Sản xuất và bảo quản rượu vang nếp than quy mô xưởng thực nghiệm sử dụng enzyme và nấm men thuần chủng

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHẠM THỊ THU VÂN SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN RƯỢU VANG NẾP THAN QUY MÔ XƯỞNG THỰC NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên ñề tài: SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN RƯỢU VANG NẾP THAN QUY MÔ XƯỞNG THỰC NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Ts. Lý Nguyễn Bình Phạm Thị Thu Vân MSSV: 2051695 Lớp: CNTP K31 Luận văn ñính kèm sau ñây, với tựa ñề tài “Sản xuất và bảo quản rượu vang nếp than quy mô xưởng thực nghiệm sử sụng enzyme và nấm men thuần chủng”, do Phạm Thị Thu Vân thực hiện và báo cáo ñã ñược hội ñồng chấm luận văn thông qua. Giáo viên hướng dẫn Giáo viên chấm phản biện Ts. Lý Nguyễn Bình Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Chủ tịch hội ñồng Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm vừa qua, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn ñến toàn thể quý Thầy Cô của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm thuộc Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng - Trường ðại học Cần Thơ ñã tận tình giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể em hoàn thành ñược ñề tài luận văn của mình. Nhân ñây, ñặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến thầy Lý Nguyễn Bình, thầy ñã hướng dẫn và chỉ dạy tận tình giúp em hoàn thành ñề tài và tích lũy ñược những vốn kiến thức hữu ích về chuyên ngành trong suốt thời gian vừa qua. Em xin gửi lời cảm ơn ñến cán bộ phòng thí nghiệm và tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K31 ñã nhiệt tình giúp ñỡ, ñóng góp ý kiến và tạo ñiều kiện tốt cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Cuối lời em xin kính chúc quý Thầy Cô dồi dào sức khỏe. Chúc các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K31 bảo vệ thành công luận văn tốt nghiệp của mình. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện Phạm Thị Thu Vân Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm ii TÓM LƯỢC SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN RƯỢU VANG NẾP THAN QUY MÔ XƯỞNG THỰC NGHIỆM SỬ DỤNG ENZYME VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG Tối ưu hóa nồng ñộ enzyme glucoamylase và tỉ lệ nấm men sử dụng trong quá trình sản xuất, theo dõi sự thay ñổi của sản phẩm trong thời gian bảo quản ở quy mô xưởng thực nghiệm. Nồng ñộ enzyme glucoamylase tối ưu thực hiện quá trình ñường hóa là 0,5% hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường ñạt ñược lần lượt là 19,165% và 20,5%. Tỉ lệ nấm men thích hợp cho lên men là 0,1% và thời gian lên men chính 5 ngày. Quá trình bảo quản sản phẩm ở ñiều kiện phòng thí nghiệm cho thấy ít có sự biến ñổi so với sản phẩm sau lên men. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........ .................................................................................................... i TÓM LƯỢC........... ................................................................................................... ii MỤC LỤC.............. .................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. vi DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. vi CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU..........................................................................................1 1.1 ðẶT VẤN ðỀ...................................................................................................1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU..............................................................................1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU......................................................................2 2.1 NGUYÊN LIỆU................................................................................................2 2.1.1 Gạo nếp than .................................................................................................2 2.1.2 Enzyme amylase ...........................................................................................4 2.1.2.1 Sơ lược về enzyme amylase................................................................4 2.1.2.2 Tính chất của enzyme amylase ...........................................................5 2.1.2.3 Hoạt ñộng của amylase .......................................................................5 2.1.2.4 Cơ chất của amylase............................................................................6 2.1.2.5 Phân loại enzyme Amylase .................................................................6 2.1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae .........................................................10 2.2 QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP THAN................................12 2.2.1 Quy trình sản xuất chung............................................................................12 2.2.2 Thuyết minh quy trình ................................................................................13 2.3 CÁC QUÁ TRÌNH XẢY RA CHỦ YẾU TRONG SẢN XUẤT RƯỢU ......13 2.3.1 Quá trình dịch hóa ......................................................................................13 2.3.1.1 Cơ sở lý luận .....................................................................................13 2.3.1.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình dịch hóa ...............................13 2.3.2 Quá trình ñường hóa...................................................................................14 2.3.2.1 Cơ sở lý luận .....................................................................................14 2.3.2.