Seminar enzyme protease

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 1 SEMINAR ENZYME PROTEASE An Giang, Tháng 03.2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN SEMINAR ENZYME PROTEASE GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Th.S Nguyễn Phú Thọ Th.S Lê Hoàng Bảo Ngọc NHÓM 1 1. Bung San Ny Thanh Hồng Anh 2. Trương Thị Ngọc Hân 3. Lê Thị Đẹp 4. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh 5. Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa 6. Nguyễn Hoàng An 7. Trần Văn Phận 8. Nguyễn Phú Hơn 9. Nguyễn Minh Luân 10. Trần Thanh Tiền An Giang, Tháng 03.2013 i Mục lục Nội dung Trang Mục lục ....................................................................................................................................... i Danh sách hình .......................................................................................................................... iii Chương 1: Giới thiệu ................................................................................................................ 1 Chương 2: Tổng quan về enzym Protease ............................................................................... 2 2.1. Đặc điểm chung ................................................................................................................... 2 2.2. Phân loại .............................................................................................................................. 3 2.3. Quy trình thu nhận protease ................................................................................................. 4 Chương 3: Thu nhận protease ................................................................................................. 5 3.1. Thu nhận protease từ thực vật .............................................................................................. 5 3.1.1. Bromelin ........................................................................................................................... 5 3.1.2. Papain ............................................................................................................................... 6 3.1.3. Ficin ................................................................................................................................. 7 3.2. Nguồn protease từ từ động vật ............................................................................................. 9 3.2.1. Pepsin ............................................................................................................................... 9 3.2.2. Rennin ............................................................................................................................ 10 3.2.3. Pancreatin ....................................................................................................................... 11 3.2.4. Trypsin ........................................................................................................................... 12 3.2.5. Chymotrypsin ................................................................................................................. 13 3.3. Nguồn protease từ vi sinh vật ............................................................................................. 14 3.3.1. Đặc điểm chung .............................................................................................................. 14 3.3.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ................................................................ 14 3.3.3. Một số loại enzyme vi sinh vật: ....................................................................................... 15 Chương 4: Tình hình nghiên cứu - Ứng dụng enzym protease ............................................. 17 4.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease .............................................................................. 17 4.1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước .......................................................... 17 ii 4.1.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Protease trên thế giới: ...................................................... 17 4.2. Ứng dụng enzyme protease ................................................................................................ 18 4.2.1. Trong công nghiệp sữa .................................................................................................... 