Seminar chủ đề: Agarose

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 14/03/2014 ‹#› SEMINAR Chủ đề: agaROSE GVHD: Th.s Nguyễn Thị Vân AnhSVTH: Nguyễn Thị Bảo Uyên Ứng dụng của Điện di Điện di thuốc trị liệu Điện di protein Một số ứng dụng khác kỹ thuật rất hữu ích sử dụng nhằm phân tích xác định và tinh sạch các đoạn DNA Chữa bệnh vào cơ thể hoặc lấy các ion thuốc có hại ra khỏi cơ thể Tác dụng của dòng điện một chiều: Làm giãn mạch Tác động lên hệ thần kinh Tác dụng của ion thuốc: Không gây tổn thương da Không gây đau, không lây truyền các bệnh đường máu Giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bật của lúa như mùi thơm, protein, amilose Giúp thực hiện công tác chọn lọc tao giống lúa thuần rẻ tiền và hiệu quả cao Chọn ra được giống nếp bè năng suất cao hơn 15% và protein trên 10% Ở mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh học, trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein Vì vậy việc tìm hiểu, phân tích các phân tử DNA, RNA là rất cần thiết. Khi hiểu rõ cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất các hợp chất thứ cấp dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh….. ĐIỆN DI LÀ GÌ? Nguyên tắc thực hiện Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thướt lỗ của thể nền (gel)  Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốckhác nhau nhờ vào sự khác nhau của: •Lực điện trường tác động lên chúng(nếu các phân tử tích điện khác nhau) •Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel •Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử Phương pháp điện di Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb Ngoài ra còn điệndi trong trường xung (PFGE Pulse Field GelElectrophonesic) ĐiệN di trên gel agarose Agarose -Agarose(polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da -Polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose -Cấu trúc agarose không đồng nhất: vừa tích điện vừa trung hòa. trong phân tử có chứa nhóm sunfat, metoxyl, cacboxyl. hàm lượng sunfat trong agarose được coi là chỉ số độ sạch của agarose. chỉ số này càng thấp thì chất lượng càng cao. thường trong agarose có chứa 0.04% sunfat-Agarose là một polyme trung tính tạo nên tính đông tụ của agar Agarose được tách ra ở dạng thạch từ một số loài biển đỏ tảo, hoặc rong biển, được tìm thấy tại California và miền đông châu Á. Agarose gel   Agarose gel là một loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 20 kb. Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel  Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNAnhỏ và ngược lại Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau Kích thước phân tử Cấu hình DNA Nồng độ agarose Thành phần thực hiện điện di Agarose Lược Khuôn gel Máy điện di Quy trình điện di Chuẩn bị agarose Đặt mẫu DNA vào giếng Nhuộm DNA bằng EtBr Quan sát và chụp hình Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp  Dễ dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp Dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP) hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphate 8                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE Các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chấtcho các enzyme naỳ Khi tăng điện thế của quá trình điện di các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ từ cực âm đến cực dương   Quan sát sự dịch chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di. Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. EtBr được dùng đê ̉phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn Tuy nhiên ái lực của thuốc nhuộm đối với nucle acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu suất huỳnh qang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel Một số phương pháp thu hồi DNA agarose gel Agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp Chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa Dung dịch gel có DNA Bổ sung muối đến nồng độ 0,5M Đoạn DNA quan tâm Cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1 Cắt 1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp   Agarose gel chứa bằng DNA Dung ly DNA ra khỏi màng Rửa cột vài lần DNA liên kết với màng Ly tâm ở 10.000-15.000 rpm trong10-15 phút. Cho vào tube ly tâm Đoạn DNA quan tâm Cho vào đệm chiết làm nóng hòa tan Thủy tinh đặt trong một cột lọc 2. Ly tâm Cắt một rãnh nhỏ phía trước băng DNA quan tâm Tách chiết DNA bằng phenol và kết tủa Rửa mẫu giấy và dung ly DNA trong đệm Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào mẫu giấy Đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45 Cắt một rãnh nhỏ trước băng DNA quan tâm Làm đầy bằng glycerol Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol Chiết dung dị ch glycerol-DNA bằng pipette 3. Điện di vào bẫy Cách 1 Cách 2 Hòa tan gel trong dung dịch muối NaI (4 M) DNA liên kết với hạt thủy tinh Tách chiết DNA bằng phenol và kết tủa Dung ly DNA ra khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp Bổ sung hạt thủy tinh vào dung dịch Rửa và kết tủa tiểu thể 4. Dùng hạt thủy tinh Ứng dụng của điện di agarose gel Ưu điểm và nhược điểm Kết luận Phương pháp điện di giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA. Nhờ phương pháp này mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả. Có nhiều loại khuôn đỡ được áp dụng cho kỹ thuật này. Nhưng mỗi loại phân tử khác nhau sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau. Điện di agarose gel là phương pháp tối ưu nhất đối với DNA Cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe !