaåm ñaït 109 teá baøo/g. Coù theå baûo quaûn saûn phaåm 6 thaùng ôû nhieät ñoä phoøng. Phöông phaùp söû duïng cheá phaåm: 4g/l saøo maï caáy, xöû lyù qua 2 böôùc: troän vaøo luùa ngay tröôùc khi gieo vaø hoà vaøo reã maï ngay tröôùc khi caáy. v Cheá phaåm Azogin: Moâi tröôøng dobereiner caûi tieán phaân phoái vaøo caùc erlen 250-500 ml ôû möùc 1/3 theå tích bình. Thanh truøng baèng hôi nöôùc ôû 1atm trong 30 phuùt. Löôïng gioáng caáy vaøo chieám 1-5% theå tích moâi tröôøng, sau 48-72 giôø nuoâi caáy treân maùy laéc hoaëc caùc thuøng leân men coù suïc khí, nhieät ñoä laø 30-470C, maät ñoä coù theå ñaït 109-1010 teá baøo/ml caùc chuûng vi sinh khaùc nhau ñöôïc nuoâi caáy rieâng leû roài chuyeån moät caùch voâ truøng vaøo boàn chöùa. Töø ñaây chuùng ta caáy vaøo caùc chaát mang ñaõ ñöôïc thanh truøng tröôùc ñeå taïo saûn phaåm. Chaát mang söû duïng trong quy trình naøy laø than buøn vaø chaát höõu cô vôùi tæ leä 1:1, nghieàn mòn qua ray 0.1mm vaø thanh truøng baèng tia gamma. v Giaûi phaùp HI0103: Ñaây laø quy trình saûn xuaát phaân ñaïm sinh hoïc töø Azospirillum lipoferum: moâi tröôøng phaân sinh khoái ñöôïc cho vaøo caùc chai thuûy tinh chöùa khoaûng 1/3 theå tích moãi chai, sau ñoù thanh truøng baèng noài aùp suaát 60 phuùt keå töø luùc soâi. Sau khi KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 41 thanh truøng, ñeå nguoäi, caáy vaøo chai ½ loï gioáng azospirillum vaø ñeå vaøo nôi thoaùng maùt trong nhaø. Sau 24 giôø laáy ra laéc maïnh ñeå troän ñeàu moâi tröôøng nuoâi caáy.tieáp tuïc uû sau 24- 48 giôøta thu ñöôïc sinh khoái vôùi maät ñaït 198-109 teá baøo/ml. duøng sinh khoái naøy troän vaøo maï tröôùc khi caáy, hoaëc troän vôùi ñaát phaân chuoàng ñaõ uû chín vôùi tæ leä 1:1 ñeå taïo cheá phaåm. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 42 CHÖÔNG 5 :HIEÄU QUAÛ SÖÛ DUÏNG CUÛA PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM 5.1 Tình hình nöôùc ngoaøi Ñeán nay nhieàu nöôùc treân theá giôùi ñaõ saûn xuaát caùc cheá phaåm phaân vi sinh theo nhieàu höôùng khaùc nhau. Phuï thuoäc vaøo neàn kinh teá xaõ hoäi, khoa hoïc coâng ngheä, trình ñoä daân trí vaø ñieàu kieän töï nhieân cuûa moãi nöôùc khaùc nhau maø khaùc nhau. Nhöng taát caû saûn xuaát theo höôùng ñoù laø: tieän cho ngöôøi söû duïng vaø cho hieäu quaû kinh teá cao nhaát. Caùc nghieân cöùu töø caùc nöôùc Myõ, Canada, Nga, AÁn Ñoä, Thaùi Lan, Trung Quoác, Nhaät Baûn, cho thaáy söû duïng cheá phaåm phaân vi sinh coá ñònh ñaïm coù theå cung caáp cho ñaát vaø caây troàng töø 30 -60 kg N/ha/naêm. Ngoaøi ra, thoâng qua caùc hoaït ñoäng soáng cuûa vi sinh vaät, caây troàng ñöôc naâng cao khaû naêng trao ñoåi chaát, khaû naêng choáng chòu beänh taät vaø naâng cao naêng suaát, chaát löôïng noâng saûn. Ôû AÁn Ñoä nhôø söû duïng phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm cho caùc caây boä ñaäu (lac,ñaâu töông), luùa, cao löông ñaõ mang laïi lôïi nhuaän laø 1204, 1015, 1149 vaø 343 rupi/ha töông ñöông vôùi söï taêng naêng suaát laïc, ñaäu töông laø 13,9%, luùa 11,4%, cao löông 18,2% vaø boâng 6,8% (JUWARKA 1994) Baûng 5.1 Hieäu quaû söû duïng phaân vi sinh coá ñònh ñaïm treân moät soá caây troàng Caây troàng/phaân boùn Tyû leä taêng naêng suaát (%) Lôïi nhuaän (R/ha) Ñaäu, laïc/Rhizobium Luùa/Taûo lam Cao löông/azopirillum Boâng /azotobacter 13,9 11,4 18,2 6,8 1204 1015 1149 343 (Nguoàn :Juwarka 1994) Taïi Thaùi Lan lôïi nhuaän ñem laïi hoï ñaäu töông 126,7-144 USD/ha, laïc 36,2- 91,5 USD/ha, hay moät goùi cheá phaåm/200g coù theå thay theá 26,8 kg ure Taïi Trung Quoác phaân vi sinh coá ñònh ñaïm laøm taêng naêng suaát caây troàng 7- 15% tieát kieäm 20% phaân khoaùng Hieän nay, phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm ñaõ ñöôïc söû duïng taïi nhieàu quoác gia treân theá giôùi. Rieâng vi khuaån noát saàn, haøng naêm ñem laïi 25 trieäu USD, trong ñoù taïi Myõ saûn phaåm naøy ñöôïc baùn ra vôùi doanh soá 19 trieäu USD. Taïi Thaùi Lan tyû leä taêng tröôûng cuûa phaân vi khuaån noát saàn töø naêm 1980-1993 cho ñaäu töông laø 199%, laïc 280%. Toång giaù trò saûn phaåm naøy 1995 ñaït 406,571 USD (Cong ngoen 1997) KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 43 Ngoaøi phaân vi khuaån noát saàn caùc loaïi, phaân vi sinh vaät khaùc nhö coá ñònh Nitô töï do azotobacter, clostridium, taûo lam, coá ñònh nitô hoäi sinh töø azopirillum, phaân giaûi phoát phaùt chaäm töø Bacillus, Pseudomonas…Phoøng tröø vi sinh vaät gaây beänh vuøng reã töø Steptomuces, Bacilllus cuõng ñöôïc saûn xuaát vôùi soá löôïng lôùn. Vôùi tính hieäu quaû cao cuûa phaân vi sinh vaät ñaõ thuùc ñaåy caùc nöôùc phaùt trieån khoâng ngöøng saûn xuaát khoâng ngöøng caû veà löôïng vaø chuûng loaïi. Theo soá lieäu thoáng keâ cuûa AÁn Ñoä (1993). Töø naêm 1992-1993 toång hôïp caùc daïng phaân vi sinh boùn tröïc tieáp cho caây troàng laø 2.584 taán vaø naêm 2000 laø 818.000 (taêng treân 3 laàn) töông ñöông 2 tyû USD Baûng 5.2 Caùc loaïi phaân vi sinh ñöôïc saûn xuaát taïi AÁn Ñoä Loaïi phaân boùn Soá löôïng Rhizobium Azotobacter Azospirillum Taûo lam Phaân giaûi laân 35,0 162,61 77,16 267,72 275,51 Toång coäng 818,000 5.2 Tình hình trong nöôùc Trong gaàn voøng 20 naêm qua caùc coâng trình nghieân cöùu vaø thöû nghieäm phaân vi khuaån noát saàn taïi Vieät Nam cho thaáy phaân vi khuaån noát saàn coù taùc duïng naâng