18 4.2.2. Trong chế biến nước mắm ............................................................................................... 19 4.2.3. Trong công nghiệp chế biến thịt ...................................................................................... 19 4.2.4. Trong công nghiệp dệt .................................................................................................... 19 4.2.5. Trong sản xuất bia........................................................................................................... 20 4.2.6. Trong công nghiệp da ..................................................................................................... 21 4.2.7. Trong hương phẩn, mỹ phẩm .......................................................................................... 21 4.2.8. Trong y học .................................................................................................................... 22 4.2.9. Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa ............................................................................ 23 4.2.10. Trong một số ngành khác .............................................................................................. 24 Chương 5: Kết luận ................................................................................................................ 25 Tài liệu tham khảo .................................................................................................................. 26 iii Danh sách hình Nội dung Trang Hình 2.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein .................................................. 2 Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease ............................................................................................. 3 Hình 2.3: Quy trình tổng quát thu nhận protease ......................................................................... 4 Hình 3.1: Cấu trúc phần hydrocacbon của bromelin thân dứa ...................................................... 5 Hình 3.2: Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin ......................................... 6 Hình 3.3: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) ................................................................. 6 Hình 3.4: Cấu trúc tâm hoạt động của papain .............................................................................. 6 Hình 3.5: Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhựa sung ................................................. 8 Hình 3.6: Cấu trúc không gian của pepsin A ............................................................................... 9 Hình 3.7: Một số chế phẩm men tiêu hóa pepsin ......................................................................... 9 Hình 3.8: Phomat ...................................................................................................................... 11 Hình 3.9: Một số chế phẩm pacreatin ........................................................................................ 11 Hình 3.10: Cấu trúc không gian của trypsin .............................................................................. 12 Hình 3.11: Trypsin cắt các liên kết tạo ra bởi nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hoặc arginine với nhóm amine (-NH2) của các amino acid bất kì .................................................................... 13 Hình 3.12: Cấu trúc không gian của chymotrypsin .................................................................... 13 Hình 3.13: Cấu trúc không gian của subtilisin ........................................................................... 15 Hình 3.14: Cấu trúc tâm hoạt động của subtilisin ...................................................................... 15 Hình 3.15: Chế phẩm từ collagenase ......................................................................................... 16 Hình 4.1: Một số loại Phomat ................................................................................................... 18 Hình 4.2: Một số loại nước mắm điển hình ............................................................................... 19 Hình 4.3: Một số loại bia .......................................................................................................... 20 Hình 4.4: Sơ đồ khái quát quy trình sản xuất bia ....................................................................... 20 Hình 4.5: Các giai đoạn làm sạch lông ...................................................................................... 