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình ñường hóa............................14 2.3.3 Quá trình lên men rượu...............................................................................14 2.3.3.1 Khái quát về quá trình lên men rượu ................................................14 2.3.3.2 Cơ chế của quá trình lên men............................................................14 2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men....................................15 2.3.3.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men ...16 2.4 SẮC TỐ ANTHOCYANIN TRONG RƯỢU VANG NẾP THAN ...............18 2.4.1 Cấu tạo của anthocyanin.............................................................................18 2.4.2 Tính chất của anthocyannin........................................................................19 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến anthocyanin.....................................................19 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm iv 2.5 VI SINH VẬT TRONG RƯỢU......................................................................19 2.5.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic ........................................................................20 2.5.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic.................................................................20 2.5.2.1 Sinh thái khuẩn lactic ........................................................................20 2.5.2.2 Hoạt ñộng của vi khuẩn lactic...........................................................21 2.5.2.3 Kết quả hoạt ñộng của khuẩn lactic lên men malolactic và các bệnh rượu ...............................................................................................................21 CHƯƠNG III – PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.................23 3.1 PHƯƠNG TIỆN..............................................................................................23 3.1.1 Nguyên liệu.................................................................................................23 3.1.2 Hóa chất sử dụng ........................................................................................23 3.1.3 Trang thiết bị ..............................................................................................23 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM....................................................................23 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) ñến hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường trong quá trình ñường hóa..................................................................................................................23 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men ñến thời gian lên men chính và chất lượng rượu sau quá trình lên men...............................................24 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát một số thay ñổi trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm...................................26 CHƯƠNG IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................28 4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) ñến hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường trong quá trình ñường hóa...........................28 4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men ñến thời gian lên men chính và chất lượng rượu sau quá trình lên men ................................................................................................29 4.3 Một số thay ñổi trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm ...................................................................................31 CHƯƠNG V – KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ .............................................................37 5.1 Kết luận ...........................................................................................................37 5.2 ðề nghị ............................................................................................................37 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................39 PHỤ LỤC............... ................................................................................................. vii Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1 Thành phần hóa học của gạo nếp than............................................................3 Bảng 2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men.....................................................11 Bảng 3 Hàm lượng ñường khử và 0Bx của dịch ñường ứng với các nồng ñộ enzyme glucoamylase sử dụng ...............................................................................................28 Bảng 4 Nồng ñộ rượu của sản phẩm theo tỉ lệ nấm men và ngày lên men...............30 Bảng 5 ðộ trong của sản phẩm rượu theo tỉ lệ nấm men..........................................30 Bảng 6 Hàm lượng acid và ester của sản phẩm rượu theo tỉ lệ nấm men.................31 Bảng 7 Kết quả theo dõi sự biến ñổi về pH, ñộ Brix, ñộ cồn và ñường khử của sản phẩm trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm ở quy mô xưởng thực nghiệm . ................................ ..................................................................................................34 Bảng 8 Kết quả theo dõi hàm lượng tạp chất trong quá trình bảo quản sản phẩm ở quy mô xưởng thực nghiệm ......................................................................................35 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1 Gạo nếp than ...................................................................................................2 Hình 2 Cấu tạo của hạt nếp .........................................................................................3 Hình 3 Công thức cấu tạo của amylose.......................................................................3 Hình 4 Công thức cấu tạo của amylopectin ................................................................4 Hình 5 Cơ chế cắt liên kết α-1,4 và α-1,6-glycosid của amylase...............................6 Hình 6 Cơ chế tác ñộng của α-amylase lên tinh bột ...................................................8 Hình 7 Nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................................10 Hình 8 Công thức cấu tạo của anthocyanidin ...........................................................19 Hình 9 Mẫu phân tích hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường sau quá trình ñường hóa ...... ..................................................................................................28 Hình 10 Mẫu phân tích sản phẩm theo tỉ lệ nấm men...............................................29 Hình 11 Máy nghiền búa... .......................................................................................32 Hình 12 Nếp than ... .......... .......................................................................................32 Hình 13 ðường hóa dịch ñường... ............................................................................32 Hình 14 Bã nếp....... ..................... ............................................................................32 Hình 15 Dịch ñường lên men... ................................................................................32 Hình 16 Dụng cụ lên men rượu ................................................................................32 Hình 17 Sản phẩm rượu nếp than..............................................................................33 Hình 18 ðồ thị biểu diễn ñộ trong của sản phẩm trong quá trình bảo quản theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm ...........................................................................35 Hình 19 ðồ thị biểu diễn hàm lượng tạp chất sinh ra theo thời gian bảo quản ở quy mô xưởng thực nghiệm .............................................................................................36 Hình 20 Sản phẩm rượu vang nếp than.....................................................................37 Hình 21 Quy trình sản xuất ñề nghị ..........................................................................38 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ Như chúng ta ñã biết, rượu là một loại thức uống mang hương vị truyền thống của nền văn hóa ẩm thực Việt Nam. Ngày xưa, rượu thường dùng trong những dịp lễ tết, cúng ñình, giổ chạp... và cho ñến nay với sự phát triển không ngừng của xã hội, rượu ñã ñược sử dụng phổ biến hơn. Trong các buổi tiệc, dù là tiệc vui hay buồn, tiệc lớn hay nhỏ cũng không thể thiếu ñược loại thức uống này. Chính vì tính phổ biến ñó của rượu, ngày nay các nhà chế biến ñã tiến hành nghiên cứu và chế biến ra hàng loạt các mặt hàng rượu với nhiều hương vị khác nhau như ngoài rượu ñế và các loại rượu có ñộ cồn cao còn có mặt hàng rượu vang, là loại rượu ñược chế biến theo kiểu lên men và không qua chưng cất. Loại rượu này ñược sản xuất chủ yếu từ trái cây và ngày nay nó còn ñược sản xuất ra từ các loại ngũ cốc như là gạo nếp. Rượu vang hiện nay có nhiều mặt hàng khác nhau như: rượu vang nếp than, rượu vang chuối xiêm, rượu vang nho, rượu vang khóm…Mỗi loại rượu vang thì ñều có hương vị, màu sắc, mùi thơm ñặc trưng của loại nguyên liệu sản xuất ra nó. Với ñề tài này, tôi tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang nếp than bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng nhằm rút ngắn ñược thời gian chế biến sản phẩm mà vẫn cho ra loại sản phẩm rượu thơm ngon và thu hút ñược người tiêu dùng bởi chất lượng của nó, ñồng thời theo dõi một số thay ñổi trong quá trình bảo quản sản phẩm rượu ở quy mô xưởng thực nghiệm. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ðề tài ñược thực hiện dựa trên Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ khóa 12-2008 của Nguyễn Thị Giang Thanh - chuyên ngành Công nghệ Sinh học nhưng nghiên cứu ở quy mô xưởng thực nghiệm. Do ở quy mô lớn nên sẽ có sự khảo sát lại một số chỉ tiêu trong quá trình sản xuất và một số thay ñổi của sản phẩm trong quá trình bảo quản. Mục tiêu nghiên cứu cụ thể của ñề tài như sau: - Tối ưu hóa nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) sử dụng cho quá trình ñường hóa dịch nếp than - Tối ưu hóa tỉ lệ nấm men trong quá trình lên men rượu - Theo dõi một số thay ñổi trong quá trình bảo quản sản phẩm như sự thay ñổi về ñộ rượu, ñộ trong của sản phẩm, lượng tạp chất sinh ra trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Gạo nếp than Hình 1 Gạo nếp than Gạo nếp than là một loại gạo ñặc biệt ñược trồng nhiều ở Nam bộ. Vì thế rượu nếp than ñược sản xuất chủ yếu ở Nam bộ. Gạo nếp than gồm 4 loại: - Nếp cẩm ðức Hòa - Nếp ñen Khánh Vĩnh - Nếp than Long ðất - Lúa lức nếp cẩm Các loại lúa này có năng suất không cao, thường chỉ ñạt 2,8 – 3,3 tấn/ha. Hiện nay dân vùng ñồng bằng Nam bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo. Theo cách này nếp than ñược chia thành 2 loại: - Nếp than ñen huyền - Nếp than hồng ñỏ Các sắc tố của nếp than dễ tan trong nước, vì thế sản phẩm rượu mang màu sắc ñặc trưng của loại gạo nguyên liệu. Màu của nếp than là màu của anthocyanin. Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô ñịnh hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay ñổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay ñổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường: pH thấp anthocyanin thường có màu ñỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa. Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng thành phần hoá học của các loại nếp than không khác nhiều. Thành phần hóa học của nếp than cho ở Bảng 1 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 3 Bảng 1 Thành phần hóa học của gạo nếp than Thành phần Hàm lượng (%) Nước Protein Lipid Glucid Acid hữu cơ Tro 14 8,2 1,5 74,9 0,6 0,8 (Nguyễn Thị Hiền và cộng sự, 2004) Về cấu tạo của hạt nếp than: nếp than cũng là một trong những loại lúa ñược trồng ở nước ta, lúa gạo thì có rất nhiều loại nhưng về mặt cấu tạo thì ña số các loại lúa gạo ñiều có cấu tạo giống nhau và cụ thể như sau Hình 2 Cấu tạo của hạt nếp Trong cấu tạo của hạt nếp thì nội nhũ là chiếm ưu thế gần như là toàn bộ hạt nếp, nội nhũ có thành phần chủ yếu là tinh bột, tinh bột bên trong hạt nếp than có hai dạng là: amylose chiếm 0,3 % và amylopectin chiếm 99,7 % (Bùi ðức Hợi và cộng sự, 2007). + Amylose Hình 3 Công thức cấu tạo của amylose Amylose thường ở dạng kết tinh có lớp hydrate bao quanh xen kẻ với các amylose kết tinh không có lớp hydrate. Phân tử amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh, mỗi mạch có từ 200 ñến hàng nghìn gốc glucose liên kết nhau theo liên kết α-1,4-glucosid. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 4 Amylose trong hạt tinh bột, trong dung dịch hoặc ở trạng thái thoái hóa có cấu tạo mạch thẳng ñơn giản, khi thêm tác nhân kết tủa vào mới có hình xoắn ốc. Amylose có trọng lượng phân tử khoảng 50000-160000. Do cấu trúc mạch thẳng amylose có số gốc hydroxyl tự do nhiều nên dể hòa tan trong nước ấm, tuy nhiên ở dạng tinh thể không bền vững khi ñể yên tinh thể sẽ tách ra. Amylose khi phản ứng với iod sẽ tạo phức màu xanh ñặc trưng ñây là ñặc ñiểm chủ yếu ñể nhận biết tinh bột khi sử dụng iod làm thuốc thử, amylose có khả năng tạo phức với một số hợp chất hữu cơ có cực và ñộ hòa tan khác nhau trong nước cũng như trong các hợp chất không cực kiểu hydrocacbua: parapin, butanol, izopropanol, acid béo (stearic, oleic), phenol,… + Amylopectin Hình 4 Công thức cấu tạo của amylopectin Amylopectin có cấu tạo vô ñịnh hình, có dạng phân nhánh. Ngoài liên kết α-1,4-glucosid các phân tử glucose còn liên kết với nhau theo liên kết α-1,6-glucosid mỗi nhánh có không quá 24 gốc glucose. Amylopectin có khối lượng khoảng 2 - 4.108. Do cấu trúc nhánh nên liên kết rất yếu với iod. Phần liên kết ñược chủ yếu là nhánh ngoài hình thành nên những chất hấp phụ có màu tím ñỏ. Amylopectin chỉ tan ñược trong nước ở nhiệt ñộ cao tạo thành dung dịch có ñộ nhớt cao và rất bền vững. Amylopectin không có khả năng tạo phức với butanol và các chất hữu cơ khác, không bị hấp thụ trên cellulose. 2.1.2 Enzyme amylase 2.1.2.1 Sơ lược về enzyme amylase Enzyme amylase là một loại enzyme có giá trị về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử còn ñược gọi là diastase. Enzyme này có cả ở thực vật và ñộng vật. Amylase ñược tinh sạch từ malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz. Amylase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucosid nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Amylase của malt thủy phân lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho nấm men trong quá trình lên men. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 5 Amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những enzyme ñược ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác ñặc biệt là trong các ngành công nghệ thực phẩm ñể làm lỏng tinh bột. 2.1.2.2 Tính chất của enzyme amylase Tinh bột bị thủy phân trong suốt quá trình nẩy mầm của hạt ngũ cốc nhờ vào hoạt ñộng của các loại enzyme thủy phân mà quan trọng nhất trong số ñó là enzyme amylase. Mặc dù α- amylase ñóng vai trò chủ yếu trong sự phân cắt tinh bột nhưng cần có sự phối hợp giữa α- amylase, β-amylase và một loại enzyme cắt nhánh ñể thuỷ phân hoàn toàn tinh bột. Amylase ñược chia ra làm 2 nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase: bao gồm α-amylase (EC 3.2.1.1) tham gia phân cắt mối liên kết α-1,4- glucosid. Các enzyme thủy phân liên kết α-1,6-glucosid bao gồm isoamylase (EC 3.2.1.68) hay pullulanase (EC 3.2.1.41). Exoamylase: gồm β-amylase (EC 3.2.1.2) tham gia phân cắt tinh bột ñã dịch hóa và dextrin thành maltose, glucoamylase (EC 3.2.1.3) còn gọi là amyloglucosidase tham gia phân hủy dextrin thành glucose (Nguyễn ðức Lượng, 2002). Tốc ñộ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt ñộ, tốc ñộ polymer hoá của cơ chất. Các amylase từ các nguồn khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt ñộ hoạt ñộng, pH tối ưu, các ñặc ñiểm thuỷ phân, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối của quá trình thuỷ phân sẽ khác nhau. 2.1.2.3 Hoạt ñộng của amylase Enzyme amylase là nhóm enzyme tham gia thủy phân tinh bột. Cơ chế chuyển hóa tinh bột bởi nhóm enzyme này ñược tóm tắt như sau: Tinh bột α-amylase Pullulanase Dextrin không nhánh Dextrin + Oligosaccharide Dextrin β-amylase Amyloglucosidasese Glucose maltose Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 6 CH2OH H H H H H OH OH CH2OH H H H H H OH OH H2O OH- H+ + Amylase phân cắt α-1,4-glucosid CH2 H H H H OH OH CH2OH H OH H H H H2O OH- H+ + Amylase phân cắt α-1,6-glucosid Hình 5 Cơ chế cắt liên kết α-1,4 và α-1,6-glycosid của amylase 2.1.2.4 Cơ chất của amylase Cơ chất enzyme amylase tác dụng ñó chính là tinh bột và glycogen +Tinh bột: Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật chủ yếu trong các loại củ (khoai lang, khoai tây...), các loại ngũ cốc, các loại hạt, và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau ñều có cấu tạo từ amylose và amylopectin. Các loại tinh bột ña số có 20-30% amylose và 70-80% amylopectin. Trong thực vật tinh bột ñược xem như là chất dự trữ năng lượng quan trọng. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn hợp tinh bột bị ñun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hoá và ñược gọi là hồ tinh bột. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucosid bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức ñộ: dịch hoá và ñường hoá. Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị ñường hoá thì sản phẩm là maltose và glucose. + Glycogen Glycogen ñược cấu tạo từ các glucose liên kết nhau bởi liên kết α-1,4-glucosid. Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucosid. Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2-3 triệu. Glycogen dễ tan trong nước. Ở ñộng vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan. 2.1.2.5 Phân loại enzyme Amylase Amylsase có nhiều loại khác nhau, ở ñây ta chỉ nghiên cứu sâu vào 2 loại amylase sử dụng chủ yếu trong thí nghiệm là α-amylase và glucoseamylase + α-amylase (EC 3.2.1.1) Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 7 Là enzyme có khả năng xúc tác phản ứng phân cắt liên kết α-1,4-glucosid ở dạng cơ chất nên gọi là endoamylase hay enzyme nội bào. Khi tác dụng lên tinh bột một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào và giải phóng ra glucose dạng α nên ñược gọi là α-amylase. Enzyme α-amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ tinh bột mà còn phân huỷ cả hạt tinh bột nguyên vẹn chưa xử lý nhưng với tốc ñộ rất chậm. Sự thuỷ phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai ñoạn. Giai ñoạn ñầu chỉ một số liên kết trong cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin, ñộ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh (gọi là giai ñoạn dịch hóa cả amylose và amylopectin ñều bị dịch hóa nhanh). Sau ñó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục cho ra các tetra, trimaltose không cho màu với iod. Các chất này bị thủy phân rất chậm cho tới di và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau ñó các chất này bị phân cắt nên chuỗi bị ngắt dần và tạo thành maltotetraose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thuỷ phân amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylase không phân cắt ñược liên kết α-1,6-glucosid ở mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lên sản phẩm lâu thì sản phẩm cuối ngoài ñường glucose, maltose còn có các dextrin phân tử thấp và isomaltose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ chuyển hóa thành maltose, maltosetriose, maltosetetraose và một số dextrin phân tử thấp (không cho màu với iod). Tuy nhiên thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp và maltose. Các giai ñoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột bởi α-amylase Các giai ñoạn dextrin hoá Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp Giai ñoạn ñường hoá Dextrin tetra-và trimaltose
di- và monosaccharide Amylose oligosaccharide
polyglucose
maltosetetraose
maltosetriose
maltose. Khả năng dextrin hoá của α-amylase rất cao do ñó người ta còn gọi α-amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá. α-amylase α-amylase α-amylase Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 8 Hình 6 Cơ chế tác ñộng của α-amylase lên tinh bột Một số ñặc tính của enzyme α-amylase: - Enzyme từ các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau - Enzyme α-amylase có ít methionine và khoảng 7-10 gốc cystine - Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng - Protein của các α-amylase có tinh acid và có tinh chất của globuline - ðiểm ñẳng diện nằm trong vùng pH 4,2-5,7. Khối lượng phận tử của α-amylase khoảng 45-59 KDa - Mỗi phân tử α-amylase ñều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn ñịnh cấu trúc bậc 3 của enzyme duy trì hoạt ñộng của enzyme. Do ñó, Ca2+ còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác ñộng bởi các tác nhân gây biến tính và tác ñộng của enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt ñộ hơn các amylase khác. ðặc tính này có liên quan ñến hàm lượng Ca2+ trong phân tử. Tất cả các amylase ñều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+... Chỉ trong trường hợp ứng dụng α-amylase của mầm (malt) mới cần thêm ion Ca2+ ñể hoạt hóa enzyme. Vì ở ñây ion Ca2+ liên kết với phân tử men không bền vững. - ðiều kiện hoạt ñộng của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. ðộ bền với acid của α-amylase malt kém hơn so với của α-amylase nấm mốc. ðộ bền của α-amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ và pH. Tuy nhiên so với các loại amylase khác thì ñộ bền với nhiệt ñộ α-amylase cao hơn. Ở 00C và pH 3,6, α-amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính, α-amylase nấm mốc và malt hoạt ñộng tốt nhất ở nhiệt ñộ 58-600C. Do ñó, trong sản xuất rượu, người ta thường dùng malt ñể ñường hóa cơ chất ở nhiệt ñộ 60-650C. Amylose Amylopectin Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 9 Trong ñề tài nghiên cứu này ta sử dụng enzyme α-amylase dưới dạng chế phẩm enzyme từ vi sinh vật với tên gọi cụ thể là Termamyl 120L, loại chế phẩm này có những ñặc tính như sau: Loại enzyme chịu nhiệt ñộ cao (95-1050C) Liều lượng sử dụng 0,05-0,1% pH hoạt ñộng là 3,5-7,5 Hoạt ñộng ổn ñịnh trong dung dịch enzyme có 50-70 ppm Ca2+ Chế phẩm ở dạng lỏng + β-amylase (EC 3.2.1.2) Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glucosid từ ñầu không khử của mạch polymer, tạo thành ñường β-maltose. Sự thủy phân sẽ không xảy ra hoàn toàn ñối với amylopectin. Phản ứng sẽ dừng ở ñiểm phân nhánh. + Glucoamylase (EC 3.2.1.3, γ-amylase hay amyloglucosidase) Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucosid. Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lược từng phân tử glucose ra khỏi ñầu không khử của mạch ñể tạo glucose. Glucoamylase là ezyme ngoại bào. Ngoài liên kết α-1,4 và α-1,6-glucosid, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3-glucosid. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các amylase khác. Các polysaccharide có nhánh như amylopectin, glycogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân rất nhanh. ða số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5-5,5 và nhiệt ñộ 500C. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không ñược bảo vệ bởi Ca2+. Với ñề tài nghiên cứu này ta sử dụng enzyme glucoamylase dưới dạng chế phẩm enzyme từ vi sinh vật với tên gọi cụ thể là AMG 300L. + Isoamylase (EC 3.2.1.68) Xúc tác thủy phân liên kết α-1,6-glucosid của amylopectin, sản phẩm là những chuỗi polysaccharide mạch thẳng. Trong thực tế, ñược sử dụng kết hợp với glucoamylase ñể phá vỡ hoàn toàn tinh bột. + Pollulanase (EC 3.2.1.41) Xúc tác thủy phân liên kết α-1,6-glucosid của pullulan và amylopectin tạo thành maltriose và polysaccharide mạch thẳng. Mặc dù isoamylase và pullunase có cùng kiểu cắt ñứt mạch amylopectin những tính chọn lọc của chúng là khác nhau, isoamylase chủ yếu cắt ñứt liên kết α-1,6-glucosid nối những mạch dài còn pullunase cắt ñứt nối những mạch ngắn hơn. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 10 2.1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình 7 Nấm men Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men có cấu tạo ñơn bào, sinh sản bằng cách nảy chồi, khi gặp ñiều kiện không thuận lợi thì sinh bào tử. Về sinh dưỡng: nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con ñường hấp thu có chọn lọc trên bề mặt của tế bào, sau ñó khuếch tán vào bên trong. Tế bào nấm men có hình elip, kích thướt của tế bào nấm men khoảng 8-15µm. ðây là loại nấm men có khả năng lên men nổi, tế bào nấm men lơ lửng trong dịch lên men và tập trung nhiều ở vùng bề mặt, quá trình lên men tạo nhiều bọt khí, nấm men sẽ bám trên bọt khí, ñến một lúc nào ñó bọt khí bị vở ra và do sự chênh lệch về khối lượng riêng nên nấm men sẽ chìm xuống dưới khi ñó nấm men tiếp xúc nhiều với cơ chất tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình lên men. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 11 Bảng 2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men Thành phần Hàm lượng (%) chất khô Cacbon 49,8 CaO 12,4 Nitơ 6,7 Hydro 3,54 P2O5 2,34 K2O 0,04 SO3 0,42 MgO 0,38 Fe2O3 0,035 SiO 0,09 (Nguyễn ðức Lượng, 2002) Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại ñường như: glucose, saccarose, fructose, rafinose, galactose. Chúng có khả năng lên men ở nhiệt ñộ cao (36-400C), chúng có khả năng chịu ñược ñộ acid. ðặc biệt chúng có khả năng chịu ñược thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng ñộ 0,02%-0,025%. ðặc ñiểm này rất thuận lợi khi lên men có sử dụng thuốc sát trùng. ðặc ñiểm quan trọng hơn hết của loại nấm men này là khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn với lượng ñường trong dung dịch từ 12-18% có khi cao tới hơn 22%, nhiệt ñộ lên men thích hợp là 28-320C và thời gian lên men ngắn. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 12 2.2 QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP THAN 2.2.1 Quy trình sản xuất chung Pha nước (tỉ lệ 1 nếp: 4 nước) Gạo nếp than nghiền mịn Dịch hóa (sử dụng enzyme α-amylase) ðường hóa (sử dụng enzyme glucoamylase) Lọc bỏ bã nếp ðiều chỉnh pH (4,5-5,0) và ñộ Bx =22o Thanh trùng (80-850C, 30 phút) Làm nguội (30-330C) Bổ sung Nấm men Lên men chính Chiết rút Lên men phụ (Bổ sung 0,5-1g acidsorbic/kg sản phẩm) Sản phẩm Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 13 2.2.2 Thuyết minh quy trình - Nếp than nghiền mịn cho tinh bột dễ dàng tiếp xúc với enzyme, bổ sung nước vào theo tỉ lệ 1 nếp: 4 nước ñể hòa tan tinh bột - Dịch hóa bằng enzyme α-amylase trong 30 phút làm cho dịch cháo loãng ra do tinh bột bị α-amylase phân cắt thành những dextrin mạch ngắn với tốc ñộ rất nhanh - Sau ñó tiến hành ñường hóa dịch nếp bằng enzyme glucoamylase trong 30 phút khi ñó tinh bột trở thành những phân tử glucose và glucose chính là cơ chất nấm men có thể sử dụng ñể lên men thành rượu - Sau khi ñường hóa xong lọc bỏ bả nếp, thu dịch trong do bả nếp có nhiều chất xơ sẽ ngăn cản quá trình lên men của nấm men. Tiếp theo ta ñiều chỉnh ñộ Brix, pH của dung dịch thích hợp cho lên men (ñộ Bx=22o, pH 4,5-5,0) bằng ñường saccharose và acid citric ñể chuẩn bị cho lên men - Thanh trùng dịch ñường ở 80-850C trong 30 phút ñể hạn chế những vi sinh vật gây lên men tạp trong dịch lên men, và sau ñó ñể nhiệt ñộ dịch ñường giảm xuống còn 30-330C ta tiến hành bổ sung nấm men vào thực hiện quá trình lên men rượu - Sau khi kết thúc quá trình lên men chính tiến hành chiết rượu và lên men phụ, thời gian lên men phụ này làm cho sản phẩm ñược ổn ñịnh về ñộ rượu, ñộ trong, mùi vị... ñồng thời khi có sự bổ sung acid sorbic vào ñể giữ màu của sản phẩm và làm cho sản phẩm ổn ñịnh và ít bị biến ñổi trong thời gian bảo quản do loại acid này có tính xác trùng mạnh ñối với nấm men và nấm mốc. 2.3 CÁC QUÁ TRÌNH XẢY RA CHỦ YẾU TRONG SẢN XUẤT RƯỢU 2.3.1 Quá trình dịch hóa 2.3.1.1 Cơ sở lý luận Tinh bột của các loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn,…có lớp màng bền vững bảo vệ nó khỏi bị men amylase tác dụng. Mặt khác, ở trạng thái bình thường tinh bột không ở trạng thái hòa tan nên sự tác dụng của men amylase lên nó rất yếu. Muốn tăng cường quá trình ñường hóa cần phải phá vở cấu trúc tế bào chuyển tinh bột về trạng thái hòa tan và ñến lúc ñó enzyme α-amylase ñã ñược bổ sung vào sẽ hoạt ñộng phân cắt những hạt tinh bột thành dextrin mạch ngắn và một lượng nhỏ ñường glucose tạo thuận lợi cho quá trình ñường hóa. 2.3.1.