So sánh kết quả phát hiện monodon baculovirus trên tôm sú (penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm malachite green, nhuộm haematoxylin và eosin, polymerase chain reaction

created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Gần đây tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cũng được nhập về nuôi ở nước ta (trích dẫn từ Bộ Thủy sản, 2006). 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó Cùng với sự phát triển, tốc độ gia tăng diện tích và sản lượng tôm nuôi là tình hình dịch bệnh không ngừng bùng phát. Đây cũng là một trong những nguyên nhân quan trọng làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi. Tại Thái Lan nghề nuôi tôm năm 1992 bị thiệt hại 30 triệu USD (Nash et al., 1995); năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm tại Trung Quốc thiệt hại 400 triệu USD (Wei Qi, 2001); năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu USD (Subasinghe et al., 1995); năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại 600 triệu USD (Chanratchakool et al., 2001); năm 1999 bệnh tôm đã làm Ecuador thiệt hại 280 triệu USD (Alday de Graindorge and Griffith 2001). Theo Lightner (1996) thì virus là tác nhân chủ yếu và đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm. Chẳng hạn như bệnh do virus đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHD), hội chứng Taura đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Châu Mỹ La tinh hoặc bệnh MBV cũng đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm sú ở Đài Loan năm 1987 và 1988 (Chen et al., 1988). Thiệt hại hàng năm do bệnh dịch thủy sản gây ra cho thế giới là khoảng 3 tỷ USD (Rosenberry, 1996) (trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006) Năm 1989 lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn của MBV trong cơ quan gan tụy của Postlarvae (PL) ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) (Rosenberry, 1997). Theo kết quả nghiên cứu của Liao (1999) thì quần đàn tôm mẹ bắt từ biển của Đài Loan 1987 nhiễm MBV 33%, đến năm 1989 nhiễm 100%, thường gặp nhiễm 85%. Loài virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan năm 1987-1988 (Liao et al., 1992). Natividad (1992) cho biết, ở Philippine đến năm 1992 rất khó tìm được một đàn PL của tôm sú không nhiễm MBV (trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo,1997). MBV cũng được xem là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch ở Úc. MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên (Lightner và Redman, 1981). Virus này gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et al., 1992). Còn theo Lightner (1996) thì MBV có thể nhiễm ở hầu hết các giai PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 đoạn khác nhau của tôm, bắt đầu từ giai đoạn Zoea 2, riêng giai đoạn Nauplius có tính trơ với virus. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (trích dẫn từ Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). Theo Phan Lương Tâm (1994) thì tại Việt Nam trong hai năm 1994-1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng. Các công trình nghiên cứu liên quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi ở ĐBSCL cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất hiện của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus) (trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1997). Kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) cho thấy tại các tỉnh miền Trung có khoảng 70% bể PL có MBV dương tính. Khi đưa PL xuống ao đất để ương thành tôm giống, tỷ lệ nhiễm MBV trên đàn giống tăng cao, gần 90% ao ương nhiễm MBV. Tôm bố mẹ dùng trong các trại sản xuất tôm sú giống ở miền Trung bị nhiễm MBV từ 60 – 70%. Đầu năm 2001, tôm sú đã chết hàng loạt, trên diện rộng ở ĐBSCL, được coi là “đại dịch tôm sú’'. Tại các vùng mới chuyển đổi, đã có 20.854 ha bị thiệt hại; một số vùng ở Cà Mau thiệt hại tới hơn 80%. Nôn nóng chuyển đổi tự phát, không có kỹ thuật, hạ tầng thuỷ lợi chưa có là những nguyên nhân chính làm cho bệnh đốm trắng phát tán và lan tràn. Vụ đầu năm 2002, bệnh tôm lại tái diễn ở ĐBSCL, được xác định là do hạ tầng chưa cải thiện, môi trường nuôi quá xấu. Đến hết tháng 9/2003, số diện tích nhiễm bệnh ở Kiên Giang là hơn 8.000 ha, Cà Mau bị hơn 232 ha; nhất là Miền Trung thất bại nặng nề khi Khánh Hoà, Phú Yên, Quảng Nam, Ninh Thuận có hàng nghìn ha tôm bị nhiễm bệnh. Riêng thiệt hại của Khánh Hoà ước tính 26,6 tỷ đồng, Bình Định 40 tỷ. Khảo sát của Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản (NCTS) III cho thấy, nếu tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh, tôm giống có nguy cơ nhiễm cao, đặc biệt với bệnh MBV. Tôm giống sản xuất trong nước hiện tập trung ở miền Trung. Trong đó, riêng Khánh Hoà đã có hơn 1.000 trại, cung cấp khoảng 7 tỷ tôm PL cho cả nước. Với mật độ xây dựng trại giống ngày càng dầy, việc tuân thủ quy hoạch và các tiêu chuẩn xử lý thải hạn chế, ấu trùng tôm có nguy cơ nhiễm bệnh cao. Phòng bệnh học của Trung tâm NCTS III, đã phát hiện 30/54 mẫu kiểm tra PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 tôm bố mẹ nhiễm MBV, với mẫu tôm PL bị nhiễm là 40,5% (trích dẫn từ Mai Phương và Hà Yên, 2003). Báo cáo kết quả của ngành NTTS năm 2003 thì cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm. Trong đó, diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Các bệnh xảy ra với tôm cũng chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm qua do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng từ 25-46,6%, trung bình 38,9% tỷ lệ nhiễm MBV từ 43,3-60%. Và trong số 4 nguồn cung cấp giống về cho 2 tỉnh vùng Ðông Bắc Bộ này, có tới 3 nguồn có quá nửa số giống bị nhiễm bệnh MBV. Tại các tỉnh Nam Bộ theo báo cáo năm 2003 của Viện NTTS II thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50% (Hà Anh, 2007). Theo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Quản lý bệnh thủy sản Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ từ năm 2001-2003 thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên tôm giống tại các tỉnh ĐBSCL là 13,1% và MBV là 33,8% (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2004). Năm 2005 theo phòng kiểm dịch giống thủy sản Cà Mau cho biết qua số mẫu kiểm dịch đã có tới 83% mẫu tôm giống ở tỉnh bị nhiễm MBV. Trung tâm khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu năm 2006 đã xét nghiệm 2.326 mẫu tôm phát hiện có gần 50% số mẫu kém chất lượng; trong đó có 941 mẫu nhiễm MBV,184 mẫu nhiễm virus đốm trắng. còn ở Trung tâm khuyến ngư Kiên Giang thì qua kiểm tra 100 mẫu tôm giống, số lượng tôm bị nhiễm bệnh còi chiếm đến 40% lượng tôm sú giống nhập về (Cung Diễm, 2006). Trong đầu vụ nuôi tôm sú năm 2008, hiện đã có gần 100.000 ha nuôi tôm sú ở Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh… bị chết, mức độ thiệt hại từ 30-90% . Riêng ở Kiên Giang ước lượng mức thiệt hại do tôm chết đã trên 15 tỷ đồng. Trong đó, điển hình như huyện Vĩnh Thuận là 17.247 ha chiếm 88,98%; huyện An Minh 15.904 ha chiếm 50,25%; huyện U Minh hượng 3.653 ha chiếm 52,35%; và An Biên 2.475 ha chiếm 30,11% diện tích thả nuôi (Song Huỳnh, 2008). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 7 Tại huyện Mỹ Xuyên-Sóc Trăng là nơi có mô hình nuôi tôm-lúa được các nhà khoa học ở các viện, trường đại học trong cả nước đánh giá mang tính bền vững cao. Tuy nhiên, đến khoảng trung tuần tháng 4-2008, nơi đây có hơn 2.500 ha tôm nuôi bị chết, chiếm gần 80% diện tích. Nhiều hộ nuôi tôm ở Trà Vinh cũng lâm vào cảnh tương tự. Khi tôm được 2,5 tháng tuổi thì bị bệnh đốm trắng, đầu vàng… tình trạng tôm chết hàng loạt cũng đang diển biến phức tạp tại các huyện Châu Thành. Cầu Ngang, Duyên Hải…Cùng thời gian này, tại các Trạm kiểm dịch động vật thủy sản thuộc Chi cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản tỉnh Trà Vinh đã phát hiện và vận động các hộ sản xuất, kinh doanh tự tiêu huỷ hơn 24,5 triệu con tôm sú giống có mang mầm bệnh MBV, đỏ thân, phát sáng... Trong đó, có trên 22,2 triệu con con tôm giống sản xuất tại địa phương và gần 2,3 triệu con nhập ngòai tỉnh (Duy Hoàng, 2008). Phần lớn các diện tích tôm bị chết là do người nuôi thả giống trước lịch thời vụ. Trong thời gian đầu, tôm phát triển tốt, nhưng sau đó thì bị bệnh đốm trắng, một số khác thì bị đỏ thân. Hiện nay, ĐBSCL mỗi năm cần khoảng 22 đến 25 tỷ con giống. Trong khi đó, nguồn tôm giống ở các địa phương chỉ đáp ứng khoảng 30 đến 35%, còn lại phải thu mua con giống từ các tỉnh miền Trung nhưng theo thống kê thì nguồn tôm giống ở các tỉnh này có tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao từ 65-70%. Theo Sở Thủy sản Bạc Liêu, qua kiểm tra trên 355 mẫu tôm giống tại các cơ sở bán tôm giống đã phát hiện có 52,4% (186/355) mẫu bị nhiễm bệnh MBV; 10,4% (37/355) mẫu bị nhiễm bệnh đốm trắng; 11% (39/355) mẫu bị nhiễm bệnh đầu vàng (Nguyễn Kiểm, 2008). Theo báo cáo của ngành thủy sản các tỉnh ĐBSCL cho biết, tôm sú hiện vẫn tiếp tục chết tại nhiều tỉnh ven biển trên diện tích hàng ngàn hécta, nâng diện tích tôm chết từ đầu năm đến nay trên 120.000ha, nhiều gần 3 lần tháng 3- 2008, tập trung tại Cà Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha (Thảo An, 2008). 2.4 Bệnh MBV 2.4.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh MBV là virus type A baculovirus monodon, có cấu trúc nhân là ADN hai mạch, có lớp vỏ bao, dạnh hình que (Lightner, 1996). Chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ±15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Chủng MBV của tôm (P. plebejus, P. monodon, P. merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45-52 x 260- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 8 300 nm, kích thước vỏ bao 60 x 420 nm (Mari et al., 1993 được trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006). Virus ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tụy và tế bào biểu bì phía trước ruột giữa, virus tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn tiềm ẩn: sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế bào chất biến đổi. Giai đoạn 1: Nhân tế bào trương nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển ra sát màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành giọt mỡ. Virus bắt đầu gây ảnh hưởng. Giai đoạn 2: Nhân trương to, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện thể ẩn trong nhân. Giai đoạn 3: tế bào bị bệnh, nhân tăng lên 2 lần đường kính, 6 lần thể tích. Bên trong nhân có một đến nhiều thể ẩn, trong thể chứa đầy các virus. Các virus phá hũy tế bào ký chủ, tiếp tục di chuyển sang các tế bào khác hoặc theo chất bài tiết của tôm ra môi trường, tạo thành virus tự do tồn tại trong bùn và nước (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008). 2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2008) thì khi tôm mới nhiễm MBV, dấu hiệu bệnh không biểu hiện rõ ràng. Khi tôm nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có biểu hiện một số dấu hiệu sau: Tôm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm. Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh trưởng chậm. Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám như: ký sinh trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi. Gan tụy teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh. Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao. 2.4.3 Phân bố Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên năm 1980 ở đàn tôm sú đưa từ Đài Loan đến nuôi ở Mêhico (Lightner et al., 1981,1983). Tiếp theo các nhà nghiên cứu đã phát hiện bệnh MBV có xuất phát từ Đài Loan, Philippines, Malaysia, Polynesia thuộc Pháp, Singapore, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc…Theo Chen et al. (1989) thì những năm 1987 và 1988 ở Đài Loan bệnh MBV đã gây PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 9 thiệt hại nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm sú (trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006). Cho đến nay bệnh MBV đã phân bố rộng rãi ở tôm nuôi và tôm tự nhiên khu vực Đông bán cầu và hiện nay ghi nhận ở Úc, Đông Á, Trung Á, Đông Nam Á, Ấn Độ, Đông Châu Phi. 2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm Tôm sú là loài thường xuyên nhiễm bệnh MBV, các loài tôm khác cũng khả năng bị nhiễm MBV như: P. merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P. vannamei (Lightner, 1996). MBV nhiễm từ giai đoạn Post đến giai đoạn tôm trưởng thành, ngoại trừ trứng, ấu trùng Nauplius (Lightner, 1996). 2.4.5 Phương thức lây nhiễm Bệnh MBV lan truyền từ tôm bị nhiễm bệnh sang tôm khỏe (chủ yếu là tôm khỏe ăn tôm bệnh hoặc nhiễm virus theo chất thải của tôm). (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008) 2.4.6 Chẩn đoán bệnh Có thể chẩn đoán sơ bộ bệnh MBV thông qua các dấu hiệu chính của bệnh như đã mô tả ở phần trên. Áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh các mẫu mô gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng Malachite green, dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40X. Dưới kính hiển vi, có thể nhận biết sự hiển diện của virus này thông qua sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu, ít bắt màu thuốc nhuộm, nằm trong các nhân phình to của tế bào biểu mô gan tụy. Có thể dùng phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin để phát hiện các thể ẩn hình cầu, bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, ở độ phóng đại ≥ 40X. Ngoài ra, cũng có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặc trưng của MBV, dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các vi thể virus MBV trong nhân tế bào biểu mô gan tụy hay các kỹ thuật như ELISA, lai tại chổ... (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 2.4.7 Phòng bệnh Không dùng tôm giống có nhiễm mần bệnh MBV. Kiểm tra đàn tôm bố mẹ trước khi cho đẻ. Cải tạo ao thật kỹ trước mỗi vụ nuôi. Nuôi tôm đúng mùa vụ, quản lý, chăm sóc tốt, cung cấp đầy đủ thức ăn về chất và lượng. Không để tôm sốc trong quá trình nuôi. Xử lý nước bằng ozon và các chất sát trùng Benzalkon clorua trước khi ấp trứng thì có thể sản xuất được đàn tôm PL không bị nhiễm MBV (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008). 2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green Phương pháp nhuộm nhanh bằng Malachite green 0,05-0,1% được Lightner et al. đề ra năm 1983 nhằm phát hiện các thể ẩn của MBV trong vòng 5 phút. Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này thì hạn chế, nó chỉ có thể kiểm tra được những con tôm bị nhiễm bệnh cấp tính hoặc trước cấp tính trong một quần đàn có tỷ lệ nhiễm cao (Lightner et al., 1989). 2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) 2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học Mô học được nghiên cứu bắt đầu từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhock (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỷ XVIII Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Tiếp theo lĩnh vực nghiên cứu này là Xanvier Bichat (1771-1802), một giảng viên dạy giải phẩu học và phẩu thuật tại một trường đại học ở Pari đã đưa ra khái niệm chung đầu tiên về mô học trên động vật, và từ đó mô học trở thành một phần của môn giải phẩu học dạy cho sinh viên y khoa. Tiếp theo đó, các nhà động vật học đã vận dụng công cụ mới này vào nghiên cứu của họ trên nhiều động vật khác nhau (trích dẫn từ Tài Hoàng Nhật Quang, 2008). Để góp phần vào sự phát triển của mô học, nhà bệnh học người Đức Rudolph Virchow (1821-1902) đã đề xuất ý tưởng “bệnh có thể được đặc trưng bởi những biến đổi ở cấp độ tế bào”. Ý tưởng này đã đóng góp to lớn cho học thuyết tế bào và sự phát triển của mô bệnh học. Từ đó, mô học không chỉ được PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 ứng dụng trong việc nghiên cứu cấu trúc mô bình thường mà còn được áp dụng trong nghiên cứu những biến đổi cấu trúc của cơ quan bệnh. Theo Lightner và Bell (1989) thì mô học là khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào, như mô thần kinh, mô da. Những biến đổi bệnh lý ở các mô và tế bào được gọi là những tổn thương vi thể. Nghiên cứu các tổn thương có nghĩa là mô tả đầy đủ mọi chi tiết của tổn thương đó ở mức độ vi thể rồi kết luận nó thuộc nhóm bệnh gì. Mô tả bệnh không chỉ mô tả tổn thương mà còn là công việc so sánh đối chiếu các tổn thương đó đối với những biểu hiện lâm sàng của tôm, cá. Nghĩa là tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa những biến đổi hình thái với các rối loạn chức năng trên cơ sở xác định việc chẩn đoán (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). 2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng mô học trong việc hệ thống các bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et al., 1992). Năm 1997 Wang, Tang và Chen chứng minh sự hiện diện virus đốm trắng trên Penaeus monodon và Penaeus japonicus bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học và điện tử. Kế đến năm 1998, Sudha et al. bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển ở Ấn Độ (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) . Ở Việt Nam, năm 1999 Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR và năm 2000 ông cũng ứng dụng tiếp 2 phương pháp này trong nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu bệnh đỏ mang trên tôm sú bố mẹ, bệnh phát sáng, bệnh đục thân và bệnh đốm trắng trên ấu trùng tôm sú giống tại các trại giống thuộc các khu vực Miền Trung và Nam Bộ”. Năm 2001, Hòa cũng đã ứng dụng mô học trong việc xác định cường độ cảm nhiễm MBV. Đến năm 2003, Bùi Quang Tề cũng đã ứng dụng phương pháp này vào việc chẩn đoán bệnh tôm và đưa ra phương pháp phòng trị. Cùng năm này, Phạm Trần Nguyên Thảo đã ứng dụng phương pháp mô học và PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm giống và tôm thịt. Theo Nguyễn Anh Tuấn và ctv (2003) thì phương pháp này là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn đoán được bệnh bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó cũng có những hạn chế là thao tác tương đối chậm và chỉ phát hiện bệnh khi tôm đã nhiễm nặng. Đồng thời khi sử dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh nên kết hợp với PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm vì đôi khi những hình thái tổn thương của một số bệnh có biểu hiện giống nhau (trích dẫn từ Phùng Thúy An, 2005). 2.7 Phương pháp PCR 2.7.1 Sơ lược về PCR Polymerase Chain Reaction là phương pháp được Kary Mullis et al. phát minh năm 1985 đã giúp các nghiên cứu về ADN nói riêng và về sinh học phân tử nói chung đạt được những thành tựu to lớn. PCR là kỹ thuật khuếch đại từ một đoạn ADN bất kỳ có thể nhân lên hàng tỷ lần nhanh chóng nhờ sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (primer) chuyên biệt (oligonucleotides) dài khoảng 17 đến 30 nucleotite có trình tự bổ sung với trình tự của đoạn ADN gốc, enzyme tổng hợp ADN, các nucleotide tự do và dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phần virus. Những virus ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này (Trần Việt Tiên, 2007). Hiện nay, PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền, phân tích pháp y,… Theo Khuất Hữu Thanh (2006) thì PCR là một chuổi chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép (dNTP, enzyme ADN polymerase, Mg2+…), phân tử ADN được biến tính cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94-950C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn lai (anealation): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các đoạn mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 600C-700C, tùy theo độ lớn và Tm của các đoạn mồi sử dụng và thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho ADN polymerase tổng hợp tốt nhất (thường dùng Taq ADN polymerase tách chiết từ̀ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus). Thời gian của các bước này tùy thuộc độ dài của ADN cần khuếch đại, thường 30 giây đến nhiều phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu so với lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo tính toán thì sau 25 đến 35 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 225-235 bản sao. Trong qui trình PCR, sau những chu kỳ đầu, các chu kỳ cuối nhiệt độ cần tăng thêm 1-20C. Do về sau lượng mồi giảm, lượng khuôn tăng lên, mặt khác enzyme Taq ADN polymerase hoạt động yếu dần do tác động nhiệt độ, vì vậy cần tăng nhiệt độ chu kỳ sau để tăng hiệu quả tổng hợp ADN. Sau phản ứng các ADN được nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát thông qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và đọc kết quả dưới bàn đọc UV. 2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ADN khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh (2006) khuôn ADN có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của ADN khuôn. Enzyme: ADN polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các đặc tính của ADN polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau. Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc: Trình tự của mồi được chọn sao cho giữa mồi xuôi và mồi ngược không thể bắt cặp bổ sung với nhau và cũng không có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005). Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược phải tương đương nhau (thông thường nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 720C). Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lập đi lập lại nhiều lần (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005). Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3. Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lập lại trên gen. Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 Nồng độ các loại nucleotide tự do: Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) khoảng 20 – 200 µM / mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2006) Nồng độ Mg2+: Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 µM. Nước sử dụng cho phản ứng phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào. Không chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy acid nucleic. Môi trường dung dịch đệm phải ổn định. Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20-50 µl. Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005) số lượng chu kỳ PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đọan đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (3) các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau… 2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản Hiện nay, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu như sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán... để phát hiện mầm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm... Trong thủy sản thì phương pháp này theo Trần Thị Tuyết Hoa (2007) có những ứng dụng sau: Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi: (1) Chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết. (2) Phòng bệnh: kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống. (3) Kiểm soát bệnh: theo dõi, kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu. Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu – Sự nhiễm khuẩn hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli. Góp phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2009 – 5/2009 - Địa điểm phân tích mẫu: Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản - khoa Thủy Sản - trường Đại học Cần Thơ 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu - Tôm giống - Tôm thịt 3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp Malachite Green - Bộ dụng cụ mổ - Thớt nhựa - Lame và lamella - Kính hiển vi 3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin - Bộ dụng cụ mổ - Kính hiển vi - Lame và lamella - Máy cắt lát mỏng - Khuôn đúc - Khay nhuộm - Máy ảnh, bút chì, sổ ghi chép 3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR - Máy chu kỳ nhiệt - Pipet tự động - Ống típ 1.5 ml và 0.5 ml - Que nghiền mẫu - Máy ủ - Máy li tâm - Máy điện di - Máy chụp hình UV - Lò viba - Cân điện tử PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 - Tủ lạnh - Tủ -80 0C - Tủ -20 0C 3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green - Malachite Green 0,05-0,1%, cồn 900 3.2.3.2 Phương pháp nhuộm haematoxylin và Eosin - Nước cất -Cồn tuyệt đối, cồn 950, cồn 800 , cồn 700 - Xylen - Formaline - Paraffin - Thuốc nhuộm Haematoxylin và Eosin (H&E) - Keo canada palsam - Dung dịch Davidson’s AFA (Davidson’s alcohol formaline acetic) 3.2.3.3 Phương pháp PCR - Dung dịch nạp mẫu - Agarose - TAE buffer 0,5X 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu mẫu - Địa điểm thu mẫu: Kiên Giang, Cần Thơ - Số lượng mẫu thu: Tôm thịt: 11 mẫu (được thu từ 4 ao) Tôm giống: 30 mẫu Trong đó, tại Kiên Giang thu 15 mẫu tôm giống và 11 mẫu tôm thịt; tại Cần Thơ 15 mẫu tôm giống. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 3.3.2 Phương pháp phân tích 3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green (theo phương pháp Lightner, 1996) Chuẩn bị tiêu bản: - Tôm lớn: dùng dao mổ giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên lame tán mỏng. - Tôm giống: dùng pen và kim mũi giáo tách giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên lame tán mỏng (lấy khoảng 25-40 con/mẫu). - Nhỏ 1 giọt dung dịch malachite green 0.1% lên mẫu, đậy lamella lại - Quan sát các thể ẩn MBV trong vòng 5 phút - Các thể ẩn MBV bắt màu xanh, hình cầu đơn lẻ hay kết thành từng chùm. 3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin a) Phương pháp cố định mẫu (theo phương pháp Lightner, 1996) Chuẩn bị dung dich Davidson’s AFA Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson’s AFA Cố định mẫu Tôm lớn - Dùng kéo cắt bỏ các phần phụ trên cơ thể tôm như: các chân bơi và chân bò. Sau đó, cắt đôi tôm tại vị trí nối của phần đầu và phần bụng, tiếp tục dùng kéo cắt phần đầu của tôm ra làm đôi theo chiều dọc cơ thể. - Cho mẫu vừa cắt vào lọ chứa dung dịch cố định. - Sau khi mẫu được cố định từ 24-48 giờ thì chuyển mẫu sang cồn 50-700 để bảo quản mẫu (thời gian trữ mẫu trong cồn thì không giới hạn). Thành phần Thể tích Ethyl alcolhol 95% 330 ml Formaline 200 ml Acid acetic 115 ml Nước cất 335 ml PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 Tôm giống - Nhúng trực tiếp mẫu vào dung dịch cố định - Thời gian cố định mẫu từ 12-24 giờ, sau đó chuyển sang cồn 50-700 để bảo quản. b) Xử lý mẫu - Đối với tôm giống thì xử lý cả nguyên con - Đối với tôm lớn: Dùng dao và pen lột bỏ phần vỏ của tôm và cắt tỉa mẫu lại cho đẹp. - Mẫu mô tôm sau khi cắt cho vào catsset và quy trình xử lý mẫu được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô theo Bảng 3.2 (Shreck & Moyle, 1999): - Sau khi hoàn thành các bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa tôm vào lọ số 1 và cho chương trình cài đặt trên vận hành. Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu TT Hóa chất sử dụng Kích cỡ khối mô/Thời gian Mẫu tôm giống Mẫu tôm thịt 1 Cồn 80% 20’ 30’ 2 Cồn 95% 20’ 60’ 3 Cồn 95% 30’ 30’ 4 Cồn 100% 40’ 60’ 5 Cồn 100% 40’ 180’ 6 Cồn 100% 40’ 180’ 7 Cồn 100% 60’ 180’ 8 Xylen 20’ 30’ 9 Xylen 30’ 30’ 10 Paraffin+Xylen (7:3) 60’ 60’ 11 Paraffin+ Sáp ong (1:1) 60’ 60’ 12 Paraffin+ Sáp ong (7:3) 60’ 60’ c) Đúc khối - Sau quá trình xử lý, mẫu được tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho paraffin nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh để cố định vị trí của mẫu trong khuôn. Khi mẫu được tẩm vào trong paraffin, đặt khuôn nhựa xử lý có kí hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách paraffin ra khỏi khuôn. d) Cắt lát - Chuẩn bị máy cắt: Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của mũi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-30o. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lát cắt được hình thành. - Cắt mẫu: Trước khi tiến hành cắt mẫu phải điều chỉnh độ dày của lát cắt. Có thể bắt đầu những lát cắt 12-16 µm. Sau khi đã cắt bằng mắt khối mẫu và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt 3-6 µm. Mẫu được cắt ra thành từng băng dài, cho vào nước ở nhiệt độ 45-500C, làm cho paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn đạt yêu cầu. Dán từng đoạn này lên lame. Mẫu dán xong đặt lame lên lò nung điều chỉnh nhiệt độ khoảng 40-500C cho paraffin chảy ra, lúc này mẫu sẻ được dính chặt vào lame. e) Nhuộm tiêu bản (theo Maye, s có điều chỉnh) gồm các bước sau: Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu STT Hóa chất sử dụng Thời gian (phút) 1 Xylen 5 2 Xylen 5 3 Xylen 5 4 Cồn tuyệt đối 1000 5 5 Cồn tuyệt đối 1000 5 6 Cồn 700 2 7 Rửa nước máy 5 8 Haematoxylin 1 9 Rửa nước máy 5 10 1% acid alcohol 10 giây 11 Rửa nước máy 1 12 Eosin 2 13 Cồn 950 5 14 Cồn 1000 5 15 Cồn 1000 5 16 Xylen 5 17 Xylen 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 f) Dán mẫu Trải một lớp Canada palsam lên tiêu bản, đậy lamelle lên trên để bảo vệ mẫu. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô. g) Quan sát tiêu bản và đọc kết quả Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Đầu tiên quan sát ở vật kính 10X để đánh giá tiêu bản. Tiêu bản đạt yêu cầu phải có các thể ẩn hình cầu nằm trong nhân bắt màu hồng của Eosin. Các tiêu bản đạt yêu cầu sẽ được quan sát ở độ phóng đại 40X. 3.3.2.3 Phương pháp PCR (sử dụng kít Duplex MBV–WSSV của Công ty Nam Khoa) a) Thành phần bộ kít Các ống WSSV- MBV PCR mix (gồm 43 µl Tris HCl, KCl, Tap polymerase, dNTP, UNG, dUTP, mồi xuôi và ngược, MgCl2), đối chứng dương (Plasmid chèn WSSV- MBV- DNA), đối chứng âm (TE 1X) và MBVDNA-IC (Plasmid chèn DNA chứng nội tại) b) Chuẩn bị mẫu Mẫu là tôm PL, tôm giống cỡ nhỏ tiến hành lấy khoảng 50 con. Mẫu tôm thịt: Tiến hành cắt một phần gan tụy của tôm (tổng lượng mẫu không quá 1 gr). Tất cả các loại mẫu trên có thể lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 95% c) Ly trích ADN từ mẫu tôm Nguyên tắc Phương pháp dựa trên nguyên tắc phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH- SDS) và sốc nhiệt để tách chiết ADN của virus từ mẫu vật. Quy trình thực hiện - Cho mẫu vật vào ống Eppendorf 1,5 ml, thêm vào 100 µl dung dịch tách chiết, dùng que nghiền nhuyễn mẫu. Sau đó thêm 500- 700 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn. (nếu thao tác nhiều mẫu thì nên giữ lạnh trên đá cho đến khi chuyển qua bước tiếp theo). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 - Chuyển các ống Eppendorf này đến bếp nhiệt khô ở 960 C, giữ yên 5- 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh trong đá vài phút. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích PCR hoặc giữ lạnh trong -200 C (không quá 1 tuần). d) Quy trình khuếch đại phát hiện WSSV- MBV - Mẫu phân tích: cho 2 µl dung dịch chiết ADN và 5 µl dung dịch MBVDNA- IC (vortex kỹ) vào 1 ống WSSV-MBV-PCR mix 43 µl. - Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương và 5 µl dung dịch MBVDNA- IC (vortex kỹ) vào 1 ống WSSV-MBV-PCR mix 43 µl. - Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm và 5 µl dung dịch MBVDNA-IC (vortex kỹ) vào 1 ống WSSV-MBV-PCR mix 43 µl. - Chu kỳ nhiệt: Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo thống số 01 chu kỳ: 40 0C trong 10 phút 01 chu kỳ: 95 0C trong 05 phút 40 chu kỳ: 94 0C trong 30 giây 49 0C trong 30 giây 72 0C trong 60 giây 01 chu kỳ: 72 0C trong 10 phút e) Đọc kết quả - Chuẩn bị bản gel: Pha 1,5% Agarose bằng dung dịch đệm TAE 0,5X chai, sau đó đun cho Agarose tan hết (không còn bọt khí), đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 600C cho Ethidium bromide vào lắc nhẹ (nếu đổ gel ở khuôn gel có thể tích 30 ml thì thể tích Ethidium bromide cần dùng là 2 μl, khuôn có thể tích 120 ml thì thể tích Ethidium bromide cần dùng là 5 μl) để Ethidium bromide tan đều rồi tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel quá dày, <0,8 cm). Khi bản gel đông lại thì nhẹ nhàng gỡ bỏ các lược trên bản gel, chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (cùng loại với dung dịch đã dùng đun Agarose) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel là được. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 - Điện di: Dùng giấy Parafin rồi nhỏ khoảng 2–3 μl dung dịch nạp mẫu, hút 10 μl sản phẩn PCR ra nhỏ vào và trộn đều, sau đó cho vào giếng trên bản gel. Điện di ở hiệu điện thế là 100 volt, trong thời gian 35–40 phút - Đọc kết quả: Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang ADN 1 kb plus ladder để xác định trọng lượng phân tử. WSSV: sản phẩm khuếch đại 526 bp MBV: sản phẩm khuếch đại 195 bp MBVDNA-IC: sản phẩm khuếch đại 232 bp 3.4 Phương pháp xữ lý số liệu Xác định cường độ cảm nhiễm Theo Lightner và Redman, 1983 (trích dẫn từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa và Phạm Minh Đức, 2008) chia cường độ cảm nhiễm MBV ra làm 4 mức (tính cường độ theo thị trường quan sát): · Cường độ cảm nhiễm nhẹ (+): một vài tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus. · Cường độ cảm nhiễm trung bình (++): 10-30% tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus. · Cường độ cảm nhiễm nặng (+++): 30-60% tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus. · Cường độ cảm nhiễm rất nặng (++++): 60-80% tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR 4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG Bằng phương pháp nhuộm MG kiểm tra 30 mẫu tôm sú giống nhiễm MBV (Hình 4.1). Trong đó, có 7 mẫu nhiễm nặng chiếm 23% (nhiễm +++), 11 mẫu nhiễm trung bình chiếm 37% (nhiễm ++) và 12 mẫu nhiễm nhẹ chiếm 40% (nhiễm +) (Hình 4.2). Hình 4.1: Tôm giống bị nhiễm bệnh MBV có kích cở không đều nhau 23% 37% 40% Nhiễm nặng Nhiễm trung bình Nhiễm nhẹ Hình 4.2: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm MG PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Dự kiến thu 30 mẫu tôm thịt nhưng do trong quá trình tiến hành không có mẫu tôm thịt bị nhiễm bệnh nên chỉ thu được11 mẫu. Các mẫu tôm thịt được chọn để phân tích là những tôm có màu tối sẫm, có kích thước và trọng lượng nhỏ hơn những con trong đàn (Hình 4.3). Bằng phương pháp nhuộm MG đều phát hiện thấy có 11 mẫu nhiễm MBV ở cường đô nhiễm nhẹ (+). Kết quả phát hiện trên các mẫu nhiễm MBV ở các mẫu tôm giống và tôm thịt cho thấy có các thể ẩn hình cầu dạng chùm hay dạng đơn lẻ bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6) phù hợp với kết quả nhuộm MG của Lightner, 1996. Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG (mũi tên chỉ thể ẩn MBV dạng chùm) (ở vật kính 40X) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG (mũi tên chỉ thể ẩn MBV dạng chùm) (ở vật kính 40X) 4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E Đối với tôm giống qua kiểm tra bằng phương pháp nhuộm H&E ở 30 mẫu này có 1 mẫu nhiễm trung bình chiếm 3% (nhiễm ++), 7 mẫu nhiễm nhẹ chiếm 23% (nhiễm +), 16 mẫu không thấy nhiễm MBV chiếm 54% và 6 mẫu không đọc được kết quả chiếm 20% (Hình 4.6) . 3% 23% 54% 20% Nhiễm trung bình Nhiễm nhẹ Không nhiễm Không đọc được kết quả Hình 4.6: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm H&E PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 Các mẫu tôm giống phát hiện nhiễm MBV ở phương pháp nhuộm H&E đều có các thể ẩn bắt màu hồng của Eosin phù hợp với kết quả nhuộm H&E của Lightner, 1996 (Hình 4.7) Đối với tôm thịt kết quả kiểm tra qua 11 mẫu đều thấy tế bào gan tụy có biểu hiện bình thường (Hình 4.8). Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E (mũi tên chỉ các thể ẩn MBV dạng chùm bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin) (ở vật kính 40X). Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp nhuộm H&E (mũi tên chỉ tế bào gan tụy bình thường (ở vật kính 40X). 4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 Đối với tôm giống khi kiểm tra 30 bằng phương pháp PCR có 23/30 mẫu dương tính (chiếm 77%) và 7/30 mẫu âm tính (chiếm 23%) (Hình 4.10 và Hình 4.11). Còn đối với tôm thịt kết quả kiểm tra bằng PCR có 3/11 dương tính (chiếm 27%) và 8/11 mẫu âm tính (chiếm 73%) (Hình 4.12 và Hình 4.13) Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR Ghi chú: Lược trên và lược dưới (tương tự) có: Giếng M: Thang đo Giếng 1 : Đối chứng âm Giếng 2 : Đối chứng dương Giếng 3 đến giếng 17: Mẫu tôm giống PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 27% 73% Mẫu nhiễm virus MBV Mẫu không nhiễm virus Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR Ghi chú: Giếng M: Thang đo Giếng 1: Đối chứng âm Giếng 2: Đối chứng dương Giếng 3 đến giếng 13: Mẫu tôm thịt 4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 So sánh kết quả phát hiện MBV bằng 3 phương pháp nhuộm nhanh, mô học truyền thống và PCR ở 30 mẫu tôm giống (Bảng 4.1) cho thấy có 8/30 mẫu (chiếm 27%) đều cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp. Trong đó, ở phương pháp nhuộm nhanh có 5/30 mẫu nhiễm với cường độ nặng (nhiễm +++) và 3/30 mẫu nhiễm trung bình (nhiễm ++), riêng phương pháp mô học có 7/8 mẫu nhiễm nhẹ (nhiễm +) và 1/8 mẫu nhiễm trung bình (nhiễm ++). 8 mẫu này được kiểm chứng lại bằng phương pháp PCR đều cho kết quả dương tính. Mặt khác, 22/30 mẫu (chiếm 73%) còn lại thì cho kết quả không đồng nhất khi phát hiện bệnh bằng 3 phương pháp này. Ở phương pháp nhuộm nhanh có 12/22 mẫu nhiễm nhẹ (nhiễm +), 2/22 mẫu nhiễm nặng và 88 mẫu nhiễm trung bình. Riêng phương pháp mô học thì 22 mẫu này hầu như không quan sát thấy thể ẩn (16/22 mẫu thấy tế bào gan tụy bình thường và 6/22 mẫu không đọc được kết quả). Trong khi đó, ở phương pháp PCR có 15/22 mẫu dương tính. Sở dĩ trong 22 mẫu còn lại có sự sai khác giữa 3 phương pháp có thể là do 2 lý do sau: Thứ nhất là khi kiểm tra mẫu tôm giống là kiểm tra ở mức độ quần thể nên khi tiến hành phương pháp nhuộm nhanh có thể thực hiện ở những cá thể tôm nhiễm bệnh nặng nhưng khi trữ mẫu lại để tiến hành tiếp 2 phương pháp còn lại thì có thể thực hiện ở những cá thể nhiễm nhẹ hoặc không nhiễm. Thứ hai là có thể là do kỹ thuật phân tích của người thực hiện phương pháp chưa cao chẳng hạn như ở phương pháp nhuộm MG nếu người kỹ thuật viên chưa có kinh nghiệm trong quá trình quan sát mẫu sẽ rất dễ nhầm lẫn giữa thể ẩn và giọt dầu, hay ở phương pháp nhuộm H&E nếu không cẩn thận trong bất kỳ khâu nào của phương pháp như, cắt mẫu, nhuộm mẫu... thì mẫu mô sẽ không đọc được kết quả. Mặc khác, ở phương pháp PCR do sử dụng bộ kít Nam Khoa nên kết quả chỉ biết được là mẫu nhiễm dương tính hay âm tính chứ không thể nhận biết được mức độ nhiễm của mẫu là nặng hay nhẹ. Bên cạnh đó, bộ kít này thực hiện với số lượng tôm giống nhiều (50-70 tôm/mẫu) và sử dụng phương pháp ly trích thô để phát hiện bệnh nên còn lẫn nhiều tạp chất do đó cho kết quả phát hiện cũng chưa cao lắm. So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm thịt PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 Qua kết quả phát hiện MBV bằng 3 phương pháp này ở 11 mẫu tôm thịt (Bảng 4.2) cho thấy có 3 mẫu dương tính ở phương pháp nhuộm MG và PCR, còn ở phương pháp nhuộm H&E thì hoàn toàn thấy tế bào gan tụy bình thường. Nguyên nhân dẫn đến kết quả ở phương pháp PCR có 8 mẫu âm tính là do trong quá trình quan sát ở phương pháp nhuộm MG chưa có kinh nghiệm nên nhằm giữa giọt dầu và thể ẩn MBV. Bảng 4.1: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, H&E và PCR Phương pháp STT Mẫu Nhuộm MG (30/30) Nhuộm H&E (8/30) PCR (23/30) 1 + - + 2 + - - 3 ++ + + 4 ++ - + 5 + - + 6 ++ - + 7 + K + 8 + - - 9 + K - 10 + K + 11 ++ - + 12 ++ + + 13 +++ + + 14 ++ - + 15 ++ + + 16 ++ - - 17 ++ - + 18 +++ + + 19 +++ + + 20 +++ ++ + 21 +++ - + 22 +++ - + 23 +++ + + 24 + - - 25 + - + 26 + K + 27 + K - 28 + K - 29 ++ - + 30 ++ - + Ghi chú: PP nhuộm nhanh và mô học: PP PCR: PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 +: Mẫu có cường độ nhiễm virus nhẹ +: Mẫu dương tính ++, +++: Mẫu có cường độ nhiễm virus nặng -: Mẫu âm tính -: Mẫu có tế bào gan tụy bình thường K: Mẫu không đọc được kết quả Bảng 4.2: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm thịt bằng phương pháp pháp nhuộm MG, H&E và PCR Ghi chú (tương tự ở Bảng 4.1) Phương pháp STT Mẫu Nhuộm MG (11/11) Nhuộm H&E (0/11) PCR (3/11) 1 + - - 2 + - - 3 + - - 4 + - - 5 + - - 6 + - - 7 + - + 8 + - - 9 + - + 10 + - - 11 + - + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Đối với mẫu tôm giống bị nhiễm MBV nặng khi được phát hiện bằng 3 phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR thì đều cho kết quả dương tính. Nhưng đối với mẫu tôm giống bị nhiễm nhẹ hoặc nhiễm vừa thì có sự sai khác nhau khi phát hiện bằng 3 phương pháp này. - Đối với mẫu tôm thịt do số mẫu phân tích còn quá ít nên không thể khẳng định được kết quả chính xác. - Phương pháp PCR thì tiện lợi hơn phương pháp nhuộm MG và nhuộm H&E trong việc phát hiện mầm bệnh trong bất kỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phương pháp nhuộm MG và nhuộm H&E thì lại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, Nhưng ở phương pháp nhuộm MG thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên cho kết quả chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh ở cơ quan đích nhanh hơn nhuộm H&E. 5.2 Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu so sánh trong việc phát hiện bệnh bằng 3 phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR trên cả tôm giống và tôm thịt với số lượng mẫu nhiều hơn. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Thủy sản, 2006. Hiện trạng nuôi tôm ở Việt Nam, Cơ hội và những thách thức. 9, truy cập ngày 14/11/2008. 2. Bộ Thủy Sản, 2006. Tình hình nuôi trồng thủy sản thế giới. 133290, truy cập ngày 14/11/2008. 3. Bộ Thủy Sản, 2006. Tác hại của dịch bệnh thuỷ sản. 6385208, truy cập ngày 14/11/2008. 4. Bộ thủy sản, 2008. Đồng Bằng Sông Cửu Long tôm chết hàng loạt- thực trạng và giải pháp. 3430635, truy cập ngày 14/11/2008. 5. Bộ NN&PTNT, 2008. Hàn Đình Sơn. Đồng Bằng Sông Cửu Long nghề nuôi tôm gặp nhiều khó khăn. cập nhật ngày 14/11/2008. 6. Bùi Quang tề, 2006. Bệnh MBV. 7. Cung Diễm, 2006. Kiểm tra tôm giống trước khi nhập. cập nhật ngày 16/11/2008. 8. Duy Hoàng, 2008. Trà Vinh tiêu hũy hơn 24.5 triệu con tôm giống bị nhiễm bệnh. cập nhật ngày 16/11/2008. 9. Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Minh Hậu và Nguyễn Thanh Phương, 2004. Tỷ lệ cảm nhiễm WSSV (White Spot Syndrome Virus) và MBV (Monodon Baculovirus) trên tôm sú (Penaeus monodon) thả ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ chuyên ngành thủy sản (2004). 10. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh Monodon Baculovirus ở tôm he. Nhà xuất bản nông nghiệp. =1, cập nhật ngày 16/11/2008. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 11. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 12. Hà Anh, 2007. Bệnh ở tôm và đôi lời bàn. cập nhật ngày 16/11/2008. 13. Tổng Cục Thống kê, 2007. cập nhật ngày 14/11/2008. 14. Khuất Hữu Thanh, 2006. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. 15. Lightner. D. V., 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedure for disease of shrimp. 16. Lightner D. V. , T. A. Bell and R. M. Redman., (1989). A review of the known host, geographical range and current diagnostic proceducres for the virus diseases of cultured penaeid shrimp. Advances in tropical aquaculture 1989. 17. Mai Phương và Hà Yên, 2003. Báo động đỏ về bệnh tôm nuôi. cập nhật ngày 14/11/2008. 18. Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1997. Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại Việt Nam. truy cập ngày 14/11/2008. 19. Nguyễn Thùy Ngân, 2008. Tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú (Penaeus monodon) bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV- Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus). Luận văn tốt nghiệp đại học 2008. 20. Nguyễn Thanh Phương, Trần Ngọc Hải, 2004. Giáo trình Kỹ thuật sản xuất giống và nuôi giáp xác. Khoa Thủy sản- Trường Đại Học Cần Thơ. 21. Nguyễn Chu Hồi, 2008. Thủy sản: Thế mạnh kinh tế của Đồng Bằng Sông Cửu Long. truy cập ngày 14/11/2008. 22. Nguyễn Kiểm, 2008. ĐBSCL: Chất lượng tôm giống - Nỗi lo của nhà nông. truy cập ngày 16/11/2008. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 23. Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003. Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp đại học 2003. 24. Phùng Thúy An, 2005. Ứng dụng kỹ thuật PCR và mô học để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng và đầu vàng trên tôm sú giống (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp đại học 2005. 25. Song Huỳnh, 2008. Các huyện vùng bán đảo Cà Mau: Tôm nuôi bị chết hàng loạt. 9, cập nhật ngày 16/11/2008. 26. Tài Hoàng Nhật Quang, 2008. Cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). Luận văn tốt nghiệp đại học 2008. 27. Từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa, 2008. Giáo trình Dịch tể học và quản lý dịch bệnh thủy sản. Khoa Thủy sản- Trường Đại Học Cần Thơ. 28. Thị trường tôm sú ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thiếu cả chất và lượng. cập nhật ngày 16/11/2008. 29. Thảo An, 2008. Đồng Bằng Sông Cửu Long - một mùa tôm ảm đạm. cập nhật ngày 25/11/2008 30. Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới. 133290, cập nhật ngày 14/11/2008. 31. Trần Việt Tiên, (2007). Ứng dụng phương pháp RT-PCR trong chẩn đoán virus gây bệnh đầu vàng (YHV) trên tôm sú (Penaeus monodon) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận Văn tốt nghiệp đại học 2007. 32. Trần Thị Tuyết Hoa, 2007. Giáo trình Sinh học phân tử. Khoa Thủy sản- Trường Đại Học Cần Thơ. 33. Trần Thị Tuyết Hoa, 2008. Giáo trình Bệnh truyền nhiễm 2. Khoa Thủy sản- Trường Đại Học Cần Thơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 PHỤ LỤC Bảng 1: Trọng lượng và tháng tuổi cuả mẫu tôm thịt Mẫu tôm thịt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Trọng lượng (gram) 7,6 9,6 8,5 9,2 8,7 5 7,3 9,2 9,5 9 8,6 Tháng tuổi 2 2 2 2 2 1,5 1,5 2 2 2 2 Bảng 2: Giai đoạn post thu của mẫu tôm giống STT Giai đoạn Post (P) Địa điểm thu 1 P12 KG 2 P10 KG 3 P12 CT 4 P12 CT 5 P12 CT 6 P15 KG 7 P12 KG 8 P15 KG 9 P12 KG 10 P12 CT 11 P12 CT 12 P12 CT 13 P12 KG 14 P12 KG 15 P12 KG 16 P12 KG 17 P12 KG 18 P12 KG 19 P12 CT 20 P12 CT 21 P15 CT 22 P12 CT 23 P12 CT 24 P12 KG 25 P12 KG 26 P12 KG 27 P12 CT 28 P12 CT 29 P12 CT 30 P12 CT PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version