21 Hình 4.6: Mỹ phẩm chứa collagen ............................................................................................ 21 iv Hình 4.7: Thuốc có chứa enzyme papain .................................................................................. 22 Hình 4.8: Thuốc có chứa bromelin ............................................................................................ 23 Hình 4.9: Thuốc có chứa chymotripsin ..................................................................................... 23 Hình 4.10: Sản xuất bánh kẹo ................................................................................................... 24 1 Chương 1: Giới thiệu Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid. Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây. 2 Chương 2: Tổng quan về enzym Protease 2.1. Đặc điểm chung Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein và peptide. Cơ chế thủy phân như sau: Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và có thể trở thành hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, khi đó sự thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzym chuyển sang trạng thái hoạt động. Hình 2.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. 3 2.2. Phân loại Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) . Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng: Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta chia protease làm 2 nhóm chính: Endopeptidase (proteinase): Chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ. Exopeptidase (polypeptidase): Chủ yếu phân cắt peptide ở hai đầu mạch. Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các nhóm: Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid. Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm. Protease trung tính: papain, … hoạt động ở vùng pH trung tính. 4 2.3. Quy trình thu nhận protease Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu Protease thô và tinh sạch protease. Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì ta nghiền , trích ly rồi ly tâm. Còn với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào rồi đem ly tâm. Tinh sạch protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần không phải protease ra khỏi thành phần protease. Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết. Hình 2.3: Quy trình tổng quát thu nhận protease 5 Chương 3: Thu nhận protease 3.1. Thu nhận protease từ thực vật Thực vật có nguồn enzym đã được loài người hiểu biết và ứng dụng từ rất lâu. Cho đến nay, người ta đã thu nhận enzym từ thực vật để ứng dụng vào các sản xuất khác nhau chủ yếu là nhóm protease. Một số protease phổ biến được thu từ nguồn thực vật: Bromelin, papain, ficin… 3.1.1. Bromelin Bromelin là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 maltose, 2 glucosamine, 2 xylose và 1 fructose. Hình 3.1: Cấu trúc phần hydrocacbon của bromelin thân dứa Bromelin có trung tâm hoạt động chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S-S-. Hoạt tính của bromelin là do nhóm sulfhydryl trong trung tâm hoạt động quyết định. Bromelin có 3 hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase và esterase. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelin: Cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết… Bromelin có nhiều ở trong thân và quả dứa. Hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi quả chín, do đó thu hoạch trái dứa vào khoảng thời gian này sẽ cho năng suất enzym cao. Bromelin thân được thu từ dịch rút ra từ thân cây dứa, trung bình có thể thu được 3,6kg bromelin từ 378 lít nước rút ra từ thân cây dứa. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin được thực hiện theo sơ đồ sau: 6 Hình 3.2: Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin 3.1.2. Papain Hình 3.3: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) Là một protease-thiol, trung tâm hoạt động có nhóm –SH. Chính nhóm này quyết định hoạt tính của papain. Hình 3.4: Cấu trúc tâm hoạt động của papain Theo R. L. Hill và E.L. Smith, Papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amyno acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton. 7 Enzym papain được thu từ nguồn nguyên liệu là cây đu đủ (Carica papaya). Nhựa cây đu đủ là hỗn hợp enzym chứa các protease: Papain, chymopapain, proteinase III, proteinase IV, thiolprotease… Trong đó papain chiếm 95% hàm lượng hỗn hợp enzym này. Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất và hoạt tính enzym cao nhất. Hoạt tính của papain phụ thuộc vào các yếu tố sau: Nhiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3h ở 1000C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,50C và nếu tăng nhiệt độ cao hơn nó sẽ mất hoàn toàn hoạt tính do cấu trúc trung tâm hoạt động bị phá hủy hoàn toàn. Khi thủy phân các protein khác nhau thì nhiệt độ phản ứng thích hợp cho papain cũng khác nhau. pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Papain dạng ổn định tức dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5. Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% và cũng không thay đổi độ nhớt trong methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình papain. Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochcloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. 3.1.3. Ficin Enzym ficin được thu từ nguồn nguyên liệu là cây sung, vả (Ficus), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales. Cây sung xuất xứ từ vùng Tây Á và phân bố khắp vùng Địa Trung Hải. Ở Việt Nam có nhiều lồi sung khác nhau: sung (Ficus racemosa L), sung trổ (Ficus variegata), sung ba thuỳ (Ficus hirta), sung thằn lằn (Ficus pumila L), vả (Ficus auriculata lour). Ficin được chiết tách từ nhựa sung. Hầu hết các bộ phận của cây đều có chứa nhựa. Người ta có thể thu ficin từ nhựa của lá, thân và quả sung. Ở dạng nhựa tươi, ficin dẽ bị oxi hóa bởi không khí làm cho dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị gỉam xuống. Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả Ascaris sống đều có thể bị thủy giải bởi enzim ficin. Ficin còn có thể thủy gỉai các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo. 8 Hoạt tính của papain phụ thuộc vào các yếu tố sau: Nhiệt độ: Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzym, tốc độ phản ứng của enzym tỷ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ. Nhiệt độ hoạt động: 30 - 800C. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt tính xúc tác 50 - 650C. Ficin có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2 giờ ở 500C. Độ pH: pH hoạt động của ficin rộng: 4 – 9,5 (dịch nhựa sung có pH = 5); pH tối thích của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzim: gelatin: pHopt = 5; casein: pHopt = 9,5; hemoglobin: pHopt = 7. Các yếu tố hoạt hóa: Hoạt tính của ficin tăng lên khi có mặt của các nhân tố: kim loại, cyanide, cysteine, mercaptoethanol, 1,2-dimercaptopropanol. Các yếu tố kìm hãm: Enzym sẽ bị bất hoạt khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalemnide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay iodoacetamide. Hình 3.5: Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhựa sung 9 3.2. Nguồn protease từ từ động vật Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…) 3.2.1. Pepsin Pepsin hoạt đợng trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin. Hình 3.6: Cấu trúc không gian của pepsin A Pepsin là một mạch polypeptide đơn giản hợp thành bởi 329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleusine, có thể cuộn lại thành hình cầu, rất ít xoắn cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc bốn cũng gồm có bốn tiểu phần; pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm carbonxyl của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin. Chế phẩm pepsin được tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua. Hình 3.7: Một số chế phẩm men tiêu hóa pepsin 10 Pepsin xúc tác trực tiếp sự thủy giải protein, tạo thành chủ yếu những peptide ngắn, có ít hay không có amino acid tự do. Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein tạo sản phẩm pepton có trọng lượng phân tử nhỏ. Tính chất đặc hiệu của pepsin thể hiện ở chỗ là pepsin chỉ cắt những liên kết peptide tạo thành do amino acid thơm như tyrosin, phenylalanine, tryptophan liên kết với các amino acid khác. Ngoài ra pepsin còn thủy phân liên kết giữa Ala-Ala, Ala-Ser, nó cũng cắt liên peptide giữa Leu- Val, Val-Cis, Glu-Asn, Leu-Glu, nhưng ở mức độ thấp hơn. Cũng như nhiều protease khác ngồi việc phân cắt được liên kết peptid, pepsin có khả năng phân cắt cả liên kết ester (Losins và cộng sự, 1954), hay có thể làm đông tụ sữa (Teply và cộng sự, 1980). Ngoài ra pepsin còn gây ra sự phân giải protein ở một số enzyme như: trypsin, pepsin, amylase… Ngòai khả năng thủy phân các protein tự nhiên, pepsin còn thủy phân nhiều cơ chất tổng hợp. Hoạt tính của papain phụ thuộc vào các yếu tố sau: pH: Pepsin là một protease acid điển hình, hoạt động ở vùng pH acid từ 1- 4, pH thích hợp của pepsin khoảng 1,5 – 2,4. Đối với cơ chất thì pH thích hợp có thể thay đổi. Nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ thích hợp tối ưu khoảng 40 – 500C. Các lọai muối và các dung môi hữu cơ Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hóa của pepsin.Trong sự pepton hóa, HCl là acid gây ra sự thủy phân mạnh nhất, kế đó là HNO3, HBr, H2SO4, H3PO4, các acid lactic, formic,…gây tác động kém hơn. Các muối kim loại nặng như Pb, Hg, Pt ở nồng độ rất thấp vẫn có thể gây kết tủa và làm biến tính enzym. Chất sát khuẩn: Chất sát khuẩn như HCN, salisilic acid, cloroform…với lượng nhỏ thì không ảnh hưởng đáng kể đến pepsin. Nhưng khi với liều cao chúng làm giảm đáng kể hoạt tính của pepsin. Các chất kìm hãm: Tất cả các chất gây biến tính protein đều là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzim nói chung và của pepsin nói riêng. 3.2.2. Rennin Rennin là một protease acid tính, là thành phần chủ yếu của rennet chiết rút từ ngăn thứ tư của dạ dày bê. Rennin đặc biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu là casein của sữa) và còn có tên gọi là enzym đông tụ sữa điển hình. 11 Hình 3.8: Phomat Enzym này do chính tế bào chính của tuyến dạ dày tiết ra, enzym này dùng để tiêu hóa sữa cho các con vật mới sinh ra. Khi con vật lớn, bắt đầu ăn thì rennin được thay thế bởi pepsin. Các liên kết hydro đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động. Thành phần hóa học, rennin chứa nhiều amino acid tính acid hơn amino acid tính kiềm, nhưng tỉ lệ thấp hơn so với pepsin. Ngoài ra, rennin chứa nhiều prolin, serin và trong phân tử có chứa tới ba cầu disulfur. Rennin thể hiện tính acid nhưng yếu hơn pepsin. Đặc hiệu thủy phân: Rennin chỉ thủy phân những liên kết peptide và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amine. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và phenylalnine. Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa. Ở pH = 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 liên kết peptide trong phân tử casein. 3.2.3. Pancreatin Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và người thường trích pancreatin từ tụy tạng của heo. Pancreatin là hệ enzym thủy phân xúc tác các phản ứng chuyển hóa đạm, đường, chất béo và một số chất khác ở trong ruột. Tỷ lệ các enzym này trong dịch tụy người không thay đổi ngoại trừ một vài trường hợp thiếu hụt có chọn lọc của lipase và trysinogen. 1mg pancreatin có khoảng lớn hơn hoặc bằng 25 đơn vị hoạt tính protease, lớn hơn 25 đơn vị hoạt tính amylase và lớn hơn 2 đơn vị hoạt tính lipase. Bột pancreatin là dạng bột vô định hình có màu xám nhạt hay vàng nhạt, có mùi và vị hơi đặc trưng, hòa tan trong nước và không tan trong cồn và chloroform. Hình 3.9: Một số chế phẩm pacreatin 12 Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh và nó hoạt động mạnh nhất trong 2 - 3 giờ sau khi ăn thực hiện quá trình tiêu hóa ở ruột non. Pancreatin có thể pepton hóa nhiều loại thức ăn như sữa, thịt, cháo và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương để dễ tiêu hóa. 3.2.4. Trypsin Trypsin có trong dịch tụy của người và động vật. Trypsin là tiếp tục thủy phân các protein các protein thức ăn còn lại sau khi đã bị thủy phân một phần ở dạ dày. Ở trong máu cũng có một ít trypsin hoạt động. Hình 3.10: Cấu trúc không gian của trypsin pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp cho trypsin là 7,8 – 9,5, ổn định ở 3 – 5. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của trypsin là nhiệt độ cơ thể nhưng nó vẫn hoạt động tốt ở nhiệt độ 30 – 400C, 900C và pH = 6 – 8 thì dung dịch enzym bị mất hoạt tính hoàn toàn. Trong môi trường có pH = 8 có sự hiện diện của Ca thì enzyme ở dạng không hoạt động trở thành dạng hoạt động. Khi không có Ca thì enzyme mất 50% hoạt tính. Ngược lại nếu có Cu, Ag, Hg có tác dụng ức chế enzyme. Trypsin là loại enzyme thủy phân protein không triệt để. Khi sử dụng trypsin thì chỉ có 1/3 liên kết peptide trong phân tử protein bị thủy phân. Trypsin cắt các liên kết được tạo ra bởi nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hay arginine (ngoại trừ nhóm histidine) với nhóm amine (-NH2) của các amino acid bất kì và trypsin không cắt liên kết giữa lysine và arginine. 13 Hình 3.11: Trypsin cắt các liên kết tạo ra bởi nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hoặc arginine với nhóm amine (-NH2) của các amino acid bất kì Các phân tử protein khi bị phân cắt bởi trypsin sẽ tạo ra những peptide có trọng lượng phân tử nhỏ và đôi khi cũng tạo ra các amino acid tự do. Ngòai hoạt động thủy phân liên kết peptide, trypsin còn thủy phân được liên kết ester. 