ĐẶT VẤN ĐỀ
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1].
Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều trị bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở ruột.
Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế của Berberin như: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao . Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc cũng như thành phẩm là rất quan trọng.
Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dược điển Trung Quốc (2005) định lượng Berberin bằng HPLC. Để có cơ sở lựa chọn phương pháp định lượng Berberin thích hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “ So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III” với những mục tiêu sau:
Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)
Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
So sánh hai phương pháp định lượng trên để tìm phương pháp thích hợp cho việc định lượng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lượng thuốc trong nước.
40 trang |
Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 3355 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu So sánh 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
®Æt vÊn ®Ò
Berberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã trong nhiÒu lo¹i c©y thuèc ë ViÖt Nam, kho¶ng 150 loµi thuéc nhiÒu hä thùc vËt kh¸c nhau. Berberin chñ yÕu ë trong th©n vµ rÔ c©y vµng ®¾ng víi tû lÖ 1,5-3%[1].
Berberin ®îc biÕt ®Õn víi t¸c dông næi bËt lµ k×m khuÈn t¶ vµ E.coli, ®iÒu trÞ bÖnh lþ. Thuèc ®îc sö dông phæ biÕn do gi¸ thµnh thÊp vµ kh¸ an toµn, kh«ng ¶nh hëng tíi sù ph¸t triÓn b×nh thêng cña vi khuÈn cã Ých ë ruét.
HiÖn nay trªn thÞ trêng cã c¸c d¹ng bµo chÕ cña Berberin nh: thuèc nhá m¾t, viªn nÐn, viªn bao…. V× vËy vÊn ®Ò kiÓm tra chÊt lîng nguyªn liÖu lµm thuèc còng nh thµnh phÈm lµ rÊt quan träng.
Dîc ®iÓn ViÖt Nam III (D§VN III) cã chuyªn luËn kiÓm nghiÖm nguyªn liÖu vµ chÕ phÈm viªn nÐn Berberin b»ng ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô tö ngo¹i UV- VIS, dîc ®iÓn Trung Quèc (2005) ®Þnh lîng Berberin b»ng HPLC. §Ó cã c¬ së lùa chän ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin thÝch hîp, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thùc hiÖn ®Ò tµi : “ So s¸nh hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005) vµ b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo dîc ®iÓn ViÖt Nam III” víi nh÷ng môc tiªu sau:
§¸nh gi¸ ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005)
§¸nh gi¸ ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin nguyªn liÖu b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III
So s¸nh hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng trªn ®Ó t×m ph¬ng ph¸p thÝch hîp cho viÖc ®Þnh lîng berberin trong c¸c c¬ së kiÓm tra chÊt lîng thuèc trong níc.
PHÇN I. TæNG QUAn
vµi nÐt VÒ BERBERIN:
1.1.1. CÊu tróc:
Beberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã khung protoberberin[1]. Isoquinolin cßn ®îc gäi lµ benzo[c] pyridin hay 2- benzamin lµ mét hîp chÊt h÷u c¬ th¬m heterocyclic[18]
CÊu tróc cña isoquinolin
C«ng thøc cÊu t¹o:
C«ng thøc ph©n tö: C20H18NO4+ PTL: 336.36
Tªn khoa häc : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]
1.1.2. Nguån gèc: Berberin thêng cã trong rÔ, th©n rÔ, th©n, vá c©y nh÷ng c©y thuéc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin cã nhiÒu trong th©n vµ rÔ c©y vµng ®¾ng víi tû lÖ 1,5-3%, berberin chiÕm Ýt nhÊt lµ 82% so víi alcaloid toµn phÇn [9].
Berberin thêng cã lÉn c¸c t¹p chÊt alcaloid kh¸c nh: palmatin, jatrorrhizin. Giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2%, jatrorrhizin kh«ng qu¸ 5 % [6],[13].
1.1.3. TÝnh chÊt
- Bét kÕt tinh mµu vµng, kh«ng mïi, cã vÞ rÊt ®¾ng. Tan trong níc nãng, khã tan trong ethanol vµ níc l¹nh, rÊt khã tan trong cloroform, kh«ng tan trong ether.[6]
1.5. T¸c dông dîc lý:
- Berberin cã t¸c dông kh¸ng vi trïng nh: vi khuÈn ( shigella, tô cÇu vµ liªn cÇu khuÈn), thÓ protozoal, vi nÊm, candida, virus, nÊm men, kÝ sinh trïng g©y bÖnh (kÝ sinh trïng sèt rÐt, kÝ sinh trïng ®êng ruét) [12], [17].
- Berberin cã t¸c dông k×m khuÈn t¶ vµ E.coli, ®Æc biÖt khi dïng sÏ kh«ng ¶nh hëng tíi sù ph¸t triÓn b×nh thêng cña hÖ vi khuÈn cã Ých ë ruét, khi dïng phèi hîp víi mét sè thuèc kh¸ng sinh sÏ h¹n chÕ t¸c dông phô g©y ra bëi c¸c thuèc kh¸ng sinh ®èi víi hÖ sinh vËt ®êng ruét [17].
- Berberin cã t¸c dông øc chÕ sù bµi tiÕt ion trong lßng ruét, øc chÕ co c¬, gi¶m cholesterol vµ trigycerid, chèng tiÓu ®êng, øc chÕ c¬n nhÞp nhanh thÊt, gi¶m viªm cho ngêi bÞ viªm khíp, t¨ng tiÓu cÇu cña bÖnh nh©n xuÊt huyÕt, gi¶m tiÓu cÇu tiªn ph¸t vµ thø ph¸t, kÝch thÝch sù bµi tiÕt mËt vµ th¶i trõ bilirubin[17].
ChØ ®Þnh: [9],[12],[17]
- BÖnh lþ trùc khuÈn, héi chøng lþ, viªm ruét, tiªu ch¶y, viªm èng mËt vµ ®Æc biÖt lµ bÖnh sái mËt, vµng da, sèt, sèt rÐt, môn nhät.
- §iÒu trÞ viªm kÕt m¹c, ®au m¾t ®á do kÝch thÝch bªn ngoµi( do n¾ng, giã, l¹nh, bôi, khãi…) vµ ®iÒu trÞ bÖnh ®au m¾t hét.
- §iÒu trÞ bÖnh Leishmania, Trichomonas.
1.1.6. Chèng chØ ®Þnh: [17]
- Phô n÷ cã thai v× kh¶ n¨ng g©y co bãp tö cung cña berberin
- Ngêi dÞ øng víi berberin ( rÊt hiÕm gÆp)
1.1.7. D¹ng thuèc vµ hµm lîng: [11]
- D¹ng viªn nÐn, viªn bao, viªn nang víi hµm lîng 10 mg, hoÆc 50-100 mg/ viªn
- D¹ng thuèc nhá m¾t ®iÒu trÞ viªm kÕt m¹c, ®au m¾t ®á do kÝch thÝch bªn ngoµi (giã, n¾ng, l¹nh, bôi, khãi)
1.2. Mét sè ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin:
1.2.1. Ph¬ng ph¸p thÓ tÝch: [5], [13]
Hßa tan 0,3g chÕ phÈm (chÝnh x¸c) vµo trong cèc víi 150ml níc ®ang s«i. Lµm nguéi, chuyÓn dung dÞch vµo b×nh ®Þnh møc 250ml. LÊy chÝnh x¸c 50ml dung dÞch kali dicromat 0,1N råi thªm níc tíi v¹ch. L¾c ®Òu trong 5 phót, läc qua giÊy läc kh«, bá 20ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 100ml dÞch läc cho vµo b×nh nãn nót mµi 250 ml, thªm 2g kali iodid, l¾c cho tan, sau ®ã thªm 10 ml dung dÞch acid hydrochloric 16%, ®Ëy kÝn, l¾c ®Òu, ®Ó vµo bãng tèi trong 10 phót. ChuÈn ®é b»ng dung dÞch natri thiosulfat 0,1N, gÇn ®iÓm t¬ng ®¬ng thªm 2ml dung dÞch hå tinh bét vµ tiÕp tôc chuÈn ®é cho ®Õn khi mµu xanh biÕn mÊt th× dõng.
Song song tiÕn hµnh lµm mÉu tr¾ng trong cïng ®iÒu kiÖn.
1ml dung dÞch kali dicromat 0,1N t¬ng øng víi 12,39 mg C20 H18NO4Cl.
1.2.2. Ph¬ng ph¸p ®o UV-vis
Ph¬ng ph¸p 1:[6].
* Dung dÞch thö: C©n 0.200 g chÕ phÈm vµ hßa tan trong 200ml níc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm níc ®Õn 1000ml. LÊy 10ml dung dÞch nµy pha lo·ng víi níc ®Õn 100ml.
* Dung dÞch chuÈn: C©n chÝnh x¸c kho¶ng 0,200 g Kali dicromat thuèc thö chuÈn ®· sÊy kh« ë 1100C trong 4 giê, hßa tan trong níc. Thªm 10ml dung dÞch acid sulfuric 1N vµ thªm níc võa ®ñ 1000ml.
* §o ®é hÊp thô: §o At vµ As cña dunh dÞch thö vµ dung dÞch chuÈn ë bíc sãng 421 nm.
* C¸ch tÝnh: Lîng ( mg) cña C20H18NO4Cl ®îc tÝnh b»ng c«ng thøc sau:
a: khèi lîng ( mg) kali dichromat.
Ph¬ng ph¸p 2 [6]
X¸c ®Þnh hµm lîng berberin clorid trong viªn nÐn.
* Dung dÞch thö: C©n 20 viªn, tÝnh khèi lîng trung b×nh vµ nghiÒn thµnh bét mÞn. C©n chÝnh x¸c mét lîng bét viªn t¬ng ®¬ng víi kho¶ng 80 mg berberin clorid, thªm 10ml níc ®Ó thÊm ®Òu bét viªn, sau ®ã thªm kho¶ng 200ml níc s«i, khuÊy kÜ 5 phót, ®Ó nguéi råi chuyÓn vµo b×nh ®Þnh møc 500ml, thªm níc tíi v¹ch, l¾c ®Òu. §Ó l¾ng tù nhiªn hoÆc ®em ly t©m. LÊy chÝnh x¸c 5ml dung dÞch trong ë trªn ®em pha lo·ng víi níc cÊt võa ®ñ 100ml.
* Dung dÞch chuÈn : pha t¬ng tù dung dÞch thö, dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid.
* MÉu tr¾ng: níc cÊt.
* TiÕn hµnh ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch thö vµ chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn t¹i bíc sãng cùc ®¹i 345 nm, cèc ®o dÇy 1 cm.
1.2.3. Ph¬ng ph¸p c©n [5]
¸p dông ®Ó ®Þnh lîng viªn nÐn berberin clorid, dùa trªn kh¶ n¨ng t¹o tña cña berberin víi acid picric.
C©n 20 viªn vµ nghiÒn thµnh bét mÞn. C©n chÝnh x¸c mét lîng bét viªn t¬ng øng víi kho¶ng 0.50g berberin clorid, cho vµo b×nh ®Þnh møc 250ml, thªm kho¶ng 200 ml methanol (TT), l¾c kü ®Ó hßa tan berberin, råi thªm methanol ®Õn ngÊn. L¾c ®Òu, läc qua giÊy läc kh«, bá 20ml dÞch läc ban ®Çu. LÊy ®óng 100ml dÞch läc. Lµm bay h¬i cho ®Õn kh« trªn c¸ch thñy, thªm 150ml dung dÞch NaOH 0,1N vµ 90ml níc, ®un nãng. L¾c kü ®Ó hßa tan. §Ó nguéi råi läc qua giÊy läc ®· thÊm ít. Röa phÔu vµ giÊy läc 3 lÇn, mçi lÇn 10ml níc.
Gép dÞch läc vµ níc röa, thªm 10ml dung dÞch acid hydroclorid 0,1N råi tiÕp tôc cho ngay vµ tõ tõ 30ml dung dÞch b·o hßa acid picric ( TT). L¾c ®Òu.
§Ó yªn qua mét ®ªm, läc qua phÔu thñy tinh xèp cã ®êng kÝnh lç xèp 10 – 16 mm ( ®· c©n b×) ®Ó lÊy tña. Röa tña 3 lÇn víi níc cÊt ë kho¶ng 150C, mçi lÇn 15ml níc, hót kiÖt níc råi sÊy kh« phÔu vµ tña ë 1000C ®Õn khèi lîng kh«ng ®æi. Khèi lîng tña x¸c ®Þnh lµ P (g).
1 g tña t¬ng øng víi 0,6586 g C20H18NO4Cl.
1.2.4. Ph¬ng ph¸p HPLC
Ph¬ng ph¸p 1:[14], [15].
* §iÒu kiÖn s¾c ký:
- Cét s¾c ký: Cét thÐp kh«ng gØ ( 25cm x 4 mm) ®îc nhåi bëi h¹t silicagel ®· ®îc octadecylsilan hãa cã ®êng kÝnh 5 mm.
- NhiÖt ®é cét: 400C.
- Pha ®éng: Hßa tan 3,4g kali dihydrophosphat vµ 1,7g natri laurylsulfat trong 1000 ml hçn hîp dung m«i níc vµ acetonitril (1:1).
- Tèc ®é dßng: §iÒu chØnh tèc ®é dßng sao cho thêi gian lu cña berberin kho¶ng 10 phót.
- Detector UV ë bíc sãng 345 nm.
- ThÓ tÝch tiªm: 10 ml.
- Nång ®é dung dÞch thö vµ chuÈn: 0,1mg/ml vµ c¸ch tiÕn hµnh pha 2 dung dÞch nµy gièng nhau.
* TiÕn hµnh:
LÇn lît tiªm c¸c dung dÞch thö vµ chuÈn. Dùa vµo ®¸p øng cña pic berberin trong c¸c dung dÞch thö , chuÈn vµ hµm lîng dung dÞch chuÈn, tÝnh lîng berberin trong chÕ phÈm.
* C¸ch tÝnh: Lîng Wt (mg) cña berberin clorid (C20H18ClNO4).
Wt = Ws x (At / As)
Ws = Lîng (mg) cña berberin chuÈn, tÝnh theo lîng khan.
Ph¬ng ph¸p 2: [13]
* §iÒu kiÖn s¾c ký:
- Cét s¾c ký: Cét ®îc nhåi bëi c¸c h¹t silicagel ®· ®îc octadecylsilan hãa.
- Pha ®éng: Hçn hîp dung dÞch ®Öm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat víi 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iÒu chØnh tíi pH 3,0 b»ng acid phosphoric] vµ acetonitril (60:40).
- Tèc ®é dßng: 1,5 ml/ phót.
- Detector UV ë bíc sãng 263 nm.
- ThÓ tÝch tiªm: 20 ml
- Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: 32 mg/ml
* TiÕn hµnh:
LÇn lît tiªm c¸c dung dÞch thö vµ chuÈn. Dùa vµo ®¸p øng cña pic berberin trong dung dÞch thö, chuÈn vµ hµm lîng dung dÞch chuÈn, tÝnh lîng berberin cã trong chÕ phÈm.
Ph¬ng ph¸p 3: [16]
* §iÒu kiÖn s¾c ký:
- Cét s¾c ký: Cét Hypersil C18 ( 5 mm, 25 cm x 4,6 mm)
- Pha ®éng: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42).
- Tèc ®é dßng: 1ml/phót.
- Detector UV ë bíc sãng 349 nm.
* TiÕn hµnh: T¬ng tù nh 2 ph¬ng ph¸p HPLC ®· tr×nh bµy ë trªn.
1.3. Tæng quan Ph¬ng ph¸p hplc
1.3.1. Nguyªn t¾c
Ph¬ng ph¸p HPLC lµ 1 ph¬ng ph¸p ph©n tÝch hãa lý, dïng ®Ó t¸ch vµ ®Þnh lîng c¸c thµnh phÇn trong hçn hîp dùa trªn ¸i lùc kh¸c nhau gi÷a c¸c chÊt víi 2 pha lu«n tiÕp xóc nhng kh«ng hßa lÉn vµo nhau: Pha tÜnh (trong cét hiÖu n¨ng cao) vµ pha ®éng (dung m«i röa gi¶i). Khi dung dÞch cña hçn hîp c¸c chÊt cÇn ph©n tÝch ®a vµo cét, chóng sÏ ®îc hÊp phô hoÆc ph©n bè vµo pha tÜnh tïy thuéc vµo b¶n chÊt cña cét vµ cña chÊt cÇn ph©n tÝch. Khi ta b¬m dung m«i pha ®éng b»ng b¬m víi ¸p suÊt cao th× tïy thuéc vµo ¸i lùc cña c¸c chÊt víi hai pha, chóng sÏ di chuyÓn qua cét víi vËn tèc kh¸c nhau dÉn ®Õn sù ph©n t¸ch.
C¸c chÊt sau khi ra khái cét sÏ ®îc ph¸t hiÖn bëi bé phËn ph¸t hiÖn gäi lµ detector vµ ®îc chuyÓn qua bé xö lý kÕt qu¶. KÕt qu¶ cuèi cïng ®îc hiÓn thÞ trªn mµn h×nh hoÆc ®a ra m¸y in. [8]
1.3.2. C¬ së lý thuyÕt
Qu¸ tr×nh ph©n t¸ch trong kü thuËt HPLC lµ do qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ ph©n bè cña c¸c chÊt tan gi÷a 2 pha kh¸c nhau. Khi pha ®éng di chuyÓn víi mét tèc ®é nhÊt ®Þnh qua cét s¾c ký sÏ ®Èy c¸c chÊt tan bÞ pha tÜnh lu gi÷ ra khái cét. Tïy theo b¶n chÊt pha tÜnh, chÊt tan vµ dung m«i mµ qu¸ tr×nh röa gi¶i t¸ch ®îc c¸c chÊt khi ra khái cét s¾c ký. NÕu ghi qu¸ tr×nh t¸ch s¾c ký, chóng ta cã s¾c ®å. [8], [11]
1.3.3. C¸c th«ng sè ®Æc trng cña qu¸ tr×nh s¾c ký:
KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh s¾c kÝ ®îc detector ph¸t hiÖn, phãng ®¹i vµ ghi thµnh s¾c ký ®å( h×nh 1):
H×nh 1: s¾c ký ®å cña 2 chÊt vµ c¸c th«ng sè ®Æc trng
Trong ®ã :
to (thêi gian chÕt): Lµ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó pha ®éng ch¶y qua cét t¸ch
tR (thêi gian lu): thêi gian kÓ tõ khi chÊt cÇn ph©n tÝch ®îc b¬m vµo cét cho ®Õn khi xuÊt hiÖn ®Ønh cña pic chÊt cÇn ph©n tÝch.
tR’ (thêi gian lu thùc ) = tR- to.