cao naêng suaát laïc voû 13,8-17,5% ôû mieàn Baéc vaø mieàn Trung, 22% caùc tænh mieàn Nam (Ngoâ Theá Daân vaø CTV 2001) Caùc keát quaû cuõng cho ta thaáy söû duïng phaân vi khuaån noát saàn keát hôïp vôùi löôïng phaân khoaùng töông ñöông 30-40 kg N/ha mang laïi hieäu quaû kinh teá cao, naêng suaát laïc ñaït trong tröôøng hôïp naøy coù theå töông ñöông nhö boùn 60-90 kg N/ha. Hieäu löïc cuûa khuaån noát saàn theå hieän roõ neùt treân vuøng ñaát ngheøo dinh döôõng vaø vuøng ñaát môùi troàng laïc. Lôïi nhuaän do vi khuaån noát saàn ñöôïc Voõ Minh Kha vaø CTV (1995) xaùc ñònh 442.000 VND/ha tyû leä laõi/l ñoàng chi phí ñaït 9,8 laàn. Lôïi nhuaän töông töï cuõng ñöôïc Nguyeãn Thò Lieân Hoa vaø CTV (1997) taïi caùc vuøng troàng laïc ôû caùc tænh phía Nam. Baûng 5.3 Lôïi nhuaän cuûa phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm treân moät soá caây troàng KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 44 Ñaát vaø caây troàng Coâng thöùc boùn phaân Naêng suaát (taï/ha) % taêng so vôùi ñoái chöùng Luùa treân ñaát phuø sa soâng Hoàng Neàn (NPK:90.90.60+8t PC) 80% neàn+Phaân VSCÑÑ Neàn+Phaân VSCÑÑ 51,60 53,73 57,86 - 4,0 12,0 Luùa treân ñaát baïc maøu Haø Baéc(cuõ) Neàn (NPK:90.90.60+8t PC) 80% neàn+Phaân VSCÑÑ Neàn+Phaân VSCÑÑ 37,76 39,86 44,59 - 6,0 18,0 Ngoâ treân ñaát phuø sa soâng Hoàng Neàn (NPK:180.120.90+8t PC) Neàn+Phaân VSCÑÑ 41,45 41,73 46,85 - 1,0 13,0 Ngoâ treân ñaát baïc maøu Haø Baéc(cuõ) Neàn (NPK:90.90.60+8t PC) 80% neàn+Phaân VSCÑÑ Neàn+Phaân VSCÑÑ 36,98 37,42 39,88 - 1,0 8,0 Cheø treân ñaát ñoû Thaùi Nguyeân Neàn (NPK:120.90.60+8t PC) 80% neàn+Phaân VSCÑÑ Neàn+Phaân VSCÑÑ 142,90 155,34 178,21 - 9,0 25,0 (Nguoàn ñeà taøi KHCN.02.06) Phaân vi khuaån noát saàn khoâng chæ coù taùc duïng laøm taêng suaát lac, tieát kieäm ñöôïc phaân ñaïm khoaùng maø taêng cöôøng söùc ñeà khaùng cho laïc ñoái vôùi moät soá beänh vuøng reã. Ngoaøi ra vôùi taùc duïng cuûa vi khuaån noát saàn, laïc coù sinh khoái chaát xanh nhieàu hôn. Taøn dö thöïc vaät sau thu hoaïch neáu ñöôïc vuøi traû laïi cho ñaát trôû thaønh nguoàn dinh döôõng ñaïm vaø chaát höõu cô quan troïng cho caây troàng caùc vuï sau. Keát nghieân cöùu ñeà taøi caáp nhaø nöôùc KC.08.01 (1991-1995) vaø KHCN. 02.06 (1996-2000) cho bieát vi sinh vaät coá ñònh nitô coù theå tieát kieäm ñöôïc löôïng phaân khoaùng nhaát ñònh, töø 10,08-22,4 kg N/ha/vuï tuøy theo töøng loaïi ñaát vaø thôøi vuï gieo troàng. KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 45 Baûng 5.4 Khaû naêng tieát kieäm ñaïm khoaùng cuûa phaân vi sinh vaät coá ñònh nitô Ñaát troàng Khaû naêng tieát kieän khoaùng theo thôøi vuï caây troàng kgN/ha Vuï xuaân Vuï muøa Phuø sa soâng Hoàng 14,28 10,80 Phuø sa soâng Maõ 15,28 12,12 Ñaát baïc maøu 22,4 16,6 Ñaát ven bieån 17,46 17,8 Trung bình 13,76 14,51 (Nguoàn ñeà taøi KC.08.01) Keát quaû: ñaùnh giaù hieäu löïc phaân boùn vi sinh vaät ñoái vôùi caây troàng ñaõ xaùc ñònh phaân boùn vi sinh khoâng chæ cung caáp moät phaàn chaát dinh döôõng caàn thieát cho caây maø coøn coù taùc duïng naêng cao hieäu quaû söû duïng phaân khoaùng. Ñoàng thôøi coù nhieàu phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm coù khaû naêng haïn cheá moät soá beänh vuøng reã caây troàng mang laïi hieäu quaû kinh teá cho ngöôøi söû duïng vaø taùc ñoäng tích cöïc ñeán moâi tröôøng sinh thaùi ñaát… KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 46 CHÖÔNG 6: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 6.1 Keát luaän - Caùc vi sinh vaät coù khaû naêng coá ñònh ñaïm coù theå phaân laäp trong töï nhieân - Quy trình giöõ gioáng vaø nhaân sinh khoái khaù ñôn giaûn. Nhieàu loaøi ñaõ ñöôïc saûn xuaát thaønh cheá phaåm thöông maïi ôû Vieät Nam. - Söû duïng phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm cho hieäu quaû töông ñöông hoaëc cao hôn phaân hoùa hoïc nhöng thaân thieän vaø an toaøn cho moâi tröôøng soáng. 6.2 Kieán nghò: Môû roäng nghieân cöùu öùng duïng moät soá chuûng vi sinh coá ñònh ñaïm KHOÙA LUAÄN TOÁT NGHIEÄP: SAÛN XUAÁT PHAÂN VI SINH COÁ ÑÒNH ÑAÏM GVHD : Nguyeãn Thò Hai SVTH : Thaùi Sôn Nam Trang 47 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Giaùo trình phaân boùn cuûa tröôøng ñaïi hoïc Khoa Hoïc vaø Töï Nhieân Ñeà taøi: nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa moät soá phaân höõu cô vi sinh tôùi naêng suaát, haøm löôïng NO3- cuûa rau baép caûi vaø hoùa tính ñaát troàng ñaát troàng rau taïi xaõ Haø Giang cuûa Th.s Phaïm Xuaân Laân. Ñeà taøi: aûnh höôûng cuûa vieäc söû duïng phaân ñaïm ñeán khaû naêng tích luõy haøm löôïng NO3-, NH4+ trong nöôùc maët vaø nöôùc ngaàm taïi xaõ Ñaëng Xaù-Gia Laâm-HN cuûa ks Voõ Thò Loan. Vaø moät soá trang wed www.agroviet.gov www.cuctrongtrot.gov.vn www.hutech.edu.vn www.vaas.org.vn PHUÏ LUÏC Baûng 1.1 Tình hình söû duïng phaân hoùa hoïc cuûa caùc nöôùc Baûng 1.2 Nhu caàu phaân boùn treân theá giôùi Baûng 1.3 Soá löôïng phaân hoùa hoïc ñöôïc söû duïng qua caùc naêm Baûng 4.1 nhieät ñoä vaø thôøi gian giöõ gioáng Baûng 5.1 Hieäu quaû söû duïng phaân vi sinh coá ñònh ñaïm treân moät soá caây troàng Baûng 5.2 Caùc loaïi phaân vi sinh ñöôïc saûn xuaát taïi AÁn Ñoä Baûng 5.3 Lôïi nhuaän cuûa phaân boùn vi sinh coá ñònh ñaïm treân moät soá caây troàng Baûng 5.4 Khaû naêng tieát kieäm ñaïm khoaùng cuûa phaân vi sinh vaät coá ñònh nitô