3.2.5. Chymotrypsin Chymotrypsin được tiết ra từ tuyến tụy. Chymotrypsin tiết ra dưới dạng không hoạt động đó là chymotrypsinogen, sau đó chymotrypsin chuyển sang dạng hoạt động nhờ trypsin tác dụng vào. Chymotrypsin được cấu tạo từ ba sợi polypetide: Sợi A: Các amino acid từ 1 –13. Sợi B: Các amino acid từ 16 –146. Sợi C: Các amino acid từ 149 – 245. Các sợi này nối với nhau bởi cầu nối disulfite. Các sợi polypetide nối với nhau tạo thành hình cầu. Hình 3.12: Cấu trúc không gian của chymotrypsin 14 Chymotrypsin là một protease hoạt động trong môi trường có pH kiềm. Chymotrypsin hoat động trong pH = 7 - 9, pH tối ưu là 8 - 9. Hoạt tính của chymotrypsin hơi yếu hơn trypsin nhưng nó lại có khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn. Chymotrypsin xúc tác sự thủy phân liên kết peptide của các phân tử protein. Nó phân cắt có chọn lọc các liên kết peptide trong chuỗi polypeptide ở vị trí đầu C của amino acid có nhân thơm. Chymotrysin hoạt động như một endopeptidase phân cắt các mạch polypeptide thành các peptide ngắn và tác dụng trên những liên kết mà trypsin không phân cắt. Chymotrypsin ngoài khả năng phân cắt peptide, nó còn có khả năng tác dụng lên các liên kết ester. 3.3. Nguồn protease từ vi sinh vật 3.3.1. Đặc điểm chung So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. 3.3.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: P-xerin; P-thiol; P-kim loại; P-acid. Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: Protease acid; protease trung tính; protease kiềm. Trong bốn protease kể trên, các protease-xerin và protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin khoảng 20.000 – 27.000 Dalton. 15 3.3.3. Một số loại enzyme vi sinh vật: 3.3.3.1. Subtilisin Hình 3.13: Cấu trúc không gian của subtilisin Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm (serine protease) với 2 đại diện được nghiên cứu nhiều nhất là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN. Hoạt tính của enzyme Carlsberg bị kìm hãm bởi các chất phản ứng; 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI); L-3-carboxytrans 2,3-epoxypropyl-leucylamido (4-guanidine) butane (E.64); di- isopropylfluorophosphate (DFP); phenylmethyl-sulfonyl fluoride (PMSF) và tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK). Trước đây người ta vẫn tưởng rằng tất cả protease serin tạo thành một họ duy nhất có hoạt động và chức năng giống nhau. Tuy nhiên, trong thực tế có những protease từ vi khuẩn có cấu tạo không gian khác biệt. Đó là các Subtilisin là enzyme ngoại bào thuộc nhóm protease mang tính kiềm do Bacillus sutilisin và những loại tương tự sản xuất các enzyme này không có cầu disulfua trong phân tử, song lại có tính ái lực rất mạnh với các ion canxi. Trong số đó có sutilisin BPN có khối phân tử 27537 Da bao gồm 275 axit amin. Sự hoạt động của enzyme này cũng nhờ bộ ba axit amin theo thứ tự aspartat, histidin và serin, hơi khác so với các protease serin theo kiểu tripsin thường có thứ tự His(57) – Asp(102) – Ser(195). Sutilisin khá bền so với các chất tẩy rửa. Hình 3.14: Cấu trúc tâm hoạt động của subtilisin 16 Subtilisin là một protein chỉ gồm chính nó được sản xuất để tiết ra khỏi tế bào vi khuẩn. Subtilisin khi mới được tổng hợp thường ở dạng một “tiền subtilisin” gồm 30 axit amin của “chuỗi tín hiệu” tiếp đến là 77 axit amin của “chuỗi tiền” và cuối cùng là subtilisin. Điều thú vị là tất cả 107 axit amin đầu N này đều được bỏ để di chuyển thành enzyme tự do có chứa axit amin D, H và S ở trong trung tâm hoạt động. 3.3.3.2. Colagenase Colagenase là loại enzyme có khả năng thủy phân các liên kết dạng L-prolin đặc trưng trong vùng xoắn của colagenase ở trạng thái tự nhiên của cơ chất. Colagenase có thể thu nhận từ tế bào sinh vật nhân thực hoặc nhân sơ. Trong hệ thống phân loại enzyme, colagenase vi sinh vật được xếp là một phân nhóm, nhóm metaloendopeptidase có mã hiệu phân loại EC.3.4.244.3. Nhìn chung, các colagenase là những protein có khối lượng phân tử lớn và có cấu trúc phân tử không giống nhau. Phân tử colagenase có thể được tạo nên từ các phần dưới đơn vị. Một số colagenase vi sinh vật cũng như colagenase của mô thường tồn tại dưới dạng isozyme. Trong hệ thống phân loại enzyme, colagenase được xếp vào nhóm các protease kim loại với sự có mặt của các nguyên tố Ca hoặc Zn. Tuy nhiên, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy trong trung tâm hoạt động của các colagenase khác nhau có thể chứa các nhóm hoạt động