W0,5: §é réng pic ë nöa chiÒu cao
Wb: §é réng ®¸y pic.
1.3.2.1. HÖ sè dung lîng k’
[8] NÕu k' nhá th× tR còng nhá vµ sù t¸ch kÐm. Trong thùc tÕ k' n»m trong kho¶ng 2 - 5 lµ tèt nhÊt. Hai chÊt chØ ®îc t¸ch ra khái nhau nÕu chóng cã gi¸ trÞ kh¸c nhau.
1.3.2.2 §é chän läc a (selectivity - factor)
a= (k2' > k1' ) [4], [8]
a kh¸c 1 cµng nhiÒu th× kh¶ n¨ng t¸ch cµng râ rµng, tèi u tõ 1,5 ®Õn 2.
1.3.2.3. §é ph©n gi¶i (resolution)
§Æc trng cho møc ®é t¸ch hai chÊt ra khái nhau trªn mét ®iÒu kiÖn s¾c ký. §é ph©n gi¶i cña 2 pic ë c¹nh nhau ®îc tÝnh theo c«ng thøc:
[4], [8]
§é ph©n gi¶i c¬ b¶n ®¹t ®îc khi R = 1,5
1.3.2.4. HÖ sè bÊt ®èi AF
Cho biÕt møc ®é c©n ®èi cña pic s¾c ký, nã ®îc tÝnh theo c«ng thøc:
[4], [8]
Trong ®ã:
W1/20: lµ chiÒu réng cña pic ®îc ®o ë 1/20 chiÒu cao cña pic
a: kho¶ng c¸ch tõ ®êng vu«ng gãc h¹ tõ ®Ønh pic ®Õn mÐp ®êng cong phÝa tríc t¹i vÞ trÝ 1/20 chiÒu cao cña pic.
Khi AF n»m trong kho¶ng 0,5-2,5 th× phÐp ®Þnh lîng ®îc chÊp nhËn, nÕu AF cµng t¨ng lªn th× hiÖn tîng kÐo ®u«i cµng râ. HiÖn tîng ®Ønh kÐo ®u«i (tailing peak) cã thÓ lµ do t¬ng t¸c gi÷a chÊt cÇn ph©n tÝch vµ pha tÜnh hoÆc cét s¾c ký bÈn. §Ønh kÐo tuyÕn tríc (fronting peak) cã thÓ do lîng mÉu ®a vµo qu¸ lín so víi n¨ng lùc cét [7].
1.3.2.5. Sè ®Üa lý thuyÕt N
§Æc trng cho hiÖu lùc cét.
N = 16 hay N=5,54 [4], [8]
NÕu gäi L lµ chiÒu cao cét s¾c ký, th× chiÒu cao cña ®Üa lý thuyÕt H ®îc tÝnh b»ng c«ng thøc:
1.3.4. Nguyªn t¾c cÊu t¹o hÖ thèng HPLC [4],[8]
HÖ thèng HPLC ®¬n gi¶n vµ ®ñ ®Ó lµm viÖc theo kü thuËt HPLC bao gåm 6 bé phËn chÝnh sau:
a/HÖ thèng b¬m
§Ó b¬m pha ®éng vµo cét t¸ch. B¬m nµy ph¶i ®iÒu chØnh ®îc ¸p suÊt (0 - 400 bar)
a/ B×nh chøa dung m«i vµ hÖ thèng xö lý dung m«i
B×nh chøa dung m«i thêng b»ng thñy tinh hoÆc thÐp kh«ng gØ. Dung m«i ch¹y s¾c ký ®îc läc qua mµng läc (thêng mµng läc cì lç 0,45 mm ) vµ ®uæi khÝ hßa tan.
c/ HÖ tiªm mÉu
§Ó ®a mÉu ph©n tÝch vµo cét.
Cã nhiÒu ph¬ng ph¸p tiªm mÉu kh¸c nhau, ®¬n gi¶n nhÊt lµ sö dông mét van tiªm. Trong c¸c hÖ thèng s¾c ký hiÖn ®¹i lµ hÖ tiªm mÉu tù ®éng.
Trong s¾c ký láng, mÉu láng cã thÓ ®îc tiªm ngay sau khi läc lo¹i t¹p qua mµng läc 0,45 mm, cßn mÉu r¾n cÇn hßa tan trong 1 dung m«i thÝch hîp.
d/ Cét s¾c ký láng HPLC
Cét ®îc chÕ t¹o b»ng thÐp ®Æc biÖt tr¬ víi hãa chÊt, chÞu ®îc víi ¸p suÊt cao ®Õn vµi tr¨m bar.
- ChiÒu dµi cét: 10, 15, hoÆc 25 cm; thÝch hîp víi c¸c tiÓu ph©n pha tÜnh cã ®êng kÝnh rÊt nhá (3, 5, 10 mm).
- §êng kÝnh cét: 4 hoÆc 4,6 mm.
e/ Detector trong HPLC
Lµ bé phËn ph¸t hiÖn chÊt ph©n tÝch, tïy theo b¶n chÊt cña chÊt cÇn ph©n tÝch mµ sö dông detector thÝch hîp. Detector hay sö dông lµ detector hÊp thô UV - VIS. Ngoµi ra cßn cã detector khóc x¹, huúnh quang, ®iÖn hãa.
f/ ThiÕt bÞ hiÓn thÞ kÕt qu¶
Cã nhiÒu lo¹i nhng ®¬n gi¶n vµ phæ biÕn nhÊt lµ m¸y tù ghi ®Ó tÝn hiÖu ®o díi d¹ng pic.
S¬ ®å khèi hÖ thèng HPLC ®îc tæng qu¸t ë h×nh 2
B¬m
Van tiªm mÉu
Binh chøa pha ®éng
Cét
Bé phËn tù ghi
Detector
H×nh 2: S¬ ®å khèi tæng qu¸t hÖ thèng HPLC
1.3.5. C¸ch ®¸nh gi¸ pic[7]
* §¸nh gi¸ diÖn tÝch pic: DiÖn tÝch cña mét chÊt t¬ng øng víi tæng lîng chÊt ®ã. §Ó tÝnh diÖn tÝch pic, hiÖn nay ngêi ta thêng dïng m¸y tÝch ph©n ®iÖn tö g¾n víi m¸y vi tÝnh (sai sè kho¶ng 0,5 %) hoÆc m¸y ph©n tÝch c¬ häc (sai sè 1,3 %). Ph¬ng ph¸p nµy cã thÓ dïng cho c¸c pic kh«ng bÞ tr«i ®êng nÒn vµ c¶ pic cã ®êng nÒn bÞ tr«i. Ph¬ng ph¸p nµy chØ cÇn ®iÓm ®Çu ®iÓm cuèi cña pic ®îc nhËn ra chÝnh x¸c vµ cho kÕt qu¶ tèt víi nång ®é võa, trung b×nh vµ cao.
* §¸nh gi¸ chiÒu cao pic: Khi pic cã d¹ng kh«ng ®æi th× chiÒu cao pic (kho¶ng c¸ch gi÷a ®êng nÒn vµ ®Ønh pic) lµ mét ®¹i lîng tû lÖ víi diÖn tÝch pic vµ nã còng cã thÓ dïng ®Ó ®¸nh gi¸ phæ. Ph¬ng ph¸p chØ ¸p dông khi c¸c chØ sè k' lµ h»ng ®Þnh.
* Víi pic cã ®êng nÒn bÞ nhiÔu hoÆc bÞ hÑp th× viÖc x¸c ®Þnh chiÒu cao pic sÏ dÔ dµng vµ chÝnh x¸c h¬n viÖc x¸c ®Þnh diÖn tÝch pic.
1.4.Tæng quan PH¦¥NG PH¸P QUANG PHæ HÊP THô UV-VIS
1.4.1. C¬ së lý thuyÕt[2],[3],[4],[6]
1.4.1.1. §Þnh luËt Lambert-Beer
ChiÕu mét chïm tia s¸ng ®¬n s¾c cã bíc sãng λ vµ cêng ®é Io qua dung dÞch ®ång nhÊt cã nång ®é C, bÒ dµy líp dung dÞch lµ l. Khi ®i qua dung dÞch ,mét phÇn ¸nh s¸ng bÞ hÊp thô, mét phÇn bÞ ph¶n x¹, phÇn cßn l¹i (I) th× ®i qua dung dÞch .
Mèi quan hÖ gi÷a I vµ Io ®îc thÓ hiÖn b»ng ®Þnh luËt Lambert-Beer.
I = Io 10 -εCl
Víi ε lµ hÖ sè hÊp thô riªng cña dung dÞch. HÖ sè nµy kh«ng phô thuéc vµo nång ®é, chØ phô thuéc vµo b¶n chÊt chÊt tan, vµo bíc sãng cña ¸nh s¸ng chiÕu vµo dung dÞch.
1.4.1.2. §iÒu kiÖn øng dông ®Þnh luËt Lambert – beer
+ Chïm tia s¸ng ph¶i ®¬n s¾c
+ Dung dÞch ph¶i lo·ng (n»m trong kho¶ng nång ®é thÝch hîp)
+ Dung dÞch ph¶i trong suèt (trõ chuÈn ®é ®o quang).
+ ChÊt thö ph¶i bÒn trong dung dÞch vµ ph¶i bÒn duíi t¸c dông cña ¸nh s¸ng (UV-VIS).
1.4.1.3. Sù sai lÖch ®èi víi ®Þnh lËt Lambert-beer
+ Sù sai lÖch do m¸y:(do bé phËn ®¬n s¾c ,bé phËn khuÕch ®¹i kÐm) nh do tÕ bµo quang ®iÖn, nh©n quang qu¸ giµ, ®é nh¹y kÐm.
+ Sai lÖch do ho¸ häc:
- Do sù ph©n ly (ion ho¸): thêng gÆp khi pha lo·ng dung dÞch, ph©n tö chÊt tan bÞ ph©n ly, mµ ®é hÊp thô cña d¹ng ph©n tö vµ d¹ng ion ph©n ly kh«ng nh nhau.
- Do t¹o dimer, trimer: s¶n phÈm trïng hîp nµy l¹i cã ®é hÊp thô kh¸c d¹ng ®¬n ph©n tö.
+ Do ph¶n øng c¸c chÊt l¹:
- ChÊt l¹ cã thÓ t¹o phøc víi c¸c ion trong dung dÞch: ®Ó ®Ò phßng hiÖn tîng nµy x¶y ra, ngêi ta dïng mÉu tr¾ng cã thµnh phÇn nh dung dÞch, chØ thiÕu chÊt cÇn ®Þnh lîng.
- Sù hÊp thô cña chÊt l¹, thuèc thö còng cã thÓ ¶nh hëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh lîng. V× vËy trong qu¸ tr×nh lµm ph¶n øng ²t¹o mµu², ph¶i chó ý tíi ®iÒu kiÖn ph¶n øng vµ c¸c thµnh phÇn tham gia ph¶n øng.
1.4.1.4. Mét sè ®¹i lîng th«ng dông[
a/ §é truyÒn qua (T-Transmittance):
§é truyÒn qua (hay cßn gäi lµ ®é thÊu quang) ®Æc trng cho ®é trong suèt (vÒ mÆt quang häc) cña dung dÞch, ®îc ®Þnh nghÜa:
T = = 10-εCl
Thêng T tÝnh ra phÇn tr¨m (%). Mét chÊt cã T=1(hay100%), nghÜa lµ hoµn toµn kh«ng cã hÊp thô ¸nh s¸ng, ngêi ta nãi chÊt ®ã hoµn toµn trong suèt.
b/ §é hÊp thô (A-Absorbance):
§é hÊp thô (hay cßn gäi lµ mËt ®é quang) ®îc ®Þnh nghÜa :
A = lg = ε.C.l
§èi víi mét chÊt x¸c ®Þnh (cã ε x¸c ®Þnh), thêng ®o trªn mét lo¹i cèc ®o (cã bÒ dµy th«ng thêng lµ l=1 cm), nh vËy ®é hÊp thô tû lÖ thuËn víi nång ®é dung dÞch:
A=K.C (K=ε.l)
c/ HÖ sè h©p thô phÇn tr¨m ():
Theo c«ng thøc A =ε.C.l, nÕu l=1 cm, C=1% th× :
A = ε =
VËy chÝnh lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é 1%, dïng cèc ®o cã bÒ dµy 1cm. Víi mét chÊt tan x¸c ®Þnh, t¹i mét λ x¸c ®Þnh, lµ mét h»ng sè.
d/ HÖ sè hÊp thô ph©n tö (εμ):
HÖ sè hÊp thô ph©n tö, hay cßn gäi lµ hÖ sè t¾t mol lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é 1M/l, dïng cèc ®o cã bÒ dµy1cm.
Còng nh , víi mét chÊt x¸c ®Þnh, trong nh÷ng ®iÒu kiÖn ®o x¸c ®Þnh (λ, dung m«i, nhiÖt ®é,...) εμ lµ mét h»ng sè.
Gi÷a vµ εμ cã mèi liªn hÖ εμ = M
ë ®©y M lµ ph©n tö gam cña chÊt tan.
1.4.2. Mét sè kü thuËt ®Þnh lîng b»ng ph¬ng ph¸p quang phæ UV-VIS.[2],[4],[8]
1.4.2.1. Ph¬ng ph¸p ®o phæ trùc tiÕp:
§o ®é hÊp thô cña dung dÞch, tÝnh nång ®é C cña dung dÞch dùa vµo gi¸ trÞ biÕt tríc (tra cøu).
A = .C.l → C = (víi l =1 cm)
Trong ph¬ng ph¸p nµy, ph¶i chó ý kiÓm tra m¸y ®o vÒ bíc sãng (λ) vµ mËt ®é quang A b»ng c¸ch:
Dïng ®Ìn thuû ng©n, ®Ìn D2 (cho mét v¹ch s¸ng cã bíc sãng x¸c ®Þnh).
Dïng mét mÉu chuÈn, ®o vµ ®iÒu chØnh ®Ó t×m sai sè.
Dïng mét kÝnh läc Holmium (cã c¸c gi¸ trÞ λmax x¸c ®Þnh cho trong tµi liÖu )®Ó kiÓm tra l¹i m¸y.
Dïng dung dÞch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiÕt quang phæ pha thµnh dung dÞch cã nång ®é chÝnh x¸c. §o phæ t×m c¸c gi¸ trÞ λmax vµ t×m Amax .
1.4.2.2. Ph¬ng ph¸p so s¸nh
§o ®é hÊp thô Ax, Ac cña dung dÞch thö cã nång ®é Cx (cha biÕt) vµ cña dung dÞch chuÈn cã nång ®é Ac (®· biÕt).
Ta cã: = → Cx = x Cc
Chó ý: nång ®é cña dung dÞch thö Cx vµ cña dung dÞch chuÈn Cc kh«ng ®îc chªnh lÖch nhau qu¸ nhiÒu. Nång ®é dung dÞch nµy cµng gÇn nhau, kÕt qu¶ cµng chÝnh x¸c.
Ngoµi ra cßn cã c¸c kü thuËt ®Þnh lîng kh¸c nh: ph¬ng ph¸p ®êng chuÈn, ph¬ng ph¸p thªm ®êng chuÈn, ph¬ng ph¸p chuÈn ®é ®o quang, ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng hçn hîp theo nguyªn t¾c céng phæ .
PhÇn 2: thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶
2.1. Nguyªn vËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
2.1.1. Nguyªn liÖu, ho¸ chÊt, thuèc thö:
2.1.1.1. §èi tîng nghiªn cøu:
. Berberin clorid: ChÊt chuÈn hµm lîng 83,3% do ViÖn kiÓm nghiÖm thuèc TW cung cÊp
. Berberin clorid d¹ng nguyªn liÖu do bé m«n Ho¸ Dîc cung cÊp
. Palmatin: do viÖn kiÓm nghiÖm thuèc TW cung cÊp
2.1.1.2. Ho¸ chÊt, thuèc thö:
. Muèi potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4)
. Heptane sodium sulfonate, triethylamine
. Acetonitril dïng cho HPLC (Merk)
. Níc cÊt 2 lÇn (cÊt trùc tiÕp t¹i Bé m«n Hãa v« c¬ trêng ®¹i häc Dîc Hµ Néi) dïng cho m¸y HPLC
. Mét vµi hãa chÊt kh¸c
2.1.1.3. ThiÕt bÞ:
+ M¸y s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100
+ C©n ph©n tÝch AY 220 , Max = 220 g, ®é chÝnh x¸c 0,1 mg
+ M¸y ®o pH JENWAY cña Anh
+ M¸y cÊt níc 2 lÇn
+ M¸y l¾c siªu ©m EBRO ARMATUREN cña §øc
+ M¸y läc hót ch©n kh«ng Satorius
+ B×nh ®Þnh møc c¸c lo¹i: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ...
+ Cèc cã má: c¸c lo¹i 100; 200; 500
+ Pipet chÝnh x¸c, pipet thêng, ®òa thñy tinh.
+ B¬m tiªm, lä ®ùng mÉu, mµng läc 0,45 mm...
2.1.2. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu:
2.1.2.1. ChØ tiªu nghiªn cøu:
. Ph©n tÝch mÉu thö b»ng ph¬ng ph¸p HPLC vµ ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV- VIS
. §¸nh gi¸ ®é chÝnh x¸c, tÝnh ®óng, tÝnh tuyÕn tÝnh, tÝnh ®Æc hiÖu cña hai ph¬ng ph¸p trªn
. So s¸nh 2 ph¬ng ph¸p trªn
2.1.2.2. Ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh c¸c chØ tiªu nghiªn cøu:
Nghiªn cøu trªn lý thuyÕt vµ tµi liÖu tham kh¶o ®Ó lùa chän ph¬ng ph¸p ph©n tÝch
B»ng thùc nghiÖm, dùa vµo kÕt qu¶ thu ®îc, xö lý thèng kª vµ rót ra kÕt luËn
Ph¬ng ph¸p sö dông trong thùc nghiÖm: HPLC, §o quang phæ hÊp thô UV-VIS
2.1.2.3.Ph¬ng ph¸p xö lý sè liÖu thèng kª:
. D÷ liÖu thu ®îc ®îc xö lý b»ng ph¬ng ph¸p thèng kª - sö dông c«ng cô hç trî lµ phÇn mÒm Microsoft Excel
. Mét sè ®Æc trng thèng kª ®îc sö dông:
- Gi¸ trÞ trung b×nh:
- §é lÖch chuÈn:
- §é lÖch chuÈn t¬ng ®èi (RSD): RSD% = 100
- Sai sè chuÈn :
- Sai sè t¬ng ®èi:
- Kho¶ng tin cËy: = ± taSx
Trong ®ã : xi lµ kÕt qu¶ x¸c ®Þnh lÇn thø i ; n lµ sè lÇn x¸c ®Þnh
+ Tiªu chuÈn Fischer ®Ó ®¸nh gi¸ ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña 2 ph¬ng ph¸p thÝ nghiÖm kh¸c nhau : Ftn = ; trong ®ã S1 > S2
Ftn>Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª
Ftn>Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª
Ftn<Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph¬ng ph¸p kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª
Flt tra b¶ng ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K = n – 1
+ Test T ®Ó so s¸nh gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh lîng cña hai ph¬ng ph¸p kh¸c nhau :
T = () víi =
T < : gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh lîng cña hai ph¬ng ph¸p kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª
T > : gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh lîng cña hai ph¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª
tra b¶ng ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K = n1+n2-2
2.2. KÕt qu¶ thùc nghiÖm :
2.2.1. §Þnh lîng Berberin clorid nguyªn liÖu b»ng ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III * Do có sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên chúng tôi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn.
C¸ch tiÕn hµnh :
+ Dung dÞch thö : C©n 0,200 g chÕ phÈm vµ hoµ tan trong 200 ml níc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm níc ®Õn 1000 ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy pha lo·ng víi níc ®Õn 100 ml (C = 20g/ml)
+ Dung dÞch chuÈn ®îc pha t¬ng tù dung dÞch thö , dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid
+ §o ®é hÊp thô cña dung dÞch thö vµ dung dÞch chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn t¹i bíc sãng cùc ®¹i 421 nm víi mÉu tr¾ng lµ níc cÊt, cèc ®o dµy 1 cm.
* C¸ch tÝnh kÕt qu¶ :
Theo ph¬ng ph¸p so s¸nh, hµm lîng phÇn tr¨m ®îc tÝnh theo c«ng thøc : C% = C
Trong ®ã :
C% : Hµm lîng % Berberin clorid cã trong mÉu thö.
C : Hµm lîng % Berberin clorid cã trong mÉu chuÈn
At : §é hÊp thô cña dung dÞch thö.
Ac : §é hÊp thô cña dung dÞch chuÈn.
mt : Khèi lîng tÝnh b»ng gam cña Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu ®· c©n ®Ó pha dung dÞch thö.
mc : Khèi lîng tÝnh b»ng gam cña Berberin clorid chuÈn ®· c©n ®Ó pha dung dÞch chuÈn.
TiÕn hµnh ®Þnh lîng 5 mÉu. KÕt qu¶ ghi trong b¶ng 1 .
B¶ng1 : KÕt qu¶ ®Þnh lîng Beberin clorid trong nguyªn liÖu
STT
Khèi lîng c©n(g)
§é hÊp thô(A)
C%
1
0,1971
0,269
86,50
2
0,2010
0,272
85,76
3
0,2062
0,280
86,06
4
0,2090
0,285
86,42
5
0,2030
0,277
86,48
ChuÈn
0,2001
0,263
83,30
Theo kÕt qu¶ ë b¶ng 1, ta cã:
Gi¸ trÞ trung b×nh: = 86,24%
§é lÖch chuÈn : S = 0,324
Kho¶ng tin cËy cña gi¸ trÞ trung b×nh (ë møc tin cËy 95%): ∆X(%) = 0,40
§é lÖch chuÈn t¬ng ®èi: RSD = 0,37%
KÕt luËn: Hµm lîng Beberin clorid trong bét nguyªn liÖu lµ 86,24%0,40%.
2.2.2. §¸nh gi¸ ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin clorid nguyªn liÖu b»ng ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III
2.2.2.1./TÝnh chÝnh x¸c :
Nguyªn t¾c: §é chÝnh x¸c cña ph¬ng ph¸p ®îc ®¸nh gi¸ b»ng ®é lÖch chuÈn t¬ng ®èi cña c¸c phÐp thö song song.
C¸ch tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy nh trong phÇn 2.2.1.1
KÕt qu¶ thö ®é chÝnh x¸c cña ph¬ng ph¸p cho thÊy ®é lÖch chuÈn t¬ng ®èi cña c¸c kÕt qu¶ (RSD = 0,37% < 2%). Nh vËy ph¬ng ph¸p lµ chÝnh x¸c
2.2.2.2 TÝnh tuyÕn tÝnh:
TiÕn hµnh kh¶o s¸t sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é vµ ®é hÊp thô trªn chÊt chuÈn Berberin.
C©n 5 mÉu chÊt chuÈn Berberin clorid cã khèi lîng tõ 0,1600g→ 0,2400g ( t¹i c¸c ®iÓm 80%,90%,100%,110%,120% nång ®é dïng khi ®Þnh lîng)
C¸ch tiÕn hµnh t¬ng tù 2.2.1
B¶ng 2: Sù phô thuéc cña mËt ®é quang vµo nång ®é dung dÞch
STT
1
2
3
4
5
C (mg/ml)
0,0161
0,0180
0,0202
0,0220
0,0240
A
0,215
0,239
0,262
0,286
0,315
H×nh 6 .§å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc cña mËt ®é quang vµo
nång ®é dung dÞch
- Ph¬ng tr×nh håi quy biÓu thÞ mèi t¬ng quan gi÷a mËt ®é quang vµ nång ®é dung dÞch lµ: y = 12,5 x + 0,013;
- HÖ sè t¬ng quan: 0,998
- §é lÖch chuÈn cña y_ intercept: Sb = 0,009
- Víi ®é tin cËy 95% ta cã kho¶ng tin cËy cña y_intercept:
b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042
Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy hÖ sè t¬ng quan cña ®êng håi quy vît qu¸ 0,99…TÊt c¶ c¸c gi¸ trÞ n»m trªn ®êng håi quy hoÆc ph©n bè ®ång ®Òu c¶ hai phÝa cña ®êng håi quy.
Kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0.
VËy ph¬ng ph¸p lµ tuyÕn tÝnh trong kho¶ng nång ®é tõ 80% ®Õn 120% nång ®é lµm viÖc.
2.2.2.3. §é ®óng:
. C©n 3 mÉu chÊt ®èi chiÕu Beberin clorid ( hµm lîng 83,3%) víi khèi lîng tõ 0,1600g → 0,2400g (t¹i c¸c ®iÓm 80, 100, 120% so víi lîng c©n dïng khi ®Þnh lîng)
. TiÕn hµnh t¬ng tù 2.2.1. Mçi mÉu ®o 3 lÇn, lÊy kÕt qu¶ trung b×nh
. TÝnh to¸n kÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é ®óng dùa vµo ®é hÊp thô cña mÉu chuÈn lµ 0,263 øng víi khèi lîng c©n 0,2001g
KÕt qu¶ thu ®îc ghi ë b¶ng 3
B¶ng 3: KÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é ®óng cña ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS
STT
Khèi lîng c©n (g)
Lîng ho¹t chÊt cã thùc a (g)
§é hÊp thô trung b×nh (A)
Lîng t×m l¹i trung b×nh b (g)
PhÇn tr¨m t×m l¹i (b/a.100%)
1
0,1605
0,1337
0,208
0,1322
98,88
2
0,2020
0,1683
0,267
0,1696
100,77
3
0,2362
0,1967
0,313
0,1984
100,86
Tõ kÕt qu¶ b¶ng 3 ta cã:
- Trung b×nh % t×m l¹i: 100,17%
- Ph¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t¬ng quan gi÷a lîng ho¹t chÊt ban ®Çu vµ lîng ho¹t chÊt t×m l¹i lµ: y = 1,052x – 0,008
- HÖ sè t¬ng quan: r = 0,999
- §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,003
- §é lÖch chuÈn cña ®é dèc: Sa = 0,019
- Víi ®é tin cËy 95% ta cã:
Kho¶ng tin cËy cña ®é dèc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992 < a < 1,112
Kho¶ng tin cËy cña y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009 hay - 0,017 < y_intercept < 0,001
H×nh 7: §å thÞ biÓu diÔn ph¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh vÒ mèi t¬ng quan gi÷a lîng ho¹t chÊt t×m l¹i vµ lîng ho¹t chÊt cã thùc
KÕt luËn:
- Kh«ng cã sai sè hÖ thèng h»ng ®Þnh v× kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0.
- Kh«ng cã sai sè hÖ thèng tû lÖ v× kho¶ng tin cËy ®é dèc chøa 1.
- Gi¸ trÞ trung b×nh cña tû lÖ thu l¹i lµ 100,17% nghÜa lµ n»m trong kho¶ng tõ 98% ®Õn 102%.
Nh vËy, ph¬ng ph¸p ®a ra lµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t.
2.2.2.4. TÝnh ®Æc hiÖu:
Nh trong phÇn 1.1.2 ®· tr×nh bµy, c¸c t¹p chÊt cÇn x¸c ®Þnh trong Berberin nguyªn liÖu lµ Palmatin vµ Jatrorrhizin. Nhng trong ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm kh«ng cã chÊt chuÈn Jatrorrhizin, chóng t«i chØ tiÕn hµnh x¸c ®Þnh sù ¶nh hëng cña t¹p chÊt Palmatin ®èi víi ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng
TiÕn hµnh:
+ C©n 0,200 g chÊt chuÈn berberin clorid vµ hßa tan trong 200 ml níc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm níc ®Õn 1000 ml, thu ®îc dunhg dÞch berberin chuÈn 0,2 mg/ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy cho vµo 4 b×nh ®Þnh møc 100 ml.
+ Pha dung dÞch Palmatin 10%, 5% vµ 2,5% so víi nång ®é cña berberin clorid ®em ®o
. C©n 0,02 g Palmatin chuÈn vµ hßa tan trong 20 ml níc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm níc ®Õn 100 ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml vµ thªm níc võa ®ñ tíi v¹ch, ®îc dung dÞch palmatin chuÈn 0,02 mg/ml
. LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml vµ thªm níc võa ®ñ tíi v¹ch, ta ®îc dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml.
. LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml vµ thªm níc võa ®ñ tíi v¹ch, ®îc dugn dÞch palmatin 0,005 mg/ml.
. LÇn lît thªm 10 ml dung dÞch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vµo 3 b×nh ®Þnh møc 100 ml ®· chøa berberin clorid chuÈn trªn vµ thªm níc võa ®ñ tíi v¹ch. Mét b×nh ®Þnh møc 100 ml kh«ng thªm palmatin vµ thªm níc tíi v¹ch. §em ®o ®é hÊp thô quang cña dung dÞch 4 b×nh nµy t¹i bíc sãng 421 nm
B¶ng 4: KÕt qu¶ thu ®îc vÒ sù ¶nh hëng cña t¹p chÊt palmatin tíi
®é hÊp thô quang cña berberin clorid
B×nh 1
B×nh 2
B×nh 3
B×nh 4
Berberin clorid 0,2 mg/ml (ml)
10
10
10
10
Palmatin 0,02 mg/ml (ml)
10
Palmatin 0,01 mg/ml (ml)
10
Palmatin 0,005 mg/ml (ml)
10
§é hÊp thô A
0,263
0,282
0,271
0.266
NhËn xÐt: Tõ kÕt qu¶ b¶ng trªn, ta thÊy ®é hÊp thô quang cña dung dÞch t¨ng theo sù t¨ng cña nång ®é dung dÞch palmatin. Khi thªm 2,5% palmatin, hµm lîng berberin trong bét nguyªn liÖu ®Þnh lîng theo ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS cña D§VN III t¨ng 1,14%. NÕu cã 2% palmatin nh trong giíi h¹n vÒ palmatin mµ D§VN III yªu cÇu th× kÕt qu¶ ®Þnh lîng t¨ng 0,91%
VËy ph¬ng ph¸p kh«ng cã tÝnh ®Æc hiÖu.
2.2.3. §Þnh lîng berberin clorid nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005):
§iÒu kiÖn s¾c ký ®Ó ®Þnh lîng Berberin clorid nguyªn liÖu
- Cét s¾c ký: h¹t nhåi silicagel ®îc octadecylsilan hãa
- Detector UV: 263 nm
- Pha ®éng: ®Öm phosphate [ hçn hîp KH2PO4 0,05M vµ heptan Na sulfonate(1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iÒu chØnh pH=3,0 b»ng H3PO4] – acetonitril (60:40).
- NhiÖt ®é cét: nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm
- ThÓ tÝch tiªm: 20μl
- Tèc ®é dßng: 1,5 ml/phót
* TiÕn hµnh:
+ Dung dÞch thö: C©n 0,04 g berberin clorid hßa tan trong níc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml.Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm níc tíi v¹ch. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 2 ml dÞch läc trªn cho vµo b×nh ®Þnh møc 25 ml , thªm níc tíi v¹ch.
+ Dung dÞch chuÈn : pha t¬ng tù dung dÞch thö, dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid
+ Tiªm lÇn lît 10 μl dung dÞch chuÈn vµ c¸c dung dÞch thö vµo hÖ thèng s¾c ký, ch¹y s¾c ký theo c¸c ®iÒu kiÖn ®· lùa chän. Dùa vµo diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic trªn s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch thö, nång ®é cña dung dÞch chuÈn, tÝnh hµm lîng (%) Berberin clorid cã trong mÉu thö theo c«ng thøc sau:
HL% =
Trong ®ã:
: DiÖn tÝch pic mÉu thö
: DiÖn tÝch pic mÉu chuÈn (= 12,2646)
: Khèi lîng c©n mÉu chuÈn (0,0405 g)
: Khèi lîng c©n mÉu thö
83,30: Hµm lîng thùc cña mÉu chuÈn
B¶ng 5: KÕt qu¶ ®Þnh lîng Berberin clorid nguyªn liÖu
STT
Khèi lîng c©n (g)
DiÖn tÝch pic (mAU.min)
Hµm lîng (%)
1
0,0407
12,6917
85,78
2
0,0402
12,6120
86,30
3
0,0398
12,4224
85,86
4
0,0405
12,7101
86,32
5
0,0400
12,5350
86,20
ChuÈn
0,0405
12,2646
83.30
Theo kÕt qu¶ ë b¶ng 5, ta cã:
- Gi¸ trÞ trung b×nh: = 86,09 %
- §é lÖch chuÈn: S = 0,254
- Kho¶ng tin cËy cña gi¸ trÞ trung b×nh (ë møc tin cËy 95%): X (%) = 86,09% 0,315%
- §é lÖch chuÈn t¬ng ®èi: RSD (%) = 0,295
VËy theo ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng trªn, hµm lîng Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu lµ: 86,09% 0,315%
2.2.4. §¸nh gi¸ ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng berberin clorid nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005):
2.2.4.1. TÝnh chÝnh x¸c:
C¸ch tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy nh trong phÇn 2.2.3
KÕt qu¶ thö ®é chÝnh x¸c cho thÊy ®é lÖch chuÈn cña c¸c kÕt qu¶ RSD =0,295 % < 2%. VËy ph¬ng ph¸p lµ chÝnh x¸c.
2.2.4.2. TÝnh tuyÕn tÝnh:
TiÕn hµnh kh¶o s¸t sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é vµ diÖn tÝch pic trªn chÊt chuÈn Berberin.
C©n 5 mÉu chÊt chuÈn Berberin clorid cã khèi lîng tõ 0,1600g→ 0,2400g ( t¹i c¸c ®iÓm 80%,90%,100%,110%,120% nång ®é dïng khi ®Þnh lîng)
TiÕn hµnh t¬ng tù 2.2.3
KÕt qu¶ thu ®îc ë b¶ng 6
B¶ng 6: Sù phô thuéc cña diÖn tÝch pic vµo nång ®é dung dÞch
STT
1
2
3
4
5
C (μg/ml)
25,76
28,80
32,16
35,04
38,48
DiÖn tÝch pic (mAU.min)
9,7115
10,8580
12,1243
13,2081
14,5069
H×nh 10: §å thÞ biÔu diÔn sù phô thuéc gi÷a diÖn tÝch pic vµo nång ®é cña dung dÞch
- Ph¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t¬ng quan gi÷a diÖn tÝch pic vµ nång ®é dung dÞch lµ:y = 0,377x + 0,002
- HÖ sè t¬ng quan: R = 0,9999
- §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,003
- Víi ®é tin cËy 95% ta cã kho¶ng tin cËy cña y_intercept:
b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay - 0,007 < y_intercept <0,011
NhËn xÐt: HÖ sè t¬ng quan cña ®êng håi quy vît qu¸ 0,99…TÊt c¶ c¸c gi¸ trÞ ®o ®îc n»m trªn ®êng håi quy hoÆc ph©n bè ®ång ®Òu c¶ hai phÝa cña ®êng håi quy. Kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0.
VËy ph¬ng ph¸p nµy lµ tuyÕn tÝnh trong kho¶ng nång ®é tõ 80% ®Õn 120% nång ®é lµm viÖc.
2.2.4.3. TÝnh ®óng:
. C©n 3 mÉu chÊt ®èi chiÕu berberin clorid (hµm lîng 83,3%) víi khèi lîng tõ 0,032g → 0,048g (t¹i c¸c ®iÓm 80%,100%,120% so víi lîng c©n dïng khi ®Þnh lîng).
. Mçi mÉu ch¹y s¾c ký 3 lÇn, lÊy gi¸ trÞ trung b×nh. TiÕn hµnh t¬ng tù 2.2.3
. TÝnh to¸n kÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh ®óng dùa trªn diÖn tÝch pic cña mÉu chuÈn lµ 12,2646 mAU.min øng víi khèi lîng c©n 0,0405 g.
KÐt qu¶ thu ®îc ghi ë b¶ng 7
B¶ng 7: KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh ®óng cña ph¬ng ph¸p HPLC
STT
Khèi lîng c©n(g)
Lîng Beberin clorid cã thùc a (g)
DiÖn tÝch pic trung b×nh (mAU.min)
Lîng t×m l¹i trung b×nh b (g)
PhÇn tr¨m t×m l¹i
%=b/a100%
1
0,0322
0,0268
9,8535
0,0270
100,75
2
0,0402
0,0335
12,1701
0,0334
99,70
3
0,0481
0,0401
14,5705
0,0400
99,75
H×nh 11: §å thÞ biÓu diÔn ph¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh vÒ mèi t¬ng quan gi÷a lîng ho¹t chÊt cã thùc vµ lîng t×m l¹i
- Ph¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t¬ng quan gi÷a lîng ho¹t chÊt ban ®Çu vµ lîng ho¹t chÊt t×m l¹i lµ: y = 0,997x + 0,001
- HÖ sè t¬ng quan: R = 0,999
- Trung b×nh % t×m l¹i :100,07%
- §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,001
- §é lÖch chuÈn cña ®é dèc: Sa = 0,013
- Víi ®é tin cËy 95% ta cã:
Kho¶ng tin cËy cña ®é dèc: a ± 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038
Kho¶ng tin cËy cña y_intercept :b ± 3,182Sb hay -0,002 < y_intercept <0,004
KÕt luËn :
- Kh«ng cã sai sè hÖ thèng h»ng ®Þnh v× kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0.
- Kh«ng cã sai sè hÖ thèng tû lÖ v× kho¶ng tin cËy cña ®é dèc chøa 1.
- Gi¸ trÞ trung b×nh cña tû lÖ thu l¹i lµ 100,07% n»m trong kho¶ng tõ 98% ®Õn 102%.
Nh vËy ph¬ng ph¸p lµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t.
2.2.4.4. TÝnh ®Æc hiÖu:
Nh trong phÇn 1.1.2 ®· tr×nh bµy, c¸c t¹p chÊt cÇn x¸c ®Þnh trong Berberin nguyªn liÖu lµ Palmatin vµ Jatrorrhizin. Nhng trong ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm kh«ng cã chÊt chuÈn Jatrorrhizin, chóng t«i chØ tiÕn hµnh x¸c ®Þnh sù ¶nh hëng cña t¹p chÊt Palmatin ®èi víi ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng
TiÕn hµnh:
. C©n 0,04 g berberin clorid chuÈn hßa tan trong níc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml.Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm níc tíi v¹ch, thu ®îc dung dÞch Berberin clorid 0,4 mg/ml. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 2 ml dÞch läc trªn cho vµo 4 b×nh ®Þnh møc 25 ml , thªm níc tíi v¹ch.
. Pha dung dÞch palmatin chuÈn cã nång ®é 10%; 5%; 2,5% so víi nång ®é berberin clorid ®em ch¹y s¾c ký.
+ C©n 0,04 g palmatin chuÈn hßa tan trong níc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml, thªm níc tíi v¹ch. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy 5 ml dÞch läc nµy cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml, thªm níc tíi v¹ch, thu ®îc dung dÞch palmatin 0,04mg/ml.
+ LÊy chÝnh x¸c 25 ml dung dÞch palmatin 0,04 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml, thªm níc tíi v¹ch., thu ®îc dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml.
+ LÊy chÝnh x¸c 25 ml dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml, thªm níc tíi v¹ch, thu ®îc dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml.
. LÇn lît thªm 2 ml dung dÞch palmatin 0,04; 0,02; 0,01 mg/ml vµo 3 b×nh ®Þnh møc 25 ml trªn, thªm níc võa ®ñ tíi v¹ch. B×nh ®Þnh møc 25ml kh«ng thªm palmatin ®îc thªm níc võa ®ñ tíi v¹ch.
. Ch¹y s¾c ký dung dÞch 4 b×nh nµy.
KÕt qu¶ thu ®îc ghi trong b¶ng 8
B¶ng 8: KÕt qu¶ thu ®îc vÒ sù ¶nh hëng cña t¹p chÊt palmatin tíi diÖn tÝch pic cña Berberin clorid
B×nh 1
B×nh 2
B×nh 3
B×nh 4
Berberin clorid 0,4 mg/ml
2
2
2
2
Palmatin 0,04 mg/ml
2
Palmatin 0,02 mg/ml
2
Palmatin 0,01 mg/ml
2
DiÖn tÝch pic (mAU.min)
12,2650
12,3011
12,3229
12,2530
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.1
-0.10
1.0
]
UV_VIS_1
mAU
min
WVL:263 nm
H×nh 12: S¾c ký ®å mÉu tr¾ng
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.1
-5.0
35.0
BERBERIN CH
UV_VIS_1
mAU
min
1 - 7.353
WVL:263 nm
H×nh 13: S¾c ký ®å mÉu chuÈn
H×nh 14: S¾c ký ®å mÉu chuÈn cã thªm Palmatin
NhËn xÐt: DiÖn tÝch pic hÇu nh kh«ng thay ®æi khi cã mÆt tíi 10% palmatin. VËy ph¬ng ph¸p cã tÝnh ®Æc hiÖu khi cã mÆt cña t¹p chÊt nµy.
2.2.5. So s¸nh hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc 2005 vµ ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo dîc ®iÓn ViÖt Nam III:
2.2.5.1. So s¸nh kÕt qu¶ ®é chÝnh x¸c cña hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng:
C¸c tÝnh to¸n ®îc thùc hiÖn trªn c¸c kÕt qu¶ thu ®îc khi ®Þnh lîng Berberin clorid nguyªn liÖu do bé m«n Hãa Dîc trêng §¹i Häc Dîc Hµ Néi cung cÊp.
Tãm t¾t kÕt qu¶ thu ®îc khi ®Þnh lîng nguyªn liÖu Berberin clorid b»ng hai ph¬ng ph¸p ë b¶ng 9
B¶ng 9: Tãm t¾t c¸c kÕt qu¶ thùc nghiÖm thu ®îc khi ®Þnh lîng nguyªn liÖu Berberin clorid
Ph¬ng ph¸p
Hµm lîng trung b×nh (%)
Ph¬ng sai (S2)
§é lªch chuÈn (S)
Sè lÇn thÝ nghiÖm
HPLC
86,09
0,0645
0,254
5
§o quang UV-VIS
86,24
0,1050
0,324
5
Dïng chuÈn F (Fisher): Ftn = S12/S22 (S1>S2)
Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3
S1: ®é lÖch chuÈn cña ph¬ng ph¸p ®o quang UV-VIS
S2: ®é lÖch chuÈn cña ph¬ng ph¸p HPLC
Flt ( ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K1 = 5 - 1 = 4; K2 = 5 - 1 = 4) lµ: 6,39
Nh vËy Ftn<Flt do ®ã ®é lÆp l¹i cña 2 ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin nguyªn liÖu kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.
2.2.3.2. So s¸nh kÕt qu¶ gi¸ trÞ trung b×nh cña hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng :
Do ®é lÆp l¹i cña 2 ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª nªn ®Ó so s¸nh kÕt qu¶ gi¸ trÞ trung b×nh cña hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng, ta dïng Test T.
T = víi =
T ph©n phèi Student víi n1 + n2 – 2 bËc tù do
ë møc tin cËy 95% hay α =0,05, ta cã: =2,306
= = 0,291
Do ®ã Tqs = = 0,815
Nh vËy 0,815 < 2,306 nªn víi møc ý nghÜa 0,05 gi¸ trÞ trung b×nh hµm lîng Berberin trong nguyªn liÖu cña hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.
2.2.3.2. §¸nh gi¸ u nhîc ®iÓm cña hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005) vµ b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III
Ph¬ng ph¸p HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005):
+ ¦u ®iÓm:
. Ph¬ng ph¸p cã tÝnh ®Æc hiÖu khi cã mÆt t¹p chÊt palmatin
+ Nhîc ®iÓm:
. Yªu cÇu ph¶i cã c¸c hãa chÊt dung m«i tinh khiÕt dïng cho HPLC
. Chi phÝ cao khi ph¶i ch¹y pha ®éng cã acetonitril vµ ®Æc biÖt lµ hãa chÊt heptan natri sulfonat rÊt ®¾t tiÒn
. Qu¸ tr×nh chuÈn bÞ ch¹y s¾c ký vµ ch¹y ®êng nÒn tèn thêi gian
Ph¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS theo D§VN III:
+ ¦u ®iÓm:
. Kh«ng tèn hãa chÊt dung m«i
. Thêi gian ph©n tÝch nhanh chãng, chØ cÇn 5-10 phót cã thÓ cho biÕt ngay kÕt qu¶
. Kü thuËt thao t¸c ®¬n gi¶n, m¸y mãc dÔ t×m, gän nhÑ
+ Nhîc ®iÓm:
Ph¬ng ph¸p kh«ng cã tÝnh ®Æc hiÖu (palmatin ¶nh hëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh lîng)
2.3. Bµn luËn:
Ph¬ng ph¸p HPLC lµ mét ph¬ng ph¸p ph©n tÝch hiÖn ®¹i, ®ang tõng bíc ®îc ®a vµo phßng kiÓm nghiÖm vµ trung t©m kiÓm nghiÖm ë ViÖt Nam. Ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005) cho biÕt hµm lîng Berberin trong nguyªn liÖu lµ 86,09% ± 0,315%; ph¬ng ph¸p chÝnh x¸c víi RSD = 0,295% < 2%, tuyÕn tÝnh trong kho¶ng 80%-120% nång ®é ®Þnh lîng vµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t. ¦u ®iÓm cña ph¬ng ph¸p nµy lµ cã tÝnh ®Æc hiÖu khi cã mÆt t¹p chÊt palmatin trong nguyªn liÖu Berberin. Tuy nhiªn ph¬ng ph¸p nµy l¹i rÊt tèn kÐm khi ph¶i dïng nh÷ng dung m«i vµ hãa chÊt ®¾t tiÒn nh: natri heptan sulfonat, acetonitril…
Hµm lîng Berberin trong nguyªn liÖu khi ®Þnh lîng b»ng ph¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS theo d®vn iii lµ 86,24% ± 0,40%; ph¬ng ph¸p chÝnh x¸c víi RSD = 0,37% < 2%, tuyÕn tÝnh trong kho¶ng 80%-120% nång ®é ®Þnh lîng vµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t nhng kh«ng ®Æc hiÖu ( t¹p chÊt palmatin ¶nh hëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh lîng). Tuy nhiªn. D§VN III cã quy ®Þnh giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2% [6]. Theo kÕt qu¶ ë môc 2.2.2.4 th× nÕu palmatin cã mÆt 2%, kÕt qu¶ ®Þnh lîng t¨ng 0,91%. Nªn víi berberin nguyªn liÖu thâa m·n yªu cÇu vÒ giíi h¹n t¹p chÊt palmatin th× sù cã mÆt cña palmatin kh«ng ¶nh hëng lín ®Õn kÕt qu¶ ®Þnh lîng.
Ngoµi ra, khi so s¸nh kÕt qu¶ cña hai ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng ta thÊy ®é chÝnh x¸c vµ gi¸ trÞ trung b×nh kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª.
Nh vËy, nÕu kh«ng yªu cÇu ®é chÝnh x¸c cao, cã thÓ dïng ph¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III ®Ó ®Þnh lîng berberin nguyªn liÖu (®¹t yªu cÇu vÒ giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2%) v× ph¬ng ph¸p nµy kh«ng tèn kÐm, tiÕn hµnh nhanh, thao t¸c ®¬n gi¶n, dÔ thùc hiÖn. Víi thµnh phÈm do kh«ng quy ®Þnh hµm lîng palmatin vµ nh÷ng t¹p kh¸c còng cã thÓ hÊp thô UV nªn ®Ó cã kÕt qu¶ ®Þnh lîng chÝnh x¸c th× nªn dïng ph¬ng ph¸p HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc (2005).
KÕt luËn
* KÕt luËn
Trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn khãa luËn tèt nghiÖp, chóng t«i ®· thu ®îc mét sè kÕt qu¶:
+ X¸c ®Þnh ®îc hµm lîng cña berberin trong nguyªn liÖu b»ng ph¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS ( theo D§VN III) vµ b»ng ph¬ng ph¸p HPLC( theo dîc ®iÓn Trung Quèc 2005). KÕt qu¶ cho thÊy c¶ hai ph¬ng ph¸p ®Òu ®¸p øng c¸c chØ tiªu : ®é chÝnh x¸c, ®é ®óng, tÝnh tuyÕn tÝnh. Nhng chóng kh¸c nhau vÒ tÝnh ®Æc hiÖu: ph¬ng ph¸p HPLC víi sù cã mÆt palmatin kh«ng ¶nh hëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh lîng, trong khi ®ã palmatin ¶nh hëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh lîng trong ph¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS
+ HiÓu ®îc c¬ së lý thuyÕt cña ph¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao, mét ph¬ng ph¸p ph©n tÝch hiÖn ®¹i cã nhiÒu øng dông trong kiÓm nghiÖm thuèc, biÕt sö dông thµnh th¹o c¸c thao t¸c c¬ b¶n cña m¸y HPLC.
+ Häc ®îc c¸ch t×m tµi liÖu, lµm thùc nghiÖm vµ tr×nh bµy v¨n b¶n mét c¸ch khoa häc vÒ mét vÊn ®Ò nghiªn cøu;
+ T×m hiÓu ph¬ng ph¸p HPLC, lµm quen vµ sö dông thµnh th¹o ®îc m¸y HPLC ®Ó ®Þnh lîng mét s¶n phÈm; biÕt c¸ch ®¸nh gi¸ mét ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng.
* §Ò xuÊt:
Do ®iÒu kiÖn thêi gian vµ hãa chÊt cã h¹n nªn chóng t«i chØ míi tiÕn hµnh ®Þnh lîng Berberin clorid nguyªn liÖu. Tuy nhiªn tõ kÕt qu¶ thu ®îc trong khãa luËn, chóng t«i cã nh÷ng ®Ò xuÊt sau:
+ ¸p dông ph¬ng ph¸p HPLC theo dîc ®iÓn Trung Quèc(2005) ®Ó ®Þnh lîng Berberin clorid trong mét sè chÕ phÈm thuèc nhá m¾t
+ Nghiªn cøu, kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ®Þnh lîng berberin b»ng HPLC kh«ng ph¶i dïng Natri heptan sulfonat ®Ó ¸p dông ®Þnh lîng ë c¸c c¬ së kiÓm nghiÖm trong níc.
Tµi liÖu tham kh¶o
I. TiÕng viÖt
1. Bé m«n Dîc liÖu (1998), Bµi gi¶ng dîc liÖu, Trêng §H Dîc Hµ Néi, tËp 2, tr. 89- 91.
2. Bé m«n Hãa Ph©n tÝch (2006), Hãa ph©n tÝch, Trêng §H Dîc Hµ Néi, tËp 2, tr. 41- 62.
3. Bé m«n Hãa Ph©n tÝch (2002), Hãa ph©n tÝch, Trêng §H Dîc Hµ Néi, tËp 1, tr. 27- 44.
4. Bé m«n Hãa Ph©n tÝch (2004), KiÓm nghiÖm thuèc, Trêng §H Dîc Hµ Néi, tr. 68- 79,83-98.
5. Bé Y tÕ (1994), Dîc ®iÓn ViÖt Nam II, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tËp 3, tr.71- 74.
6. Bé Y tÕ (2002), Dîc ®iÓn ViÖt Nam III, Nhµ xuÊt b¶n Y häc Hµ Néi, tr.33- 35, 178- 179 phô lôc 3 (PL- 75, 76).
7. NguyÔn Minh §øc (2006), S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao vµ mét sè øng dông vµo nghiªn cøu, kiÓm nghiÖm dîc phÈm, dîc liÖu vµ hîp chÊt tù nhiªn, Nhµ xuÊt b¶n y häc thµnh phè Hå ChÝ Minh, tr.138,148-149.
8. Ph¹m Gia HuÖ, TrÇn Tö An (1998), Hãa ph©n tÝch tËp 2, §¹i häc dùîc Hµ Néi, tr.55-98.
9. §ç TÊt Lîi (1999), Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam, XuÊt b¶n lÇn thø VIII- Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tr.195.
10. Tõ V¨n M¹c (1995), Ph©n tÝch hãa lý, NXB khoa häc vµ kü thuËt Hµ Néi, tr.313-319.
11. DS. Ph¹m ThiÖp- DS.Vò Ngäc Thóy( t¸i b¶n lÇn thø 13), Thuèc biÖt dîc vµ c¸ch sö dông, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tr.106.
II. TiÕng Anh
12. Martindal 34 (2005), volume II, p.1659.
13. Pharmacopoeia of the people¢s republic of China (2005), volum III, p.94- 96.
14. The Korean Pharmacopoeia, 8th edition (2002), p.81-82.
15. The Japanese Pharmacopoeia fifteenth edition (2006), p.351- 352.
16. Wang, S. D; Song, B.S . (2000), Determination of berberin in decoted liquid from Shensu granules with water by reversed- phase liquid chromatography, Sepu, p. 261- 262.
III. Trang web
17. C©y thuèc quý (2007), berberin, www. c©y thuèc quý. Info.vn.
18. Wikipedia (2007), berberin,
.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- So sánh 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và ….DOC