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình dịch hóa Qua nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng, khi ñun tinh bột với nước lên tới 400C, hạt tinh bột bắt ñầu trương nở. Nếu tiếp tục tăng nhiệt ñộ, thể tích của hạt tinh bột tiếp tục tăng, mối liên kết giữa các phần tử của hạt tinh bột yếu dần và tới một lúc nào ñó thì các phần tử tinh bột ñược tan ra trong dung dịch. Hiện tượng tan ra của tinh bột này gọi là hiện tượng hồ hóa. Khi tinh bột bị hồ hóa thì enzyme α-amylase hoạt ñộng và phân cắt tinh bột thành những mạch ngắn làm dịch cháo loãng ra. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 14 2.3.2 Quá trình ñường hóa 2.3.2.1 Cơ sở lý luận Trong quá trình sản xuất rượu, tế bào nấm men không có khả năng chuyển hóa tinh bột, hồ tinh bột thành rượu. Chúng chỉ có khả năng sử dụng ñường, chuyển ñường thành rượu. Vì vậy sau khi dịch hóa, dịch tinh bột cần ñược chuyển thành ñường trước khi lên men. Về lý thuyết, sự chuyển tinh bột thành ñường có thể xảy ra nhờ sự xúc tác của các chất hóa học (acid, bazơ) hoặc men amylase. Trong sản xuất rượu, người ta chỉ sử dụng enzyme amylase ñể ñường hóa. 2.3.2.2 Những biến ñổi xảy ra trong quá trình ñường hóa Sau khi dịch hóa tinh bột chủ yếu bị biến ñổi thành những dextrin mạch ngắn và một phần glucose khi ở vào thời ñiểm thích hợp cho glucoamylase hoạt ñộng thì các enzyme này sẽ tiến hành phân cắt dextrin và tạo ra sản phẩm chủ yếu là ñường glucose ñể chuẩn bị cho quá trình lên men. 2.3.3 Quá trình lên men rượu 2.3.3.1 Khái quát về quá trình lên men rượu Lên men rượu là một quá trình trao ñổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (ñược sinh ra từ sự trao ñổi chất ñể duy trì sự sống của nấm men). Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí. - Lên men yếm khí: là sự phân hủy ñường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, len men rượu, butylic… - Lên men hiếu khí: là sự phân hủy ñường có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men acid acetic, citric… Lên men rượu, bia ñều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa ñường thành rượu etylic và CO2. Nguời ta còn gọi lên men là quá trình cồn hóa, rượu hóa. Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kỳ chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai ñoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng). - Thời kỳ lên men chuyển ñường thành rượu và CO2: giai ñoạn này, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình ñể thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao ñổi chất ñể duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2. 2.3.3.2 Cơ chế của quá trình lên men ðể lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất ñịnh. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải ñạt ñược >100 triệu tế bào trong 1 ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 15 mạnh. ðuờng lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên ñược hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau ñó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ ñược tạo thành. Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường, CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt ñộ 25 – 300C là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng ñạt ñược trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, ñến lúc nào ñó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi ñến bề mặt, do có sự thay ñổi ñột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men ñủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái ñộng, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường ñiều này làm cho quá trình trao ñổi chất diễn ra nhanh hơn, khi ñó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang ñiện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men ñiều ảnh hưởng ñến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng ñến quá trình lên men. 2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men: Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng ñến quá trình lên men rượu như sau: + Nồng ñộ ñường Nấm men chỉ có khả năng lên men ñường thành rượu trong khoảng nồng ñộ thích hợp từ 10 – 22%, nồng ñộ ñường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng ñộ ñường 30 – 35%, nồng ñộ ñường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men. + Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ðể thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộng sống của nấm men, cụ thể nấm men Saccharomyces cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu. Nấm men chủng XII phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 30 – 330C nhiệt ñộ tối ña là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men ñược nuôi cấy ở nhiệt ñộ thấp hơn nhiệt ñộ tối ưu ở 17–220C có năng lực lên men rất lớn. ðối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu ñược giới hạn nhiệt ñộ khá rộng từ 1-450C. Nếu nhịêt ñộ quá 500C nấm men sẽ chết. + Ảnh hưởng của acid (pH) Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2-8 nhưng thích hợp nhất là 4- 4,5. Vi khuẩn bắt ñầu phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu ñể ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH 3,8-4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần ( Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 16 thuần hoá) với ñộ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng ñiều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. ðể tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh ñến trung tâm hoạt ñộng của nấm men. + Ảnh hưởng của nồng ñộ rượu Nồng ñộ rượu sinh ra có ảnh hưởng ñến tốc ñộ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng ñộ rượu ảnh hưởng ñến tốc ñộ phát triển riêng của nấm men còn phù thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, ñiều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng ñộ rượu ban ñầu 1% chưa có ảnh hưởng ñến tốc ñộ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4– 6% ñã có ảnh hưởng xấu. + Ảnh hưởng của oxy Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong ñiều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men ñường tạo thành rượu và CO2, còn trong ñiều kiện ñầy ñủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa ñường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2. Oxy là thành phần không thể thiếu ñược ở giai ñoạn phát triển sinh khối. Tuy nhiên, nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai ñoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai ñoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển. 2.3.3.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men + Sự tạo thành acid Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyrovic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid latic. Acid acetic có thể ñược tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic trong ñó 1 phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai sẽ bị khử: CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic ñược tạo bởi pyrovat dehydronase theo phản ứng: CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 17 Acid citric theo Laphon ñược tạo từ aldehyde acetic. Phản ứng ñược biểu diễn tổng quát như sau: 9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic ñược tạo thành có thể theo hai con ñường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic: 2CH3-COOH + CH3CHO = COOHCH2CH2COOH + C2H5OH Hoặc ñược tạo thành do deamin acid glutamic. Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin. Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic ñược biểu diễn như sau: C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2. Glycerin và aldehyde ñều là sản phẩm trung gian của lên men rượu. Trong ñiều kiện lên men nhằm mục ñích chỉ thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 – 5,2. Với ñiều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn ñường 2 – 3% so với lượng ñưa vào. Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng ñường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và ñường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu ñạt 11,9%. Lên men ñường xảy ra theo phương trình: 2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH + Sự tạo thành rượu bậc cao Một trong những sản phẩm phụ quan trọng ñược tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các alcol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào rượu etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu ñến chất lượng sản phẩm. ðó là các alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic… Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 – 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin. Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao ñược ñơn giản theo phản ứng: R-CH(NH2)-COOH + H2O = RCH2OH + NH3 + CO2. Như vậy việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến ñổi của acid amin xảy ra trong ñiều kiện yếm khí chỉ có thể ñồng thời với lên men rượu, sự tạo thành alcol cao phân tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau ñó mất CO2 và cuối cùng aldehyde bị khử ñể tạo ra alcol. Bằng con ñường tương tự, nhiều acid amin cũng ñược tạo thành như valin và isoleucin…chúng là tiền ñề ñể tạo ra các alcol bậc cao sau này. Thực ra quá trình amin hoá acid pyrovic xãy ra rất phức tạp, qua nhiều giai ñoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau. Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác ñộng cho các quá trình khác tiếp theo. + Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác Sự tạo thành ester Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 18 Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau ñể tạo ra những ester tương ứng. Phương trình tổng quát: R1CH2OH + R2COOH = R2COO-CH2R1 + H2O Este etylic có thể ñược tạo thành do alcol etylic kết hợp với acid acetic hoặc là do sự tham gia phản ứng của các aldehyde. Sự tạo thành metanol Trong quá trình nấu nguyên liệu, các chất pectin este của acid polygalacturonic bị thủy phân tạo thành acid pectic và alcol metylic. Sự tạo thành fufurol ðường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccarose, glucose, fructose và một ít maltose ñược tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt ñộ cao các ñường sẽ bị phân hủy và mất nước ñể tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin. ðường pentose bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol. Sự tạo thành aldehyde Là sản phẩm của quá trình trao ñổi chất ở nấm men và cũng có thể ñược tạo thành qua con ñường oxy hóa các loại rượu chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde. Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay ñổi theo nhiệt ñộ, pH, mức ñộ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. 2.4 SẮC TỐ ANTHOCYANIN TRONG RƯỢU VANG NẾP THAN 2.4.1 Cấu tạo của anthocyanin Anthocyanin là sắc tố tan trong nước, rất phổ biến trong thực vật, có màu ñỏ, xanh da trời, màu do sự phối hợp giữa ñỏ và xanh (thành màu tím), có trong trái cây, hoa, và những mô thực vật. ðây là chất màu có rộng rãi trong thực vật ở khắp nơi trên thế giới. Anthocyanin là glycosid của các anthocyanidin với monosaccharide, di và trisaccharide. Anthocyanidin ít tan trong nước hơn anthocyanin và không thấy tự do trong tự nhiên. Anthocyanin là các dẫn xuất polyhydroxy và methoxy của flavylium. Trong thực phẩm có 6 anthocyanidin phổ biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), nó khác nhau do ñộ hydroxyl và methoxyl hóa vòng B. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 19 Hình 8 Công thức cấu tạo của anthocyanidin 2.4.2 Tính chất của anthocyannin Màu của anthocyanin ñược xác ñịnh bởi cấu trúc hóa học và môi trường bên ngoài. Có thể hai anthocyanin khác nhau cho màu giống nhau hay hai anthocyanin giống nhau lạ