khác nhau như SH, OH. Colagenase thường bao gồm từ 230 - 739 gốc axit amin. Các colagenase serin hoặc kim loại thường chứa một số đoạn trình tự giống nhau. Đa số các colagenase có pH hoạt động trung bình hoặc hơi kiềm (pH 7 - 8). Nhiệt độ hoạt động thích hợp của các colagenase thường dưới 400C. Các colagenase có tính đặc hiệu cao đối với các colagen. Colagen của mô có tính đặc hiệu cao hơn enzyme của vi khuẩn và có thể phân giải colagen tới các peptide dễ phân giải. Các colagenase được dùng như một công cụ để phân tích thành phần của mô liên kết. Các colagenase còn có thể có khả năng ngăn chặn sự phát triển của ác khối u. Các colagenase là enzyme đầy tiềm năng trong công nghiệp da, mỹ phẩm và đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm. Hình 3.15: Chế phẩm từ collagenase 17 Chương 4: Tình hình nghiên cứu - Ứng dụng enzym protease 4.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease 4.1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: Tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút. Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp protease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp protease. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Tồn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine protease từ Trùn Quế” (2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30 - 80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 - 12. “Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C. Nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993 - 1994, Thực hiện bởi TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm. protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. 4.1.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Protease trên thế giới: Năm 1857, Corvisart tách được tripsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. 18 Năm 1861 Brucke cũng đã tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngòai các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các protease trong máu. Năm 1879 Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease như: Papain, trypsin, chymotrypsin, subtilisin... Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các protease của động và thực vật. Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng. 4.2. Ứng dụng enzyme protease Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp… 4.2.1. Trong công nghiệp sữa Hình 4.1: Một số loại Phomat Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Người ta chỉ sử dụng các Protease của vi sinh vật có tính chất tương tự renin hoặc chỉ 19 thay thế 25 - 50% renin. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. 4.2.2. Trong chế biến nước mắm Nước mắm là hỗn hợp các acid amin. Các acid amin này được tạo thành do sự thủy phân của protease, các protease này do các vi sinh vật tổng hợp nên. Hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hòan thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Hình 4.2: Một số loại nước mắm điển hình 4.2.3. Trong công nghiệp chế biến thịt Enzyme protease như papain, bromelin, fixcin… được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt). Tiêm dung dịch enzyme vào thịt hoặc con vật trước khi giết mổ. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1 - 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm là bảo tồn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân. 4.2.4. Trong công nghiệp dệt Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân 20 lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm. Do đó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng. 4.2.5. Trong sản xuất bia Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. Hình 4.3: Một số loại bia Nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficin, chế phẩm protease nấm sợi và papain đều có tác dụng rất tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia. Trong đó papain được ứng dụng nhiều hơn cả. Hình 4.4: Sơ đồ khái quát quy trình sản xuất bia 21 4.2.6. Trong công nghiệp da Các loại enzyme được dùng trong chế biến da động vật như: protease acid, protease trung tính, protease kiềm của vi khuẩn, protease nấm sợi, papain từ đu dủ, bromelin từ trái thơm. Enzyme protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Protease được dùng để làm mềm, làm sạch và tẩy lông da, tăng tính đàn hồi, cải thiện điều kiện làm việc, trách ô nhiễm môi trường. Hình 4.5: Các giai đoạn làm sạch lông 4.2.7. Trong hương phẩn, mỹ phẩm Hiện nay, một số nước sản xuất những loại kem chứa enzyme để xoa mặt, xoa tay, cạo râu… Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì da đã chết tách ra, da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, sự phát triển của lông, tóc, chậm lại. Hình 4.6: Mỹ phẩm chứa collagen 22 4.2.8. Trong y học 4.2.7.1. Papain Thuốc tẩy giun tốt cho nhiều loại giun, trừ giun móc (ankylostome). Ngừa thai đối với cả nam giới và nữ giới, tuy nhiên trong thời kì thai nghén papain có thể gây sẩy thai. Chữa trị viêm vú, những viêm tụy mãn tính, viêm ruột mãn tính, ung thư tế bào biểu mô. Thành phần thuốc đánh răng, nhằm phân hủy protein thức ăn, chống mảng răng, cao răng. Một hỗn hợp papain và muxin dạ dày (10/90) được dùng có kết quả để giảm hạ mỡ và cholesterol. Hình 4.7: Thuốc có chứa enzyme papain 4.2.7.2. Trypsin Làm giảm các triệu chứng viêm (sưng, nóng, đỏ, đau) do những bệnh lý sau gây ra như gãy xương, bong gân, trĩ nội, trĩ ngoại, viêm trực tràng và sau khi cắt trĩ, tụ máu, huyết khối. Trypsin còn được dùng chung với rutin và bromelain để trị sưng xương khớp. 4.2.7.3. Bromelin Tiêu viêm, giảm phù nề và tụ huyết, hỗ trợ tiêu hóa, giảm triệu chứng sổ mũi, giúp mau lành những vết thương nhỏ, đặc biệt là căng nhức cơ, bong gân Tăng hệ miễn dịch, ức chế quá trình viêm, bôi lên nơi tổn thương (vết thương, vết bỏng, vết mổ) để làm sạch các mô hoại tử, mau lành sẹo. Tăng hiệu quả kháng sinh và thuốc chữa hen, giảm di căn ở các bệnh ung thư. 23 Hình 4.8: Thuốc có chứa bromelin 4.2.7.4. Chymotrypsin Giảm viêm và phù mô mềm do áp xe và loét, hoặc do chấn thương và nhằm giúp làm lỏng các dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh phổi và viêm xoang. Hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng. Dùng trong điều trị phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ. Giảm đau, hạ sốt, kháng viêm. Đẩy nhanh hoạt động tuyến bã và đào thải chất ứ. Hình 4.9: Thuốc có chứa chymotripsin 4.2.9. Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa Protease có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước sốt thức ăn… Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất tẩy rửa: Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy. 24 Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh. Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp. Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao. Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có thể phân hủy sinh học. Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại. 4.2.10. Trong một số ngành khác Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bánh kẹo nhằm tăng mùi và vị của bánh. Ngòai ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,… Hình 4.10: Sản xuất bánh kẹo 25 Chương 5: Kết luận Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid. Protease thường được thu nhận từ ba nguồn chính: thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, nguồn từ vi sinh vật là tỏ ra ưu thế do vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau và enzyme có hoạt tính rất cao, thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp. Protease đóng vai trò quan trọng trong nền sản xuất hiện đại, là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Việc sản xuất và ứng dụng enzyme ở nước ta chưa thực sự phát triển, tuy nhiên đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Trong đó, enzyme protease được sản xuất và sử dụng nhiều nhất. Tin chắc rằng, trong một tương lai không xa, nền công nghiệp enzyme của nước ta nói chung và protease nói riêng sẽ phát triển vượt bậc. 26 Tài liệu tham khảo Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzyme, Thành phố Hồ Chí Minh, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2006), Công nghệ sinh học (Tập 3), Thành phố Hà Nội, Nhà xuất bản Giáo dục. Lê Văn Việt Mẫn và Trần Quốc Hiền (2006), ‘Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti)’, Tạp chí Phát Triển KH&CN 9 (11): 59-67. Nguyễn Duy Hà, Nguyễn Thị Minh Huệ, Nguyễn Thị Thu Hà (2006) Seminar: Nguồn thu nhận Protease, Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh. Lê Thị Ngọc Bích, Võ Văn Giàu, Phan Chí Hiếu, Trần Thị Kim Yến (2006), Seminar: Hệ enzyme protease, Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Ngọc Phúc, Nguyễn Tuấn Anh, Hồ Thị Thùy Dung, Trần Quang Tuyến (2012), Tiểu luận: Sự tổng hợp và ứng dụng của enzyme Protease, Trường Đại học Khoa học Huế, Thành phố Huế, Lê Huy Kỹ, Dương Kim Linh, Phạm Hoàng Minh, Nguyễn Thanh Nga (2006), Seminar: Ứng dụng của hệ Protease, Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh.